UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Impacto do tratamento com Benznidazol na evolução da doença de
Chagas experimental - análise imunopatológica e funcional
AUTOR: Ivo Santana Caldas
.ORIENTADORA: Profa Maria Terezinha Bahia CO-ORIENTADOR: Prof. André Talvani
Ouro Preto Novembro de 2011
III
Dedico às pessoas que fazem parte da minha vida, umas por me ajudarem no crescimento e pelo carinho, outras por me apresentarem projetos
IV
Aos meus pais, Angelo e Helena, pelo amor e exemplo e aos meus irmãos, Sérgio e Walace, pelo apoio e amizade.
À Professora Maria Terezinha Bahia, pela orientação oferecida, paciência nos momentos difíceis e principalmente pela grande amizade.
Ao professor André Talvani, pela coorientação, pelos conhecimentos passados, amizade, e bons momentos vividos.
Aos professores Wanderson Geraldo de Lima e Rosália Morais Torres pelas colaborações referentes à histopatologia e análises eletrocardiográficas.
Ao professor George Luís Lins Machado Coelho pela contribuição nas análises estatísticas e pela gentileza de estar sempre disposto a ajudar.
À professora Marta de Lana e ao professor Evandro Machado pela boa convivência e colaborações.
Aos pesquisadores Olindo e Andréa do centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ, pela colaboração referente aos experimentos de citometria.
Às grandes amigas Lívia e Tassiane, que sempre estiveram presentes em minha vida! Ao Paulo Marcos da Matta Guedes, por ser um grande amigo e pelas colaborações realizadas.
A todos os alunos do laboratório de Doença de Chagas, especialmente ao Álvaro, que esteve sempre presente na realização deste trabalho.
À Ana e Ludmilla pelo auxílio e por serem tão prestativas. A todos os colegas do Curso de Pós-Graduação.
V
1 - Introdução
....16
1.1 A doença de Chagas...16
1.2 Alterações induzidas pela cardiopatia chagásica ...17
1.3 Benznidazol - quimioterapia específica para a doença de Chagas...19
1.4 O cão como modelo experimental da doença de Chagas...24
2 - Justificativa...26
3 - Objetivos...28
3.1 Objetivo Geral...28
3.2 Objetivos específicos...28
4 - Animais, material e métodos...30
4.1 Cepas de Trypanosoma cruzi...30
4.2 Animais...30
4.3 Fármaco e esquema de tratamento...31
4.4 Polimorfismo das formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi...31
4.5 Inoculação dos animais e confirmação da infecção...31
4.6 Curva de parasitemia...32
4.7 Avaliação de cura parasitológica após tratamento com Bz...32
4.8 Eletrocardiografia para avaliação funcional do miocárdio...36
4.9 Teste “in vitro” proliferação e avaliação do índice apoptótico de CMSP....37
4.10 Necrópsia...41
4.11 Expressão de mRNA de citocinas através da PCR ...42
4.12 Análise estatística...45
5
–
Resultados...46
5.1 Polimorfismo das formas tripomastigotas sanguíneas...46
5.2 Curvas de parasitemia...46
5.3 Histopatologia do miocárdio dos cães infectados...50
5.4 Determinação da susceptibilidade ao Benznidazol das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi...52
5.5 Análise quantitativa da miocardite e da fibrose no miocárdio dos cães infectados e tratados com Bz, nas fases aguda e crônica da infecção...53
5.6 Alterações cardíacas avaliadas pela Eletrocardiografia...56
5.7 Parâmetros imunológicos...65
5.7.1. Cinética de Imunoglobulina G (IgG) e isotipos (IgG1 e IgG2), nos soros de cães inoculados com as cepas do T.cruzi...65
5.7.2 Influência da quimioterapia específica com Bz na produção de anticorpos no soro de cães infectados pelo T. cruzi...69
5.7.3 Avaliação da proliferação de células mononucleares do sangue periférico...72
5.7.4 Avaliação da proporção de linfócitos TCD4+ e TCD8+ nas CMSP...74
VI
5.7.6 Quantificação dos níveis das citocinas IFN-γ, IL-10 e TNF-α no
sobrenadante das culturas de células mononucleares do sangue
periférico dos cães infectados pelo T.cruzi...78
5.7.7 Quantificação da expressão de mRNA das citocinas IFN-γ, IL- 10 e TNF-α no átrio direito dos cães infectados pelo T. cruzi.84
6 - Discussão...93
7 - Conclusões...112
8 - Referências bibliográficas...
.114
VII
Figura 1 - Passos realizados para a análise dos dados por citometria de fluxo. A) e C)
Distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade celular (SSC)
demonstrando a população de linfócitos contida na região R; B) Distribuição pontual de FL1/CFSE versus FL4/Anti-CD4:Alexa Fluor® 647 e D) Distribuição pontual de
FL1:Anexina V versus FL4:Anti-CD4:Alexa Fluor® 647...40
Figura 2 - Miocardite observada nos cães inoculados com 2000 tripomastigotas
sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi eutanasiados aos 90 (A) e 270 dias de infecção (B)...50
Figura 3 - Fibrose observada nos cães inoculados com 2000 tripomastigotas
sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma
cruzi sacrificados aos 90 (A) e 270dias de infecção (B). Imagens obtidas de lâminas com
cortes de átrio direito coradas pelo Tricrômico de Masson...51
Figura 4 - Miocardite observada nos cães inoculados com 2000 tripomastigotas
sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma
cruzi sacrificados aos 90 (A) e 270 dias de infecção (B). Imagens obtidas de lâminas com
cortes de átrio direito coradas pela hematoxilina e eosina...54
Figura 5 - Fibrose observada nos cães inoculados com 2000 tripomastigotas
sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma
cruzi sacrificados aos 90 (A) e 270 dias de infecção (B). Imagens obtidas de lâminas com
cortes de átrio direito coradas pelo Tricrômico de Masson...55
Figura 6 - Medidas de duração da onda P apresentadas por cães infectados por 2.000
tripomastigotas/kg das cepas VL-10 (A), AAS (B) e Berenice-78 (C) do T.cruzi. Os
exames foram realizados nos momentos antes (CNI), aos 120 dias (120DI) e aos 270 dias após a infecção (270DI). (D) Correlação entre duração da onda P e fibrose observada no átrio direito de todos os cães incluídos no estudo...57
Figura 7 - Medidas de duração do intervalo PR apresentadas por cães infectados por
2.000 tripomastigotas/kg das cepas VL-10 (A), AAS (B) e Berenice-78 (C) do T.cruzi.
(D) Correlação entre duração do intervalo PR e fibrose observada no átrio direito de todos os cães incluídos no estudo...59
Figura 8 - Medidas de duração do complexo QRS apresentadas por cães infectados por
2.000 tripomastigotas/kg das cepas VL-10 (A), AAS (B) e Berenice-78 (C) do T.cruzi.
VIII
dias após a infecção (270DI). (D) Correlação entre duração do QRS e fibrose observada
no átrio direito de todos os cães incluídos no estudo...60
Figura 9 - Traçados eletrocardiográficos de cães infectados por 2.000 tripomastigotas/kg das cepas VL-10, AAS ou Berenice-78 do T.cruzi. (A) Aumento do intervalo PR (B)
Contrações ventriculares prematuras (C) Bloqueio sinoatrial (D) arritmia atrial (E) Síndrome Bradi-taqui e (F) bloqueio completo do ramo direito do feixe de Hiss...64
Figura 10 - Índices de reatividade de anticorpos da classe IgG, IgG1 e IgG2 determinados através de ELISA nos soros de cães inoculados com 2000 tripomastigotas sanguíneos das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi. A)
Imunoglobulinas da classe IgG, B) IgG1 e C) IgG2, sendo AI: antes da infecção, DI: dias
de infecção; CNI grupo controle não infectado. ...66
Figura 11 - Correlação entre miocardite e fibrose com os índices de reatividade de
anticorpos da classe IgG (A), IgG1 (B) e IgG2 (C) determinados através de ELISA nos soros de cães inoculados com 2000 tripomastigotas sanguíneos das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi e que foram eutasiados aos 270 dias de
infecção...68
Figura 12 - Índices de reatividade de anticorpos da classe IgG, IgG1 e IgG2 determinados através de ELISA nos soros de cães inoculados com 2000 tripomastigotas sanguíneos das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi e tratados ou
não com o Benznidazol. A) Imunoglobulinas da classe IgG, B) IgG1 e C) IgG2...70
Figura 13 - Correlação entre miocardite e fibrose com os índices de reatividade de anticorpos da classe IgG (A), IgG1 (B) e IgG2 (C) determinados através de ELISA nos soros de cães inoculados com 2000 tripomastigotas sanguíneos das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi e que foram tratados ou não com Bz, eutasiados aos
270 dias de infecção...71
Figura 14 -Análise representativa de proliferação de linfócitos do sangue periféricos de
cães infectados pelo Trypanosoma cruzi por meio de incorporação de CFSE, utilizando
IX
C) Células marcadas com CFSE e estimuladas com antígenos de Trypanosoma cruzi e D)
Células marcadas com CFSE e estimuladas com Concanavalina A...72
Figura 15 - Análise representativa de avaliação da proporção de linfócitos TCD4+ e
TCD8+ obtidas do sangue periféricos de cães infectados pelo Trypanosoma cruzi e
marcadas pelo CFSE, utilizando citometria e software FlowJo. Linfócitos marcados por anticorpos anti-CD4+ (A) e anti-CD8+ (B)...74
Figura 16 - Razão entre a freqüência de linfócitos T CD4+ e T CD8+ encontrada em
cultura de células mononucleares do sangue periférico obtidas de cães infectados pelo
Trypanosoma cruzi aos 45 (A) e 90 dias de infecção (B)...75 Figura 17 - Análise representativa de avaliação da apoptose de linfócitos TCD4+ e
TCD8+ obtidos de cultura de células mononucleares do sangue periférico de cães infectados pelo Trypanosoma cruzi, utilizando citometria e software FlowJo. Linfócitos
marcados por anticorpos anti-CD4+ (A) e anti-CD8+ (B)...76
Figura 18 - Quantificação de IFN-γ, através de ELISA, no sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de cães infectados com 2000 tripomastigotas sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10 (A), AAS (B) e Berenice-78 (C) do
Trypanosoma cruzi submetidos ao tratamento com Bz...80 Figura 19 - Quantificação de IL-10, através de ELISA, no sobrenadante de células
mononucleares do sangue periférico de cães infectados com 2000 tripomastigotas sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10 (A), AAS (B) e Berenice-78 (C) do
Trypanosoma cruzi submetidos ao tratamento com Bz...82 Figura 20 - Quantificação de TNF-α, através de ELISA, no sobrenadante de células
mononucleares do sangue periférico de cães infectados com 2000 tripomastigotas sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10 (A), AAS (B) e Berenice-78 (C) do
Trypanosoma cruzi submetidos ao tratamento com Bz...84
Figura 21 - Curvas padrão gerada com 7 diluições seriadas de uma mesma amostra de
cDNA para verificação das eficiências dos primers para IFN-γ (A), IL-10 (B), TNF-α(C) e β-actina(D)...85
Figura 22 - Ciclos de amplificação gerados com diluições seriadas de uma mesma
X
Figura 23 - Curva de dissociação do cDNA amplificado dos mRNA para as citocinas IFN-γ, IL-10, TNF-α e do controle endógeno β-actina, com picos em torno de 71oC, 75oC, 84oC e 74oC, respectivamente...87
Figura 24 - Níveis de expressão de IFN-γ no átrio direito de cães infectados pelas cepas
VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi, necropsisados aos 90 dias (A) e 270
dias de infecção (B)...88
Figura 25 - Níveis de expressão de IL-10 no átrio direito de cães infectados pelas cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi, necropsisados aos 90 dias (A) e 270
dias de infecção (B)...90
Figura 26 - Níveis de expressão de TNF-α no átrio direito de cães infectados pelas cepas
VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi, necropsisados aos 90 dias (A) e 270
XI
Tabela 1 - Alvo e iniciadores utilizados.As sequências foram determinadas com base na
sequência de nucleotídeos obtidas GenBank Database...44
Tabela 2 - Análise estatística descritiva dos valores estáveis da curva de coeficiente de
variação...49
Tabela 3 - Padrão de inflamação, fibrose e efeito do tratamento observado nos cães
infectados pelas cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi aos 90 dias de
infecção...56
Tabela 4 - Padrão de inflamação e fibrose observado nos cães infectados pelas cepas
VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi aos 270 dias de infecção...56 Tabela 5 - Alterações eletrocardiográficas apresentadas por cães infectados por 2.000
tripomastigotas/kg das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do T.cruzi e entre os cães
XII
Gráfico 1 - Polimorfismo das formas tripomastigotas sanguíneas observadas durante os
picos de parasitemia em camundongos Swiss inoculados com 5000 tripomastigotas sanguíneos das cepas Berenice-78, Y, AAS e VL-10 do Trypanosoma cruzi...46
Gráfico 2 - Curvas de parasitemia obtidas de cães inoculados com 2000 tripomastigotas
sanguineos/kg de peso corporal das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi...47 Gráfico 3 - Resultado da análise para determinação do número mínimo de campos
representativos para quantificação da: A) Inflamação B) Fibrose; avaliada em preparações de lâminas coradas pela Hematoxilina & Eosina e Tricrômico de Masson. CV: coeficiente de variação...48
Gráfico 4 - Percentagem de testes sorológicos e parasitológico e/ou molecular –
hemocultura e PCR – positivos realizados no sangue de cães inoculados com 2000 tripomastigotas sangüíneas/kg de peso corporal das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do
Trypanosoma cruzi após o tratamento com 7mg de Bz/Kg por 60 dias...52
Gráfico 5 - Alterações eletrocardiográficas apresentadas por cães infectados por 2.000
tripomastigotas/kg das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do T.cruzi. Os exames foram
realizados nos momentos antes (AI), aos 120 dias (120DI) e aos 270 dias após a infecção (270DI)...65
Gráfico 6 - Reatividade das células mononucleares do sangue periférico obtidas de cães
experimentalmente infectados com 2000 tripomastigotas sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi após estimulação in vitro.
Os resultados foram expressos como índice de estimulação...73
Gráfico 7 - Análise da apoptose de linfócitos T CD4+ presentes em células
mononucleares do sangue periférico mantidas em cultura por 48 horas e estimulados com antígeno de Trypanosoma cruzi, obtidas dos grupos não infectado (CNI) e infectado (CI)
com 2000 tripomastigotas sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi...77
Gráfico 8 - Análise da apoptose de linfócitos T CD8+ presentes em células
XIII
com 2000 tripomastigotas sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi...78 Gráfico 9 - Quantificação de IFN-γ, através de ELISA, no sobrenadante de células
mononucleares do sangue periférico de cães infectados com 2000 tripomastigotas sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi nos momentos antes (AI) 45 e 80 dias de infecção (DI)...79 Gráfico 10 - Quantificação de IL-10, através de ELISA, no sobrenadante de células
mononucleares do sangue periférico de cães infectados com 2000 tripomastigotas sangüíneos/kg de peso corporal das cepas VL-10, AAS e Berenice-78 do Trypanosoma cruzi nos momentos antes (AI) 45 e 80 dias de infecção (DI)...81 Gráfico 11 - Quantificação de TNF-α, através de ELISA, no sobrenadante de células
XIV
Considerando as controvérsias sobre a eficácia do tratamento específico com Benznidazol (Bz) na prevenção ou redução das lesões cardíacas crônicas, este projeto propôs avaliar a influência do tratamento específico na evolução da cardiopatia chagásica, utilizando como modelo experimental cães infectados por cepas do
Trypanosoma cruzi sensíveis e resistentes ao Bz. As avaliações imunopatológicas e
clínicas foram realizadas utilizando: (i) a avaliação da área ocupada pela inflamação e pela fibrose no músculo cardíaco (ii) avaliação dos níveis de expressão mRNA para citocinas no tecido cardíaco; (iii) avaliação da resposta proliferativa e morte por apoptose de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) e quantificação da produção de citocinas no sobrenadante das CMSP dos animais ao longo da infecção; (iv) avaliação das possíveis interferências do tratamento com Bz sobre a evolução clínica da cardiopatia experimental, através da detecção das alterações eletrocardiográficas, em cães chagásicos tratados e não tratados.
Nossos resultados mostraram que o tratamento específico induziu 100% de cura nos animais infectados pela cepa Berenice-78, e que não houve cura parasitológica entre os infectados pelas cepas VL-10 e AAS. O tratamento específico, de maneira geral, preveniu as lesões cardíacas dos animais curados, bem como as alterações eletrocardiográficas. De forma interessante, entre os animais não curados foi observado um padrão de resposta variável de acordo com a população do T. cruzi. Nos animais
infectados pela cepa AAS foi detectada redução significativa do processo inflamatório e da fibrose no tecido cardíaco acompanhado de ausência de alterações eletrocardiográficas. De forma diferente, entre os animais infectados pela cepa VL-10, o tratamento não foi eficaz em reduzir tanto as lesões cardíacas quanto as alterações eletrocardiográficas. Os parâmetros imunológicos avaliados durante as fases aguda e crônica da infecção foram marcadamente influenciados tanto pela cepa do parasito quanto pelo tratamento específico. Foi possível correlacionar a intensidade das lesões cardíacas e a produção de imunoglobulinas (IgG, IgG1, IgG2) no soro e de citocinas (TNF-, IFN- e IL-10) no sobrenadante de CMSP, além da expressão de mRNA dessas citocinas no tecido cardíaco dos animais submetidos ou não à quimioterapia com o Bz.
XV
Based on the divergences concerning the efficacy of anti-Trypanosoma cruzi
treatment with Benznidazol (Bz) in the prevention and reduction of cardiac chronic lesions, the aim of this study was evaluate the influence of Bz in the evolvement of the Chagas cardiopathy using dog models infected with Bz-resistent and – susceptible strains of parasites. Clinical and immunopathology parameters were performed through evaluation of the: (i) inflammation and fibrosis area in cardiac muscle; (ii) mRNA expression of cytokines in cardiac tissue; (iii) proliferative response, apoptosis and quantification of cytokines in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and their supernatant, respectively; and (iv) interferences of Bz on the clinical evolving thought electrocardiography (ECG) alterations in infected dogs treated or not with Bz.
Our data showed that Bz-treatment induced 100% of cure in animals infected with Berenice-78 strain and absence of cure in those infected with VL-10 and AAS strains of parasite. In the presence of cure, there were prevention of cardiac lesions and ECG alterations and, among not cured animals, it was observed a variable pattern of immunopathology and clinical aspects according to the T. cruzi genetic population.
Interestingly, AAS strain was associated with reduction of inflammatory infiltration and fibrosis in heart tissue as well as absence of ECG alterations while VL-10 strain was not able to ameliorate these parameters. Immune aspects evaluated during acute and chronic phases were influenced by parasite strains and by Bz-treatment. Following this, intensity of cardiac lesions was correlated with high serum production of immunoglobulins (IgG, IgG1, IgG2) and with the release and expression of cytokines (TNF-, IFN- e IL-10) in CMSP supernatant and cardiac tissue, respectively, in those animals submitted or not to Bz-treatment.
16
1 - Introdução
1.1
A doença de Chagas
A doença de Chagas é um dos principais problemas médico-sociais brasileiros, acometendo milhões de pessoas no país. No mundo são aproximadamente 10 milhões de pessoas infectadas pelo Trypanosoma cruzi com pelo menos 25 milhões de
indivíduos sob risco de infecção (WHO, 2010). A moléstia de Chagas é uma doença crônica, incapacitante e debilitante, com grande impacto sócio-econômico e cultural. Dentre as principais sintomatologias clínicas que acometem 20-30% dos indivíduos infectados pelo parasito, destacam-se alterações na motilidade esofágica e intestinal e alterações eletrofuncionais cardíacas, sendo o comprometimento cardíaco a causa morte primária associada à doença (Prata 2001).
Costuma-se dividir a história natural da cardiopatia chagásica nas formas de miocardite aguda e crônica, intercalada pela longa e enigmática forma indeterminada. Excluíndo os casos inesperados de morte súbita (Prata et al., 1986), os demais casos
relatados sucedem uma forma de acometimento cardiovascular típico da doença, a cardiopatia chagásica crônica (CCC), que apresenta como característica principal um caráter progressivo e fibrosante. O que se compreende como caráter progressivo está, muitas vezes, ligado à série crescente de eventos inflamatórios envolvendo o órgão cardíaco infectado pelo T. cruzi. Observa-se, neste processo inflamatório, uma destruição
direta dos cardiomiócitos gerando no indivíduo chagásico quadros clínicos de comprometimento do ritmo e da condução (síncopes e palpitações) ou da contratilidade miocárdica (dispnéia, cansaço e edema). A compreensão dos principais mecanismos de destruição destes cardiomiócitos propiciaria estratégias farmacológicas que atuariam no remodelamento cardíaco ainda na fase aguda da doença (Andrade et al., 1997).
17
Infelizmente, ainda pouco se sabe sobre estes fatores que predispõem a gravidade da CCC, bem como aqueles que propiciam o caráter evolutivo da doença. Alguns fatores parecem exercer importância no desenvolvimento progressivo da doença de Chagas, como por exemplo, a cronologia da doença, a exposição às reinfecções, o padrão da resposta imune do hospedeiro, os eventos apoptóticos e a variabilidade genética do hospedeiro e do parasito (Dvorak, 1984; Andrade et al., 1990; Andrade et al.,1992;
Manuel-Caetano et al., 2007; Rocha et al., 2007).
1.2
Alterações
induzidas
pela
cardiopatia
chagásica
-
imunopatogênese na doença de Chagas
Fatores gerados em resposta ao parasito possuem importância na patogênese provocada pelo T.cruzi. A resposta imune é fundamental para redução do parasitismo,
todavia pode contribuir para geração das manifestações crônicas observadas em parte dos indivíduos chagásicos. O tecido cardíaco é o principal alvo de infecção e inflamação em ambas as fases da doença de Chagas e a integridade e o destino das células do hospedeiro contribuem diretamente para determinar o curso desta infecção. O perfil celular, bem como de citocinas, durante a fase aguda da doença de Chagas parece ser capaz de determinar um padrão de resposta inflamatória durante a fase crônica (Guedes et al.,
2009). Citocinas apresentando um perfil inflamatório contribuem para a síntese de inúmeras quimiocinas e seus respectivos receptores, além dos intermediários de oxigênio, contribuindo para aumento do recrutamento celular durante o processo inflamatório e suprimem o parasitismo, respectivamente. Ao contrário, citocinas com perfil regulatório promovem redução na síntese de óxido nítrico por macrófagos e aumentam sua susceptibilidade aos parasitos intracelulares (Gutierrez et al., 2009).
Durante a fase crônica da infecção os infiltrados inflamatórios são compostos principalmente por macrófagos e linfócitos, embora ocasionalmente neutrófilos e eosinófilos sejam também detectados (Reis et al.,1993; Higuchi et al.,1997; dos Santos et al., 2001). Entre os linfócitos, os citotóxicos (TCD8+) podem se tornar tão prevalentes
quanto os auxiliares (TCD4+) nos focos inflamatórios de indivíduos com cardiopatia chagásica crônica (Reis et al.,1993; Higuchi et al.,1997). Entretanto, os fatores que
18
células inflamatórias no controle do parasitismo e na gênese da cardiopatia ainda são pouco conhecidos (Lannes-Vieira et al., 2009).
É sabido que o T. cruzi, de forma similar a outros patógenos é capaz de evadir-se à
resposta imune através da simples modulação dos eventos apoptóticos nas células hospedeiras (Heussler et al., 2001). O parasito redireciona a resposta apoptótica em
células imunes (células B, T e macrófagos) contribuindo desta forma para a perda de células T CD4+ e depleção de timócitos, controle da resposta inflamatória e do recrutamento celular no sítio da lesão devido à produção de fatores de crescimento pelas células fagocíticas que internaliza células do hospedeiro em apoptose e/ou parasitos em apoptose. Outro mecanismo de escape do parasito estaria na prevenção de apoptose do cardiomiócito parasitado durante seu estágio de proliferação intracelular até sua liberação para o meio extracelular, sem afetar sua sobrevivência e, assim, perpetuando a infecção (Luder et al., 2001).
Apesar de intensivamente estudada, a patogênese da doença de Chagas continua não muito bem esclarecida, os mecanismos imunopatológicos que promovem as lesões nos tecidos não estão ainda bem elucidados. A dificuldade em detectar-se o parasito no miocárdio levou a postulação de teorias auto-imunes para explicar o desenvolvimento das lesões inflamatórias miocárdicas durante a fase crônica da doença. Estas lesões poderiam ser resultado de uma reação de auto-imunidade causada por auto-anticorpos ou por linfócitos T auto-reativos derivados de mimetismo molecular de antígenos do parasito e do hospedeiro, ou ainda por ativação bystander não envolvendo antígenos do
T. cruzi sendo induzido por antígenos provenientes de lesões teciduais (Leon et. al.,
2001; Kierszenbaum, 1999; Cossio et. al., 1974; Anselmi et al., 1966). Recentemente foi
demonstrada a reatividade contra auto-antígeno Cha (proteína presente em mamíferos) em humanos e camundongos infectados com o T. cruzi (Girones et al., 2001).
Entretanto, trabalhos mais recentes apontam para uma participação ativa do parasito na patogênese da cardiopatia chagásica crônica (Higuchi, 1995; Higuchi et al.,
1993; Barbosa et al, 1986). Uma associação entre a inflamação e a presença de T. cruzi
no tecido cardíaco, assim como sua ausência em locais sem inflamação, foi descrita por Belloti et al. 1996 e Higuchi et al.1995 utilizando a técnica de imunoperoxidase. A
19
(PCR) e hibridização com sondas internas específicas. Porém, não sendo detectadas seqüências de DNA do T. cruzi em tecido cardíaco de pacientes assintomáticos ou
soronegativos (Jones et al., 1993). Resultados concordantes foram obtidos por
Lages-Silva et al. (2001) e Vago et al. (1996) utilizando amplificação de seqüências do DNA do
cinetoplasto (kDNA) do T. cruzi em tecidos do esôfago de pacientes com megaesôfago,
sendo observada uma relação direta entre a inflamação tecidual e a presença do parasito. A presença do parasito parece ser importante para desencadear o processo de formação da miocardite chagásica crônica.
Na maioria dos casos não é possível fazer correlação entre a intensidade da lesão e a quantidade de antígeno e/ou DNA do parasito presente, sugerindo que o parasito (envolvendo características genéticas inerentes à sua cepa) é responsável por disparar e manter o processo de patogênese no miocárdio, e que este seria amplificado por mecanismos auto-imunes que dependeriam da predisposição genética do hospedeiro (Girones & Fresno, 2003; Ãnez et al. 1999; Belloti et al., 1996; Higuchi, 1995; Rowland et al, 1995; Jones et al., 1993).
1.3 Benznidazol - quimioterapia específica para a doença de Chagas
O Benznidazol (Bz) (N-benzil-2-nitro-imidazol-1-acetamida) (Radanil®, Rochagan®, Roche) foi descoberto empiricamente no início dos anos 70 após a partir de 1960 terem demonstrado que a nitrofurazona administrada em esquemas de longa duração curava grande parte de camundongos infectados pelo T.cruzi. Adicionalmente,
quando este composto foi testado em pacientes, apesar de parte deles terem o parasito encontrado pela técnica de xenodiagnóstico, os resultados foram considerados satisfatórios (Cançado, et al, 1964). O Bz surge, assim, como uma nova perspectiva para
o tratamento da doença de Chagas, apresentando alto índice de cura na fase aguda e com razoável tolerabilidade pelos pacientes. O Bz atua via formação de radicais livres, onde o grupo nitro presente em sua molécula sofre redução por meio de enzimas do tipo nitroredutases, com consequente formação de radicais nitroaniônicos. Estes radicais são os responsáveis pela atividade anti-T. cruzi por formarem ligações covalentes com DNA,
RNA e proteínas do parasito. (Díaz de Toranzo et al 1988, Docampo, 1990; revisado por
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Vários estudos têm demonstrado que o tratamento com o Bz apresenta pequena ou nenhuma atividade quando realizado na fase crônica da doença de Chagas, com índices de cura variando entre 0% a 19,1% (Viotti et al, 1994, Lauria-Pires et al, 2000,
Cançado 2002). Entretanto, considerando o risco dos eventos deletérios cardíacos e da morte súbita durante a fase crônica, o tratamento com drogas tripanocidas pode ser importante na prevenção da progressão de alterações cardíacas severas. De acordo com Viotti et al., (1994, 2005) e Suasnábar et al., (2002) o tratamento de indivíduos
chagásicos com Bz, durante a fase crônica, induz diminuição da progressão de alterações eletrocardiográficas e da cardiopatia, em relação aos individuos não tratados. De acordo com Andrade et al.,(2004) o tratamento efetivo, na fase crônica da doença, previniu a
progressão das alterações cardíacas retratada através do eletrocardiograma realizado ao final do tratamento e durante o período de avaliação pós-tratamento.
Além disto, os indivíduos tratados apresentam a negativação da sorologia ou mostram um decréscimo dos níveis de anticorpos mais frequentemente que os não tratados (Andrade et al., 2004). Entretanto, Lauria-Pires et al. (2000) mostraram que a
infecção é persistente após o tratamento e que, alterações eletrocardiográficas progressivas são observadas tanto em indivíduos tratados como naqueles não tratados e, usando métodos moleculares, mostraram que os níveis de parasitemia não foram significantemente diferentes entre os chagásicos crônicos tratados e não tratados. De acordo com os autores estes achados e as progressivas alterações clínicas observadas em ambos os grupos de pacientes indicam que o tratamento de infecção crônica parece não induzir benefício (Lauria-Pires et al, 2000, Braga et al, 2000).
Correntemente, ensaios clínicos realizados em diferentes países mostram evidências de sucesso na quimioterapia com Bz entre crianças e adolescentes (Sosa-Estani, 1998). Adicionalmente, foi demonstrado que o tratamento com Bz, apesar de distante do ideal, conduz a benefícios concretos quando realizados em fases recentes da doença. Ensaios clínicos realizados na Argentina e no Brasil mostraram índices de 62 a 87% de cura parasitológica em crianças tratadas com Bz (de Andrade et al, 1996,
Sosa-Estani, 1998, 1999, Silveira et al, 2000, Straiger, 2004, de Andrade et al, 2004). Estes
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Andrade et al (1996) o tratamento efetivo, nesta fase da doença, pode prevenir a
progressão da doença e suas complicações porque o eletrocardiograma realizado no final do tratamento e durante o período de avaliação pós-tratamento, mostrou 1 (1,7%) caso incidente de bloqueio completo do ramo direito do feixe de Hiss no grupo tratado com Bz, e 4 (6,9%) no grupo placebo. Entretanto, Silveira et al (2000) obtiveram apenas
8,35% de cura entre 12 crianças de 7 a 12 anos após o tratamento com Bz realizado durante a fase crônica indeterminada da doença de Chagas. Durante a avaliação clínica longitudinal (avaliação durante 8 a 20 anos) foi observada uma evolução clínica para as formas cardíacas ou digestivas da doença em 4 (33,3%) dos pacientes tratados (Silveira
et al, 2000).
Também os ensaios clínicos realizados durante a fase aguda da infecção mostram altos níveis de cura parasitológica, sendo observado índices variando entre 40% a 76% de cura parasitológica, definida pela negativação da sorologia e dos testes parasitológicos (Shikanai-Yasuda et al, 1990, Andrade et al, 1992, Bahia-Oliveira, 2000, Cançado,
2002).
Assim o tratamento de pacientes chagásicos em ambas as fases da doença com o Bz têm fornecido resultados distintos, principalmente quando ensaios terapêuticos realizados em diferentes áreas geográficas são comparados. Yun et al., (2009) mostraram
que o tratamento com Bz realizado em programas com crianças e jovens (menores de 18 anos) provenientes de duas regiões da Bolívia, uma de Honduras e uma da Guatemala apresentaram diferentes resultados. Após 18 meses, foi observada soroconversão negativa em 87,1%, 58,1% e em nenhum dos pacientes de Honduras, Guatemala e na região de Sucre na Bolívia, respectivamente. Na região de Entre Rios na Bolívia, após 60 meses, foi observada sorologia negativa em apenas 5,4% dos pacientes.
Um dos fatores que contribui para os diferentes resultados obtidos com o tratamento da doença humana seria o tipo de cepa do parasito predominante em algumas áreas geográficas (Andrade et al., 1992). Foi sugerido que a resistência natural do T cruzi
aos nitroderivados seria a explicação para os baixos índices de cura detectados em pacientes chagásicos tratados, pois foram descritas diferenças na susceptibilidade de cepas do parasito a estes quimioterápicos (Brener et al., 1976; Filardi and Brener, 1987).
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quimioterápicos in vivo (Toledo et al., 2003 and 2004). Vinte clones representativos da
diversidade filogenética total do T. cruzi, incluindo os genótipos 19 e 20 (T. cruzi I) e os
genótipos 32 39 (T. cruzi II) (Miles et al., 1980, Tibayrenc & Ayala, 1988; Anonymous,
1999) foram analisados. Os resultados demonstraram diferenças importantes entre estoques de T. cruzi que poderiam ser utilizadas como marcadores de comportamento
biológico. Membros do grupo T. cruzi I foram altamente resistentes, enquanto membros
do grupo T. cruzi II foram susceptíveis ou parcialmente resistentes ao Bz.
Camandaroba et al.(2003) determinaram a susceptibilidade ao Bz de sete clones
isolados da cepa Colombiana, altamente resistente ao Bz, e previamente classificada como Biodema ou tipo III (Andrade & Magalhães, 1997), e T. cruzi I (Anonymous,
1999). Os resultados demonstraram uma alta resistência dos clones, sugerindo uma predominância de clones altamente resistentes nesta cepa. De acordo com os autores estes resultados indicam que aparentemente a possibilidade de cura é mínima para pacientes infectados com este Biodema. A resposta à quimioterapia com Bz foi também investigada por Campos et al., (2005) para quatro clones isolados da cepa do T. cruzi
21SF (Biodema Tipo I, T. cruzi II). A variação de 30% a 100% na taxa de cura de
populações clonadas de cepas pertencentes ao grupo T. cruzi II sugerem que esta seja
uma das explicações para a alta variação da resposta à quimioterapia da doença de Chagas com Bz por cepas desta linhagem genética.
As falhas no tratamento de pacientes infectados com cepas do grupo T. cruzi I
podem ser devido à resistência de cepas deste tipo genético a drogas anti-chagásicas (Camandaroba et al., 2003). Concordância entre resultados obtidos em pacientes e
camundongos infectados com a mesma cepa já foram descritos (Andrade et al., 1992;
Filardi & Brener, 1987). Também, o T. cruzi I (Cepa Colombiana), que é totalmente
resistente ao Bz no modelo murino (Camandaroba et al., 2003), também foi altamente
resistente em cães (Guedes et al., 2002). Além disso, os resultados controversos em
relação ao benefício do tratamento na prevenção da progressão das lesões cardíacas podem estar relacionados, pelo menos parcialmente, com o nível de resistência das populações do T. cruzi presentes. Neste contexto é importante a realização de estudos
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com cepas que apresentem diferentes níveis de resistência ao Bz, a exemplo do que provavelmente ocorre nas diversas regiões endêmicas.
De forma semelhante são poucos os estudos sobre as alterações induzidas pelo tratamento específico, bem sucedido ou não, na resposta imune celular. A análise da proliferação de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de pacientes chagásicos crônicos, submetidos à quimioterapia específica, demonstrou que após cinco anos as respostas médias de proliferação dos pacientes parasitologicamente curados foram similares à de indivíduos não infectados. Pacientes submetidos ao tratamento e não curados apresentaram altos índices de proliferação celular. Logo, sugere-se uma relação entre a cura parasitológica e a normalização da reatividade celular frente a antígenos do
T. cruzi (Dutra et al., 1996). De modo concordante, foi demonstrada em um estudo
realizado pelo nosso grupo a normalização da reatividade das células mononucleares do sangue periférico em cães submetidos ao tratamento com Bz após a cura parasitológica (Guedes et al. 2004). Também foi observado um nível intermediário de reatividade
celular entre os animais tratados, mas não curados, assim como um perfil similar em relação aos níveis de anticorpos específicos determinados pelo imunoensaio ELISA.
Neste contexto, apesar dos trabalhos focando resistência do parasito, resposta imune e mecanismo inflamatório cardíaco, pouco se sabe sobre os efeitos do tratamento com Bz na resposta inflamatória cardíaca na doença de Chagas. Interessantemente, estudo in vitro mostrou que o Bz pode interferir na produção de citocinas e de óxido
nítrico por macrófagos, promovendo inibição da síntese de IL-6, IL-10 e inibindo também a expressão do gene da iNOS (Revelli et al., 1999). Portanto o tratamento com
Bz supostamente pode influenciar o curso da infecção pelo T.cruzi, não somente pela
destruição direta do parasito, poderia interferir também na resposta imune frente ao
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1.4 O cão como modelo experimental da doença de Chagas
Cães experimentalmente infectados por determinadas cepas do T.cruzi
desenvolvem intensa miocardite com parasitismo acentuado de cardiomiócitos e lesões necróticas de células cardíacas não parasitadas durante a fase aguda (Andrade et al.,
1997). Durante a fase aguda da infecção de cães podem ser observados, a partir de exame eletrocardiográfico, bloqueios intraventriculares e hemi-bloqueios de ramo esquerdo, em decorrência das lesões inflamatórias em áreas de condução nervosa. A participação do sistema imune na fase aguda da infecção pode ser avaliada pela observação de parasitos viáveis ou em apoptose, sugerindo mecanismo citotóxico e citolítico, mediado por células imunes efetoras (Andrade et al., 1997). Durante a fase crônica indeterminada do
cão, assim como no homem, não são observados sintomas ou alterações eletrocardiográficas graves, entretanto infiltrados inflamatórios e áreas de fibrose podem ser observados no miocárdio em análise histopatológica, principalmente no átrio direito. Na forma indeterminada da doença de Chagas, ao contrário do observado na fase aguda, os linfócitos T apresentam a característica de não aderirem ao cardiomiócito, sugerindo que não estavam exercendo ação citotóxica ao hospedeiro, além disso, apresentam tendência a morte celular, indicando uma regulação da inflamação pelo processo de apoptose (Andrade et al, 1997).
A utilização do modelo cão para estudos de quimioterapia experimental para as fases aguda e crônica da doença de Chagas foi recentemente descrita pelo nosso grupo (Guedes et al, 2002). Neste estudo cães infectados por cepas de T. cruzi sensíveis,
parcialmente sensíveis e resistentes ao Bz foram tratados com este fármaco e o tratamento induziu índices de cura similares aos reportados em ensaios clínicos realizadas em ambas as fases, aguda e crônica, da doença de Chagas. O cão tem sido apontado como o modelo experimental ideal para quimioterapia da doença de Chagas por duas importantes razões: a primeira é o fato de que cães experimentalmente infectados pelo T. cruzi desenvolvem uma infecção com características similares à doença de
Chagas humana, tanto na fase aguda, como na fase crônica da doença (Lana et al, 1992;
Bahia et al, 2002). A segunda é que cães experimentalmente infectados e tratados com
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Recentemente temos buscado relacionar o padrão de resposta imune com o desenvolvimento da patologia cardíaca observada em cães experimentalmente infectados, e reforçar que o cão é um bom modelo para o estudo dos mecanismos imunopatológicos da doença de Chagas, uma vez que reproduz os aspectos clínicos e imunológicos observados em pacientes chagásicos. Utilizando cães da raça Beagle foi mostrada relação direta entre presença de cardiomegalia e alta proliferação de células mononucleares do sangue periférico associada a baixos níveis de IgG 1 (Guedes et al 2008). Demonstrou-se
a prevalência de uma resposta inflamatória durante a fase aguda nos animais que apresentaram forma cardíaca durante a fase crônica e que animais que permaneceram na forma indeterminada apresentam mistura de resposta Th1 e Th2, sugerindo que a resposta imune durante a fase aguda da infecção é importante para o estabelecimento das lesões cardíacas observadas durante a fase crônica (Guedes et al 2009). Mostramos
também que a severidade da doença cardíaca possivelmente está correlacionada com aumento da expressão de quimiocinas que recrutam células pró-inflamatórias para o miocárdio, enquanto o desenvolvimento da forma indeterminada estaria relacionado ao aumento da expressão de quimiocinas com perfil inflamatório, antiinflamatório ou regulatório, contribuindo para recrutamento de células T regulatórias para o miocárdio durante as fases aguda e crônica da doença (Guedes et al 2010). Considerando estes
antecedentes, o presente trabalho avaliou a eficácia do tratamento específico com Bz sobre a resposta imune celular em cães infectados por cepas do T.cruzi com diferentes
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2 - Justificativa
Durante a infecção pelo T. cruzi ocorre uma dinâmica interação
parasito-hospedeiro envolvendo múltiplos fatores que atuam na patogênese da doença de Chagas, alguns inerentes ao parasito, tais como carga parasitária e genética do parasito influenciando o tropismo, a virulência e a patogenicidade para o hospedeiro. Devem ser considerados, também, aqueles relacionados ao hospedeiro, como idade, sexo e a constituição genética, que irão determinar a formação e a atuação do sistema imunológico.
Entretanto, apesar de intensamente estudada, a patogênese da doença de Chagas ainda não é completamente entendida, os mecanismos imunopatológicos que promovem as lesões nos tecidos não estão ainda bem elucidados. Trabalhos mais recentes vêm apontando no sentido de que o parasito tenha participação ativa na patogênese da cardiopatia chagásica crônica. Considerando os estudos que apontam à importância da presença do parasito na progressão da doença de Chagas crônica e os resultados controversos sobre o benefício do tratamento especifico com Bz na evolução da cardiopatia chagásica crônica, é de grande importância a realização de estudos experimentais para a avaliação do efeito do tratamento com Bz na resposta imune e na progressão das alterações cardíacas de animais inoculados com cepas do parasito resistentes a este fármaco.
Neste trabalho foi investigado as conseqüências da utilização do Bz nos casos de falha terapêutica, nos casos de cura parasitológica, assim como a sua influência sobre o sistema imune de um hospedeiro, devido aos estudos controversos realizados em humanos sobre o benefício do tratamento. Neste trabalho foi acompanhada a progressão das alterações eletrocardiográficas causadas pelo T. cruzi, desde a infecção até a
instalação da fase crônica da doença, em cães tratados com Bz, comparativamente aos animais infectados e não tratados.
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fase. Reproduz também as formas crônica indeterminada e cardíaca da doença. Os trabalhos do nosso grupo no modelo canino para doença de Chagas têm mostrado que estes animais desenvolvem manifestações clínicas, resposta imune e resposta ao tratamento específico que são idênticas a aquelas observadas em humanos. Desta forma, este estudo avaliou a eficácia do tratamento específico com Bz na prevenção de lesões cardíacas, na alteração da resposta imune e na evolução clínica dos animais tratados com Bz, comparativamente a animais não tratados inoculados com as mesmas cepas do
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3 - Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Avaliar a influência do tratamento específico com Benznidazol (Bz) na evolução da cardiopatia chagásica, utilizando como modelo experimental cães infectados por cepas do parasito sensíveis e resistentes a esse fármaco.
3.2 Objetivos específicos
i Avaliar a evolução clínica dos animais infectados por diferentes cepas do
T.cruzi, submetidos ou não ao tratamento específico, através da eletrocardiografia, tanto
na fase aguda quanto na fase crônica da doença de Chagas experimental;
ii Quantificar o infiltrado inflamatório e a área de fibrose no miocárdio de cães
infectados por diferentes cepas do T.cruzi, submetidos ao tratamento específico com Bz
comparativamente aos animais não tratados infectados pelas mesmas cepas;
iii Avaliar a cinética de Imunoglobulina G (IgG) e isotipos (IgG1 e IgG2), por
meio de imunoensaio enzimático (ELISA), nos soros de cães tratados com Bz, em relação aos animais controle infectados e não tratados;
iv Analisar a resposta imune celular por meio de linfoproliferação das células
mononucleares do sangue periférico (CMSP) em cães infectados por diferentes cepas do
T. cruzi, utilizando a citometria de fluxo;
vAvaliar a frequência de apoptose em CMSP de cães infectados por diferentes
cepas do T. cruzi, submetidos ou não ao tratamento específico com Bz durante a fase
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vi Avaliar as alterações no perfil da resposta imune celular induzidas pelo
tratamento específico com Bz através da dosagem das citocinas IFN-γ, IL-10, TNF-α, no
sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico através de ELISA;
vii Avaliar as alterações no perfil da expressão de RNAm das citocinas IFN-γ,
IL-10 e TNF-α induzidas pelo tratamento específico com Bz no tecido cardíaco de cães,
através da PCR em tempo real quantitativa;
viii Relacionar as alterações do padrão da resposta imune celular e humoral
com a intensidade da inflamação e fibrose no coração dos animais submetidos ao tratamento específico, comparativamente aos animais não tratados.
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4 - Animais, material e métodos
4.1 Cepas de Trypanosoma cruzi
i Cepa VL-10 - Foi isolada de paciente na forma indeterminada da doença de
Chagas no estado de Minas Gerais (Schlemper et al., 1982). Esta cepa é considerada
resistente ao tratamento com Bz (Filardi & Brener, 1987, Caldas et al., 2008) e segundo
novo consenso de nomenclatura (Zingales et al, 2009) classificada como pertencente ao
discrete typing units II (DTU II) (Moreno et al., 2010).
ii Cepa AAS - A cepa AAS (T.cruzi II) foi isolada de um caso de infecção aguda
em humano no estado de Minas Gerais. Considerada parcialmente resistente ao tratamento com Bz por Filardi & Brener, (1987), se mostrou resistente ao quimioterápico por Caldas et al., (2008).
iii Cepa Berenice-78 - Foi isolada por Lana & Chiari, (1986) de um caso humano no Brasil, esta cepa é considerada sensível à quimioterapia com Bz (Caldas et al., 2008) e pertence ao DTU II (Moreno et al., 2010).
4.2 Animais
Foram utilizados cães sem raça definida, obtidos e mantidos no Canil da Universidade Federal de Ouro Preto. Os animais foram alimentados com ração comercial para cães e água ad libitum. Antes de inclusão no estudo os animais foram tratados com
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4.3 Fármaco e esquema de tratamento
Neste projeto foi utilizado como quimioterápico o Benznidazol, um derivado 2-nitroimidazol (N–benzil–2–nitro-1- imidazolacetamida) - Roche. Os cães foram tratados com 7mg/kg de Bz/dia, durante 60 dias, divididos em duas doses diárias. O tratamento foi iniciado a partir do primeiro dia em que o animal apresentou parasitemia patente pelo exame de sangue a fresco.
4.4 Polimorfismo das formas tripomastigotas do Trypanosoma
cruzi
O polimorfismo das formas tripomastigotas sanguíneas foi realizado por meio de análise de sangue a fresco de camundongos Swiss infectados pelo T. cruzi durante o pico
de parasitemia da fase aguda da infecção, pelas cepas VL-10, AAS e Berenice-78. Foi realizada a coleta de 3l de sangue de vasos da ponta da cauda e contadas 200 formas tripomastigotas aleatoriamente em microscopia óptica (400x), classificando-as como fina, larga ou muito larga (Brener & Chiari, 1963).
4.5 Inoculação dos animais e confirmação da infecção
Foram inoculados com cada uma das cepas do T.cruzi, 20 cães. Os cães foram
inoculados aos 120 dias de idade, com 2.000 formas tripomastigotas sangüíneas/kg, via intraperitoneal. Os animais infectados foram divididos, aleatoriamente, em 2 grupos experimentais, sendo os animais do grupo 1 (n=10) tratados com Bz e os animais do grupo 2 (n=10) mantidos sem tratamento. A partir do 10o dia de inoculação foi coletado diariamente, sangue da veia marginal da orelha dos cães para a confirmação da infecção. Para a avaliação das lesões cardíacas a metade dos animais de cada grupo foi eutanasiada durante a fase aguda (imediatamente após o tratamento – aos 90 dias de infecção) e a outra metade durante a fase crônica (6 meses após o término do tratamento – aos 270 dias de infecção).
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apresentando exames de sangue a fresco persistentemente negativos foram submetidos à hemocultura para a confirmação da infecção.
4.6 Curva de parasitemia
A parasitemia dos cães foi avaliada diariamente, por meio de coleta de 5L de sangue da veia marginal da orelha e posteriormente, examinados ao microscópio para a detecção dos parasitos. A quantificação dos parasitos foi realizada de acordo com a técnica descrita por Brener (1962) até 10 dias após a negativação. As curvas representam as médias diárias dos parasitos quantificados, por exame de sangue a fresco, nos animais de cada grupo controle.
4.7 Avaliação de cura parasitológica após tratamento com
Benznidazol
Foi considerado curado todo animal que apresentou negativação dos testes parasitológicos/moleculares e sorológicos. Os testes parasitológicos/moleculares utilizados foram a hemocultura (Hc) e a PCR enquanto o teste sorológico foi o ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Assim, os animais com resultados da sorologia
positivos e resultados da Hc negativos foram submetidos à investigação da cura por PCR. Todos os animais que apresentaram resultados de Hc e PCR negativos foram considerados curados.
Os testes parasitológicos empregados neste projeto foram:
4.7.1 Hemocultura
O teste de hemocultura foi realizado imediatamente antes da eutanásia nos animais utilizados para os experimentos de fase aguda da infecção (90 dias) e nos cães que foram sacrificados na fase crônica, foi realizado um teste 30 dias e outro 6 meses após o tratamento. A técnica descrita por Chiari et al., (1989), com algumas
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foi desprezado e a camada leucocitária removida para outro tubo e suspensa em meio LIT. Posteriormente, as hemácias foram também suspensas em meio LIT e os tubos incubados em estufa a 28oC e homogeneizados uma vez por semana. Cada preparação foi examinada ao microscópio 30, 60, 90 e 120 dias depois de realizada a técnica, para a detecção dos parasitos.
4.7.2 Reação em Cadeia da Polimerase
Para a realização da reação em cadeia da polimerase (PCR), foi coletado sangue dos cães no primeiro e no sexto mês após o término do tratamento (animais necropsiados durante a fase crônica). Utilizou-se a técnica de PCR descrita por Britto et al., (1993) e
otimizada por Gomes et al., (1998). Foram coletados 10mL de sangue de cada cão, e
colocados em tubos com igual volume de Guanidina-HCl 6M/EDTA 0,2M (Sigma Chemical Company, USA) (Ávila et al., 1991). Essa mistura, sangue/guanidina/EDTA,
foi mantida à temperatura ambiente e após 15 dias fervida em banho-maria (Britto et al.,
1993). O lisado foi estocado à temperatura ambiente. A seguir, encontra-se a descrição sucinta de cada etapa desta reação:
a) Extração do DNA -Foi utilizada a técnica proposta por Sambrook et al., (1989)
com algumas modificações realizadas por Gomes et al.,(1998). Alíquotas do lisado de
sangue foram transferidas para tubos de microcentrífuga, sendo em seguida desproteinizado com igual volume de fenol-clorofórmio. A mistura foi homogeneizada lentamente e centrifugada. O sobrenadante foi retirado e ao sedimento foram adicionados H2O milli-Q estéril e novamente centrifugado. Em seguida, a fase aquosa foi purificada com clorofórmio e o DNA presente nessa fase precipitado com dois volumes de etanol absoluto gelado e 10mM de acetato de sódio em banho de gelo. Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e após a volatilização do etanol, o DNA obtido ressuspendido em água milli-Q estéril e estocado a 4oC.
b) Amplificação específica do T. cruzi - As reações de amplificação continham
Tris-HCl, Triton X-100, MgCl2, KCl, os diversos dNTP’s (Pharmacia Biotech), a Taq DNA polimerase (Invitrogen), e cada iniciador [S35(5’AAATAATGTACGGG (T/G) GAGATGCATGA3’) e 36 (5’GGGTTCGATTGGGGTTGGTGT3’) (OPERON
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amplificação em termociclador automático (MinCycler TM). As condições da reação foram: desnaturação do DNA a 95ºC, anelamento dos iniciadores a 65º C e extensão a 72º C. As etapas de extração do DNA e a mistura da reação da PCR foram monitoradas com controles negativos (amostras de sangue de cães não infectados) e positivos (cães infectados na fase aguda da infecção). Além disso, para evitar contaminações, cada etapa da reação foi realizada em ambientes separados, utilizando reagentes e equipamentos destinados exclusivamente para cada uma das etapas.
c) Detecção dos produtos da PCR - Os produtos amplificados pela PCR foram visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida e revelados pela prata (Santos et
al., 1993). O tamanho das bandas amplificadas foi monitorado pela utilização de
marcador de peso molecular. Após a eletroforese, o gel foi fixado em solução de etanol e ácido acético, sob agitação. Em seguida esta solução foi desprezada e o gel foi corado com uma solução de nitrato de prata sob agitação. Posteriormente, o gel foi lavado e revelado em solução de NaOH e formaldeído, com agitação até o aparecimento das bandas. Novamente o gel foi transferido para a solução fixadora e fotografado para documentação.
4.7.3 Ensaio imunoenzimático
i- Dosagem de IgG total e subclasses IgG1 e IgG2:
Foram coletados, aproximadamente 5mL de sangue dos cães, através da veia femural. As amostras de sangue foram centrifugadas e o sobrenadante (soro) foi coletado e armazenado em tubos eppendorf a -20ºC. As coletas de sangue dos cães foram feitas antes da inoculação, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 dias de infecção e no dia da necropsia nos cães utilizados para realização dos experimentos de fase crônica e até a coleta de 90 dias nos que foram eutanasiados na fase aguda da infecção. Foram utilizados antígenos da forma epimastigota da cepa Y do T. cruzi, obtidos de cultivo acelular em
meio LIT. Como conjugado foram utilizadas anti-imunoglobulinas de cão da classe IgG marcadas com peroxidase (Bethyl Laboratories, Montgomery, USA).
O ELISA foi realizado segundo a metodologia descrita por Voller et al., (1976),
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antigênico de epimastigotas, na concentração definida previamente por titulação em bloco, diluído em solução tampão carbonato. As placas foram incubadas a 4oC por 18h e após este intervalo de tempo foram bloqueadas com PBS + SFB e incubadas a 37ºC. A próxima etapa consistiu na adição de soro de cada animal, e incubação a 37ºC.
Posteriormente foi adicionado o conjugado, diluído em PBS-Tween, conforme titulação prévia, e as placas foram novamente incubadas a 37ºC. Finalmente, foi adicionada a solução de substrato (O-fenilenodiamino-OPD, solução de ácido cítrico e H202) e posteriormente a reação foi interrompida com a adição de ácido sulfúrico. A leitura foi realizada em leitor de microplaca (BIO RAD, Modelo 3550) com filtro de 490nm. Em cada placa foram adicionados 10 soros controles negativos e quatro controles positivos. A absorbância discriminante, em cada placa, foi calculada tomando-se a média da absorbância dos 10 soros negativos somados a dois desvios padrões. Posteriormente foi calculado o índice de reatividade, dividindo o valor da absorbância de cada amostra encontrada pela absorbância discriminante, sendo os valores encontrados entre 0.9 e 1.1 considerados duvidosos, valores abaixo de 0.9, negativos e acima de 1.1, considerados positivos.
ii- Dosagem das citocinas IFN-γ, TNF-α e IL-10:
Os ensaios imunoenzimáticos de ELISA sanduiche foram realizados utilizando-se
o sobrenadante da cultura de células mononucleares do sangue periférico dos cães infectados ou não pelo T. cruzi. Para o procedimento do ensaio foram utilizados kits para
detecção das citocinas IFN-γ, TNF-α e IL-10 (R&D Systems Inc, Minneapolis, USA) Para a sensibilização das microplacas de 96 poços foi adicionado 100L/poço dos anticorpos monoclonais anti-IFN-γ (Cat: MAB781) IL-10 (Cat: MAB7351) e anti-TNF-α (Cat: MAB1507), usando diferentes diluições em PBS, segundo especificações do fabricante. As placas foram incubadas over-night à temperatura ambiente para
sensibilização. Posteriormente, as placas foram lavadas três vezes com o PBS com 0,05%
Tween. Em seguida, as placas foram secas com o auxílio de papel toalha e posteriormente
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amostras e dos padrões IFN-γ recombinante (Cat: 781-CG), TNF-α recombinante (Cat: 1507-CT-025) e IL-10 recombinante (Cat: 735-CL-010), da R&D Systems Inc,
Minneapolis, USA. Após 2 horas de incubação foram realizados mais três procedimentos de lavagem e adicionados 100L dos anticorpos biotinilados de detecção anti IFN-γ (BAF781), anti-TNF-α (Cat: BAF1507) e anti-IL-10 (Cat: BAF735) usando diferentes diluições em PBS, pH 7,4 com 1% de albumina bovina e incubadas durante 2h a temperatura ambiente, seguindo-se três procedimentos de lavagem. Em seguida foram adicionados 100L/poço de estreptoavidina HRP (Cat: DY998, R&D Systems Inc,
Minneapolis, USA) em diluição de 1:200 em PBS com 1% de albumina bovina, e
posterior incubação a temperatura ambiente durante 20min. As placas foram novamente lavadas, e adicionado 100L da solução substrato por poço (mistura diluída 1:1 de peróxido de hidrogênio e tetrametilbenzidina – Cat: DY999/R&D Systems Inc,
Minneapolis, USA), seguido de incubação por 20-30min em temperatura ambiente. A reação foi interrompida acrescentando 50L de H2SO4 1M por poço. A densidade óptica foi determinada utilizando leitor de microplacas com filtro de 450m. A quantificação das citocinas presentes nas amostras foi determinada baseada na densidade óptica obtida com a curva padrão de concentrações conhecidas das citocinas, analisadas pelo software
SOFTmax PRO 4.0.
4.8 Eletrocardiografia para avaliação funcional do miocárdio
Para a realização do eletrocardiograma (ECG), os cães foram anestesiados com tiopental (15 mg/kg de peso corporal) por via endovenosa. O eletrocardiógrafo utilizado foi do modelo ECG 06, ECAFIX-FUNBEC, São Paulo Brasil. A padronização foi de 1mV/cm e velocidade de 50 mm/seg. Os eletrodos foram adaptados em agulhas 25x7 mm que foram introduzidas na pele dos animais durante o exame. Sempre foram registradas as derivações periféricas (DI, DII, DIII, aVR, aVL e aVF) e as precordiais V10, CV5RL, CV6RL e CV6LU. As leituras e interpretações foram feitas por um especialista que não conhecia a situação clínica dos cães.
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4.9 Teste
“
in vitro
”
de proliferação e avaliação do índice apoptótico
de células mononucleares do sangue periférico
Foram realizadas imunofenotipagens das células mononucleares do sangue periférico (CMSP) dos cães experimentalmente infectados no momento antes da infecção, 45 dias e 90 dias após inoculação, utilizando marcadores de superfície celular para as subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+) em células CMSP submetidas à cultura.
Para a obtenção das CMSP foram colhidos 15mL de sangue estéril, adicionado 10mL de RPMI acrescido de 100µL de heparina sódica, sendo, em seguida adicionado
Ficoll Hipaque (1:1). Após centrifugação a 1800rpm por 40 minutos a 4oC, o anel de
células foi retirado e transferido para tubo falcon contendo 15mL de RPMI heparinizado que foi centrifugado a 1500 rpm por 10minutos a 4oC, sendo as células ressuspendidas em 2ml de meio RPMI e contadas em câmara de Neubauer para ajuste da concentração para 107 células por mL.
Após o ajuste da concentração, foi retirado 400µL da suspensão de células e foi adicionado 400µL de solução de CFSE à 5µM (Vybrant® CFDA SE Cell Tracer Kit), e
os tubos foram incubados no escuro por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação foi acrescentado RPMI (1:1) suplementado com 10% de soro fetal bovino e foi aguardado 5 minutos para bloqueio da reação, com os tubos mantidos no gelo e protegidos da luz. A suspensão celular foi lavada 3 vezes em meio MEM, usando centrifugação a 1300rpm por 5 minutos a 4oC e a seguir as células foram ressuspendidas com 400µL de RPMI.
A avaliação da capacidade proliferativa (índice de estimulação) foi realizada em micro-placas de 96 poços. Em cada poço foi acrescentado 25µl de células ressuspendidas (250.000 células) em 175µl de meio CTCM acrescido de 20% SFB. As células colhidas de cada animal foram colocadas em oito poços, dois poços com células não marcadas com CFSE, dois com células marcadas e não estimuladas, dois com células marcadas e estimuladas com 25µl Concanavalina-A (80µg/ml) e dois com células marcadas e estimuladas com 25µl de antígeno de T. cruzi (4x107 tripomastigotas/ml).
A leitura das amostras foi realizada no citômetro de fluxo modelo FACSCallibur
(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, U.S.A.), através do
