Estudo comparativo dos efeitos de selantes
hemostáticos no reparo ósseo de tíbia de ratos
*Comparative study of the effects of hemostatic
sealants in the repair of rat tibias
NAIANA VIANA VIOLA1, LUCIANA PEREIRADA SILVA1, ANA MARIA MINARELLI-GASPAR2, ELENY BALDUCCI-ROSLINDO3
* Trabalho realizado no Departamento de Morfologia, na Disciplina de His-tologia e Embriologia da Faculdade de OdonHis-tologia da Universidade Esta-dual Paulista “Júlio Mesquita Filho” – UNESP – Araraquara (SP), Brasil. 1. Acadêmicas da Faculdade de Odontologia de Araraquara da Universidade
Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho” – UNESP – Araraquara (SP), Bra-sil.
2. Professora Doutora da Disciplina de Anatomia, do Departamento de Mor-fologia da Faculdade de Odontologia de Araraquara da Universidade Esta-dual Paulista “Júlio Mesquita Filho” – UNESP – Araraquara (SP), Brasil. 3. ProfessorAdjunto da Disciplina de Histologia e Embriologia, do
Departa-mento de Morfologia da Faculdade de Odontologia de Araraquara da Uni-versidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho” – UNESP – Araraquara (SP), Brasil.
Endereço para correspondência: Profa Dra Eleny Balducci Roslindo,
Departa-mento de Morfologia, Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP, Rua Humaitá, 1.680 – 14801-903 – Araraquara (SP), Brasil. Tel.: (16) 3301-6494. E-mail: eleny@foar.unesp.br
Recebido em 24/7/ 06. Aprovado para publicação em 20/4/07. Copyright RBO2007
RESUMO
Objetivo: Verificar por meio de análise histológica os efei-tos de agentes hemostáticos na reparação óssea, colocados em defeitos ósseos nas tíbias direita e esquerda de ratos jo-vens. Métodos: Foram utilizados 32 ratos machos (Holtzman). Após assepsia e anestesia, foi realizada incisão de 1cm em cada perna, expondo a região anterior da tíbia. Utilizando um micromotor e broca esférica, foram preparadas cavida-des, expondo a medula óssea, as quais foram irrigadas com ácido épsilon-aminocapróico (EACA) ou preenchidas com ge-latina absorvível Gelfoam. Nos períodos de sete, 14, 30, 45 dias, os animais foram sacrificados segundo o protocolo bio-ético, as tíbias removidas e fixadas em formol a 10% para inclusão em parafina e análise em microscopia de luz. Resul-tados: A análise dos cortes histológicos demonstrou que em todos os grupos (controle e tratados) os fenômenos biológicos
da reparação óssea estiveram presentes, com diferença ape-nas na cronologia. As reações da reparação óssea confirma-ram a biocompatibilidade dos materiais; o grupo tratado com Gelfoam apresentou discreta aceleração no processo de repa-ração tecidual em relação aos demais grupos, principalmen-te nos períodos de 14, 30 e 45 dias pós-cirurgia. O Gelfoam foi totalmente reabsorvido; a remoção dos agentes hemostáticos das lojas cirúrgicas acelera o processo de reparação tecidual. Conclusão: Em todos os grupos experimentais, a seqüência de fenômenos biológicos que compõem a reparação óssea es-teve presente, havendo diferença na cronologia. As reações apresentadas no reparo ósseo confirmaram a biocompatibi-lidade dos materiais. A remoção total dos agentes hemostáti-cos nas lojas cirúrgicas acelera o processo de reparação teci-dual.
Descritores – Regeneração óssea; Tíbia; Adesivo tecidual de fibrina; Osteogênese; Espuma de fibrina; Ratos; Estudos com-parativos
ABSTRACT
Objective: Make a histological analysis to check the effects of
difference being the time for their occurrence. Biocompatibility of the materials was confirmed by the reactions seen in bone repair. Removal of all hemostatic agents in surgical sites speeds up the tissue repair process.
Keywords – Bone regeneration; Tibia; Fibrin tissue adhesive; Osteogenesis; Fibrin foam; Rats; Comparative studies
INTRODUÇÃO
Materiais hemostáticos e/ ou antifibrinolíticos participam em geral do processo de formação do coágulo sanguíneo, que consiste na conversão da protrombina, na formação de fibrina e, finalmente, na retração do coágulo.
O sangramento pós-perfusão pode ser devido à deficiente hemostasia mecânica ou aos distúrbios da hemostasia, da coa-gulação ou da fibrinólise(1-3). Assim, após uma lesão, o orga-nismo depende da coagulação para estancar o sangramento e ajudar na cicatrização. Portanto, para que a coagulação ocor-ra normalmente, ela depende de proteínas do sangue chama-das fatores de coagulação. Se um desses fatores, como, por exemplo, o fator VIII (hemofilia A) ou o fator IX (hemofilia B), estiver em quantidade insuficiente no plasma sanguíneo, o sangramento pode persistir por tempo maior(4). Também foi observado que pacientes com mecanismo hemostático nor-mal podem apresentar hemorragia pós-cirurgia, decorrente de interferências no equilíbrio do sistema fibrinolítico(5).
Esse sistema desempenha papel fundamental na produção do sangramento pós-perfusão. Na tentativa de inibir a sua ocor-rência e a conseqüente tendência à hemorragia, foi preconiza-da por vários autores(1,6-7) a administração de agentes antifibri-nolíticos antes e durante a circulação extracorpórea.
Os selantes hemostáticos locais absorvíveis são substân-cias com propriedades hemostáticas que, quando colocadas sobre o local e imobilizadas por suturas ou simples compres-são, substituem o coágulo sanguíneo.
O ácido épsilon-aminocapróico (EACA) é um agente farma-cológico antifibrinolítico, derivado do aminoácido lisina, ob-tido por meio de síntese química, indicado na prevenção ou redução do sangramento pós-perfusão.
vor da hemostasia, pela proteção que oferece aos coágulos contra o processo fibrinolítico fisiológico.
O Gelfoam, esponja à base de gelatina, é insolúvel em água e biologicamente reabsorvível, promove o rompimento de pla-quetas e sustenta os fios de fibrina(9). Pode ser usado sozinho ou associado com a trombina, em cirurgias para controlar he-morragias excessivas(10). Diversos estudos têm demonstrado que inicialmente provoca uma reação inflamatória, mas sem efeitos deletérios de longa duração na formação óssea(11-13).
A necessidade de terapia de reposição em pacientes com alterações na coagulação pode ser reduzida por circuncisões ou com o uso de selantes de fibrinas(14). De outra maneira, os benefícios substanciais dos selantes de fibrina, relativamente seguros e de baixo custo, podem ser antecipados em um gru-po de pacientes com discrasia sanguínea(15).
Tendo em vista que agentes hemostáticos facilitam a for-mação do coágulo ou impedem sua destruição, este trabalho teve como objetivo estudar histologicamente os efeitos de se-lantes hemostáticos em tíbias de ratos no processo de reparo em defeitos ósseos, procurando observar a presença de célu-las inflamatórias, de fagocitose e a deposição de tecido ósseo. MÉTODOS
Foram utilizados 32 ratos (Rattus norvegicus albinus,
Holtz-man) provenientes do Biotério Central da UNESP de Arara-quara, com peso corporal em torno de 120g, os quais foram alimentados com ração granulada e água ad libitum e manti-dos em gaiolas individuais em ambiente climatizado. Para os procedimentos cirúrgicos, todos os animais foram anestesia-dos com injeção intramuscular de Ketamina® base e
expon-do a medula óssea, de maneira que ambas as tíbias recebes-sem cavidades.
Na tíbia direita a cavidade foi irrigada com solução a 5% de ácido épsilon-aminocapróico (EACA) durante cinco minutos. Em seguida, os retalhos foram rebatidos e as bordas da ferida suturada com fio de Vicryl® (Poligalactina 910, Johnson & Johnson).
Na tíbia esquerda a cavidade foi preenchida com o
Gel-foam® e, após a recolocação do retalho em posição, foi reali-zada a sutura como no membro direito.
No grupo controle os animais (12) passaram pelos mesmos procedimentos do tratado. As cavidades das tíbias foram irri-gadas com soro fisiológico e, em seguida, os retalhos das feri-das foram rebatidos e suturados, como os anteriores.
Os animais foram colocados em gaiolas de alumínio iso-ladas e sua recuperação foi acompanha diariamente. Para evitar qualquer desconforto como dor, foi administrado du-rante os primeiros dias o analgésico ácido acetilsalicílico, na dosagem de 120-300mg/kg em dose única por via oral, como recomendado pela Canadian Council on Animal Care
(CCAC).
Em grupos de cinco, os animais foram sacrificados aos sete, 14, 30 e 45 dias após o ato cirúrgico, segundo o protocolo bioético; as tíbias direita e esquerda foram seccionadas com tesoura de ponta romba. Após a remoção do excesso de teci-dos, as peças foram fixadas em formalina a 10% durante 72 horas e na seqüência foram descalcificadas em solução de citrato de sódio e ácido fórmico em partes iguais(13) e proces-sadas para inclusão em parafina. Para o estudo histológico foram realizados cortes semi-seriados com seis micrômetros de espessura e corados pela hematoxilina-eosina. Os cortes obtidos foram analisados e fotografados no fotomicroscópio
Jenaval (Zeiss®), pertencente à Disciplina de Histologia e Embriologia da UNESP.
Figura 1 – Grupo controle sete dias –
Defei-to ósseo preenchido por tecido coniuntivo e delgadas trabéculas ósseas. HE, 125x.
Figura 2 – Grupo controle 14 dias – O
de-feito apresenta tecido ósseo imaturo e amplos espaços medulares. HE, 125x.
Figura 3 – Grupo controle 30 dias – Defeito
ósseo preenchido parcialmente por tecido ósseo neoformado. HE, 125x.
Na análise dos resultados foi observada a presença de exu-dato, células inflamatórias e clásticas, neoformação de fibras colágenas, além de formação de tecido ósseo nas tíbias.
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Expe-rimentação Animal da Faculdade de Odontologia de Arara-quara – UNESP, em 17/11/2004.
RESULTADOS
A análise histológica mostra, nos defeitos ósseos das tíbias dos animais controle e tratados com EACA e Gelfoam®, pro-gressiva neoformação óssea no decorrer dos períodos de ob-servação.
Grupo controle (GC)
Aos sete dias, o tecido conjuntivo em formação está bastante celularizado, permeando pequenas e delgadas trabéculas ós-seas e raras células inflamatórias (figura 1). Aos 14 dias, o de-feito ósseo encontra-se parcialmente preenchido por tecido ós-seo imaturo, rodeando amplos espaços medulares (figura 2).
Aos 30 dias, no grupo controle o tecido neoformado com grau de maturação variado preenche o defeito ósseo, mos-trando que o processo de regeneração está quase completo (figura 3). Aos 45 dias, o tecido ósseo maturo, com espaços medulares definidos, ocupa o defeito ósseo na sua totalidade e a presença de periósteo mostra a regeneração total (figura 4).
Grupo tratado (GT)
Aos sete dias, o grupo com EACA apresenta o defeito ósseo preenchido parcialmente por delgadas trabéculas ósseas neo-formadas, imaturas, entre o tecido conjuntivo frouxo com ra-ras células inflamatórias. Nota-se a presença de algumas gotí-culas do material (figura 5).
Figura 4 – Grupo controle 45 dias – Defeito
ósseo preenchido por tecido ósseo matu-ro recoberto por periósteo. HE, 125x.
Figura 5 – Grupo EACA sete dias – Defeito
ósseo apresenta delgadas trabéculas ós-seas e raras células inflamatórias. HE, 125x.
Figura 6 – Grupo Gelfoam sete dias –
Pre-sença de material e delgadas trabéculas ósseas no fundo da cavidade. HE, 125x.
Figura 7 – Grupo EACA 14 dias – Tecido
ósseo neoformado permeando amplos es-paços medulares. HE, 125x.
Figura 8 – Grupo Gelfoam 14 dias –
Ausên-cia de material remanescente e tecido ós-seo imaturo com amplos espaços medula-res. HE, 125x.
Figura 9 – Grupo EACA 30 dias – Tecido
ósseo permeando espaços medulares am-plos e indefinidos. HE, 125x.
Figura 10 – Grupo Gelfoam 30 dias –
Teci-do ósseo com grau de maturação variaTeci-do. HE, 125x.
Figura 11 – Grupo EACA 45 dias – Tecido
ósseo maturo circundando espaços medu-lares definidos. HE, 125x.
Figura 12 – Grupo Gelfoam 45 dias –
Teci-do ósseo compacto. HE, 125x.
macrófagos. Na região mais profunda da cavidade nota-se a formação de trabéculas ósseas delgadas e imaturas (figura 6).
Aos 14 dias, o defeito ósseo no grupo EACA mostra-se par-cialmente preenchido por trabéculas ósseas mais espessas em relação ao período anterior. Alguns espaços medulares per-manecem amplos, indefinidos, enquanto outros encontram-se menores e definidos (figura 7).
No grupo do Gelfoam, aos 14 dias, nos espécimes que não apresentam material remanescente, ocorreu progressão de
neoformação óssea, mostrando trabéculas mais espessas e de-finidas permeando espaços medulares amplos e indefinidos, preenchendo parcialmente o defeito ósseo (figura 8).
Aos 30 dias, o grupo de EACA apresenta maior formação de tecido ósseo, com grau de maturação mais avançado, quando comparado com os períodos anteriores. Os espaços medula-res estão diminutos, definidos, embora alguns ainda estejam amplos (figura 9).
inten-sa quando comparada com a dos períodos anteriores. Os es-paços medulares em sua maioria estão pequenos e definidos, caracterizando tecido ósseo maduro (figura 10).
Aos 45 dias, os grupos de EACA e Gelfoam® mostram a loja cirúrgica remodelada por tecido ósseo compacto, circundan-do espaços medulares preenchicircundan-dos por tecicircundan-do conjuntivo frou-xo. O processo de reparação tecidual foi semelhante para os grupos controle e tratado com EACA e Gelfoam® (figuras 4, 11, 12), mas a análise histológica comparativa mostra que o grupo Gelfoam® apresenta osteogênese mais intensa após a reabsorção do material remanescente verificado aos 14 dias.
Como o objetivo deste trabalho foi verificar se os materiais utilizados – selantes hemostáticos – proporcionam ou não a neoformação óssea, julgamos dispensável a análise morfo-métrica dos tecidos neoformados.
DISCUSSÃO
Nos procedimentos cirúrgicos em geral, a rápida hemosta-sia colabora com tempo operatório menor, facilita a visibili-dade do campo cirúrgico e a organização do coágulo sanguí-neo, o que favorece a reposição tecidual.
Pacientes com mecanismo hemostático normal podem apre-sentar hemorragia pós-cirurgia decorrente de interferências no equilíbrio do sistema fibrinolítico(5).
O mecanismo de ação do épsilon-ácido aminocapróico (EACA) mostrou que, quando administrado em pacientes, com-bina-se com o plasminogênio e com a plasmina livre, impe-dindo desse modo que as enzimas fibrinolíticas se liguem aos resíduos de lisina existentes na molécula de fibrinogênio(1). Portanto, sendo um potente agente antifibrinolítico, tem a ca-pacidade de desviar o equilíbrio coagulação/ fibrinólise em favor da hemostasia, pela proteção que oferece aos coágulos contra o processo fibrinolítico fisiológico(8).
A esponja de gelatina absorvível Gelfoam® tem por função coibir as hemorragias dos capilares, das vênulas e das arterío-las, cuja hemostasia não foi obtida por ligaduras e nem por suturas. Ela pode ser usada sozinha ou associada com a trom-bina, para controlar hemorragias excessivas(10).
A reparação óssea em tíbias de rato do grupo controle mos-trou a evolução do reparo do 7o ao 45o dias após o defeito ósseo, iniciando com áreas de neoformação e culminando com o preenchimento total da loja cirúrgica com tecido ósseo matu-ro. Esses padrões de normalidade relativos à neoformação ós-sea são similares aos descritos por outros pesquisadores(16-17).
O projeto experimental utilizado em tíbias esquerdas
(Gel-foam®), nas quais o agente hemostático foi deixado no local, serviu para criar uma situação na qual alguns efeitos
deleté-rios de materiais implantados seriam maximizados. Tal con-dição não é freqüentemente esperada para ocorrer clinicamen-te, mas os resultados possibilitaram esclarecer algumas das complicações cirúrgicas que acontecem quando esses mate-riais permanecem no local.
Okamoto et al(18) mostraram que o uso do EACA e do im-plante de adesivo fibrínico (Tissucol®) no processo de reparo alveolar em ratos submetidos à desidratação crônica pela pri-vação de ingestão de líquidos durante nove dias melhorou o quadro fibrinolítico provocado pela desidratação. Assim, os resultados obtidos em nosso trabalho mostraram que a irriga-ção das lojas cirúrgicas com soluirriga-ção a 5% de épsilon-ácido aminocapróico e a colocação de fragmentos da esponja absorvível de Gelfoam® provocaram reações teciduais qualita-tivamente similares às do grupo controle. No entanto, a inten-sidade das reações teciduais no grupo Gelfoam® foi progres-sivamente maior após a reabsorção do material aos 14 dias.
Os agentes hemostáticos avaliados foram efetivos no con-trole hemorrágico e favoreceram a organização do coágulo sanguíneo e o reparo ósseo. Todavia, os resultados indicaram que no período inicial de sete dias, nos espécimes que apre-sentaram resíduos de materiais, a osteogênese foi menos in-tensa. Porém, no período de 14 dias, em que o Gelfoam foi completamente reabsorvido, houve aceleração de neoforma-ção óssea, tornando-se similar ao EACA e ao controle. Assim, observou-se que esses agentes hemostáticos são compatíveis com as respostas teciduais, pois não induziram reações inflama-tórias e proporcionaram a formação de tecido conjuntivo e ós-seo, como foi demonstrado por outros pesquisadores(11,16-18).
Nossos resultados foram interpretados como indicando que a permanência de material remanescente em lojas cirúrgicas, em especial no osso, prejudica a osteogênese e pode provocar reação de corpo estranho. Assim, quando do uso de agentes hemostáticos, é necessário todo cuidado para removê-los com-pletamente da ferida cirúrgica.
CONCLUSÃO
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