ANÁLISE DE FITOPLÂNCTON

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ANÁLISE DE FITOPLÂNCTON

Exercício realizado na Agência Portuguesa do Ambiente, (APA)

Laboratório de Referência do Ambiente, (LRA)

ABRIL/MAIO 2011

LEONOR CABEÇADAS* e JOÃO FERREIRA**

* Agência Portuguesa do Ambiente, APA

** Instituto da Água, INAG

7 de Junho 2011, INAG

No âmbito de um Projecto de colaboração

INAG, APA e CIIMAR

Kirchneriella spp.

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Objectivos:

Realização de um Exercício com vista a comparar a variabilidade dos

resultados de uma análise quantitativa de Fitoplâncton entre os

participantes.

Delinear um procedimento comum a adoptar no próximo Exercício de

Comparação Interlaboratorial

(ECI) de fitoplâncton

de modo a

minimizar potenciais fontes de variabilidade nos resultados entre

participantes.

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Tabela 1. Participação de 12 representantes de 11 Entidades

• Foi preparada a amostra B –

Alvito, de Junho de 2010, em

triplicado .

• Três grupos de participantes.

Cada grupo analisou 1 dos

replicados.

• Tempo médio de análise da

amostra ± 3 horas.

Nome do

participante Instituição participante

Carla Gameiro Quimiteste – Engenharia e Tecnologia, S.A.

Cristina Costa AquaExam, Lda.

Elisa Pereira Nostoc – Laboratório de Investigação Biológica, Lda.

Leonor Cabeçadas Agência Portuguesa do Ambiente Manuel Carneiro Águas do Douro e Paiva, S.A. Micaela Vale CIIMAR – Universidade do Porto

Paulo Pereira Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge

Sérgio Paulino Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge

Sílvia Condinho Águas do Algarve, S.A.

Sónia Gonçalves Labelec – Estudos, Desenvolvimento e Actividades Laboratoriais, S.A.

Susana Nunes Laboratório da Água da Universidade de Évora

Vitor Gonçalves Direcção de Serviços dos Recursos Hídricos/Universidade dos Açores

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Para uma estimativa de contagem de fitoplâncton estatísticamente aceitável,

recomenda-se serem contadas pelo menos 50 unidades de cada um dos taxon

dominantes (células, colónias ou filamentos). A contagem total deve atingir os 500

indivíduos (Venrick, 1978).

A Tabela 2 e Figura 1 mostram a relação entre o nº de unidades contadas e a

precisão.

Considerando que o método de Utermöhl se baseia no pressuposto de que a

distribuição das células no fundo da câmara de sedimentação é a de Poisson, a

precisão é dada pela seguinte equação:

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Nº de células contadas L.C. ± (%) 1 200 2 141 3 116 4 100 5 89 6 82 7 76 8 71 9 67 10 63 15 52 20 45 25 40 40 32 50 28 75 23 100 20 200 14 400 10 500 9 700 8 1000 6 2000 5 5000 3

Tabela 2. Relação entre o nº de células contadas e o limite de confiança (L.C.), (para um nível

de confiança de 95% (Anderson & Thröndsen 2003).

0 50 100 150 200 250 0 100 200 300 400 500 600 700 800

L.C. ( %)

nº de células contadas

Para manter uma precisão aceitável (28%) é suficiente contar 50

unidades de cada um dos taxon dominantes . Para se obter uma

precisão de 10 a 9% a contagem total deve situar-se entre os 400

e os 500 indivíduos (Olrik et al., 1998).

Fig.1 Relação entre o nº de células contadas e o limite de

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A conversão das contagens de fitoplâncton para a respectiva concentração, C (densidade

/abundância ) num determinado volume de amostra (normalmente litro ou mililitro)

obtêm-se através da seguinte equação:

Onde:

C = Concentração (densidade/abundância) das espécies fitoplanctónicas (respectivamente

Células l

-1

_{e Células ml}

-1

₎

V = volume da câmara de contagem (ml)

A

t

= área total da câmara de contagem (mm

2

)

A

c

= área contada da câmara de contagem (mm

2

)

N = nº de células das espécies contadas

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Procedimento adoptado para todos os participantes, Método de Utermöhl,

NE 15204, 2006:

Fig. 2 –

Sedimentação, para evitar a formação de

bolhas de ar na câmara de sedimentação ** colocou-se ao lado uma caixa de Petri com água e ambas foram cobertas com caixa de plástico forrada com papel de filtro humedecido para manter a humidade.

Nota* = préviamente homogenizada durante 1 min.

3 - Área do fundo da câmara de

sedimentação = 491 mm

2

4 - Estratégia de contagem:

6 T em 200X – Área observada= 54 mm

2

(

11% da área do fundo da câmara

)

6 T em 400X – Área observada= 27 mm

2

(

6% da área do fundo da câmara

).

5 - Factores de conversão para o cálculo

da concentração de fitoplâncton em

número de células por litro:

6 T em 200X = 3795

6 T em 400X = 7506

1 – Sedimentação de uma alíquota*

da amostra B - Alvito Junho 2010 numa

câmara de sedimentação.

2 - Volume de amostra sedimentado **

= 2,4 ml

Nota** = câmara de sedimentação previamente calibrada por pesagem.

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6 - Os taxa seleccionados para contagem na ampliação de 200X foram

os seguintes:

•Aphanizomenon sp.– filamento (21 células/filamento) •Woronichinia spp.– colónia (128 células/colónia)

•Coelastrum reticulatum – coenobia > 20 µm (32 células/coenobium) •Chlorococcales coloniais – colónia > 20 µm (7 células/colónia)

•Closterium aciculare – célula solitária

•Closterium acutum var. variabile – célula solitária •Cosmarium spp.- célula solitária

•Staurastrum spp.– célula solitária •Cryptomonas obovata - célula solitária

7 - Os taxa seleccionados para a contagem na ampliação de 400X foram

os seguintes

:

•Merismopedia spp.– coenobia (4 células/coenobium)

•Coelastrum reticulatum – coenobia < 20 µm (16 células/coenobium) •Crucigenia spp.– coenobia (4 células/coenobium)

•Oocystis spp.– coenobia (4 células/ceoenobium) •Tetraedron spp.– célula solitária

•Chlorococcales não coloniais < 20 µm – célula solitária •Chlorococcales coloniais < 20 µm (5 células/colónia) •Cyclotella spp.– célula solitária

•Chroomonas acuta – célula solitária

•Nanofitoflagelados não identificados – célula solitária

Notas:

Para a espécie Coelastrum reticulatum distinguiram-se duas classes de tamanho (coenobium > 20 µm e coenobium < 20 µm) quantificadas cada uma delas em ampliações diferentes, respectivamente em 200X e 400X.

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Tabela 3

. Resultados obtidos

Fitoplâncton total, Nanoplâncton e Micro plâncton (cel/ml)

Participante FitoTotal Nano Micro Código (cel /ml) (cel/ml) (cel/ ml)

ELab11A01 59298 50883 8842 1ª semana ELab1102 59638 43820 15818 câmara 1 ELab1104 47951 37222 10728 n=5 ELab1108 58925 45817 13108 ELab1111 62700 50981 11719 ELab11A02 64093 53698 10801 2ª semana ELab1101* 59651 50869 8782 câmara 2 ELab1106 41302 30122 11180 n=6 ELab1110 33285 24845 8440 ELab1112# 51275 40175 11100 ELab1113 87395 76494 10865 ELab11A04 70131 60423 9708 3ª semana ELab1105& 106004 88578 18144 câmara 3 ELab1109** 73900 58262 18336 n=4 ELab11A04d 71434 59275 12144 Média 63132 51431 11981 SD 17842 16436 3138 CV% 28 32 26 N 15 15 15 Mediana 59651 50883 11100 Estratégia de contagem

Todos os Participantes Excepções

6T 200x * , & 2T 400x 6T 400x # 3T 400x

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Fig.3 – Resultados obtidos pelos participantes para a análise quantitativa de

Fitoplâncton Total e para as fracções respectivamente de nanofitoplâncton

e microfitoplâncton (cel/ml).

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 FitoTotal (cel/ml) Nano (cel/ml) Micro (cel/ml)

(cel/ml

)

(11)

Fig. 4 – Boxplots para resultados de Fitoplâncton total, Nanoplâncton e

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0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 FitoTotal (cel/ml) Média (cel/ml) (-3SD) (+3SD) (cel/ml)

Fig.5 – Resultados obtidos pelos participantes para a análise quantitativa de

Fitoplâncton Total (cel/ml). A média (63 132 cel/ml) e ± 3SD (9 607 e 116 651

cel/ml) são calculados com base nos resultados de todos os participantes.

Limite Superior de Controlo, LSC

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0 20000 40000 60000 80000 100000 120000

Fracção do Nanofitoplâncton (cel/ml) Nano (cel/ml)

Fig.6 - Resultados para a fracção de

nanofitoplâncton

(cel/ml).

Fig.7 – Boxplot para a fracção de

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0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 Meris* (cel/ml) Cret<20um** (cel/ml)

Fig.8 - Resultados para Merismopedia

spp. e Coelastrum reticulatum <20 µm

(cel/ml) (todos os participantes).

Tabela 4 - Teste-U não paramétrico

Mann-Whitney

Para resultados de Merismopedia spp. (cel/ml) em 2 transeptos 400X vs 6 transeptos 400X (todos os participantes). -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 200 400 600 800 1000 Merismopedia spp.

% desvio em relação `a média

*valores aproximados

As duas amostras não são significativamente diferentes (P>=0,05, bi-caudal).

Nº de células contadas

Fig.9 – Percentagem de desvio em

relação à média para contagens de

Merismopedia spp. (nºcélulas) em 2

transeptos em 400X (todos os

participantes).

n₁ n₂ U P (bi-caudal) P (uni-caudal) 15 11 87 0,838442 0,419221 normal aprox 0,815334* 0.407667* z = 0,23355

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Fig.10 - Coeficiente de variação (%) referente a cada um dos participantes na contagem

com a ampliação de 400X.

Fig. 11 - Coeficiente de variação (%) referente a cada um dos participantes na contagem

com a ampliação de 200X.

0 5 10 15 20 25 30 35

CV% (400X)

0 5 10 15 20 25 30

CV% (200X)

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CONCLUSÕES

O coeficiente de variação de 28% (n=15) observado para os resultados obtidos pelos

participantes no exercício de análise de fitoplâncton traduz uma variabilidade de

resultados controlada .

Procedimentos a adoptar no futuro exercício

1-Volume de sedimentação

Recomenda-se o uso simultâneo de 3 câmaras de sedimentação de diferentes volumes de

modo a permitir a escolha da mais adequada (ex. 25, 10 e 5 ml).

2-Estratégia de contagem

Células de dimensões elevadas (ex. Ceratium spp.), colónias (ex. Fragilaria spp., Microcystis spp.,

Tabellaria spp.), coenobia (ex. Coelastrum spp., Pediastrum spp., Woronichinia spp.) e

filamentos (ex. Anabaena spp., Aphanizomenon spp., Tribonema spp.) devem ser contados como

uma unidade taxonómica numa ampliação baixa (ex. 200X) em toda a câmara, metade da

câmara ou 6 transeptos, dependendo da abundância da amostra.

Caso seja adoptada uma contagem em meia câmara, esta deve ser feita contando sempre o 2º

transepto de modo a obter uma contagem distribuída por toda área do fundo da câmara e não

a área correspondente à metade superior ou inferior da câmara.

Células de pequenas dimensões (ex. células isoladas de Microcystis spp., Chroomonas spp.,

Plagioselmis spp., Tetraedron spp.), coenobia/colónias de pequenas dimensões (ex.

Merismopedia spp., Crucigenia spp.) devem ser contadas em ampliação elevada (ex. 400X) no

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R1479

Merismopedia tenuissima

Lemmermann

Célula: 0,6 – 2 µm

_R1476

_{Merismopedia minima}

_Beck

Célula: 0,5 – 0,6 µm

BIOVOLUME

ø=0,6 μm; V=0,113 μm

3

a) 5 000 cel/ml 0,001 mm

3

_/l

b) 50 000 cel/ml0,006 m

3

_/l

Fig. 12 – Exemplos da distribuição de Merismopedia spp. na amostra da Albufeira do Alvito

em Junho de 2010. Concentrações de biovolume de Merismopedia spp. calculadas

respectivamente para a) amostra original e b) amostra analisada no exercício de

Abril/Maio de 2011.

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REFERÊNCIAS

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Andersen, P & J. Throndsen, 2003. Estimating cell numbers. In Hallegraeff, G.M. Anderson D.M. & A.D. Cembella (eds) Manual on Harmful Marine Microalgae. Monogr. on Oceanogr. Method. no. 11. p.99-130. UNESCO Publishing, Paris.

•

Brierley, B. Carvalho, L. Davies, S. & J. Krokowski, 2007. Guidance on the quantitative analysis of phytoplanktocn in Freshwater samples. Phytoplankton Counting Guidance v1 2007 12 05.doc

http://nora.nerc.ac.uk/5654/1/Phytoplankton_Counting_Guidance_v1_2007_12_05.pdf

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NE 15204, 2006 - Water quality – Guidance standard on the enumeration of phytoplankton using inverted microscopy (Utermöhl technique).

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Hallegraeff, G.M., Andersen D.M. & A.D. Cembella (eds), 2003. Manual on Harmful Marine Microalgae. UNESCO Publishing, Paris, 793 pp.

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HELCOM, 2003. Manual for Marine Monitoring in the COMBINE Programme of HELCOM, ANNEX C-6: Phytoplankton Species composition, Abundance and Biomass, 12 pp.

•

INAG, 2009. Manual para a avaliação da qualidade biológica da água em lagos e albufeiras segundo a Directiva Quadro da Água. Protocolo de amostragem e análise para o Fitoplâncton. Ministério do Ambiente, do Ordenamento do Território e do Desenvolvimento Regional. Instituto da Água, I.P.

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Lund, J. W. G., Kipling, C. & E. D. Le Cren, 1958. The inverted microscope method of estimating algal numbers and statistical basis of estimation by counting. Hydrobiologia 11: 2, pp. 143-170.

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Olrik, K., Blomqvist P., Cronenberg G. & P. Eloranta, 1998. Methods for quantitative assessment of phytoplankton in freshwaters, part I. Naturvärdsverket, Svensk miljöövervakning, Rapport 4860.

•

Venrick, E.L., 1978. How many cells to count?. – In: Sournia (ed.). Phytoplankton manual. UNESCO Monogr. Oceanogr. Method. 6: 167-180.

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