Teste “in vitro” de proliferação e avaliação do índice apoptótico de células mononucleares do sangue periférico

Foram realizadas imunofenotipagens das células mononucleares do sangue periférico (CMSP) dos cães experimentalmente infectados no momento antes da infecção, 45 dias e 90 dias após inoculação, utilizando marcadores de superfície celular para as subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+) em células CMSP submetidas à cultura.

Para a obtenção das CMSP foram colhidos 15mL de sangue estéril, adicionado 10mL de RPMI acrescido de 100µL de heparina sódica, sendo, em seguida adicionado

Ficoll Hipaque (1:1). Após centrifugação a 1800rpm por 40 minutos a 4oC, o anel de

células foi retirado e transferido para tubo falcon contendo 15mL de RPMI heparinizado que foi centrifugado a 1500 rpm por 10minutos a 4oC, sendo as células ressuspendidas em 2ml de meio RPMI e contadas em câmara de Neubauer para ajuste da concentração para 107 células por mL.

Após o ajuste da concentração, foi retirado 400µL da suspensão de células e foi adicionado 400µL de solução de CFSE à 5µM (Vybrant® CFDA SE Cell Tracer Kit), e os tubos foram incubados no escuro por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação foi acrescentado RPMI (1:1) suplementado com 10% de soro fetal bovino e foi aguardado 5 minutos para bloqueio da reação, com os tubos mantidos no gelo e protegidos da luz. A suspensão celular foi lavada 3 vezes em meio MEM, usando centrifugação a 1300rpm por 5 minutos a 4oC e a seguir as células foram ressuspendidas com 400µL de RPMI.

A avaliação da capacidade proliferativa (índice de estimulação) foi realizada em micro-placas de 96 poços. Em cada poço foi acrescentado 25µl de células ressuspendidas (250.000 células) em 175µl de meio CTCM acrescido de 20% SFB. As células colhidas de cada animal foram colocadas em oito poços, dois poços com células não marcadas com CFSE, dois com células marcadas e não estimuladas, dois com células marcadas e estimuladas com 25µl Concanavalina-A (80µg/ml) e dois com células marcadas e estimuladas com 25µl de antígeno de T. cruzi (4x107 tripomastigotas/ml).

A leitura das amostras foi realizada no citômetro de fluxo modelo FACSCallibur

(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, U.S.A.), através do

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para tubo falcon 2054 e os poços da placa foram lavados com 200µL de PBS gelado, para total transferência das células. Posteriormente foi adicionado 100µl de solução de EDTA (20mM), e foi incubado por 10 minutos (temperatura ambiente). A seguir foram adicionados 3 mL de PBS-W, e após homogeneização em vórtex os tubos foram centrifugados a 1600rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi vertido, os tubos foram secos suavemente e o pellet foi dividido em dois tubos para marcação com 5µl dos anticorpos monoclonais Rat Anti Dog CD8:Alexa Fluor® 647 e Rat Anti Dog CD4:Alexa

Fluor® 647 que foram adicionados diretamente ao pellet. Posteriormente os tubos foram

incubados por 30 minutos ao abrigo da luz, adicionado 2 mL de PBS-W e homogeneizado em vórtex, para seguir serem centrifugados a 1600rpm por 10 minutos. Posteriormente o sobrenadante foi descartado, adicionado 150µL de solução de fixação MFF e realizada a leitura de 20000 eventos no citômetro de fluxo.

A avaliação do índice apoptótico das células mononucleares do sangue periférico foi realizada utilizando o Kit ApoTarget™ Annexin-V FITC Apoptosis, da Invitrogen. A anexina V, disponibilizada neste kit, detecta células apoptóticas em decorrência de sua ligação preferencial a fosfolipídeos negativamente carregados, principalmente a fosfatidilserina exposta no início do processo apoptótico. As células foram incubadas em micro-placas de 48 poços. Em cada poço foram acrescentados 50µl de células ressuspendidas (500.000 células) em meio CTCM acrescido de 20% de SFB. As células de cada cão foram colocadas em três poços, um de células puras, um de células estimuladas com antígeno de T. cruzi (4x107 tripomastigotas/ml), e um poço suplementado com o tóxico Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) na concentração de 25nM, para ser usado como controle positivo de apoptose.

A leitura no citômetro de fluxo foi realizada após 48 horas de cultivo. As células foram colhidas e transferidas para tubo falcon 2054, sendo os poços lavados com 1000µL de PBS pH 7,2 gelado. Posteriormente os tubos foram submetidos a uma centrifugação a 1200rpm por 7 minutos a 18oC, em seguida vertidos e secos suavemente em papel toalha, sendo o pellet dividido em dois tubos para adição de 5µl do anticorpo monoclonal Rat Anti Dog CD8:Alexa Fluor® 647 em um deles e Rat Anti Dog

CD4:Alexa Fluor® 647 no outro. Os tubos ficaram incubados por 30 minutos e em

seguida foi adicionado 2,0 mL de PBS pH 7,2 gelado e os tubos submetidos a nova centrifugação a 1200rpm por 7 minutos. Em seguida o sobrenadante foi vertido e foi

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adicionado 50µL Anexin binding buffer (fornecido no kit), 2µL de anexina e 4µL de iodeto de propídio diretamente ao pellet de cada tubo, que ficou incubado por 15 minutos ao abrigo da luz e em temperatura ambiente. Após este período, foi adicionado 250µL de

Anexin binding buffer e os tubos foram lidos em no máximo 1 hora no citômetro de

fluxo.

A aquisição e a subseqüente análise dos dados foram realizadas utilizando o programa específico FlowJo, A figura 1 ilustra a estratégia empregada para as análises por citometria de fluxo. Primeiramente, gráficos de distribuição pontual foram construídos pela combinação dos parâmetros de tamanho e complexidade celular (FSC x SSC) e a população de interesse, que se constituiu de linfócitos, foi selecionada dentro da região R (figura 1A e 1C).

Em seguida, os eventos selecionados nesta região foram representados em gráficos de distribuição pontual construídos com combinações de diferentes fluorescências (FL), por exemplo, FL1/CFSE versus FL4/Anti-CD4:Alexa Fluor® 647. Esses gráficos foram então, divididos em quatro quadrantes (Q1 a Q4) e as freqüências dos eventos observados em cada quadrante foram determinadas pelo programa FlowJo.

Nas análises dos dados dos experimentos de proliferação celular, a reatividade da população total de CMSP, ou seja, a freqüência das células que incorporaram CFSE, foi calculada pela soma dos quadrantes Q1 e Q3 (figura 1B), já que as células que apresentam menores fluorescências são as células proliferadas, tendo em vista que a cada geração celular metade do CFSE permanece em cada célula-filha. Em seguida, a reatividade foi determinada utilizando a seguinte abordagem: o percentual de linfócitos reativos nas populações específicas das células estimuladas com o antígeno de T.cruzi foi dividido pelo percentual de linfócitos reativos nas populações específicas das células não estimuladas, portanto, dividindo o Q1 do estimulado pelo Q1 do não estimulado.

Para análise da apoptose de linfócitos T CD4+ e T CD8+, foi construído um gráfico FL1:Anexina-V versus FL4:CD4 Alexafluor 647 ou FL1:Anexina-V versus FL4:CD8 Alexafluor 647, onde foi possível identificar em Q5 os linfócitos T CD4+ (ou T CD8+) que não estavam em apoptose e em Q6 os marcados pela anexina-V e portanto apoptóticos. (figura 1D)

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Figura 1 - Passos realizados para a análise dos dados por citometria de fluxo. A) e C)

Distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade celular (SSC) demonstrando a população de linfócitos contida na região R; B) Distribuição pontual de FL1/CFSE versus FL4/Anti-CD4:Alexa Fluor® 647, demonstrando diferentes populações celulares contidas nos quatro quadrantes: Q1: linfócitos T CD4+ _{proliferado, Q2: linfócito T CD4}+ _{não proliferado, Q3:}

outras populações linfocitárias proliferadas e Q4: outras populações linfocitárias não proliferadas e D) Distribuição pontual de FL1:Anexina V versus FL4:Anti-CD4:Alexa Fluor® 647.

A cultura de CMSP para a dosagem de citocinas (IFN-γ, IL-10 e TNF-α,) foi realizada em placas de 48 poços. Para cada cão dois poços foram estimulados com antígeno de T. cruzi (4x107 tripomastigotas/ml) e dois poços permaneceram sem estímulo. Em cada poço foi acrescentado 50µl das células a 107 células/mL (500.000 células) ressuspendidas em meio CTCM suplementado com 20% de SFB. O

A

D

C

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sobrenadante foi coletado após 24 e 72 horas de cultivo e congelado a -80oC até a realização do teste de dosagem de citocinas.