EFEITO DA ANGIOTENSINA-(1-7) LIVRE OU INCORPORADA À CICLODEXTRINA E DO ANÁLOGO NÃO PEPTÍTICO AVE-0991 SOBRE A EREÇÃO PENIANA DE RATOS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS - CIPHARMA

KAMILA FELIPE BATISTA

EFEITO DA ANGIOTENSINA-(1-7) LIVRE OU INCORPORADA À

CICLODEXTRINA E DO ANÁLOGO NÃO PEPTÍTICO AVE-0991

SOBRE A EREÇÃO PENIANA DE RATOS

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KAMILA FELIPE BATISTA

EFEITO DA ANGIOTENSINA-(1-7) LIVRE OU INCORPORADA À

CICLODEXTRINA E DO ANÁLOGO NÃO PEPTÍTICO AVE-0991

SOBRE A EREÇÃO PENIANA DE RATOS

OURO PRETO - MG - BRASIL 2012

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Romulo Leite

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KAMILA FELIPE BATISTA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Romulo Leite

Co-orientadora: Dra. Andrea Grabe Guimarães Colaboradora: Dra. Gisele Vieira Rodovalho

Área de Concentração: Fármacos, medicamentos e vacinas

Linha de Pesquisa:Química e Farmacologia de substâncias bioativas

Data da defesa: 11/12/2012

Resultado: __________________________________.

BANCA EXAMINADORA:

Profa. Dra. Andrea Alzamora ________________________________________ Depto. de Ciências Biológicas - ICEB - UFOP

Prof. Dr. Sérgio Henrique Souza Santos _______________________________ Depto. de Farmacologia - ICB - UFMG

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AGRADECIMENTOS

Nenhum trabalho é construído sozinho, por isso gostaria de dizer MUITO OBRIGADA!

Obrigada a todos que participaram comigo na realização do meu mestrado. A contribuição de vocês foi fundamental para conclusão desse grande desafio. A convivência com cada um de vocês foi uma experiência gratificante para o meu crescimento.

Meu agradecimento à Deus por ser minha luz, meu protetor e meu guia. À Nossa Senhora, minha intercessora.

À minha mãe, por ter compartilhado comigo todos os momentos desta jornada, ter compreendido minhas ausências e ter memotivado a superar cada etapa deste trabalho. A você o meu amor eterno. Você também é co-autora deste trabalho!

Aos meus irmãos Karem, Karime e Felipe pelo apoio, torcida e incentivo. A vocês um grande beijo.

A minha família, em especial, aos meus tios Araci e José Eustáquio pelo exemplo de fé e determinação. A vocês o meu carinho.

Ao prof. Dr. Romulo Leite pela oportunidade, competência, entusiasmo e incansável paciência na orientação deste trabalho. “Mestre é aquele capaz de problematizar seu aluno fazendo-o despertar suas respostas”. A você devo este ensinamento e minha eterna gratidão.

A Dra. Gisele Rodovalho que demonstrou ser grande amiga e excepcional colaboradora com suas questões desafiadoras e provocativas que engrandeceram este trabalho. A você o meu carinho.

A Danielle, Eduardo, Mariana pela agradável amizade construída e contribuições efetivas neste trabalho. A vocês o meu afeto.

A Shiara e Carol Schuwartz que se fizeram presentes pela valiosa cumplicidade, singularidade, sensibilidade e amizade fraternal.

A Elba, Ivana, Renata, Carola, Simone, Suzana, Kakau e Wânia pelo indescritível companheirismo e alegria dos momentos vividos.

Ana Paula e Carina pela partilha nos momentos de anseio e pela presença confortadora.

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técnico.

Aos amigos do Laboratório de Farmacologia Experimental (CiPharma) Nívea, Priscila Gomes, Gabriela Sousa, Carolina Lício, Alessandra, Ana Carolina Moreira, Walace, Cinthia, Hebert, Luan pelo convívio e ensinamentos.

Às professoras Dra. Andrea Grabe-Guimarães e Dra. Neila Barcelos e demais professores do CiPharma pelos ensinamentos.

Ao Sr Wilson, a Mirela e aos demais funcionários do CiPharma pela convivência.

Aos amigos do Centro de Ciência Animal (CCA), em especial Érika, Lílian, Lorena e Luciana, pela compreensão e por sempre favorecerem na realização dos meus experimentos.

Ao professor Dr. Homero N. Guimarães pela manutenção técnica nos equipamentos.

A todas as Instituições que possibilitaram a realização deste trabalho:

− CNPq pela concessão da bolsa de estudos,

− Fapemig pelo suporte financeiro ao projeto,

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“Sem a curiosidade que me move, que me inquieta, que me insere na busca não aprendo, nem ensino.”

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RESUMO

A ereção peniana é resultado da complexa interação nervosa central e periférica que induz mudanças nos tecidos eréteis penianos. O mecanismo da ereção inicia com o aumento da atividade parassimpática com liberação de neurotransmissores vasodilatadores levando ao relaxamento do músculo liso peniano e arteriolar. Esse relaxamento permite um aumento do influxo sanguíneo peniano e da pressão intracarvernosa e consequente rigidez peniana. O NO é o principal neurotransmissor vasodilatador responsável pela dilatação peniana. Dados anteriores do nosso grupo mostraram que o peptídeo Ang-(1-7) apresenta efeito pró-erétil devido a vasodilatação do tecido peniano com liberação do NO. Este estudo tem como objetivo comparar o efeito pró-erétil da Ang-(1-7) livre, da Ang-(1-7) incorporada à ciclodextrina

[HPβCD/Ang-(1-7)] e de seu análogo não-peptídico AVE 0991. Visa ainda

avaliar a participação do receptor Mas, por meio de bloqueio competitivo com o peptídeo A-779 em ratos Wistar machos de 270-300g. Para isso foram utilizadas duas metodologias: a avaliação da resposta erétil, em ratos conscientes, através do modelo de ereção induzido por apomorfina e avaliação do índice de ereção induzidos por estimulação ganglionar em ratos anestesiados. Em ratos conscientes, a Ang-(1-7) livre administrada subcutâneamente, além de induzir a resposta erétil, na dose de 400 pmol/kg, foi capaz de facilitar a ereção induzida por apomorfina na dose de 300 pmol/kg. Em ratos anestesiados a Ang-(1-7) também foi capaz de facilitar a ereção induzida por estimulação ganglionar quando administrada subcutaneamente (300 pmol/kg) e quando infudida intracavernosamente (15 pmol/kg/min). A administração prévia (6h) de Ang-(1-7) incorporada à ciclodextrina

[HPβCD/Ang-(1-7)], administrada por via oral, induziu a ereção em ratos

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potencializar a ereção no modelo de ratos conscientes e no modelo de ratos anestesiados. A administração subcutânea do antagonista seletivo do receptor Mas, o A-779, bloqueou a indução e facilitação da ereção pela Ang-(1-7) e a facilitação da ereção pelo composto AVE 0991 em ratos conscientes demonstrando a participação do receptor Mas na resposta erétil. Assim, os resultados obtidos evidenciam que Ang-(1-7) livre, HPβCD/Ang-(1-7) e o análogo não-peptítico AVE-0991 são capazes de potencializar a ereção peniana através da ativação do receptor Mas, confirmando o potencial da manipulação do eixo ECA2/Ang-(1-7)/receptor Mas para o tratamento de disfunção erétil.

Palavras-chaves:

Angiotensina-(1-7),

HPβCD/Ang-(1-7),

AVE 0991, A-779

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ABSTRACT

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stimulation, indicating the involvement of different signaling pathways in a dose dependent manner. The nonpeptide Ang-(1-7) analog, the AVE 0991 compound, administered via gavage 1h before the tests, was able to potentiate the erectile response in both conscious and anesthetized animals. Subcutaneous administration of the selective competitive antagonist of the Mas receptor, the A-779 peptide, completely blocked the erection induced by Ang-(1-7) and the facilitation of erectile response induced by Ang-(1-Ang-(1-7). It also blocked the facilitation of the erection induced by AVE 0991 in conscious rats. These data demonstrates the involvement of the Mas receptor in the erectile response induced by Ang-(1-7) and AVE 0991. Altogether, our results provide evidence that free Ang-(1-7), HPβCD/Ang-(1-7) and the compound AVE-0991 are able to improve the penile erection through activation of the Mas receptor, confirming the potential of the manipulation of the axes ACE2/Ang-(1-7)/receptor Mas for the treatment of erectile dysfunction.

Keywords:

Angiotensin-(1-7) HPβCD/Ang-(1-7) AVE 0991

A-779

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Representação esquemática da estrutura peniana... 21

Figura 2 Representação esquemática da neuroanatomia peniana... 22

Figura 3 Representação esquemática do mecanismo da ereção peniana... 23

Figura 4 Representação esquemática da ativação e inibição dos neurônios ocitocinérgicos nas hipotalâmicas e extra-hipotalâmica... 25

Figura 5 Repesentação esquemática do mecanismo molecular do relaxamento do músculo liso peniano... 30

Figura 6 Representação das vias de formação da Ang II e Ang-(1-7)... 32

Figura 7 Representação esquemática da estrutura funcional da CD... 37

Figura 8 Representação esquemática do modelo usado para avaliação da função erétil em ratos conscientes... 42

Figura 9 Esquema anatômico da linha do nervo cavernoso e localização do GPM... 43

Figura 10 Esquema do modelo usado para a avaliação da função erétil em ratos anestesiados... 44

Figura 11 Representação do monitoramento da pressão intracavernosa (PI), das pressões arteriais sistólica e diastólica, da pressão arterial média com voltagens contínuas e crescentes de rato visualizado pelo software Windaq... 45

Figura 12 Fluxograma da avaliação do efeito pró-erétil do grupo controle, da Ang-(1-7) livre, de HPβCD/Ang-(1-7), de AVE 0991 e da participação do receptor Mas pelo bloqueio com o antagonista peptídico, o composto A-779, sobre a resposta erétil de ratos... 48

Figura 13 Protocolo experimental da avaliação do efeito pró-erétil da Ang-(1-7) livre administrada S.C. sobre a resposta erétil de ratos conscientes; administrada I.C. sobre a resposta erétil de ratos anestesiados e administrada S.C. sobre a resposta erétil de ratos anestesiados... 49

Figura 14

Figura 15

Protocolo experimental da avaliação do efeito pró-erétil de

HPβCD/Ang-(1-7) sobre a resposta erétil em ratos conscientes em

ratos anestesiados...

Protocolo experimental da avaliação do efeito pró-erétil do AVE 0991 livre sobre a resposta erétil de ratos conscientes e de ratos anestesiados...

50

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Figura 16

Figura 17

Protocolo experimental da avaliação da participação do receptor Mas pelo bloqueio com o antagonista peptídico, o composto A-779, em ratos conscientes...,,,,,,,,...

Efeito da Ang-(1-7), administrada por via S.C., nas doses de 200, 300 e 400 pmol/kg sobre a resposta erétil de animais conscientes administração de apomorfina S.C...

51

53

Figura 18 Efeito da Ang-(1-7), administrada por via S.C., sobre a resposta erétil induzida por apomorfina em ratos conscientes... 54

Figura 19 Figura 20 Figura 21 Figura 22 Figura 23 Figura 24 Figura 25 Figura 26 Figura 27 Figura 28 Figura 29

Efeito da infusão intracavernosa de Ang-(1-7) sobre a resposta erétil induzida por estimulação ganglionar em ratos anestesiados...

Efeito da administração subcutânea de Ang-(1-7) sobre a resposta erétil induzida por estimulação ganglionar em ratos anestesiados...

Efeito da administração oral (gavagem) de HPβCD/Ang-(1-7) sobre

a resposta erétil induzida pela apomorfina em ratos conscientes...

Efeito da administração oral de 3,67 nmol/kg de HPβCD/Ang-(1-7) sobre a resposta erétil induzida por estimulação ganglionar em ratos anestesiados...

Efeito da administração oral de 33,4 nmol/kg de HPβCD/Ang-(1-7) sobre a resposta erétil induzida por estimulação ganglionar em ratos anestesiados...

Efeito da administração oral (gavagem) de AVE 0991 sobre a resposta erétil induzida pela apomorfina em ratos conscientes...

Efeito da administração oral de AVE 0991 sobre a resposta erétil induzida por estimulação ganglionar em ratos anestesiados...

Efeito da administração subcutânea do A-779 sobre a resposta erétil induzida pela Ang-(1-7) em ratos conscientes...

Efeito da administração subcutânea do A-779 sobre a facilitação da resposta erétil induzida pela Ang-(1-7) em ratos conscientes tratados com apomorfina...

Efeito da administração subcutânea de A-779 sobre o efeito facilitador da resposta erétil induzida por apomorfina na presença do composto AVE 0991 em ratos conscientes...

Comparação das curvas estímulo-resposta obtidas a partir da estimulação do GPM em ratos anestesiados...

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LISTA DE ABREVIATURAS

A-779: antagonista do receptor Mas [D-Ala7_{-Ang-(1-7)] ou (}

H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-D-Ala-OH) ACh: acetilcolina

AMPc: monofosfato de adenosina cíclico Ang: angiotensina

AT1: subtipo 1 do receptor para Angiotensina II

AT2: subtipo 2 do receptor para Angiotensina II

ATP: trifosfato de adenosina

AVE 0991: agonista do receptor Mas Ca2+: íons cálcio

CCA: Centro de ciência animal CD: ciclodextrina

CEUA: comitê de ética para o uso de animais

CGRP: peptídeo relacionado ao gene da calcitonina DAG: diacilglicerol

DE: disfunção erétil

ECA: enzima conversora de angiotensina

ECA2: isoforma 2 da enzima conversora de angiotensina eNOS ou NOS3: óxido nítrico sintase endotelial

EP: ereção peniana

GCs: guanilato ciclase solúvel

GMPc: monofosfato de guanosina cíclico GPM: gânglio pélvico maior

iNOS ou NOS2: óxido nítrico sintase induzível iPDE5: inibidores da fosfodiesterase do tipo 5 I.M.: intramuscular

I.P.: intraperitoneal IP3: trifosfato de inositol

L-NAME: NG-nitro- L -arginina metil éster L-NMMA: L-NG-monometil citrato de arginina

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NANC: não-adrenérgico não-colinérgico NEP: endopeptidase neutra

NOS: óxido nítrico sintase

nNOS ou NOS1: óxido nítrico sintase neuronal NO: óxido nítrico

NPY: neuropeptídeo Y

PAD: pressão arterial diastólica PAM: pressão arterial média PAS: pressão arterial sistólica PDE5: fosfodiesterase do tipo 5 PCP: prolil-carboxipeptidase PEP: prolil-endopeptidase PIC: pressão intracavernosa

PI3K-AKT: fosfatidilinositol-3-quinase

PKA: proteína quinase dependente de AMPc PKG: proteína quinase dependente de GMPc PG: prostaglandina

PVN: núcleo para-ventricular

RNAm: ácido ribonucléico mensageiro ROS: espécies reativas de oxigênio S.C.: subcutânea

SNC: sistema nervoso central

SNP: sistema nervoso parassimpático SNS: sistema nervoso simpático SRA: Sistema Renina Angiotensina TOP: “Thimet-oligopeptidase”

UFOP: Universidade Federal de Ouro Preto VIP: peptídeo intestinal vasoativo

V.O.: via oral

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ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO... 18

1.1 Ereção Peniana... 18

1.2 Anatomia e fisiologia da ereção peniana... 20

1.3 Regulação central da ereção peniana... 24

1.4 Regulação periférica da ereção peniana... 26

1.5 Efeito da Ang-(1-7) sobre a ereção peniana... 31

1.6 Administração da Ang-(1-7) incorporada à β-ciclodextrina ... 36

2 OBJETIVO... 39

2.1 Objetivos específicos... 39

3 METODOLOGIA... 41

3.1 Fármacos e Reagentes... 41

3.2 Animais... 41

3.3 Modelo de estudo da resposta erétil induzida por apomorfina em ratos conscientes... 41

3.4 3.5 Modelo de estudo da resposta erétil induzida por estimulação ganglionar em ratos conscientes... Protocolos experimentais... 43 48 3.6 Análise estatística... 51

4 RESULTADOS... 52 4.1

4.2

4.3

4.4

Avaliação do efeito pró-erétil da Ang-(1-7) livre sobre a resposta erétil em ratos conscientes e anestesiados... Avaliação do efeito pró-erétil do composto de inclusão HPβ CD/Ang-(1-7) sobre a resposta de erétil em ratos conscientes e ratos anestesiados. Avaliação do efeito pró-erétil do análogo não-peptídico da Ang-(1-7), o composto AVE 0991, sobre a resposta de erétil em ratos conscientes e ratos anestesiados erétil induzido por ang-(1-7) e AVE 0991 em ratos conscientes... Avaliação da participação do receptor Mas, pelo bloqueio com o

52

57

(17)

antagonista peptídico, o composto A-779, no efeito pró-erétil induzido por Ang-(1-7) e AVE 0991 em ratos conscientes... 64 4.5

Avaliação dos parâmetros e dos veículos usados para estudo da resposta erétil em ratos anestesiados... 67

5

5.1

5.2

5.3

5.4

5.5

DISCUSSÃO...

Redefinição e comparação dos parâmetros de estimulação ganglionar pélvica e dos veículos utilizados no estudo da resposta erétil em ratos anestesiados...

Avaliação do efeito pró-erétil da Ang-(1-7) livre em ratos conscientes e anestesiados... Avaliação do efeito pró-erétil da formulação de Ang-(1-7) incorporada em hidroxipropil-β-ciclodextrina [HPβCD/Ang-(1-7)] administrada por via oral... Avaliação do efeito pró-erétil do análogo não-peptídico da Ang-(1-7), o AVE 0991 administrado por via oral... Avaliação da participação do receptor Mas no efeito pro-erétil induzido pela Ang-(1-7) livre e pelo AVE 0991 em ratos conscientes...

69

71

75

77

80

6 SUMÁRIO E CONCLUSÕES... 82

(18)

Felipe-Batista, K.

1 INTRODUÇÃO

1.1 EREÇÃO PENIANA

A ereção peniana (EP) é uma resposta sexual controlada por fenômenos neurológicos e vasculares decorrentes de eventos bioquímicos coordenados que resultam em relaxamento da musculatura lisa peniana. Este fenômeno envolve uma complexa interação entre o sistema nervoso central (SNC) e estímulos locais. O processo erétil é iniciado por reflexos espinhais, através do recrutamento de impulsos aferentes penianos e por estímulos tátil, auditivo, visual, olfativo e imaginário (Andersson, 2001). O reflexo espinhal envolve vias eferentes autonômicos e somáticos sendo modulado por reflexos supra-espinhais através do processamento das informaçãos no hipotálamo. Perifericamente, o equilíbrio entre fatores contráteis e relaxantes no corpo cavernoso peniano controla o grau de contração do músculo liso determinando o estado funcional do pênis. Assim, uma alteração nesse sistema neurofisiológico ou na transdução intracelular dos sinais pode diminuir a resposta do tecido cavernoso causando a disfunção erétil (DE) (Moreland, 2000; Andersson, 2001).

A DE masculina é definida como a incapacidade do homem em atingir ou manter a EP com rigidez suficiente para permitir uma relação sexual satisfatória (National Institutes of Health Consensus Statement, (1992) comprometendo não só o seu bem-estar e a qualidade de vida do homem, mas também apresentando implicações nos relacionamentos conjugais e sociais (Aytac e cols., 2000).

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homens entre 18-40 e acima de 70 anos, foi observado que 46,2% dos homens entre 18 e 40 anos apresentaram algum grau de DE (31,5% mínima, 12,1% moderada, 2,6% impotência). Já para os homens acima de 70 anos 21,1% apresentaram disfunção erétil mínima, 35,1% moderada e 12,3% de disfunção severa (Moreira e cols., 2001; Moreira e cols., 2003). Além do envelhecimento,

a DE está associada a doenças crônicas e a vários fatores de risco (Aytac e cols., 2000; Moreira e cols., 2003).

De acordo com os fatores de risco, a DE pode ser classificada em disfunção de origem vascular (doença cardiovascular, hipertensão arterial,

diabettes melittus, dislipidemia, tabagismo, cirurgias pélvicas/retroperitoneais, radioterapia); neuronal (causas centrais: esclerose múltipla, acidente vascular

cerebral, tumores, doenças medulares, doença de Parkinson e causas periféricas: diabettes melittus, alcoolismo, uremia, polineuropatia, cirurgias pélvicas/retroperitoneais, radioterapia); hormonal (hipogonadismo, alterações

na tireóide, hiperprolactinemia, doença de Cushing); psicológica (estresse,

depressão, ansiedade generalizada) (Nicolosi e cols., 2003; Fazio e Brock,

2004; Dean e Lue, 2005); medicamentosa (anti-hipertensivos; antidepressivos;

antipiscicóticos anti-histamínicos), associada ao estilo de vida (alcoolismo,

tabagismo, drogas de abuso como cocaína, heroína, metadona) ou a

combinação desses fatores (Nicolosi e cols., 2003; Davies e Melman, 2008).

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1.2 ANATOMIA E FISIOLOGIA DA EREÇÃO PENIANA

O pênis humano é constituído por dois corpos cavernosos dispostos aos pares, na região dorsal, separados por um tecido conectivo e um corpo esponjoso, na região ventral, que reveste a uretra formando a glande peniana na porção distal. O corpo esponjoso é composto por tecidos muscular e conjuntivo envolvidos por uma membrana fascial na sua porção distal. O corpo esponjoso possui funções urinária e ejaculatória, enquanto os corpos cavernosos são responsáveis pelo processo de EP (Kandeel e cols., 2001;

Dean e Lue, 2005).

Os corpos cavernosos são formados por células musculares lisas e fibras elásticas interligadas numa matriz extracelular de colágeno que se organizam formando as trabéculas intercomunicantes. Os corpos cavernosos são revestidos por uma bainha fibrosa e compacta, a túnica albugínea, constituída por fibras de colágeno e de elastina, que confere grande rigidez, flexibilidade e resistência ao tecido peniano. Além disso, os corpos cavernosos são divididos por um septo perfurado e incompleto, que os permite funcionar como uma unidade. No interior dos corpos cavernosos, existem diversos espaços lacunares conhecidos como espaços sinusoidais revestidos por uma camada de células endoteliais. Nesses sinusóides estão localizados os nervos cavernosos e as artérias helicínias responsáveis pela transmissão dos estímulos nervosos e pelo suprimento sanguíneo peniano durante os processos de ereção e flacidez (Figura 1) (Christ e Lue, 2004; Dean e Lue, 2005).

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vasto plexo venoso até atingir a veia lateral circunflexa e a veia dorsal profunda. A veia dorsal profunda é responsável pelo retorno sanguíneo e flacidez peniana (Figura 1) (Christ e Lue, 2004; Fazio e Brock, 2004; Dean e Lue, 2005).

Figura 1 - Representação esquemática da estrutura peniana (Adaptado de Kandell e cols.,

2001; Fazio e Brock, 2004).

A inervação peniana é constituída por fibras nervosas autonômicas (vias simpáticas e parassimpáticas) e somáticas (vias sensoriais e motoras). A inervação simpática é originada do segmento tóraco-lombar (T11-L2) enquanto a inervação parassimpática é proveniente dos segmentos sacrais (S2-S4)

(Figura 2) (Steers, 2000; Argiolas e Melis 2005) . A inervação simpática descende pelo plexo pré-aórtico e pelas cadeias abdominais dos plexos hipogástricos superior e inferior. Na região pélvica, os ramos do plexo simpático comunicam com as fibras parassimpáticas formando os nervos cavernosos (Giuliano e cols., 1997; Stief, 2003). Os nervos pré-ganglionares

(22)

originada dos segmentos sacrais (S2-S4) e forma o nervo pudendo que é o responsável pela sensibilidade peniana, causando contração ou relaxamento dos músculos estriados extracorpóreos. Dessa forma, os estímulos sensitivos locais nos órgãos genitais são responsáveis pelas ereções reflexogênicas (Stief, 2003; Christ e Lue, 2004; Dean e Lue, 2005).

Figura 2 – Representação esquemática da neuroanatomia peniana (Adaptado de Steers,

2000).

(23)

(PIC) de 10-15 mmHg para 90-100 mmHg. Para maiores detalhes veja figura 3 (Steers, 2000; Christ e Lue, 2004,Morgentaler, 2004).

Figura 3 - Representação esquemática do mecanismo da ereção peniana (Adaptado de

Morgentaler, 2004).

(24)

1.3 REGULAÇÃO CENTRAL DA EREÇÃO PENIANA

A resposta erétil inicia-se com a ativação do sistema nervoso autônomo parassimpático (SNP) pelo estímulo sexual que pode ser de origem tátil, visual, olfatória, auditiva ou imaginária (Andersson, 2001). No hipotálamo, o núcleo paraventricular (PVN) e a área pré-óptica medial (MPOA) são as principais regiões supraespinhal envolvidas no controle e na modulação da ereção peniana. A MPOA reconhece os estímulos sensoriais dos centros cerebrais e coordena a motivação sexual dos reflexos genitais necessários à ereção, à atividade motora copulatória e à ejaculação. O PVN é o centro do processamento dos estímulos supra-espinhais pró-eréteis que recebe e integra as informações hormonais e sensoriais da MPOA e as envia diretamente para a medula espinhal através dos seus neurônios pré-motores. Nessas regiões, diversos neurotransmissores e neuropeptídeos estão envolvidos no controle central dos estímulos pró-eréteis (Andersson e Wagner, 1995; Andersson, 2001; Andersson, 2003; Christ e Lue, 2004).

A dopamina (DA) é um dos principais mediadores responsáveis pela neuromodulação central da função erétil. Os neurônios dopaminérgicos centrais envolvidos na modulação do processo erétil estão localizados, na região incerto-hipotalâmica com projeções para a MPOA e para o PVN (Chen e cols., 1999; Baskerville e Douglas, 2008). A área incerto-hipotalâmica é uma

região diencefálica localizada entre o hipotálamo medial e a zona incerta caracterizada neuroquimicamente pela presença de dopamina e do hormônio concentrador de melanina (Moore e Lookingland, 1995) Os receptores da dopamina são divididos em receptores da família D1, que compreendem os

subtipos D1 e D5, e receptores da família D2 que são os subtipos D2, D3 e D4

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de íons cálcio (Ca2+_{), ativação da enzima óxido nítrico sintase} _neuronal

(nNOS), que é expressa abundantemente nos neurônios ocitocinérgicos, e consequente produção de óxido nítrico (NO). O NO liberado é responsável pela ativação do neurônios ocitocinérgicos, por um mecanismo não identificado, que liberam a ocitocina, na medula espinal e em outras áreas extra-hipotalâmicas do cérebro, levando à ereção peniana (Argiolas e Melis 2005; Xiao e cols.,

2005).

Figura 4 - Representação esquemática da ativação e inibição dos neurônios ocitocinérgicos nas hipotalâmicas e extra-hipotalâmica (Adaptado de Argiolas e Melis, 2005)

Essa indução da ereção foi comprovada quando agonistas não-seletivos D2 e D3 (apomorfina e pramipexol), e agonista D4 (PD 168077) foram administrados diretamente no PVN ou por via sistêmica. Em contraposição, a injeção de antagonista de D2, no PVN, diminuiu a resposta erétil, o que não foi observado com a injeção de antagonistas de receptores D3 ou D4. Esses resultados indicam que o mecanismo da ereção é induzida principalmente via receptores D2 no PVN (Sanna e cols., 2011). A participação da DA na

regulação central da EP foi confirmada pela indução da ereção pelo agonista dopaminérgico não-seletivo, apomorfina, em ratos machos conscientes. A partir de então a administração da apomorfina por via subcutânea (S.C.), intraperitoneal (I.P.) ou intragástrica começou a ser utilizada como modelo farmacológico de indução da EP nessas espécies (Giuliano e Rampin, 2000).

(26)

neurônios ocitocinérgicos, como por exemplo a DA, ou pela autoativação nos receptores dos neurônios ocitocinérgicos no PVN. Esses neurônios conduzem estímulos através de seus terminais sinápticos para áreas extra-hipotalâmicas do cérebro e para a medula espinhal (Melis e Argiolas, 2011). Outro neurotransmissor responsável pela modulação central da resposta erétil é a 5-hidroxitriptamina (5-HT, serotonina) que participa inibindo ou facilitando a ereção dependendo da localização e da interação com os subtipos de receptores de 5-HT. Porém seu principal efeito é o controle inibitório dos reflexos sexuais. A ação central inibitória da noradrenalina (NA) na resposta erétil ainda não está bem estabelecida na literatura científica, sendo os estudos dos mecanismos noradrenérgicos supra-espinhais são ainda escassos. Além destes neuromediadores, também podemos citar o neurotransmissor, o ácido  -aminobutírico (GABA), encontrado em concentrações elevadas na MPOA, que inibe as vias envolvidas nos reflexo autonômico e somático durante a ereção (de Groat e Booth, 1993).

1.4 REGULAÇÃO PERIFÉRICA DA EREÇÃO PENIANA

O controle periférico da EP ocorre através da liberação dos moduladores responsáveis pelo relaxamento e pela contração da musculatura lisa vascular e cavernosal. Entre os neurotransmissores responsáveis pelo controle do tônus da musculatura lisa vascular e cavernosal estão os adrenérgicos, os colinérgicos e os não-adrenérgicos, não-colinérgicos (NANC). Os principais transmissores das fibras NANC são o NO, o peptídeo intestinal vasoativo (VIP), a substância P e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP). A intensidade da contração da musculatura lisa é resultante da atividade de fatores contráteis como a noradrenalina (NA) e fatores derivados do endotélio como a endotelina-1, a prostaglandina (PG) F2α e o tromboxano A2. Outro

(27)

A NA é o principal neurotransmissor periférico resposável pela contração do músculo liso dos vasos e dos corpos cavernosos penianos via estimulação dos seus receptores adrenérgicos α1e α2 (Krane e cols., 1989). Os receptores

adrenérgicos α1a, α1d, α2a e α2c estão localizados nas células musculares lisas

e nas arteríolas cavernosas enquanto os receptores α1b e α2b são expressos no

endotélio. Além da NA, as endotelinas também são responsáveis pela contração vascular ao interagir com seus receptores ET-1 no endotélio e no músculo liso cavernosal (Dai e cols., 2000). A interação da NA e das

endotelinas com seus receptores causam aumento nos níveis intracelulares de trifosfato de inositol (IP3) e de diacilglicerol (DAG), levando à liberação de Ca2+

do retículo sarcoplasmático, abertura dos canais de Ca2+ nas membranas das células musculares lisas e influxo de Ca2+ dos espaços extracelulares. O Ca2+ aumentado liga-se à calmodulina, alterando sua conformação e expondo seus sítios de ligação para a interação com a quinase da miosina de cadeia leve. Esta ativação catalisa a fosforilação da miosina de cadeia leve, provoca o cruzamento ao longo dos filamentos de actina e desenvolvimento de força. Além disso, a fosforilação ativa a miosina ATPase, que hidrolisa o trifosfato de adenosina (ATP) provendo energia para a contração muscular (Dean e Lue, 2005).

A contração do músculo liso cavernoso é resultante não só do aumento do Ca2+_{intracelular mas também da resposta de sensiblização ao Ca}2+_com

ativação da proteína monomérica RhoA. A RhoA ativa a enzima Rho-quinase que inibe a subunidade regulatória da cadeia leve de miosina fosfatase evitando a desfosforilação dos miofilamentos de actina e mantedo o tônus contrátil do músculo liso (Somlyo e Somlyo, 2000; Wang e cols., 2002).

Estudos demonstraram que a vasoconstrição do corpo cavernoso pela via RhoA/Rho-quinase é mediada pelos receptores ET-1 e α-adrenoceptor (Wingard e cols., 2003).

(28)

lisas e nas células endoteliais dos sinusóides cavernosos. Entre os receptores muscarínicos, expressos no corpo cavernoso humano, destacam-se o subtipo M2 no músculo liso cavernosal e o subtipo M3 localizado no endotélio (Traish e cols., 1995). O relaxamento induzido pela ACh é devido a inibição da liberação

dos fatores contráteis, como a NA, e/ou pela liberação de fatores relaxantes como o óxido nítrico (NO) (Ayajiki e cols., 2009). Assim, a ACh produz

tumescência peniana e ereção, por inibir a liberação de NA através da estimulação dos receptores muscarínicos nos terminais nervosos adrenérgicos e por, principalmente, promover a liberação de NO a partir das terminações nervosas nitrérgicas por meio da interação com receptores nicotínicos expressos nos corpos cavernosos (Bozkurt e cols., 2007; Ozturk Fincan e cols.,

2010). O VIP e o CGRP promovem o relaxamento do músculo liso dos corpos cavernosos via ativação da adenilato-ciclase/aumento dos níveis intracelulares de AMPc que reduz o tônus vasomotor do corpo cavernoso (Figura 5) (Kim e cols., 1996).

Durante o fluxo de cisalhamento do sangue peniano, outro mecanismo envolvido no relaxamento muscular liso cavernoso é a ativação da produção de PGE através de um mecanismo dependente da liberação de NO. A PGE sintetizada se liga aos seus receptores no músculo liso, aumentando os níveis intracelulares do segundo mensageiro, o AMPc, e potencializando o relaxamento do músculo liso, além de suprimir a longo prazo a indução de colágeno (Moreland e cols., 1995). O aumento na produção de colágeno leva à

fibrose dos tecidos penianos, o que reduz a elasticidade e a complacência peniana e compromete a distensão do tecido cavernoso e o processo erétil. Dentre os quatro tipos de receptores EP1, EP2, EP3 e EP4 para PGE expressos no tecido peniano, o EP2 e o EP4 estão acoplados à proteína Gs e são os responsáveis pelo aumento na síntese de AMP cíclico em tecidos ou células de músculo liso (Moreland e cols., 1995).

(29)

causada pelo fluxo sanguíneo pulsátil nos espaços sinusoidais do corpo cavernoso (Burnett e cols., 1995).

A enzima óxido nítrico sintase (NOS) converte o aminoácido L-arginina em NO e L-citrulina. A NOS está localizada, em humanos, nas estruturas pélvica e urogenital, nos tecidos neuronal, endotelial e epitelial. As três isoformas da NOS são neuronal (nNOS ou NOS1), induzível (iNOS ou NOS2) e endotelial (eNOS ou NOS3) sendo que a nNOS e a eNOS são as que participam do processo de ereção. Nos nervos cavernosos NANC, o NO é sintetizado a partir da ativação da nNOS, enquanto, no endotélio, as forças mecânicas causadas pelo fluxo sanguíneo são responsáveis pela estimulação da eNOS e liberação do NO. Assim, a nNOS, expressa nas fibras NANC dos corpos cavernosos, é a principal enzima responsável por facilitar o relaxamento dos corpos cavernosos e induzir o aumento do fluxo sanguíneo peniano, enquanto a eNOS, encontrada principalmente no endotélio vascular peniano, é responsável pela facilitação e manutenção da ereção peniana(Burnett, 2004).

O NO liberado ativa a enzima guanilato ciclase solúvel (GCs) presente no músculo liso das artérias e do tecido cavernoso catalisando a produção de GMPc a partir de GTP intracelular. O GMPc ativa a proteína quinase dependente de GMPc (PKG) que fosforila proteínas dos canais iônicos causando abertura dos canais de potássio (K+_{), hiperpolarização}_{da membrana}

da célula do músculo liso, inibição dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem, diminuição do influxo de Ca2+_{na célula muscular lisa trabecular além}

de aumentar a captação de Ca2+ _{pelo retículo sarcoplasmático. Esses efeitos}

(30)

Figura 5 - Repesentação esquemática do mecanismo molecular do relaxamento do músculo

liso peniano (Adaptado de Dean e Lue, 2005).

A Ang-(1-7) é considerado até o momento o principal peptídeo agiotensinérgico que facilita o processo da EP. O SRA é um sistema endócrino circulante responsável pelo equilíbrio hidroeletrolítico e cardiovascular, cujos efeitos cardiovasculares estão associados aos seus peptídeos circulantes e teciduais biologicamente ativos e à distribuição difusa dos receptores angiotensinérgicos (Basso e Terragno, 2001; Carey e Siragy, 2003; Silva e cols., 2007; Iusuf e cols., 2008). O equilíbrio hemodinâmico do SRA é devido

(31)

1.5 EFEITO DA ANG-(1-7) SOBRE A EREÇÃO PENIANA

A Ang-(1-7) é um peptídeo vasoativo formado pela conversão direta a partir da Ang I e pela hidrólise da Ang II. A formação da Ang-(1-7) ocorre a partir da Ang I é mediada por endopeptidases, tais como prolil-endopeptidase (PEP), em células endoteliais vasculares, endopeptidase neutra (NEP) na circulação ou no rim e “thimet-oligopeptidase” (TOP) em células do músculo liso vascular conforme ilustrado na figura 6 (Ferrario e cols., 1998; Schindler e cols., 2007).

A hidrólise da Ang II em Ang-(1-7) é mediada pela isoforma 2 da enzima

conversora de angiotensina (ECA2) além da PEP e da prolil-carboxipeptidase

(PCP). Porém a ECA2 é cerca de 10 e 60 vezes mais eficiente em formar a Ang-(1-7) que a PEP e a PCP, respectivamente. Além disso, a ECA2 apresenta uma afinidade 400 vezes maior pela Ang II que pela Ang I, realçando a importância da ECA2 na regulação do equilíbrio Ang-(1-7)/Ang II (Vickers e cols., 2002; Campbell e cols., 2004; Iusuf e cols., 2008). Esses dados estão de

acordo com estudos em corações isolados de ratos hipertensos, em que a ECA2 foi a principal enzima responsável pela formação da maior parte de Ang-(1-7) a partir da administração exógena de Ang II (Trask e Ferrario, 2007). As outras vias de formação da 7) são a partir da 9) ou da Ang-(1-12). A ECA2 catalisa a conversão de Ang I em Ang-(1-9) que é posteriormente metabolizada em Ang-(1-7) pela enzima conversora de angiotensina (ECA) ou pela NEP (Rice e cols., 2004), enquanto a Ang-(1-12) é proveniente

(32)

FIGURA 6 – Representação das vias de formação da Ang II e Ang-(1-7). ECA: enzima

conversora da angiotensina; Ang: angiotensina; AT1: receptor tipo 1 da Ang II; AT2: receptor

tipo 2 da Ang II; Mas: receptor acoplado à proteína G, codificado como Mas proto-oncogene, o qual medeia os efeitos da Ang-(1-7); AT17P7-s: receptor da Ang-(1-7) que é inibido pela

pro-Angiotensina-(1-7); PCP: prolil-carboxipeptidase; PEP: prolil-endopeptidase; NEP: neutral-endopeptidase; TOP: oligopeptidase; AMP: aminopeptidase (Fonte: adaptado de Santos e Ferreira 2007; Iusuf e cols., 2008, Popescu e cols., 2012).

A ECA é a principal enzima responsável pelo metabolismo da Ang-(1-7) levando à formação da Ang-(1-5). Isso foi confirmado com o aumento de 4 a 6 vezes nos níveis de Ang-(1-7) após administração crônica de inibidor da ECA, o lisinopril, em artérias mamárias de humanos (Yamada e cols., 1998). Outro

metabólito de degradação da Ang-(1-7) é a Ang-(3-7) encontrado nos rins. A Ang-(3-7) atua como potente agonista do receptor AT4, enquanto a Ang-(1-5)

inibe a ECA com a mesma potência que a Ang I. As ações da Ang-(1-5) não afetam a vasoconstrição induzida pela Ang II plasmática nos receptores AT1

(Chappell et al., 1998; Handa, 2000). A Ang-(1-7) foi um inibidor potente da conversão da Ang I em Ang II pela ACE, com nenhum efeito sobre as demais enzimas conversoras da Ang I (Roks e cols., 1999) Essa afinidade da

(33)

As ações Ang-(1-7) são vasodilatação, anti-hipertrofia, antifibrose e inibição da agregação plaquetária (Gironacci e cols., 2000; Sampaio e cols.,

2003; Walters e cols., 2005; Gironacci e cols., 2007). A resposta vasodilatadora

da Ang-(1-7) foi demonstrada em artérias coronárias de cães, em aorta e arteríolas renais de ratos e de coelhos. Tal vasodilatação é mediada por receptores situados no endotélio (Tallant e cols., 1997; Brosnihan e cols., 1998)

e é decorrente da produção de NO, como comprovado em anéis de aorta de humanos pré-contraídos com fenilefrina em que a Ang-(1-7) não foi capaz de causar relaxamento na presença do inibidor não-seletivo da NOS, o L-NG

monometil citrato de arginina (L-NMMA) (Roks e cols., 1999). Os mecanismos

propostos para explicar esse efeito vasodilatador da Ang-(1-7) são: estimulação das prostaglandinas vasodilatadoras ou do fator de relaxamento derivado do endotélio (EDRF); aumento na produção de NO e potencialização do efeito vasorrelaxante da bradicinina (Tallant e cols., 1997; Fernandes e cols., 2001;

Santos e cols., 2003a; Faria-Silva e cols., 2005). Os efeitos da Ang-(1-7)

devem-se à sua interação com o receptor Mas expresso predominantemente no cérebro, testículos e em níveis moderados no coração e rins dos mamíferos (Vickers, 2002; Paula e cols., 1995; Santos e cols., 2003b; Alenina e cols.,

2008). O receptor Mas apresenta sete domínios transmembrânicos e é acoplado à proteína G heterodimérica (GPCR). A sua principal via de sinalização é ativação da proteína G estimulatória com produção de NO, através da estimulação da enzima fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K-AKT) que leva à diminuição dasconcentrações de Ca2+_{intracelular e consequentemente}

relaxamento celular (Ferrario e cols., 1998; Santos e cols., 2003b; Sampaio e cols., 2007; Santos e Ferreira, 2007).

Além da vasodilatação os efeitos fibróticos, hipertróficos e anti-trombóticos da Ang-(1-7) mediados pelo receptor Mas são opostos aos efeitos da Ang II com estimulação do subtipo 1 do receptor para Ang II (AT1). Isso

evidencia que a Ang-(1-7) contrarregula as ações hemodinâmicas da Ang II (Gironacci e cols., 2000; Walters e cols., 2005; Gironacci e cols., 2007). O

receptor Mas também pode agir como um antagonista funcional do receptor AT1

(34)

Felipe-Batista, K. cols., 2001; Kostenis e cols., 2005).

A identificação do receptor Mas, em áreas relacionadas ao controle cardiovascular no SNC de ratos, demonstra a participação da Ang-(1-7) como neuromodulador principalmente nas áreas relacionadas com o controle reflexo da pressão arterial (PA) tais como no hipotálamo e no bulbo ventro-lateral e dorsomedial (Sampaio e cols., 2003; Becker, 2007). Estudos demonstraram

que Ang-(1-7) atua, no hipotálamo, exibindo efeito anti-hipertensivo por diminuir a liberação de NA (Gironacci e cols., 2004). Além disso, a microinjeção de

Ang-(1-7), na região caudal do bulbo ventro-lateral, induziu efeito hipotensor envolvendo uma via relacionada ao NO. Tais efeitos foram bloqueados pela microinjeção dos antagonistas do receptor da Ang-(1-7), o D-Ala7-Ang-(1-7) (A-779), e o D-Pro7-Ang-(1-7). Assim, esses resultados comprovam os efeitos centrais da Ang-(1-7) mediados por receptores sensíveis ao A-779 e ao D-Pro7 -Ang-(1-7) (Santos e Campagnole-Santos, 1994; Fontes e cols., 1997; Santos e cols., 2003a; Gironacci e cols., 2004).

No tecido cavernoso peniano, a Ang-(1-7) é responsável pelo relaxamento dependente do NO pela ativação dos receptores Mas em contraposição a Ang II que suprime a ereção peniana através da sua interação com receptores AT1 (Yousif e cols., 2007). O receptor Mas está localizado nas

células de músculo liso trabecular e arteriolar e nas células endoteliais do corpus cavernoso (da Costa Goncalves e cols., 2007). Estudos demonstraram

que a Ang-(1-7) induziu efeito vasodilatador dependente do endotélio em anéis de aorta de ratos Sprague-Dawley, sendo esse efeito inibido pela remoção do endotélioe pelo bloqueio da NOS por L-NAME. Além disso, o D-Pro7_-Ang-(1-7)

também foi capaz de abolir essa vasodilatação. Esses dados sugerem a existência de um subtipo do receptor Ang-(1-7 ) diferente do Mas (Silva e cols.,

2007).

Na avaliação da resposta erétil periférica, in vivo, a infusão de Ang-(1-7)

(35)

ratos hipertensos. Essa resposta facilitadora da Ang-(1-7) foi completamente abolida na presença do antagonista específico do receptor Mas, o A-779 (da Costa Goncalves e cols., 2007). Também foi observado que a deleção do

receptor Mas, em camundongos, além de comprometer severamente a resposta erétil favoreceu o desenvolvimento de fibrose no corpo cavernoso (Santos e cols., 1994; Santos e cols., 2003b; da Costa Goncalves e cols.,

2007). Além desses efeitos, estudos demonstraram que o A-779 também foi capaz de inibir a angiogênese e o efeito antitrombótico da Ang-(1-7) (Cardini e cols., 1988; Machado e cols., 2001). Somado a isso, a injeção do inibidor

inespecífico da NOS, o NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), no corpo

cavernoso, atenuou significativamente a resposta erétil. Atenuação essa que não pode ser revertida pela posterior administração intracavernosa de Ang-(1-7). Esses resultados confirmam a importância do NO como mediador da ereção no relaxamento dos tecidos cavenosos decorrente da interação da Ang-(1-7) com receptor Mas (da Costa Goncalves e cols., 2007).

A melhora da função endotelial, in vivo, pode ser observada também

pela ação do agonista não-peptídico do receptor Mas, o AVE 0991, através da facilitação da liberação de NO (Wiemer e cols., 2002). O efeito vasodilatador

dependente do endotélio causado pelo AVE 0991, em aorta de camundongos do tipo selvagem, foi abolido completamente não só com o bloqueio do receptor Mas mas também em camundongos com deleção genética do receptor Mas. Além disso, o AVE 0991 foi capaz de induzir melhora na função endotelial, in vivo, com a ativação da eNOS e liberação de NO endotélial.

Esses efeitos são explicados pela maior potência do AVE 0991 na liberação de NO em relação a Ang-(1-7). Além disso estudos demonstraram que o AVE 0991 foi capaz de gerar menores quantidades de superóxido (O2-) quando

comparado com Ang-(1-7). O O2-,sendo uma das espécies reativas de oxigênio

(ROS), contribui para o estresse oxidativo celular e favorece a disfunção endotelial e em paralelo a disfunção erétil. (Wiemer e cols., 2002). Esses

(36)

potente agonista do receptor Mas e possui ação vasodilatadora como a Ang-(1-7), apresentado um efeito facilitatório na ereção peniana. A administração, no corpo cavernoso, do AVE 0991 foi capaz de potencializar a resposta erétil através da ativação do receptor Mas e da liberação de NO (da Costa Gonçalves e cols., 2012). Dessa forma, o agonista não peptídico do receptor

Mas, o AVE 0991, apresenta um potencial para o desenvolvimento de novas terapias para tratamento da disfunção erétil de administração oral (da Costa Goncalves e cols., 2007; Sampaio e cols., 2007).

1.6 ADMINISTRAÇÃO DA ANG-(1-7) INCORPORADA À Β

-CICLODEXTRINA

A [hidroxipropil-β ciclodextrina/angiotensina-(1-7)], HPβCD/Ang-(1-7) é uma possibilidade inovadora desenvolvida a fim de beneficiar do potencial fisio-farmacológico da Ang-(1-7) através de uma forma mais viável de administração como a administração por via oral (Lula e cols., 2007). Esse sistema de

transporte forma um complexo com Ang-(1-7) aumentado sua estabilidade, biodisponibilidade, solubilidade aquosa e a taxa de dissolução, possibilitando uma terapia oral não-invasiva, facilmente reversível e bem tolerada pelo paciente (Hirayama e Uekama, 1999). A administração oral da Ang-(1-7) livre é limitada devido às condições desfavoráveis desse peptídeo como a degradação por enzimas digestivas estomacais e intestinais (Rubstein et al., 1997) além de possuir uma meia-vida de curta, cerca de 10-15 segundos (Yamada e cols., 1998).

(37)

vantagens das CDs é a capacidade de formar complexos de inclusão tanto no estado sólido quanto em solução, sendo que em ambos os casos as moléculas hóspedes ficam localizadas no interior da cavidade hidrófoba (Uekama, 2004; Salústio e cols., 2011).

As CDs não são hidrolisadas nem absorvidas no estômago ou no intestino delgado. Contudo, a microflora do cólon do intestino grosso quebra estes compostos em sacarídeos menores, entregando a molécula hóspede, no caso a Ang-(1-7), para ser absorvida. Assim , as CDs protegem as molécuas hóspedes de fornecendo quantidade necessária de fármaco para que ocorra absorção de maneira eficiente e precisa (Hirayama e Uekama, 1999; Lula e cols., 2007).

Os tipos de CDs atualmente disponíveis para utilização em produtos farmacêuticos são alfa (α) , beta (β) e gama (γ) CD, o metil (M), hidroxipropil (HP), e sulfobutil-éte. A β-CD, é a CD natural mais comum, apresentando 21 grupos hidroxila disponíveis para modificações estruturais (Thompson, 1997). A 2-hidroxipropil-β-CD (HPβCD) é um derivado de CD altamente hidrofílicos

utilizada para se obter uma formulação de liberação imediata, sendo facilmente dissolvido no trato gastrointestinal, melhorando dessa forma a biodisponibilidade oral de substâncias com baixa solubilidade em água, como a Ang-(1-7) (Hirayama e Uekama, 1999).

Figura 7 - Representação esquemática da estrutura funcional da CD (Hirayama e Uekama,

(38)

Estudo de Marques e cols. (2011) mostrou que a HPβCD/Ang-(1-7)

apresenta efeito antitrombótico, in vivo, em ratos hipertensos, confirmando a atividade biológica da Ang-(1-7) por via oral através da HPβCD/Ang-(1-7) (Fraga-Silva e cols., 2011). Esse efeito é explicado pelo aumento no nível

plasmático de Ang-(1-7) com consequente ativação do receptor Mas. Além disso, a HPβCD/Ang-(1-7) induziu efeitos cardioprotetores em modelos de insuficiência cardíaca. Esses efeitos estão de acordo com a ação cardioprotetora da Ang-(1-7) comprovando que a inclusão de Ang-(1-7) em HPβCD é eficaz para a administração desse peptídeo por via oral. Associado a isso, foi observado que o aumento da concentração plasmática de Ang-(1-7) ocorreu 6 horas após da administração oral HPβCD/Ang-(1-7) em comparação com as pequenas alterações observadas após a administração da forma livre do péptido. Diante desses estudos, a utilização das HPβCD como um nanocarreador de Ang-(1-7) viabiliza a administração por via oral desse peptídeo, apresentando a HPβCD/Ang-(1-7) como uma possível terapia por via oral (Marques e cols., 2011).

(39)

2 OBJETIVO

Comparar o efeito pró-erétil da Ang-(1-7) livre ou Ang-(1-7) incorporada à ciclodextrina [HPβCD/Ang-(1-7)] e de seu análogo não peptídico AVE 0991, administradas por diferentes vias no estudo de ereção em ratos conscientes e anestesiados. Ainda, avaliar a participação do receptor Mas na resposta erétil induzida pela Ang-(1-7) em ratos conscientes.

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

2.1.1 Redefinir e comparar os parâmetros de estimulação ganglionar pélvica e os veículos utilizados no estudo da resposta erétil em ratos anestesiados.

2.1.2 Avaliar o efeito pró-erétil da Ang-(1-7) livre administrada por diferentes vias em dois modelos de estudo da função erétil (modelo de ereção induzida por apomorfina em ratos conscientes e modelo de ereção induzida por estimulação ganglionar em ratos anestesiados).

2.1.3 Avaliar o efeito pró-erétil de uma formulação de Ang-(1-7) incorporada

em β-ciclodextrina [HPβCD/Ang-(1-7)] administrada por via oral nos

modelos de estudo da função erétil em ratos conscientes e ratos anestesiados.

(40)

(41)

3 METODOLOGIA

3.1 FÁRMACOS E REAGENTES

As drogas e os reagentes utilizados e os respectivos fornecedores foram ácido ascóbico (Proquimios - Brasil), A-779 (Bachem - EUA), Ang-(1-7) (Phoenix Pharmaceuticals - EUA), apomorfina (Sigma - EUA), AVE 0991 e

HPβCD/Ang-(1-7) (gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Robson Augusto Souza

Santos Laboratório de Hipertensão - ICB/UFMG - Brasil), cloreto de sódio (Proquimios - Brasil), Heparina (Hipolabor - Brasil), quetamina (Syntec -Brasil), Xilazina (Agener União - Brasil)

3.2 ANIMAIS

Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 270 e 300 gramas, provenientes do Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). Os animais foram mantidos sob ciclo de luz de 12 horas claro/12 horas escuro, recebendo água e ração (Nuvilabl®) ad libitum. Os protocolos experimentais realizados foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFOP (protocolo CEUA-UFOP no. 53/2010).

3.3 MODELO DE ESTUDO DA RESPOSTA ERÉTIL INDUZIDA POR

APOMORFINA EM RATOS CONSCIENTES

(42)

Este procedimento foi realizado em uma sala silenciosa com luz controlada. Inicialmente os ratos foram ambientalizados nas caixas por 30 minutos antes da realização dos experimentos. O número de ereções era contado a partir dos filmes obtidos para cada experimento. Uma ereção típica era considerada quando o rato se apoiava sobre as duas patas traseiras e se curvava em direção à área genital, segurando o pênis com as patas dianteiras lambendo-o por um tempo superior a 5 segundos. Esse tipo de resposta também foi acompanhada por bocejos e lambedura das patas e do abdômen (Rampin e cols., 2003; Hannan ecols., 2006).

Diferentes grupos receberam apomorfina, Ang-(1-7), A-779 ou respectivos veículos por via S.C. (na região dorsal) em volume aproximado de 0,1 mL/100g, de acordo com as concentrações definidas para cada substância. Outros grupos receberam AVE 0991, HPβCD/Ang-(1-7) ou respectivos veículos por V.O. (gavagem) em volume aproximado de 0,5 mL/100g, de acordo com as concentrações definidas para cada substância. O veículo para a solução de apomorfina era constituído de uma solução contendo NaCl (9 mg/mL) e ácido ascórbico (0,1 mg/mL). O veículo para a solução de AVE 0991 era constituído de uma solução 10 mM de KOH. O veículo para as soluções de HPβCD/Ang -(1-7) (soluções testes) eram soluções aquosas que continham apenas a

HPβCD em quantidades equivalentes às quantidades presentes nas soluções

testes.

(43)

3.4 MODELO DE ESTUDO DA RESPOSTA ERÉTIL INDUZIDA POR

ESTIMULAÇÃO GANGLIONAR EM RATOS ANESTESIADOS

Os ratos foram anestesiados com uma mistura de quetamina (100 mg/kg) e xilasina (14 mg/kg) por administração intraperitoneal (I.P.). A artéria femoral esquerda foi canulada com tubo de polietileno 10 (PE-10) (CLAY ADAMS) contendo salina heparinizada conectada a um transdutor de pressão TruWave (Edwards Lifescience - Canadá) para contínuo monitoramento da pressão arterial média (PAM). Os registros digitais foram obtidos por meio de um sistema de aquisição de dados WinDaq (DATAQ Instruments, EUA) e analisados por inspeção visual.

O pênis foi isolado e o corpo cavernoso foi canulado com o auxílio de uma agulha (30G) conectada a um tubo polietileno (PE-10). O tubo de PE-10 por sua vez foi conectado ao transdutor de pressão acoplado ao sistema de aquisição de dados para monitoramento de pressão intracavernosa (PIC). Para administração da substância teste, o corpo cavernoso contralateral também foi canulado sendo o tubo de polietileno conectado a uma micro-seringa de 100 µL (Hamilton, USA) acoplada a uma bomba de infusão (Razel E99, USA). Uma incisão na porção inferior direita da cavidade abdominal foi realizada para expor o gânglio pélvico maior (GPM). Um eletrodo bipolar de aço inoxidável foi posicionado no centro do GPM e conectado a um estimulador elétrico (Figuras 9 e 10) (Grass SD9 Quincy, MASS, EUA).

Figura 9 _–Esquema anatômico da linha do nervo cavernoso e localização do GPM (adaptado

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Figura 10 - Esquema do modelo usado para a avaliação da função erétil em ratos

anestesiados. Os ratos tiveram a pressão arterial média (PAM) e a pressão intracavernosa (PIC) monitoradas através de cânulas inseridas na artéria femoral e no corpo cavernoso, respectivamente. (Adaptado de Quinlan e cols., 1989)

Considerando dados anteriores de nosso grupo e dados publicados na literatura, os estímulos elétricos aplicados sobre o gânglio pélvico variaram de acordo com o protocolo. Nos dois primeiros protocolos, as voltagens foram mantidas fixas, em 3 ou 4 V, e as frequências foram crescentes (1, 2, 4, 8 e 12 Hz, duração de 30 segundos cada). No último protocolo, a frequência foi mantida fixa, em 12 Hz, e as voltagens crescentes (0.5; 0.75; 1.0; 1.2; 1.5; 2.0; 2.5; 3.0; 3.5; 4.0 V, duração de 30 segundos cada) (Dorrance e cols., 2002; da

Costa-Goncalves e cols., 2007). Durante a estimulação ganglionar, as

alterações da PIC e da PAM foram monitoradas continuamente por meio de um sistema de aquisição de dados DATAQ WinDaq® serial Acquisition version 2.63

(45)

Figura 11 - Representação do monitoramento da pressão intracavernosa (PI), das pressões arteriais (PA) sistólica e diastólica, da pressão arterial média (PAM) com voltagens (V) contínuas e crescentes de rato visualizado pelo software Windaq (experimento realizado pela autora).

(46)

A)

(47)

C)

(48)

E)

Figura 12 - Fluxograma da avaliação do efeito pró-erétil (A) grupo controle (B) da Ang-(1-7) livre (C) de HPβCD/Ang-(1-7), (D) de AVE 0991 e (E) da participação do receptor Mas pelo bloqueio com o antagonista peptídico, o composto A-779, sobre a resposta erétil de ratos.

3.5 PROTOCOLOS EXPERIMEMTAIS

(49)

B)

C)

Figura 13 - Protocolo experimental da avaliação do efeito pró-erétil da Ang-(1-7) livre (A) sobre a resposta erétil de ratos conscientes (B) administrada I.C., sobre a resposta erétil de ratos anestesiados e (C) administrada S.C., sobre a resposta erétil de ratos anestesiados.

(50)

B)

Figura14 - Protocolo experimental da avaliação do efeito pró-erétil de HPβCD/Ang-(1-7) sobre a resposta erétil (A) em ratos conscientes (B) em ratos anestesiados.

A)

B)

(51)

Figura 16 - Protocolo experimental da avaliação da participação do receptor Mas pelo bloqueio

com o antagonista peptídico, o composto A-779, em ratos conscientes.

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

(52)

4 RESULTADOS

4.1 AVALIAÇÃO DO EFEITO PRÓ-ERÉTIL DA ANG-(1-7) LIVRE SOBRE A RESPOSTA ERÉTIL EM RATOS CONSCIENTES E EM RATOS ANESTESIADOS.

Para avaliar o efeito pró-erétil da Ang-(1-7), administrada via S.C., em modelo de estudo da função erétil em ratos conscientes induzidos por apomorfina S.C. (255 nmol/kg), os ratos receberam injeção S.C. de salina (0,9 g/100 mL), veículo (salina contendo ácido ascórbico), 255 nmol/kg de apomorfina, 200, 300 ou 400 pmol/kg de Ang-(1-7) conforme a representação abaixo.

Os dados obtidos demonstram que a administração da apomorfina, S.C., aumentou o número de ereções quando comparado ao grupo veículo, confirmando a capacidade da apomorfina em induzir a resposta erétil em ratos conscientes. Associado a isso, foi observado presença de bocejos (dados não mostrados), que é um comportamento estereotipado para avaliar a ação da apomorfina nos receptores dompaminérgicos centrais (Argiolas and Melis, 1998).

(53)

Salin a

Veíc ulo

(salin a+ac

. asc órbi co) Apomo rfina 255 nmo l/kg An g-(1-7

) 200 pmo

l/kg

An g-(1-7

) 300 pmo

l/kg

An g-(1-7

) 400 pmo l/kg 0 1 2 3 4

*

**

n=9 n=10 n=10

**

*

n=8 n=8 n=8

Nú m er o d e E re çõ es /3 0m in

Figura 17 - Efeito da Ang-(1-7) administrada por via S.C. nas doses de 200, 300 e 400 pmol/kg sobre a resposta erétil de animais conscientes em comparação com a resposta observada pela ativação de vias dopaminérgicas através da administração subcutânea de apomorfina (255 nmol/Kg). Cada ponto representa a média ± EPM. Os asteriscos representam diferenças significativas (*) p<0,05, (**) p<0,01. (one-way ANOVA com comparação pós-teste de Bonferroni).

Para avaliar a dose de Ang-(1-7) necessária para a facilitação da ereção induzida pela apomorfina, os animais conscientes receberam injeção S.C. de veículo (salina + ácido ascórbico), 255 nmol/kg de apomorfina, e combinações de apomorfina com 200, 300 ou 400 pmol/kg de Ang-(1-7).

(54)

Felipe-Batista, K. Veíc ulo Apomo rfina 255 nmo l/kg An g-(1-7

) 200 pmo

l/kg + AP

O

An g-(1-7

) 300 pmo

l/kg + AP

O

An g-(1-7

) 400 pmo

l/kg + AP

O

0 1 2 3

4

*

n=10

**

n=10

*******

n=8 n=8 n=8 Nú m er o d e E re çõ es /3 0m in

Figura 18 - Efeito da Ang-(1-7) administrada S.C. sobre a resposta erétil induzida por apomorfina em ratos conscientes. Cada ponto representa a média ± EPM. Os asteriscos representam diferenças significativas (*) p<0,05, (**) p<0,01 e (***) p<0,001 (one-way ANOVA com comparação pós-teste de Bonferroni).

O grupo que recebeu a combinação de apomorfina e 300 pmol/kg Ang-(1-7) apresentou aumento no número de ereções em relação ao grupo que recebeu somente apomorfina. As combinações de apomorfina com as doses de 200 e 400 pmol/kg de Ang-(1-7) não apresentaram alterações no número de ereções quando comparadas aquelas apresentadas pelo grupo tratado apenas com apomorfina. Esses resultados demonstram que 300 pmol/kg de Ang-(1-7), administrada por via S.C., potencializa a ereção induzida pela apomorfina neste modelo de ereção em ratos conscientes (Figura 18).

(55)

realizada uma curva controle com infusão intracevernosa durante 3 minutos de de solução salina (NaCl 0,9 g/100 mL). Após 5 minutos do término da curva controle iniciou-se a infusão intracavernosa de 15 pmol/kg/min de Ang-(1-7). As curvas frequência-resposta com voltagem fixa em 3V ou 4V tiveram duração de 5,5 minutos, sendo 3 minutos de infusão antes e 2,5 minutos de infusão durante a estimulação ganglionar, enquanto a curvas curva de voltagem-reposta com frequência fixa em 12 Hz tiveram uma duração total de 8 minutos, sendo 3 minutos de infusão antes e 5,5 minutos de infusão durante a estimulação ganglionar.

0 2 4 6 8 10 12

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Controle (Salina) 3V (N=6) Ang-(1-7) 15 pmol/kg/min 3V (N=6)

** * * Frequência (Hz) PI C/ PA M A

0 2 4 6 8 10 12

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Controle (Salina) 4V (N=7) Ang-(1-7) 15 pmol/kg/min 4V (N=7)

Frequência (Hz) P IC /P A M B

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Controle (Salina) 12Hz (N=6) Ang-(1-7) 15 pmol/kg/min 12 Hz (N=6)

** ** ** * Voltagem (V) P IC /P A M C