Fator Anti-hemofílico A, Teste para Hemofilia A, Atividade do Fator VIII, Fator VIII Funcional, Globulina Anti-hemofílica. Mnemônico: F08.

1. Sinonímia:

Fator Anti-hemofílico A, Teste para Hemofilia A, Atividade do Fator VIII, Fator VIII Funcional, Globulina Anti-hemofílica. Mnemônico: F08.

2. Aplicabilidade:

Bioquímicos do setor de hematologia do LAC-HNSC.

3. Aplicação clínica:

A determinação do Fator VIII está indicada para diagnóstico dos estados de deficiência de fator VIII congênito ou adquirido, para elucidação da causa do prolongamento do TTP, para monitorização da terapia de substituição de fator VIII na hemofilia A e distinção entre disproteinemias e desordens de formação de proteína (em combinação com métodos imunológicos). LEMBRE-SE

TP

TTP

AUMENTADO NORMAL _{Doença hepática ou}

deficiência de Vitamina K¹

FATOR VII

NORMAL AUMENTADO _{Presença de}

anticoagulante lúpico ou Inibidor adquirido do

fator VIII

FATOR VIII, IX, XI

AUMENTADO AUMENTADO _{CIVD ou doença hepática FATOR V, X, I (fibrinogênio)}

ou II (protrombina)

NORMAL NORMAL _{Trombocitopenia ou}

desordem qualitativa de plaquetas

Leve deficiência de fator, leve doença de von Willebrand,

deficiência de fator XIII

1. Para diferenciar entre doença hepática e deficiência de vit. K, dosar fator V e VII. Se somente o fator VII é deficiente, suspeitar de deficiência de vit. K; se ambos, doença hepática.

4. Principio do teste:

A atividade do Fator VIII no plasma do paciente é determinada por um teste de TTP modificado. O plasma do paciente é diluído e adicionado ao plasma deficitário em Fator VIII (HemosIL Factor VIII deficient plasma). A correção do tempo de coagulação prolongado do

plasma deficitário é proporcional à concentração (% de atividade) respectiva deste fator no plasma do paciente que se obtém a partir de uma curva de calibração.

5. Amostra:

5.1 Preparo do paciente:

Sempre observar as orientações do médico assistente. Apenas evitar colheitas de material após exercício físico e nas duas horas que sucedem refeições fartas e ricas em gordura. Informar se o paciente está ou esteve recentemente em uso de anticoagulante (Clexane, Heparina, Hirudoid, Liquemine, Marcoumar, Marevan, etc.). Vide POP-L04 – Coleta.

5.2 Tipo de amostra:

Sangue total coletado mediante veno-punção com seringa ou em frascos à vácuo de tampa azul clara (adulto ou pediátrico) contendo solução de citrato de sódio 3,2% (0,109 mol/L). A proporção de mistura é 1 parte de citrato para 9 partes de sangue. Este tipo de tubo possui uma superfície interna não ativadora da coagulação como plástico (polipropileno, por exemplo) ou vidro siliconizado.

5.3 Colheita:

Observar as precauções universais para punção venosa. A colheita pode ser realizada a qualquer hora, observando as recomendações do médico assistente. Utilizar uma das veias da fossa antecubital. A punção venosa deve ser sem trauma e com tempo de garroteamento menor que 1 minuto. Manter um fluxo contínuo durante o processo de transferência do material para o tubo, evitando-se o turbilhonamento de sangue. Inverter suavemente o tubo 5 a 8 x para adequada homogeneização (evitando a formação de coágulos sem ativar as plaquetas) num intervalo inferior a 1 minuto após a coleta. Quantidade mínima de sangue: conforme o tubo de amostra utilizado, adulto ou pediátrico. Para pacientes com hipercoagulabilidade efetuar a colheita após retirada e devolução do citrato de sódio do frasco de colheita, utilizando a seringa para veno-punção com troca de agulha. Este procedimento minimiza a ativação da cascata de coagulação por contato. Ordem de coleta recomendada (padrão CLSI): 1º frasco para cultura de sangue ou tubo sem qualquer aditivo; 2º frasco com citrato para coagulação (este procedimento evita contaminação com outro anticoagulante ou substância aceleradora de coágulo). Quando for o primeiro tubo a ser coletado, deve ser usado apenas para exames de rotina; ex: TP e TTP. A coleta após a gasometria, assim como a coleta de cateter, pode contaminar a amostra com heparina e causar resultados falsamente prolongados. Amostras com volume de sangue inferior ou com hematócrito aumentado têm menor volume de plasma, mais remoção de cálcio e prolongamento dos tempos de coagulação.

5.4 Preservação e transporte:

Transportar o material colhido à temperatura ambiente e dentro das normas de segurança legais. A amostra deve ser encaminhada ao laboratório o mais rápido possível, sendo ideal a centrifugação em até 1 hora após a colheita. Não se recomenda o uso de gelo no transporte.

5.5 Identificação da amostra:

Etiqueta com código de barras gerado pelo SIL do LAC. A etiqueta deve ser posicionada nos fracos de colheita a partir da tampa para o fundo em linha reta de forma que o código de barras fique visível e alinhado, sem enrugamentos e permitindo a visualização da amostra.

5.6 Armazenamento:

Manter à temperatura ambiente (15-25ºC) até a realização da prova, que não deve exceder 4 horas após a colheita. Não armazenar em geladeira. Se necessário, congelar após dupla centrifugação. Se a amostra for congelada a -20ºC, armazenamento máximo de 30 dias. Descongelar em banho-maria a 37 ºC em até 10 minutos (descongelamento rápido) e realizar o teste em até 2 horas.

5.7 Amostras Inadequadas:

Colhidas em frascos errados, mal identificadas, refrigeradas, coaguladas e coletadas desrespeitando-se a proporção adequada entre sangue e anticoagulante. O volume da amostra é crítico, amostras com variação de volume superiores a 20 % para mais ou para menos devem ser desprezadas incondicionalmente. A fim de garantir a integridade da amostra, desprezá-la após a realização dos testes e antes da liberação dos resultados, vertendo o material cuidadosamente para verificar a presença de coágulos ou microcoágulos (amostra inadequada).

6. Reagentes e materiais:

HemosIL Factor VIII Deficient Plasma, 10 x 1 mL

Kit HemosIL APTT-SP (liquid) + Cloreto de Cálcio, 5 x 9 mL Special Test Control Lev. 2, 10 x 1mL

Normal Control Assayed, 10x 1 mL Calibration Plasma, 10 x 1 mL

HemosIL Fator Diluente, 1 x 100 mL Água reagente – não comercial.

ACL TOP ® Cuvettes (caixa com 2.400 cuvetes)

Pipetadores automáticos de volumes variados (100 a 1000uL). Ponteiras plásticas descartáveis (100 a 1000 uL).

6.1 Preparo:

Factor VIII Deficient Plasma, Controles e Calibrador: deixar os frascos à temperatura ambiente (15 a 25°C) por 15 minutos, reconstituir o conteúdo do frasco do plasma com 1 mL de água destilada. Deixar repousar durante 30 minutos à temperatura entre 15 e 25ºC e misturar invertendo o recipiente antes de usar. Não agitar.

Os reagentes para TTP e o cloreto de cálcio já vem pronto para uso. Atenção! O reagente de TTP deve ser agitado vigorosamente durante 15 segundos antes do uso.

Na hora do preparo, sempre datar e rubricar os frascos dos reativos e observar o lote. Vide bula dos kits.

6.2 Estabilidade:

Factor VIII Deficient Plasma: após reconstituição, 24 h entre 2-8ºC ou dentro do aparelho (15ºC).

APTT-SP: 5 dias dentro do aparelho (15ºC) ou 30 dias entre 2-8ºC (geladeira).

Special Test Control Lev. 2: após reconstituição, 8 h entre 15-25ºC. Pode-se congelar a - 20ºC por 24 h. Descongelar a 37ºC. Não recongelar.

Normal Control Assayed: após reconstituição, 4 h dentro do aparelho (15ºC) ou 8 h entre 2-8ºC (geladeira).

Calibration Plasma: após reconstituição, 8 h entre 2-8ºC (geladeira).

Na geladeira todos os reagentes permanecem estáveis até o prazo de validade indicado na embalagem, quando fechados. Para maiores informações vide bula dos kits.

6.3 Armazenamento:

Factor VIII Deficient Plasma, APTT e cloreto, Special Test Control Lev. 2, Normal Control Assayed e Calibration Plasma em geladeira (2-8°C). O fator diluente é armazenado à temperatura ambiente.

7. Equipamentos:

• Equipamento de automação em hemostasia IL ACL TOP 500 CTS • Centrífuga

8. Calibração:

Vide Check List para rotina para fatores de coagulação no item 9. Reconstituir 2 frascos de calibrador e 2 frascos de plasma deficiente. Atenção! Usar sempre reagentes novos de TTP, Control N, Clean B diluído e Fator Diluente. Após reconstituição, colocar os 2 calibradores em 1 só frasco. Proceder da mesma forma com os dois plasmas deficientes. Verificar se os lotes dos reagentes são os mesmos registrados no aparelho, caso não seja, inserir o novo lote.

Para inserir novo lote: Setup – material list – selecionar o reagente clicando duas vezes

sobre ele. Ir em “lot specific information”, inserir lote e validade e salvar as informações. Colocar todos os reagentes on board e proceder a calibração:

Calibração: Calibration – status list - 2 cliques – selecionar o fator – clicar no ícone “test

feasibility list”, para ver a previsão (deve aparecer 1 na coluna de calibração) - clicar no “homenzinho” para calibrar. Quando a calibração (“calibration 1”) estiver pronta, entrar em “action” – “configuration” – “Math Model High View” e verificar se o valor de R2 está adequado. Em seguida, voltar e clicar em “Math Model Low View” e verificar novamente o valor do R2. Voltar em “Multiple Math Model View” e validar (V na cor verde). Isto permite juntar as duas curvas, sem ter necessidade de imprimir. Imprimir para arquivar caso necessário. Validar as duas curvas.

O R2 value deve estar entre 0,98 a 1,00 para todas as curvas. Intercept: é a diferença para cima e para baixo dos valores da curva. Slope: é a diferença entre as duas curvas.

9. Procedimento (passo a passo):

• Preparação das amostras:

As amostras serão entregues no setor de hematologia provenientes do ambulatório, postos de saúde comunitária, UPA, emergência e hospitais (HCC, HCR, HNSC e, eventualmente, HF). Avaliá-las quanto à identificação, posição do rótulo, volume, coágulos e microcoágulos. Amostras mal identificadas devem retornar ao setor administrativo. Centrifugar as amostras por 15 minutos a 2000 - 2500 g. As amostras para fatores devem ser conservadas à temperatura ambiente, submetidas à dupla centrifugação, congeladas ou, sendo o dia de dosagem, submetidas a análise em até 4 horas. Não conservar a 2 – 8 ° C (geladeira). Se houver necessidade de congelamento, seguir as técnicas descritas abaixo:

Técnica de dupla-centrifugação: 1. Primeira centrifugação: centrifugar os tubos tampados,

por 15 minutos. 2. Separar imediatamente os 2/3 superiores do plasma, tomando o cuidado de não atingir a camada que contém as plaquetas. Transferir o plasma para um tubo plástico e tampar; 3. Segunda centrifugação: centrifugar os tubos tampados contendo o plasma obtido na 1ª centrifugação por 15 minutos; 4. Separar imediatamente os 2/3 superiores do plasma, tomando o cuidado de não atingir a camada que contém as plaquetas residuais. Transferir o plasma para outro tubo de congelamento plástico e tampar (nunca congelar em tubos de vidro; o uso de tubos de vidro não siliconizado ativa os fatores de coagulação e reduz o TTP);

5. Conferir a identificação do(s) tubo(s) contendo plasma; 6. Congelar imediatamente e

manter a -20º C por até 30 dias ou a -70ºC por até 6 meses.

Técnica de descongelamento: Descongelar a amostra (dentro de uma luva para não descolar

o rótulo) em banho-maria a 37 ºC em 10 minutos (descongelamento rápido) e realizar o teste em até 2 horas.

• Corrida das amostras:

Inserir amostras nas posições S, reagentes nas posições R e o fator diluente na posição D. A programação do equipamento é automática, via interfaceamento, para as amostras de pacientes, não sendo necessário marcar os testes a serem executados. Se necessário, marcar os testes manualmente na tela do monitor. Se o código de barras de uma amostra ou de um reagente não puder ser lido, o analisador emite sinais de alerta Vide POPE-H07 - ACL TOP 500 – Sistema de coagulação. Cuidar para usar sempre os adaptadores adequados: preto para tubo normal com volume baixo, azul para eppendorf ou tubo pediátrico. Atenção! Nunca trocar o tipo de racks! rack CTS (com marca azul)– somente para uso de tubos com tampa e rack normal (toda preta) – para tubos sem tampa. Após o término dos testes os resultados são transferidos para o arquivo de interfaceamento. Fazer a liberação dos resultados no programa de interfaceamento. Os resultados processados pelo ACL-TOP são impressos automaticamente e arquivados.

• Check List para rotina dos fatores de coagulação:

Antes de começar a rotina dos exames para fatores de coagulação seguir o check list descrito abaixo para otimização do processo:

1. Fazer a manutenção diária no equipamento.

2. Verificar se houve mudança de lote dos reagentes (TP, TTP e plasma deficiente). Se houve, será necessário fazer nova curva. Para verificar, ir na tela Setup – Material list – clicar em cima de cada teste e verificar o lote em “Lot Specific Information”.

3. Verificar se as curvas de todos os fatores estão validadas: Calibration -> status list -> clicar no teste. Na aba “Calibration 1”, se estiver como “active” é porque está validada. Pode-se entrar na aba “Calibration Information” e observar em Test Status. Na aba “Tracking Information” estão descritos todos os reagentes utilizados para realizar aquela curva em questão, bem como os lotes de cada um deles.

4. Se for necessário fazer nova curva (vide item 8), reconstituir 2 calibradores e 2 plasmas deficientes. Após reconstituição colocar o conteúdo dos 2 frascos em apenas 1 dos frascos. 5. Caso não seja necessário fazer a nova curva, apenas reconstituir 1 frasco de plasma deficiente para cada fator a ser dosado, 1 controle normal e 1 Special Test 2. Atenção! Usar somente reagentes novos, incluindo Fator Diluente e Clean B (cleaning agent) diluído. 6. Para passar os controles é necessário 1 frasco de plasma deficiente específico para cada fator a ser dosado, 1 controle normal e 1 Special Test 2.

7. Descongelar as amostras somente após passagem e conferência dos controles. Descongelá-las rapidamente (em até 10 min.) em banho-maria dentro de uma luva.

8. Montagem das racks:

- Posição D1: plasma Deficiente + fator diluente + controles (Normal e Special test 2) - Posição R: reagente de TTP + Clean B diluído.

OBS. Antes de reconstituir os reagentes liofilizados, retirar da geladeira e deixar por 15 min à temperatura ambiente. Após reconstituí-los, deixar por 30 min à temperatura ambiente antes de colocar em uso.

10. .Controle de qualidade:

10.1 Interno:

Os seguintes controles devem ser processados no momento da execução do teste: Normal Control Assayed e Special Test Control Lev. 2. Vide POPE-H07 - ACL TOP 500 – Sistema de coagulação.

10.2 Externo:

Controle PELM (frequência semestral).

As informações contidas nos laudos de resultados resultam das medidas efetuadas no equipamento. Estão expressas em formato aceito e consagrado internacionalmente, sendo liberados diretamente em rede informatizada e interfaceada após conferência individualizada por profissional de nível superior habilitado.

11.1 Unidades:

Os resultados são expressos em atividade (%), UI e segundos. No sistema de interfaceamento são liberados em atividade (%).

11.1 Cálculos:

N/A

11.2 Critérios de aceitação:

Resultados cujas amostras foram preparadas rigorosamente dentro das condições estabelecidas.

Resultados dentro dos limites de normalidade e sem nenhum alarme do equipamento de automação podem ser liberadas diretamente em rede, via interfaceamento. Resultados com alarmes do equipamento de automação devem ser liberados após processamento e confirmação de resultados.

12. Valores de referência:

O intervalo de normalidade do Fator VIII é de 50 a 150% (0,50-1,50 UI).

Obs. Se o TP e TTP da amostra estiverem dentro dos limites de normalidade, liberar a seguinte frase: “TP e TTP normais, exame não realizado”.

13. Valores críticos:

N/A.

14. Especificações de desempenho:

O estudo de precisão consiste em processar uma amostra biológica por várias vezes no mesmo sistema analítico, em uma única batelada (precisão “intra-ensaio” ou repetitividade) ou em diferentes bateladas (precisão “inter-ensaio” ou reprodutibilidade). Segundo a bula do fabricante a média (inter-ensaio e intra ensaio, n=80) é 100,7% para o Normal Control Assayed (CNA) e 33,8% para o Special Test Control Lev. 2 (STL2) com CV inter-ensaio ( 3,5% CNA e 5,5% STL2) e intra-ensaio ( 4,7% CNA e 5,4% STL2). Linearidade: 5 a 150%.

15. Fontes Potenciais de Variabilidade

Temperatura ambiente acima de 30°C e abaixo de 15°C. Temperatura ideal: 25°C. Umidade relativa acima de 85% . Umidade reativa ideal: < 85%, não condensado. Exposição direta a luz solar.

Pouca ventilação.

Deve-se centrifugar a amostra no prazo de 1 hora após a colheita com citrato (4 horas se coletado com CTAD) devido à liberação do fator 4 plaquetário (um inibidor potencial da heparina ). Além disso, é importante saber que o valor da meia vida da heparina é de aproximadamente 1,5 horas.

Amostras com microcoágulos. Presença de anticoagulante lúpico.

Paciente em uso de alimentação parenteral.

Doses terapêuticas de hirudina e outros inibidores diretos de trombina.

16. Limitações do método: 16.1 Interferentes:

Hematócrito baixo / alto (>55%).

Presença de outro anticoagulante na amostra: solicitar nova colheita de material.

Plasma rico em plaquetas por centrifugação insuficiente: ocorre ativação e encurtamento dos resultados.

Amostras com hemólise, lipemia ou icterícia excessivas (não interferem: hemoglobina até 100mg/dL, triglicerídeos até 1200 mg/dL, bilirrubina até 20 mg/dL).

17. Interpretação dos resultados:

O Fator VIII é uma glicoproteína sintetizada no fígado, baço e linfonodos. Circula no plasma ligado de forma não-covalente ao fator de Von Willebrand, que prolonga sua meia-vida, estabiliza sua atividade e o torna mais suscetível à ação da trombina e inibe a ação proteolítica do complexo proteína C-S. Durante a coagulação, o fator VIII é convertido na sua forma ativa, o fator VIIIa (FVIIIa), por proteólise limitada, pela trombina ou pelo fator Xa. O FVIIIa funciona como cofator para o fator IX, acelerando (até 200.000 vezes) a conversão de FX a FXa pelo FIXa. A deficiência congênita do fator VIII é conhecida como hemofilia A, doença hereditária recessiva. Os doentes com hemofilia A são classificados de acordo com a atividade do fator VIII, em 3 categorias: hemofilia leve: 5 a 25 %; hemofilia moderada: 1 a 5 %; e, hemofilia grave: < 1 %. O decréscimo dos níveis de Fator VIII também pode estar associado à doença de von Willebrand e também pode ser adquirido secundariamente devido a doenças hepáticas ou coagulação intravascular disseminada (CID).

FIGURA 1 - Novo modelo da coagulação. (A) Iniciação da coagulação em células que expressam FT. (B) Amplificação do sinal procoagulante a partir da trombina gerada. (C) Propagação da trombina gerada na superfície plaquetária (Adaptado de HOFFMAN e MONROE,2007).

18. Biossegurança:

Usar equipamento de proteção individual (luvas, óculos e jaleco.). Fazer a descontaminação de bancadas e equipamentos conforme as normas de segurança do laboratório. Descartar resíduos de acordo com as Boas Práticas de Laboratório e com as normas federais, estaduais e locais. Vide Manual de Biossegurança.

19. Anexos:

N/A.

20. Bibliografia:

Terra, Paulo – Coagulação: interpretação clínica dos testes laboratoriais 2ª Ed. 2001. Lewis. S Mitchell – Hematologia prática de Dacie e Lewis et alli 9ª Ed. 2006. Vermylen, J., Verstraete – Hemostasia 1ª Ed. 1982.

Cançado J.R. – Métodos de Lab. Aplicados a Clínica 6ª Ed. 1985.

Silva P. H., Hashimoto Y. – Coagulação: Visão Lab. da Hemostasia Primária e Secundária 1ª Ed. 2006.

Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso – 2. ed. Barueri, SP : Minha Editora, 2010

CLSI H21-A5 – Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays; Approved Guideline – 5th ed. Vol.28, Nº5, 2008. Sites relacionados: www.wikipedia.org www.institurofleury.org.br www.diagnosticosdaamerica.com.br Artigos publicados:

Lourenço DM – Abordagem do Paciente com Moléstia Hemorrágica, WCW Multimídia & Idéia.s, 26/04/2003.

Franco RF – Fisiologia da Coagulação, Anticoagulação e Fibrinólise, Medicina Ribeirão Preto, 34: 229-237, jul./dez. 2001.

HOFFMAN, M.; MONROE, D. M. Coagulation 2006: a modern view of hemostasis. Hematology/Oncology Clinics of North America, v. 21, n. 1, p. 1-11, 2007.