Química e metabolismo das coenzimas nicotinamida dinucleotídeos

ASAE SAKURADA

QUÍMICA E METABOLISMO DAS COENZIMAS NICOT1NAMIDA DINUCLEOTÍDEOS

Tese de mestrado em Bioquímica apre­

sentada ao instituto de Bioquímica da Universidade Federal do Paraná.

C U R I T I B A 1 9 6 7

ASAE SAKÜRADA

QUÍMICA e m e t a b o l is m o d a s c o e n z im a s

NICOTINAMIDA DINUCLEOTÍDEOS

Tese de mestrado em Bioquímica apre­

sentada ao Instituto de Bioquímica da Universidade Federal do Paraná.

C U R I T I B A 1 9 6 7

QUÍMICA E ' METABOLISMO

DAS COBi'.ZIMAS BICGTIisAMIDA DIímUCLEOTÍÜSOS .

vasae sakurada

1

^isDICüi

1# Historico®

2. Nomenclatura e estrutura aas nicotinamida dánucleotídeos.

3» Propriedades físicas e químicas®

*+• Ocorrência das coenzimas nicotinamida dinucleotídeos•

5« Isolamento e determinarão.

6® Punção bioquímica®

7* Metabolismo das coenzimas nicotinamida dinucleotídeos:

a* Biossíntese de NAD a partir do ãcido nicotínico.

b® Biossíntese de NAD a partir do ãcido quinolanico®

Co Biossíntese de NAD a partir da nicotinamida®

d® Biossíntese da coenzima NADP.

8® Degradação enzimãtica das coenzimas NAD e NADP.

^ • Conclusão.

IGo Bibliografia.

- 1 -

lo Historico#

As coenzimas í^icotinamida Dinucleotídeos são conhecidas desde há muito tempoo

Êste estudo teve inicio com os trabalhos de Btlchner a partir de prepa­

rações de extratos livres de ievecturas que convertiam glicose em álcool etílico# C sistema enzimático que intervinha nesta reação de fermenta­

ção foi denominado "zimase11#

Em 1 9 C k % Harden e Young (1) $ comprovaram q ue a "zimase11 de Btlchner pode­

ria aesdoòrar-se por ultrafiltração em um componente de elevado peso molecular e um ffcofermento11 de baixo peso molecular* e concluiram que que a substância de baixo peso molecular(termoesiável) servia como cofator na fermentação alcoolica de levedura# Êste material dializvel foi denominado f,cozimasen e classificado como coenzima, termo intro­

duzido por Bertrand pra indicar substâncias de baixo peso molecular essenciais para a ação enzimática#

0 estudo da natureza química da cozimase foi iniciado por von luler(2), em 1923« Ate 1932 sabia-sef apenas, que a cozimase

estava relacionada com o ácido adeníiico obtido do musculo( adenosina- 3 fosfato)o A natureza da cozimase estaoeleceu-se$ definitivamente* com a descoberta de Warburg, segundo a qual cs eritrocitos de mamíferos continham um fator diaiizável e termoestável que era necessário para a

0 0 A

oxidação aerobica da glucose-6 fosfato,a acido 6-fosfogluconico#

Warburg e Christian(3)« em 193^ t isolaram este cofator dos eritrocitos e demonstraram que era um composto formado pela união de uma molécula de adenina e duas ats unidades de pentose(D-ribose provavelmente )f 3

)

equivalentes de ácidó fosforico e uma molécula da amida do acido - 2 - v

nicotlnico.

A deaccoerta de nicotinarcida como componente de suas preparaçõ<

puriíicadas de cozimase, e íicou estabeiecàaa a esterita semelhança entre os dois coíatores.

\

Os traoalhos realizados por von Euler(2), Schienk(^) e seus colaborador®*, contribuiram para esclarecer a estrutura química da cozimase. Singer e Kearney(X5)$ em 1952, descobriram um terceiro membro deste grupo, a Coenzima III ( componente do sistema da deshidrogenase da cisteína

sullinato), que parece ter estrutura semelhante à da nicotinamida adeni- na ainucleotídeo (í\AD), na qual se converte facilmente.

2# MOhüIiMOjbAlUx^Aí^ó,?) e ESTRUTURA.

0 termo ’•cozimase11 introduzido por Bertaand tormou-se ambíguo depois da descoberta da participação de outras coenzimas na fermentação aiaoóxicao Para remediar a situação foram propostas as desig­

nações ’’Couehidrogenasel” e ’’Codehiarogenase II” para distinguir os compostos transportadores de hidrogênio®

♦Varburg sugeriu os termos ”Difosfopiridina nucleotídeo” (DPN) e ” Trifos- fopiridina nucleotídeo” (TPh), porem estas denominações eram incorretas quimicamente e poderiam inauzir a erros, pois não se tratava de um nucelo*

tídeo de üifosfopiridina mas sim de um dinucieotídeo,áR no qual uma das bases ê um aerivado de piridina# Por este motivo em 1961, a Comissão de Enzimas da União Internacional de Bioquímica propos para o chamado

”Dif osf opiridina nucieotíaeo” o termo de ’’hicotinamida-adenina-dinucleotí- deo” abreviauamente ,hAD, e a coenzima denominada de ”Trifosfopiridina nucieotíaeo” aeve ser denominada ue ”hicotinamida-adenina-dinucleotídeo-

- 3 -

fosfato"(NADP).

A forma reduzida do NAD foi denominada de "Dihidro-nicotinamida-adenina—

ainucleotíaeo" a quai indica corretamente a parte da molécula que foi reduzida (uAD-reduzido,NAÜH + H+) e a do NADP de "Dihidro-nicotir.amida- adenina-dinucleotideo-fosíato"(NADP-reduzido ou NADPH + H+).

£Ídli\li'lLí<A(319) •

A estrutura éa Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) foi estabelecida por von Suler, Schlenk e Warburg(lO), em 19^2, através de estudos sistemáticos das açoês das enzimas hidrolíticas soore NADt inter- cnjjersão de NAD e NADP e através de sínteses orgânicas das partes compo­

nentes da molécula«

0 anel nicotinamida está unido á ribose na forma N-glicosídica, e a rioose da nicotinamida se une por sua vez à adenosina mediante o

áciao pirofosfórico de modo que a nicotinamida-adenina-dinucleotídeo(NAD) apresenta a seguinte estrutura (Fig.l):

V

A - r

H ^Oy\

H on o»*

o

K

J T T , "

Fig.l Nicotin£imida-adenina-dinucieotideo( wAD) _ A _

A nicotinamidn-adenina-dinucleotídeo-fosfnto(üADP) difere estrutural­

mente do KAi) por possuir um radical fosfato na posição 2' da ribose adenílica(FÍ£.2):

Nr

cor*Hi tf. iir

QH OH ^{1 J 1 t1'1}

0

^-P*

0

^*P*

0

^{* (^riz}

W

£ õ õ

/ oh OH

0«

°V H

= o OH

Fig*2 riicotinamida-adenina-dinucleotídeo-f osfato(MDP)■

Foram encontradas enzimas que promovem a conversão de M D a M B P em presença de adenosina trifosfato(ATP) f de acordo com a reação 1:

M D + A T P ... , ^ M D P + ADP (1)

A enzima que catalisa esta transferencia foi purificada de xevedura(ll) e de fígado de pombo(12).

As formas oxidadas e reduzidas da nicotinamida-adenina-dinucieotídeo (MD) são fosforiladas 'pela ^evedura de ima enquanto que a enzima de fígciao de pombo reage somente cora a coenzima oxidada©

oão conhecidas as fosfatases que rompem o grupo monoes- ter fosfato de M D F f resultando na formação de K4D(13fl*Oo A melhor evidencia para as ligações pirofosfatos de M D e M D P estão baseados nos fatos de que certas nucieotídeos pirofosfatases clivam as coenzimas em

nicotinamida inononucieoticieo« Esta clivagem de NAD e NADP estao represen­

tadas nas reações (2a) e (2o):

9l* X

O

COHHt

OH CH

<M CM ^

I ! Ú - i - O - f - O - C « !

II II I O O |

)

.NAD

OH OH

V

OM

\

| H H

H M

J M N

OU-O-^-OH ,

a & )

, ' C C J

íf o

i\C_5 ác. A - adanTueo

\ vC O H Hj,

j. OH OH

I! j ! í

ou - o -?* o-? - o%ou L

4

^{J s o}

& ovj

hHl

< b

V V

MAD?

o* è * ov\— T=<o

VHzO

%CCNHV

OH

1 OH

W H

NtAtf

'*<2 - O*? * OM iV»o-*?-0*CHt

" I o

Z \5’ O iF o S fO A D éM S iflt

A nicotinamida mononucxeotídeo e ácido-51 adenílico fioram isolados por hidrólise enzimatica de NAD, ao passo que nicotinamida mononucleotídeo

(NMN) e ácido 2 1,5'difosfoadenosina foram isolados de NADP por uma reação mista(15)*

A clivagem hiaroiítica do grupo pirofosfato de NAD e NADP podem ser seguiaas manomètricamente(16)o

A clivagem da ligação nicotinamida ribose de NAD e NADP por álcaxi diluiao (1?) ou enzima(lô) resultam na liberação de nicotina­

mida e adenosina aigosiato ribose (RPPKA) de acordo com a reação 3:

- 6 -

*>»tv

Q r * t

OM- <3P

» l

? . 0 ? . 0 C rt»

» II a

0

NAD nicotinnciida RPPRA

A formação de acido indica que o grupo nicotinamida na coenzima apresenta uma forma quaternária. A adenosina difosfato rioose pode ser identificado por seus açúcares redutores livres bem como por métodos cromatográficos (S (13).

3. PROPRIEDADES FÍSICAS E ^UlhlCAS (13,19).

As coenzimas M D e M D P sao de coloraçao brancaf amorfas muito higroscopicas, bastante solúveis em água e insolúveis em solventes orgânicos*

Ambas coenzimas são relativamente estáveis em solução ácida, mas são rápiaamente decompostas em meio alcalino* Em solução alcalina a 0|lDf o i*AD edestruido, a ÍOO^C, em 5 minutos*

Em álcalia a 5W transforma-se em substâncias que emitem fluorescência em

360

^mu*

Sao estáveis em solução aquosa por uma semana* guando neutralizados sao estáveis por cerca de duas semanas a GQC* Pelo aquecimento decompoe/n-se^

- 7 -

especialmente, em pxí acido©

C nicotinamida adenina dinucleotídeo (MD) apresenta uma absorção máxima a 2Ô0 mu© Não e fluore’scent e ê oticamente ativo

5^6

^{mu =-}

702

^# i\,ão e precipitado por acetato de chumbof mas produz um sal cuproso insolúvel©

0

coenzima M D pode ser reduzido por ditionito de soaloiiHa^S^O^) condu­

zindo a aaição de hiurogenio na posição k do anel nicotinamida(

26

^)•

i^esta redução somente um átomo de hidrogênio ê adicionado ao anel nico­

tinamida, emoora

2

elétrons sejam transferidos ao anel, um proton H*

aparece no meio ©(Fig©3)*

K

o ^ /

* \ /

K C '

A \

c* co NH-%

l v

\ / H

J

t two

&

I

MC' /'

_ T _

“V CH H*o

f R

5aLRdAx,t.)/ADH"

1

^i*c

,CH

N /

i

£ K A D H

0 coenzima ftAD-reduzido apresenta absorção máxima em luz ultravioleta em 3^0 muíFig.^). È fluorescente, estável em álcaxi e muito sensível em meio aciuo. 0 coenzima NAD—reduzido (NADH) e destruido em solução aquosa com a abertura no núcleo da nicotinamida.

Fig.^- Espectro de absorção de NAD oxidado e reduzido

Taoela i*

.%Ív üis ue N A D f NADP nas formas o x i d a da s e . r e u u s i d a s em tecidos*

• 0 G ü * \ — r* wl A i O i i i i s *iLü'iAb i>»Ai) n» ^AbP (2 C ) •

Tecido hAD+ MDii^

M D + + WADH

2

1mADP+ i^ADPí^

M D P ++

NAOri ?

rl0auo ae rato 370 204 574

6

²⁰⁵

211

11

ue camundongo 517

156

673 - - -

11

ue pombo 425 175

660

^{- — -}

11

ue coelho 4o6

156 562

^{- - -}

Aarenal de rato 315 154 469 17

116

133

Aorenal de- coelho 293 117 412

2 62 62

Diafragma de rato 239 133 4'27

2

^{13 13}

Husculo de rato 273 27 305

8

9 17

u de camundongo 314

22

³³⁶ 3 3 3

i% de coelho 451 • 19 470 - -

1

11

ue pombo 530 33 613 - - -

bim de rato 223

212

435 3 54 57

11

^{de pomoo} 243 136 399 - - -

M ae carnunuongo 193 105 293 - - -

11

ae cooaia 155 67

222 8 16

²⁴

baço de rato 133 65

196 2 12

₁₂

iimo ae rato

116

35 151

2 12 12

11

ae camundongo 165

65 230

^{3 9 9}

Pulmão de rato

108

⁵²

160

9

18

²⁷

Pancreas de rato 115 73 193

2 12 12

Tireoiae de cobaia

126

³⁰

156 2 2 2

Vesícula seminal de rato 138

11

139

2 22 12

Cs valores são dados como microgramaíyug) de NA D ou NADP/g de tecido úmido*

( 1 micromol de pAD=6o3 /-igi 1 micromol de i^ADP =7^3 /Ug) •

- 9 -

Tabela'

2

^.

Distribuição intraceieuxar de nicotinamiaa dinucieotídeos em fígado . <le rato(

20

^).

M D M D H ^ M D + M D - ■ M D P M D

0

^H

2

M D P +M D P + (ug) (ug) M D H _

d M D H (ug) (ug) D A D P1I M D P H

1 ... (ug) (ã)

i (ug) ( D

Homogenado total

!

i

425

116

⁵⁴¹

1

ICO 25 231

256

^ICC

ftucieo

22

_{1 3} 35

6

^c; 17

22

^o

Mitocondria 42

21 68

13 3 90 93 36

Microsoma

16

3

16

3 4 3 4

2

Fração solúvel 359 50 409 75

26 88

¹¹⁴ 45

Hecuperação total 444 84

528

^. 97 38 195 233 92

,— f _í

«Tabela 3»

Çoenzimas M D e HADP em alguns microorganismos(a).

Total de HAD em/g peso celu­

lar

HAD(-3) NADP(3&) Desconhe- cidc( Z)x

Escherichia coli

320

^57,0 10,3 32,7

Aerobacter aerógenes

310 91,0

^9,0

0

Achromobacter Fischerii 4o3

72,0

3,5 19,5

Pseudomonas fluorescens 94

31,0

^47,0

22,0

Azobacter agile 76

100 0 0

Sacharomices cerevisae 525

72,2

^10,3 16,5

Mycobacterium butyricum 117

61,0 0

^39,0

Proteus vulgaris 424 59,0 5,3

32,2

(a)j3oyer ,P., sardy ,n. ,MyrbacK,Á.., The Enzymes vol.3»159(1960í Acaaemic Press is.f.

x— Foi calculado oaseandp-se no fato de que o desconhecido tem o menmo pêso equivalente de M D ,

- 1 0 -

í>. ISOi.AiMSMQ S DETKkMIímAIÃO.

a* 1 EOi-AHiiiisTü DE í\ADj

C coenzima NAD foi, primeiramente, isolado de leveduras de cerveja ou de panificação* A primeira preparação lfpurafl foi obtida de levedura por von Euler e Schlenk(20a), por um processo que consiste na extração com agua quente, precipitação de impurezas com acetato de cnumbo, precipitação do coenzima em etapas consecutivas com fosfotungs- tato, mercúrio, prata e cobre, seguido por tratamento com oário e chumbo, fracionamento alcoólico e purificação com óxido de alumínio*

Warburg e Chr’istian(23) foram capazes de isolar não

somen-te NAD mas tambem NADP e adenosina fosfato a partir de eritrócitos*

Separaram os tres nucleotídeos com base no fato ae que o sal de bário de adenosina e levemente soiuvel em água*

Por modificação do método de Meyerhof e Ohlmeyer(20c), 0choa(20b) conseguiu isolar N A D * em sua forma purificada*

Ohlmeyer(20d), isolou NADH^ na forma pura a partir de prepitração de NAD purificada* Obteve um produto de excepcional pureza comprovado pelo coeficiente ae extinção a 340 mu*

Em 1952, Kornberg e Pricer(2l) uescreveram uma técnica de isoxamento de NAD, que era uma modificação do metodo de Willianson e Green(

22

), ootendo a coenzima com cerca de

95

^ de pureza*

Êste métouo consiste em extrair o coenzima NAD, a partir de levedura de panificação, isenta de amido, com água quente* Sste extrato é tratado com acetato básico de chumbo, e o coenzima é precipitado com nitrato de prata. 0 precipitado é aecomposto com e o NAD é novamente precipitado com acetona*

0

produto assim obtiao apresenta

76

^{a 33%} de pureza*

A purificação é completada por aasorção em resina Dowex-l( 200-400 mesh, Dow Chemical Company), eluição com aciao formico 0,1N e r eprecipitação

com acetona*

b. IiXjliAMEi/10 üE NA DP*

Warburg(23) e colaooradores foram os primeiros a descre­

verem os métodos de isolamento do &oenzima NAüP© Êles isolaram o ccenzima na forma pura a partir de eritrocitos de cavalo, hemolisadcs por um

processo que consiste em precipitar as calulas ccm acetona, fracionamen- to com acetato de mercúrio e hidroxido de bario, precipitação com acetato de etila, e precipitação fracionada com acetato de chumbo e alcool*

Recentemente, Kornberg e Horecker(2^) desenvolveram um método do qual uma parte é modificação do método de IVarburg e Christian, que produz NADP com 92% de pureza#

Neste metodo, o coenzima e extraído de fígado de carneiro com ãgua quente.

As protéínas e os ãcidos nucleècos são removidos por precipitação com âcido tricloroacético. 0 NADP é novamente precipitado com acetona e o proauto assim obtido é purificado por métoao cromatogrãfico e reprecipi-

tado com acetona*

DETERMINAI£0 DE ftiAD E IMADP»

Os processos gerais para a analise das formas oxidadas e reduzidas de NAD e NADP são feitos por métodos fluorimétricot e

espectrofotométrico•

- 1 2 -

Sumário dos processos de determinação para piridina nucleotídeos(a)•

a»âD e NADP total - Adição de cianeto, metil etil cetona, ou álcali forte, fluorescencia antes e apos o tratamento com NAD nucleo siuase ae Neurospora*

NAD - Deshiarogenase alcoólica de leveaura e etanol*

itADP - Deshidrogenase isocítrica de coração de porco*

NADH e NADPH - Ciostriaium kluyveri oxitíase*

nADü - Deshidrogenase alcoólica de levedura e acetaldeído.

NADPH - NADPH citocromo c^ redutase ou NADPH glutation re.dutase

(a)*-Kaplan,N*

0

*, and StoIzenoack,F*E<>, Methods in Enzymology vol*lII (1957).

6

. fUiM^ÃO BIOQUÍMICA.

Os ainucleotídeos de nicotinaniida e adenina são coenzimas ae numerosas deshiarogenases que catalisam reações de oxido-reauçãc.

Por exemplo, na reação catalisada, pela glisose

6

-fosíato aeshidrogenase (Zwischenferment) a glicose ó-fosfato se oxida e reduz reversivel/mente:

L? DezbidA&fiazt.

*' n Jt\, >J *' 0 ^

Jlicose

6

-xosfato + «AD + H20 --- --Acido

6

-fosfogluconico *•

+ kadh

2

Da mesma íorraa a deshidrogenase alcooiica de leweuura catalisa a oxidaçac de etanol com a redução simultânea de NAD+:

Cri^Ch

2

0iI + hAD+ CHOCHO + hADH + H+

- 1 3 -

A coflstûnte de equiliorio uesta reação foi aeterminada experimentalmente;

# -A

-2

a pli

7

e aproximadamente 1C e a pH 9 t 10 . Esta constante depende ao píi e isto se deve ao fato de que o H* e produzido quando se oxida o alcool.

A função destas çoenzimas reside no transporte reversivel ao hidrogênio, com isso o anei nicotinamida se reduz, iicanao so com dois duplos enlaces e perdendo a sua carga positiva*

^uanao o InAD + e reduzido por transferencia de 2 elétrons em uma reação enzimãtica(deshidrogenase alcoolica), iax ele aceita o equivalente de um íon hidreto (tí: ) que lhe é cedido pelo suostrato, enquanto que um proton é lioerado no meio.(Fig.5)

0

composto reduzido assim formado,não possui carga sobre o nitrogénio e contém um hidrogénio derivado ao substrato. Este hidrogênio se fixa na posição do anel nicotinamidao

A fixaçao de H na posição *+ do anel nicotinamida pode ser explicada eletronicamente; o diagrama de distribuição de cargas elétricas em HAD+

(Fig.

6

) inaica que o caroono mais positivo ao anel piridinaC carbono com menor carga elétrica) é o carbono 4, isto sugere natural^mente que é este carbono que seria ligado preferencialmente por íons negativos. A menor localização de energia esta associado com o carbono 4, assim em NAD* o centro reativo, ccm relação ao ataque nucleofilico, seria o C 4 (23a).

A transferencia de hidrogênio e feita diretamente entre o suustrato e a -JA-

coenzima. O hiurogênio transferido é qquele ligado ao carbono carbinol.

L’sia transferencia de hidrogênio é estéreoespecifica cora respeito a coenzima, ocorrenao com apenas uma face do anel, como foi demonstrado por Vennesiand e vestheimer(23) com compostos marcados com deutério.

Fig.ó- Cargas eietricas em M D .

As aeshidrogenases depenaentes de NAD e NADP catalisam oxida ção de alcoóis( primários e secundários)o, aldeídos, ácidos alfa e beta hidróxicarboxiicoa e alfa-aminoácidos. Estas reações são muito reversível

Cs nicotinamida dinucleotídeos podem aceitar elétrons, de seu substrato reauzido, transferindo-os a um substrato oxidado, dando lugar a reaçoês acopladas. Assim, a redução de aldeído acético a etanol( em peesença de aeshiarogenase alcoólica) está vinculada á oxidação do gliceraldeído 3-P( em presença de deshidrogenase da triose fosfato)

(Fig.

7

⁾

C H O

Uma outra forma de ação dos coenzimas M D + e KADP e a ae -15-

reuuzir os coenzimas de ilavinas.

Cs coenzimas de fiavinas constituem o grupo prostetico de enzimas que

o aÍugíg ou reduzem o substrato e esta redução proporciona a reação da nicotinnmida dinucleotídeo com o substrato. Como exemplo se pode citar a redução do giutation oxidado em presença de giutation redutase.’

A reação fundamental é:

i.ADH + H+ + GSSG --- NAD + 2 GSH

giutation glutation reduzido

oxidado

onde, G representa o tripeptíaeo da molécula de glutation# As glutation- reautase são enzimas que contém flavina-adenina-dinucleotídeo (FAD) como gnupo prostético# Em presença de NADK a flavina se reduz produzindo FADH^

que por sua vez reduz o G£SG#

Jí +

M D H + H + F A D NAD + ' FADH^

FADH

2

^{+ GSbG - ►} FAD + 2GSH

Gutros compostos podem ser reauzidos pela ação de NAD* e NADP*, em presença de enzima contendo FAD e flavina mononu&leotídeo (FMN) com'o grupo prostético (ver taoela ^).

-16^-

l'abela

Algumas reaçoês catalisauas por coenzimas LAD* e LADP* (2).

Enzima Suostrato Produto coenzima

Desh. alcoóxica Etanol Acetaldeído NA D*

Dtísh. isocxtrica Isocitrato oLCetogiutarato +00^ NAD+

Desh.giiçero-P L-

06

-glicerol P Dihidroxicetona P NAD+

Desh. lática Láctato Piruvato NAD+

" Gliceraldeído 3P G.A.3P »H^PC^ l,

3

difosfoglicérico M D +

Enzima málica L-malato Piruvato+CO, NADP*

Desh.Glicose

6

^{P G-}

6

^_-P Ác.

6

fosfoglucônico NADP*

Dgsh. glutâmica Ic.L-giutâmico U. -cetoglutarato+DHj NAD+e NADP*

Glutation redutase Glatation oxidadc Glutation reduzido NADPH Quinona redutase p-benzoquinona Hidroquinona NADH e

wADPH

JNitrnto redulaae uitrato Nitrito NADPrl

(2) .-Conn, . E., ana Stumpf ,P.ií., Outlines of Biochemistry,1^0 (

1963

^).

- 1 7 -

7»METAdQLI*MQ DAò CüEN ZIKAS N ICO ilN AIvLD A DINUCLEQ1 ib E ü o ( 2 3 b ) .

Qa dinucleotideos de nicotinamida e adenina estão em íntima reiação com as vitaminas ao grupo d, o ácido nicotínico.

A importância biológica desta vitamina e a sua amida foi demonstrada apos a descooerta dos coenzimas NAD* e NADP** Pouco tempo depois foi demonstrado que o áciao nicotínico e a nicotinamida eram fatores de crescimento de vários microorganismos e animais superiores, e que as substâncias em questão eram agentes curativos específicos da pelagra humana e da l!lingua-negra,f dos caes.

Em organismos superiores a maior parte da nicotinamida intracelular está na forma de NAD* e NAD*®

0

ácido nicotínico e a nicotinamida dos alimentos sao li­

berados de suas combinações naturais, graças à ação de enzimas diges­

tivas. São absorvidas iácilmente no intestino delgado e são distri- buidos no organismo através da via sanguínea. Cerca de ^0% do ácido nicotínico se encontram nos corpúsculos sanguíneos.

Os vários órgaõs retiram do sangue as quotas que lhes competem de acordo com sua atividade metabólica. Os tecidos assimilam as formas simples, convertendo-as nos coenzimas dinucleotídeos(NAD*eLNADP*).

Estas como coenzima que são, ligam-se ás apoenximas específicas. È justamente nestas formas de combinação proteica que se encontra a maior parte da nicotinâmiaa do organismo.

0

organismo degrada continuamente uma parcela dos coenzimas NADf e NADP*, por uma via,ainda, não totalmente elucidada.

Cão conhecidas as diversas formas de eliminação urinária, representadas pelo ácido nicotínico(

0,25

^a

1,25

mg/dia), pela nicotinamida(

0

^{,5 a}

4mg/dia) e principalmente por produtos'de posterior transformação, como

;% -ff.títii-nicotinnmida( 3 a 12,5 mg/dia) e a N^-metil-

6

^-piridona-

3

^carbo-

x.tr.iu a .

parte, ainaa, sofre ciescarboxilação ccnvertenuo-se em proautos ainuci não identifiçados.

Cs uiversos animais excretam formas conjugadas á glicina( ácido riicoti- núrico) e a ornitina( oicotinoil-ornitina), esta ultima encontra-se nas excreções das aves#

0

cão elimina trigonelina(ácido N^-metil nico­

tínico) e sua betnína#

No suor encontram-se apenas traços de nicotinamida e no leite da mulher a eliminação é da ordem de

3

mg por dia#

iiiOwolMKGE DE ^ICOo.lKAhlDA A D E K I M DIKUCLEOTíDEG ( M D ) .

a# Biossíntese de NAD a partir do ácido nicotínico:

Em 1922, Goldberger e Tanner(29)* relataram que o rato não necessitava de ácido nicotinaco nas condiçoes normais de sua dieta#

Baseando-se neste fato Krehi (30) e colaboradores, em 19^5* comprovaram que o ácido nicotínico poaeria ser substituido pelo triptofanoqi naq.uele animal. Desde então vários estudos nutricionais e isotopicos demons­

traram que o triptofano e seus metaboimtos, incluindo o ácido

3

^-hidró-

xiantraníiico, seriam precursores do ácido nicotínico em rato, cão, coelho, porco e vários outros mamíferos (

3 1

^*

32

^).

A relação metabólica entre o triptofano e o ácido nicotínicc originou-se através dos estudos isotopicos, no qual o triptofano ou

áciüo

3

-niaroxiantraníiico marcados eram administrados em ratos.

Anaxisando o áciüo nicotínico recujjeraao de urina e tecidos, observaram que a posição

3

do anel indólico tornou-se o carbono carboxílico do

1

aciuo nicotínico e que o nitrogênio do anei indolico é convertido em r.itrojenio uo anei piridina, ao acido nicotínico(

33

^{) •}

Os estuaos feitos com amostras de Keurospora crassa

932

^a)

e com rato, conduziram ao fato ç de que a quinurenina,

5

-hidroxiqui- nutenina e 3-hiaroxiantraníiico são intermediários na conversão de trip- tofano em ácido nicotínico(Fig.3)•

A primeira etapa na conversão do triptoflano em áoido nicotínico e a

formação de formiiquinurenina peia ação da enzima triptofanopirrolase(

3

^{^)*}

, A 0 A M

esta enzima e uma oxigênio transferase porque os atomos de oxigênio sac incorporados em formilquinurenina(reação i).

L-triptofano __________

^2

^{^ ,} Formiiquinurenina (

1

⁾

A enzima triptofano pirroiase foi purificada de Pseudomonas sp»(3*0»

A hidrólise aa formiiquinurenina em quinurenina (reação2) e catalisada pela formamidase encontrada em fígado de mamífero (

35

^)%

Pseudomonas sp>(36) e em Keurospora (37)*

Formiiquinurenina _________ t*- Quinurenina + ácido formico (2)

A quinurenina resultante e hidroxilada na posição 3 pela ajç ação ae uma enzima m.itocondrial NADP dependente, a quinurenina 3-hidroxi- lse(33) (reação3)«

0

átomo de oxigênio incorporado na quinurenina è

aerivado do oxigênio molecular e não da água (

39

^)*

A quinureninase, em presença de piriaoxal fosfato, catalisa a remoção aa cadeia lateral ua hidroxiquinurenina para formar o ácido

2

-niuroxiantraníiico ( reação k).

2 0 -

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Fig» S-Convert-ao de triptofano em piridinocarboxilicos.

C - C ll,.C H .C O O H

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K

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- O t l X U C O O H

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OH

5,0H ^UXTUXAJI ruóvTL,

(3)

- 2 1 -

A~ quinureninnses são encontradas em tecidos animais(40$, em Pseudomonas . : . (>>i,42) e em Neurospora(^3) •

Piridoxal -P

5

-aiuroxiquinurenina + H^C ---

3

-hiaroxiantranílicc +alanina

Em 193d, Priest e cc^laboradores(^h) relataram que um sistema enzimático solúvel de fígado e rim catalisam a conversão de ácido

-3

^hidro-

xiantraníiico em áciao -quinolínico#

Varias investigações subsequentes mostraram que o produto primário da reaçao de oxigenação é o ácido

2

^-amino-

3

-acroleil-fumárico e que a

ciclizaçao deste ultimo resulta na formação do ácido quinolínico (^

5

^{*^}

6

^)#

Esta ultima reação parece ser expontânea e nao requer enzima.

G ácido quinolínico parece ser um subproduto do metabolismo do triptofano e não um intermediário na formação do áciao nicotínico. Êste ácido

dicarboEÍlico era muito poore como fator de crescimentoçm rato e Neuros- pora.

Em várias preparações de fígado de mamíferos, estudadas por Mehler e May (^

7

) s a picoiínico carboxiiase foi a unica enzima encontrada que reagia com o áciao 2 amino-3-acroleil-fumárico. Ate há poucos anos não estava totalmente esclarecido se o ácido quinolínico seria um verdadeiro inter­

mediário, ou se seria um subproduto formado às espensas do ácido nicotínioo Experiências feitas com ácido 3 hiaroxiantranílioo e ácido quinolínico Kxumxinkaxaadxaxxa marcados com tritio vieram a comprovar que o aciao quinolínico é um intermediário na transformação de ácido

3

-hidroxiantra- nílico em ácido nicotínico#

Estal!via triptofano11, pela qual os animais são capazes ue sintetizar ácido nicotínico,ocorre também em Neurospora(

32

^{a) e em}

Acuithomonas prunii (^

8

^)# Parece que esta via não se processa em outras - 2 2 -

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(Mftü)

Fig.10 Via de formação de KAD a partir de acido nicotínico.

(reação II) Fig.10), é catalizada pela NAD-pirofosforilase, assim deno­

minada por Kornberg e oolaboradoees(52a). Esta enzima foi purificada de fígado de rato, levedura e eritrócito(53,5^,5^a)•

A NAD sintetase catalisa a transferência da amida da

glutamina para o ácido nicotínico do desamido-NAD, e requer ATP ( reação 111, fig. 10). Esta enzima foi purificada de levedura de panificação, por Preiás e Handler(53)* A sintetase que catalisa a reação IIIj junta­

mente coxa-outros sistemas de enzimas dependentes-de glutamina, são ini- -?4-

peia azaerina (5^o) •

b• olcocn*! jj£j nAi) A P/uvjlÍ-\ jJE ÂCliAJ v^Uíi^GíjÍi^ICO ; ♦

As plantas verdes e bactérias sintetizam ccmpostons conten- uo ácido nicotínico por uma via diferente daquela utilizada por anirr.ais0e ,>curospora.

Gs traoalhos de Grtega e ürown(55)» inaicaram que em Escherichia colit o ácido nicotínico era derivado da condensação de uma unidade de

3

^e

outra de k átomos de caroono ( glicerol e ácido succínico), amoas

isotopicamente marcadas, e que eram incorporadas pela bactéria na metade uo ácido nicotínico, em presença ae sal de amonio como fonte de nitrogê­

nio« Estudos posteriores demonstraram que os átomos de carbono do glicerol eram incorporados nas posiçoes

^+,5

^è

6

do anel piridina e os

^ \

c.tomos de caroono do succinato nas posiçoes

2

^e

3

⁽

56

^)«

Se o ácido aspártico(cu succinato) se condensa com gliceroi o proauto inicial resultante seria o ácido quinoimnico, que então de ueocarooxiiaria para formar ácido nicotínico.(Fig.11)

i r l i !

Chom tv\. COOW ^ | .!«

1 L,t

CUzoH ^ v

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Aí flSjXi á c C | u u >\gLl»y\.c O

As duas vias de biossíntese do áoido nicotínico convergem -25-

sT-ore um intermeaiário comum, o áciao quinolínico#

Andreoli e colaooradores(57)$ em I9ó3f relataram a converaõ jo ácido quinolínico 5-fosforioosil-i-pirofosfato(PPBP) dependente, em áciuo nicotínico mononucleotídeo, por uma preparação enzimática ootida de Fscherichia coli, K

-12

^o

Para estaoelecer se o ácido nicotínico seria ou não um intermediário xivre na conversão ae áciuo quinolínico e i\AD, aqueles autores fizeram experiências utilizando ácido nicotínico # e ácido nicotínico mononucle- otíaeo como cosubstratos de ácido quinolínico, e em presença de uma preparação enzimática parcialmente purixicada#

Os resultados desta experiancia indicaram claramente que o ácido nico­

tínico hão e um intermeaiário na conversão de ácido quinolínico em ácido nicotínico mononucleotídeo por Sscherichia coli, era dependente de ATP e PPPP (53), enquanto que a formação de mononucleotíaeo, * a partiir do ácido quinolínico, independia de AffPo

Em 1963» Mshizuka e Hayaishi (59) relataram que o ácido

3

-hidroxiantranílico seria convertido em ácido nicotínico mononucleotídeo na presença de PPPP e de uma preparação enzimática obtida de fígado

ae rato, e propuseram que o ádido

2

^-amino-

3

-acroleil-fumárico e ácido quinolínico seriam intermediários nesta conversão®(Fig#12)•

fkp.r^_CovO Oj.

6*\ j ÁC. 3 .0 U .O » 1 Êx C O

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COOH

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% s isto ficou praticamente comprovado que o ácido nicotínico livre não jirticipa, como um intermeuiário dissocáável, nesta conversão«

, 0 ácido nicotínico mononucleotídeo e convertido em desamiao- cm presença de ATP e pirofosforilase e o ultimo seria então amidado ca **AD na presença de glutamina, ATP e M D sintetase, como #está descrito por Preiss e Rndier(52) (Fig.lG).

As e^periencias feitas por ftakamura e colaboradores(ôO) sugerem que uma u&ica enzima seria responsável pela condensação de ácido quinoiínico e PíiPP e pela subsequente descarboxiiação, para produzir ácido nicotínico mononucieotídeo« A quinolinato transfosforibosilase encontra-se distri- buida era vários microorganismos incluindo Pseudomonas fluorescense t

Escherichia coli, Neurospora crassa, levedura, fungos e plantas como Cucunís sativas.

De outro lado, ácido nicotínico mononolcotídeo pirofosforilase (52) encon­

tra-se distribuido em vários tecidos e orgãos« Estas observações sugerem que o ácido quinoiínico e um intermediário comum na biossíntese de NAD, a partir de triptofano, succinato e glicerol(6l).

Gs resultados das experiencias de Hadwiger e colaboradores (

62

), sugerem que o áciao quinoiínico pode ser um intermediário univer­

sal na biossíntese dos compostos piriaínicos.

o.BlüSbfiíTESS £>E liAD A PAãTIH DE frlCOTIi^AKIDA»

Kornberg foi quem obteve os primeiros indícios sobre a natureza de síntese de pix*idina nucieotíueos a partir de nicojinamida.

xtowen e Aornoerg(63) relataram uma enzima de fígado que promove a seguinte reação:

- 2 7 - .

Mcotinamida + Kibose-l-P + H* -— - ■- w Nicotinamida-ribose + Pi ($«)

A constante de equiiíorio para esta reação foi estabelecida para 10,0.

A ligação nicotinamida ribose parecia ser rica em energia, e energia xivre de hidrólise era 3.200 calorias. Então, o equilíbrio desta reação favorecia a íosíoróiise do nucieosídeo, em vez de sintetizá-lo.

' Ejji 1931, Ãornoerg(6*0 descreveu uma enzima de fígado ae porco que catalisava a fosforixaçao da nicotinamida originando um

f ^

nucieotideo de acordo com a equaçao abaixo:

Nicotinamida + A T P --- «► Nicotinamida mononucleotídeo + ADP Mas, a enzima não era capaz de atuar na biossíntese ae NAD por ser pcuco ativa. A reação entre nicotinamida e 5-fosforibosil-l-pirofosfato(PRFP) foi detectado por Preiss e Handler(53) em eritrócito humano.

Nicotinamida + PHPP --- *■ Nicbiinamida mononucleotídeo + PP Uma notável contribuição para melhor entendimento da via sintética de nAD foi feita por Kornberg (5*0 quando descobriu e purificou a NAD piro- fosforilase de fígado de porco e ieveaura de cerveja.

A NAD pirofosxorilase cataxisa a seguinte reação reversível:

nicotinamida mononucleotídeo + ATP ---1» NAD + PP

Segundo H.ogeboon e Schneider (

65

) esta enzima está quase que exclusivamente localizada no núcleo.

A via biossintética de NAD a partir de nicotinamida não está perfeitamente esclarecida em condiçoes fisiológisas.

- 2 3 -

d# D ÍQ o o l^ X £ b £ DE M D P *

A coenzima M D P é sintetizada pela’fosforilação de M D de accrao, con: a equação seguinte:

M D + ATP --- M D P + ADP

As enzimas que cataiizam esta reaçao foram purificadas de levedura^ (66) o ue ixgado ue porabo(67)* A enzima de levedura fosforila as formas üAiaauas e reauzidas de DAD, ao'passo que a de fígado de pomoo promove a transferencia ae fosfato, somente na forma oxidada de M D . A reaçao de síntese de ImADP não ê reversível«

3

.

DEGMDAçAQ aMIMÃllGA VÃS COiünZlMAS M D E M D P .

Os coenzirnas NAD e ImADP estão expostas às açoes enzimáticas pelos seguintes mecanismos : desaminação, ação das pirofosfatases e de nucleosidases.

Mitchell e Mc Elroy (63), iíaplan e colaboraaores(ó9) purifi caram parcialmente uma aaenosina aesaminase de takadiastase que remove hiaroiiticamente o grupo amino da aaenosina formando desamino~MD e ímH, • A aesaminase não atua sobre o grupo amina aa molécula de NADP.

U* JIlA vftgem da ligação pirofosfato.

Foram detectadas um grande número de enzimas que hidrolizam M j e M D P na ligação piroíosfato. Em geral essas enzimas não sao especí-

*-cfts, elas atuam sobre outros nucleotídeos além das coenzirnas M D e M D P

As enzimas particularmente ativaá/atuam sore as formas oxidadas e redu- Aijas aas coenzimas foram isoladas de oatata(?C) e de veneno de cobra(7-ü<

Jacooson e xvapian(72) purificaram uma enzima que cliva a

^ *

ligação pirofosfato de po cetonico de fígado de pomoo e atua somente

& j o r e a fnrma reduzida das coenzimas í^AD e iMADPo

A enzima de fígado de pombo foi encontrada na fração solúvel do fígado (72)* Outras enzimas capazes ae clivar as formas reduzidas e oxidaaas da coenzima na ligação pirofosfato ocorrem na fraçao particulada de

tecidos, especialmente nos microsomas(73)o Uma interessante pirofosfatase foi purificada de extratos de Proteus vulgaris (7*0* Esta enzima é

termoestável e está associada a uma proteína inibidora termolábil, que e áestruida pelo aquecimento ou tratamento com ácido(7*0«

c. Ação aa nucleo sidase sobre bAD e hADP»

Os estuaos de von Euler e colaboradores (75) e Lennestrand (?6), indicaram a presença de enzimas capazes de promover a hidrólise de hAD e i\ADP na ligação nicotinamida ribose#

As nAD-nucleosidases encontram-se amplamente distribuidos em tecidos animais, aparecendo em concentrações mais elevadas no pulmão e baçc(77)*

Mann e Quastel(73) observaram, em

19

^-i» que a nicotinamida promove a inativação de l\AD em fatias de cerebro*

Cs trabalhos de Handler e iílein(79) demonstraram que nicotinamida inibia a hiarólise de hAD na ligação nicotinamida rioose.

áatman e coiaboradores(8c) estudando o mecanismo aesta reação demonstra­

ram que a inibição era dada pela troca entre nicotinamida livre, marcaaa conj , e a ligação nicotinamida de (Fig.13)•

- 3 0 -

X X

^‘n a d')

/ x . co*n*i

I! .

^■+■

IN l X O “l I N f t f A \ 0

í S.22A.A ( NAD) .

C O ^ A V

X X

N i C O T \ i>í A r A \ n A

0 mecanismo da reação acima foi formuiaaa em duas etapas:

ConKx

4- & w £ . Cal £ R £PR.fl (b) BiO

COHA2,

R - í f & f i + Ê

A etapa (a) esta envolvida na liberação de nicotinamida e formação do complexo enzima-adenosina-difosfato-ribose(E-RPPPA)•

Na etapa (b) ocorre a hidrólise do complexo para produzir a adenosina difosfato rioose e enzima livre® Então f a inibição da clivagem de NAD peia nicotinamida e a incorporação do composto marcado poderia ser expxicaao por um competição entre a H^O e a nicotinamida pelo complexo enzima-adenosima-difosfato- ribose(E-HPPPA)*

Foram obtidas evidencias de que o complexo intermediário E-RPPPA não x kIkjsj

sofre trocas com a adenosina aifosfato ribose livre(PPPRA) (80)#

fioffman(3l) relatou a solubiiização e purificação de uma enzima específica que clivam NAD e KADP na ligação nicotinamida ribose, a partir de eritrocitos ae, coelho®

A enzima era inioida por nicotinamida e esta inibição era competitiva, em contraste oom a inibição não competitiva demonstrada em enzimas de latias de baço e cérebro de porco#

ls autores afirmaram que a enzima de eritrocitos de coelho não atua como transgücosidase e sugerem que as iNAB nucleosidases de tecidos de mamíferc

X \

niurolases e transglicosidases, que atuam tanto sobre hÂú como ímADP#

Um numero ue microorganismos são portadores de enzimas que promovem a hidrólise aa ligação nicotinamida ribose de bAD e NADP c uma enzima aeste tipo foi purificada de keurospora crassa(32)#

Lr.zimas particularmente ativas foram encontradas em Bacillus subtiliis íS5) e em hycobacterium butyricum (84) f e ambas são termoesdáveis e estão associadas com proteínas inibidoras, termoestáveis#

9 # COímCIjIioãü.

Os coenzimas nicotinamida dinucleotídeos são de importance biológica fundamental e já se tem, hoje, conhecimento bastante satisfa­

tório de sua estrutura química, propriedades e mecanismo de ação.

A absorção do ácido nicotínico e nicotinamida e a sua

distribuição no organismo e bem conhecida. Foi estabelecido qme a biossí- ntese destes coenzimas em tecidos animais ocorre a partir de três diferen­

tes precursores, o ácido nicotínico, a nicotinamida e o triptofano.

A degradação enzimática destes coenzimas é conhecido desde há muito tempo, saoendo-se mesmo que sofrem a ação das seguintes enzimas:

pirofosfatases, desaminases e nucleosidases.

Ate a presente data se tem conhecimento, apenas, que o organismo vivo uebraaa continuamente uma parte dos coenzimas hAD e hADP, por uma via ainua não totalmente elucidada#

- 3 2 -

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