Avaliação histológica do implante do osso fetal bovino
acelular e desmineralizado em subcutâneo de ratos
*Histological evaluation of acellular and demineralized
fetal bovine bone in the subcutaneous of rats
WILLIAN FERNANDO ZAMBUZZI1, RODRIGO CARDOSODE OLIVEIRA2, RODRIGO PIOZZI3,
TÂNIA MARY CESTARI4, RUMIO TAGA5, MARÍLIA AFONSO RABELO BUZALAF6, JOSÉ MAURO GRANJEIRO7
* Trabalho realizado no Laboratório de Bioengenharia, Materiais e Minerali-zação Biológica, Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odon-tologia de Bauru, Universidade de São Paulo – USP – Bauru (SP), Brasil. 1. Doutorando do curso Biologia Funcional e Molecular, Instituto de
Biolo-gia, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP – Campinas (SP), Brasil.
2. Professor do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odonto-logia de Bauru, Universidade de São Paulo – USP – Bauru (SP), Brasil. 3. Cirurgião-Dentista graduado na Faculdade de Odontologia de Bauru,
Uni-versidade de São Paulo – USP – Bauru (SP), Brasil.
4. Doutorando do curso Biologia Oral, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo – USP – Bauru (SP), Brasil.
5. Professor Titular do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo – USP – Bauru (SP), Brasil.
6. Professor Associado do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo – USP – Bauru (SP), Brasil.
7. Professor Adjunto do Departamento de Biologia Celular e Molecular, Insti-tuto de Biologia da Universidade Federal Fluminense – UFF – Professor Visitante da Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo – USP – Bauru (SP), Brasil.
Endereço para correspondência: Prof. Dr. José Mauro Granjeiro, Departamento
de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense-UFF, Outeiro de São João Baptista, s/ n, Campus do Valonguinho, Centro – 24020-150 – Niteroi (RJ) – Brasil. Tel.: (21) 2629-2324, fax: (21) 3701-1617. E-mail: jmgranjeiro@vm.uff.br
Recebido em 1/6/ 05. Aprovado para publicação em 6/6/ 06. Copyright RBO2006
RESUMO
Objetivo: Avaliar a resposta tecidual ao implante do osso fetal bovino (FBB)
acelu-lar e desmineralizado em subcutâneo de ratos. Métodos: O FBB foi obtido em frigorí-fico local, transportado em gelo para o laboratório, onde foi lavado, tratado mecânica e quimicamente (álcalis e solventes orgânicos) para remoção de débris, células e san-gue; a desmineralização do material foi obtida com ácido clorídrico 0,6M a 4oC e neutralização com tampão fosfato em pH 7,4). Foram utilizados 40 ratos machos Wis-tar divididos em dois grupos: teste e controle (n = 5). No grupo teste um bloco de FBB (1 x 1 x 1cm) foi implantado no tecido subcutâneo de cada animal. No grupo controle os procedimentos cirúrgicos foram idênticos aos do grupo teste, mas sem a colocação do material. Após 10, 20, 30 e 60 dias os animais foram mortos e as peças coletadas, fixadas em formol a 10% tamponado, lavadas, desidratadas, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina. Cortes com 6µm de espessura foram corados com hematoxili-na-eosina. Resultado: A análise microscópica indicou que o osso fetal bovino foi
cir-cundado por tecido conjuntivo aos 10 dias. Entre 20 e 30 dias observou-se a substitui-ção gradual do tecido conjuntivo em contato com o material implantado por tecido adiposo. No período de 60 dias notou-se acentuada diminuição das trabéculas ósseas do material implantado, sugerindo discreta absorção do material implantado e a subs-tituição do tecido conjuntivo frouxo que circundava as partículas por tecido adiposo. Em nenhum dos períodos experimentais foram observados linfócitos ou plasmócitos no tecido reacional ou destruição tecidual. Raras áreas apresentaram células gigantes multinucleadas. A análise semiquantitativa das lâminas não demonstrou diferença significativa (p > 0,05) entre os grupos controle e FBB com relação ao infiltrado infla-matório, presença de vasos e grau de fibrosamento. Conclusão: Considerando que o material não induziu destruição tecidual ou recrutamento de células do sistema imu-nológico, foi parcialmente absorvido e bem tolerado pelo tecido, os autores concluem que o osso fetal bovino foi biocompatível.
Descritores – Transplante ósseo; Osso e ossos/ anatomia & histolo-gia; Antígenos heterófilos; Tela subcutânea; Ratos Wis-tar
ABSTRACT
Objective: The aim of this study was to assess the tissue response to implants of acellular and demineralized fetal bovine bone (FBB) in the subcutaneous of rats. Methods: FBB was supplied from a local supplier, and ice-carried to the laboratory, where debris, cells, and blood were removed through cleansing, mechanical, and chemical treatment (alkalis and organic solvents); material demineralization was achieved with 0.6M hydrochloric acid at 4ºC and buffered with phosphate at pH 7.4. A number of 40 Wistar male rats were divided into two groups: Test-group and control-group (n = 5). In the test group, a 1x1x1 cm) block was implanted in the subcutaneous tissue of each animal. In the control group, surgical procedures were identical to those from the test-group, except for material placement. After 10, 20, 30, and 60 days the animals were sacrificed and the samples were collected, fixed in 10% buffered formalin, cleansed, diaphanized in xylol, and included in paraffin. The 6 µm-thick cuts were stained with hematoxylin and eosin. Result: Microscopic analysis revealed that the bovine fetal bone was surrounded by connective tissue at 10 days. Between 20 and 30 days, a gradual replacement from the connective tissue in contact with the implanted material by fatty tissue was observed. At 60 days, a marked reduction of bone trabeculae from the implanted material was observed, suggesting a low-grade absorption of the implanted material and resorption of the lax connective tissue surrounding the particles by fatty tissue. Neither lymphocytes nor plasmocytes within the reactive tissue or tissue destruction were observed during the experimental periods. Few areas presented multinucleated giant cells. Semiquantitative analysis of samples did not show a significant difference (p > 0.05) between control group and FBB groups regarding inflammatory infiltrate, blood vessel presence, or fibrosis grade. Conclusion: Considering that the material did not induce tissue destruction or immune system cell recruitment, along with partial absorption and tissue good tolerance, we concluded that fetal bovine bone was biocompatible.
Keywords – Bone transplantation; Bone and bones / anatomy & histology; Antigens, heterophile; Subcutaneous tissue; Rats, Wistar
INTRODUÇÃO
O osso é constituído por um tecido conjuntivo altamente especializado, vascularizado e mineralizado, que possui fun-ções fisiológicas e homeostáticas no organismo(1). O tecido
ósseo, quando lesado, possui alta capacidade de regeneração espontânea, mas em casos de grandes perdas ósseas essa ca-pacidade não é suficiente para repará-lo adequadamente(2).
Nesses casos, é necessária a utilização de enxerto para auxi-liar na regeneração morfofuncional do tecido ósseo na região. Apesar de os enxertos ósseos autógenos serem amplamente aceitos como padrão para o tratamento desses defeitos, mate-riais de enxerto alógenos, xenógenos e sintéticos têm sido amplamente estudados e propostos como alternativas interes-santes ao osso autógeno(2-5).
O enxerto de osso autógeno é o tratamento mais indicado, pois apresenta boas propriedades biológicas, como osteogê-nese, osteoindução e osteocondução. Mas vários inconvenien-tes ligados a sua utilização, como necessidade de segundo sítio cirúrgico, maior período de convalescença, suscetibili-dade às infecções e risco de reabsorções ósseas progressivas e constantes, maior morbidade e custo para o sistema de saúde, limitam o seu uso com mais freqüência pelos cirurgiões orto-pedistas e dentistas(6-8).
O aloenxerto é produzido com ossos de indivíduos da mes-ma espécie, obtidos de bancos de ossos e processados de tal maneira a preservar a sua propriedade osteoindutora e osteo-condutora; no entanto, deve ser acelularizado. O alto custo de manutenção e de rigoroso controle para impedir a transmis-são de doenças e nem sempre a quantidade de tecido disponí-vel em condições ideais suprir as necessidades cirúrgicas e a demanda da população estimulam novas alternativas de en-xerto(9).
Dentre os materiais xenogênicos, os de origem bovina me-recem destaque, pois a matéria-prima para sua produção é abundante e seu custo final é acessível à população; são segu-ros em relação à indução de resposta imune e transmissibili-dade de doenças quando do processamento laboratorial ade-quado(10). A desproteinização do osso bovino a temperaturas
superiores a 300oC resulta em materiais biocompatíveis e
os-teocondutores(11-14).
Atualmente, uma das grandes metas na área médico-odon-tológica mundial é encontrar o carreador ideal para fatores de crescimento ou de indução, como as proteínas morfogenéti-cas ósseas (BMP), que seja biocompatível e osteocondutor, e que possa ser usado para melhorar a regeneração do tecido ósseo no local do tratamento. Desse modo, vários
biomate-riais produzidos com osso bovino, devido às suas característi-cas biológicaracterísti-cas já avaliadas, têm sido sugeridos como candida-tos a carreador de moléculas sinalizadoras e células para a bioengenharia tecidual. Apesar da utilização relativamente grande desses enxertos xenogênicos na prática cirúrgica, fal-tam, ainda, informações relativas às bases moleculares e celu-lares da ação desses materiais, de forma a permitir a investi-gação de alternativas para otimizar sua efetividade e segurança. É consenso que o osso desmineralizado, independente da espécie, contém fatores de crescimento e BMPs(15-16) capazes
de induzir a osteogênese, sendo potencial material para auxi-liar o reparo ósseo. Uma vez que a idade do tecido pode afetar o conteúdo desses fatores de crescimento, é pertinente identi-ficar fontes de matriz óssea desmineralizada ricas em fatores osteogênicos. Aliando a biodisponibilidade de animais jovens e o potencial maior conteúdo desses fatores, pretendemos ava-liar a resposta tecidual ao implante do osso fetal bovino (FBB) em subcutâneo de ratos.
MÉTODOS
Foram utilizados 40 ratos machos adultos (Rattus
norvegi-cus), 160g, divididos em dois grupos (n = 5): controle
(so-mente os procedimentos cirúrgicos) e teste, implantação do osso fetal bovino (FBB) em bloco (1 x 1 x 1cm), os quais fo-ram sacrificados 10, 20, 30 e 60 dias após o implante do ma-terial. A pesquisa foi realizada com a aprovação e segundo as normas recomendadas pela Comissão de Ética no Ensino e Pesquisa em Animais da Faculdade de Odontologia de Bau-ru-USP, seguindo o Colégio Brasileiro de Experimentação Ani-mal (COBEA).
Preparo do material
O FBB foi extraído de osso medular de feto bovino obtido no frigorífico local. O material, após ser coletado, é processa-do mecanicamente e lavaprocessa-do com o objetivo de eliminar rema-nescentes de tecido, sangue, gordura e outras impurezas. Pos-teriormente, o material é tratado quimicamente com solução fortemente alcalina e solventes orgânicos a fim de garantir a completa acelularização do tecido, seguindo-se a desminera-lização com HCl 0,6M a 4oC, de acordo com Urist(15).
Procedimentos cirúrgicos
Os animais foram anestesiados, por via intramuscular, com 0,5mL/ kg de peso de uma mistura de cloridato de cetamina + cloridato de xilazina, na proporção 1:1 (v/v). Realizaram-se tricotomia e assepsia com álcool iodado da pele na região dorsal
do animal. Uma incisão reta na pele desses animais no senti-do longitudinal, de aproximadamente 25mm, foi realizada para expor o tecido conjuntivo subcutâneo; em seguida, uma cavi-dade cirúrgica foi criada por meio de uma tesoura de ponta romba. O osso fetal bovino em bloco foi colocado na cavida-de cirúrgica através cavida-de uma pinça reta. Seguiu-se a sutura (fio de seda no 3.0, EthiconTM, Johnson & Johnson, São José dos
Campos, Brasil) e assepsia com álcool iodado. No grupo con-trole o mesmo procedimento cirúrgico foi realizado, mas não houve implantação do material. Por todo o período experi-mental os animais receberam dieta normal ad libitum com-posta de ração granulada e água, sendo mantidos em gaiolas com forragem de maravalha.
Decorridos os períodos experimentais de 10, 20, 30 e 60 dias, o tecido reacional foi localizado e removido, seguindo os mesmos procedimentos acima descritos. Em seguida, os animais foram mortos por deslocamento cervical.
Análise microscópica
O tecido reacional obtido de cada animal foi fixado por 24 horas em solução de formalina a 10% em tampão fosfato, la-vado em água corrente por cinco horas e processado para in-clusão em HistosecTM (Merck). Cortes histológicos com 6µm
de espessura foram obtidos e corados com hematoxilina-eosi-na (HE) para avaliação da morfologia e da regularidade super-ficial do material estudado, assim como da resposta biológica dos tecidos circunjacentes ao material, calculada em função das alterações inflamatórias (presença de edema, alterações vasculares e infiltrado inflamatório) e dos processos reparató-rios (grau de fibrosamento, proliferação angioblástica e fibro-blástica). A análise semiquantitativa dos tecidos foi realizada utilizando-se escores de 0 a 3, indicando o grau, a saber, au-sente (0), leve (1), moderado (2) e intenso (3), para o infiltra-do inflamatório, presença de vasos sanguíneos e fibrosamen-to. As medianas e desvio-padrão foram analisados utilizando o teste de Kruskal-Wallis e o de comparações múltiplas de Dunn, se p < 0,05.
RESULTADOS Análise descritiva
Grupo controle
No grupo controle foi observada apenas a regeneração do tecido conjuntivo subcutâneo nos dois primeiros períodos (10 e 20 dias), enquanto nos últimos períodos (30 e 60 dias) foi verificado tecido conjuntivo normal na região com presença de tecido adiposo.
Grupo teste
Período de 10 dias: No período inicial, o FBB estava apa-rentemente regular, exibindo seu formato original, seus espa-ços centrais ocupados por coágulo sanguíneo e rede de fibri-na. Perifericamente, o implante apresentou-se circundado por tecido conjuntivo rico em células e vasos que invadiram suas cavidades, substituindo o coágulo em reabsorção.
A superfície do FBB mais externa exibiu algumas poucas áreas de absorção, com presença de células mononucleadas e células gigantes multinucleadas (figura 1A). Os antigos ca-nais nutritivos da matriz implantada apresentaram-se preen-chidos pelo tecido conjuntivo circundante.
Período de 20 dias: A matriz implantada apresentou-se
praticamente íntegra e os espaços internos ocupados por teci-do conjuntivo frouxo. Na região central teci-do implante a sua superfície mostrou raras áreas de absorção, com presença de células mononucleadas semelhantes a fibroblastos (figura 1B). Circundando externamente o implante, havia a presença de tecido conjuntivo fibroso, com fibras e fibrócitos dispostos paralelamente a sua superfície, que se apresentava integra, in-dicando que a matriz compatibilizou-se com o leito, servindo como ancoragem aos fibroblastos e, conseqüentemente, com as fibras por eles produzidas.
Em algumas áreas da matriz, exibindo células gigantes multinucleadas, mas sem a presença de linfócitos e / ou plas-mócitos, observou-se maior grau de reabsorção (figura 1B).
Período de 30 dias: Na maioria dos casos, os espaços
cen-trais da FBB estavam ocupados por tecido conjuntivo frouxo, enquanto os mais periféricos estavam preenchidos por tecido adiposo característico do tecido subcutâneo da região (figura 2A).
Período de 60 dias: A substituição do tecido conjuntivo
frouxo por tecido adiposo também foi observada nos espaços centrais da FBB e algumas áreas da matriz apresentavam si-nais de absorção, exibindo em sua superfície tecido conjunti-vo circundante com fibrilas colágenas dispersas (figura 2B). Nesse período foi evidente uma redução significante das tra-béculas ósseas da matriz implantada.
Análise semiquantitativa
Os resultados semiquantitativos das observações das lâ-minas estão resumidos na tabela 1 e foram agrupados em função dos períodos experimentais, quanto ao infiltrado in-flamatório, presença de vasos sanguíneos e grau de fibrosa-mento.
O tratamento utilizado não induziu diferença significativa no infiltrado inflamatório em relação ao grupo controle.
Ain-TABELA 1
Valores dos escores atribuídos aos eventos observados nos tecidos reacionais
Períodos Grupos experimentais
experimentais
(dias) Controle FBB
Infiltrado Presença de Fibrosamento Infiltrado Presença de Fibrosamento inflamatório vasos sanguíneos inflamatório vasos sanguíneos
10 1* 1 0 2 2 0 (0,57)** (0,57) (0,57) (0,57) (0,57) (0,57) 20 0 1 2 1 1 1 (0,57) (0,57) (0,00) (1,00) (0,00) (0,57) 30 0 0 2 0 0 2 (0,00) (0,00) (0,57) (0,57) (0,57) (0,00) 60 0 0 2 0 0 1 (0,00) (0,00) (0,57) (0,00) (0,00) (0,57)
** Mediana dos escores ** Desvio-padrão
Escores: 0 – ausente; 1 – leve; 2 – moderado; e 3 – intenso.
B F
←
←
←
←
←
→
→
→
→
→
Figura 1 – Fotomicrografia de luz do implante de FBB (F) no tecido subcutâneo no período de 10 dias. A)
Tecido reacional composto de tecido conjuntivo frouxo, células mononucleares. Notar a presença de célu-las gigantes e célucélu-las mononucleadas em contato com o material implantado (F). Aumento 40x. Coloração HE. B) Período de 20 dias. Detalhes do tecido reacional e a presença de células mononucleares em contato com o osso implantado e pequenos capilares (seta). Aumento 40x. Coloração H.E.
A
*
*
F
Figura 2 – Fotomicrografia de luz do implante de FBB (F) no tecido subcutâneo no período de 30 (A) e 60 (B)
dias. A) Tecido adiposo (ad) presente na periferia do material implantado e tecido conjuntivo frouxo (Tc) no interior dos poros. Aumento 10x. Coloração HE. B) Detalhe de células mononucleadas em contato com fibras do material indicando sua absorção (seta). Aumento 40x. Coloração HE.
A
Tc
F
ad
B→
→
→
→
→
*
Fda, ao longo do tempo, não foi perceptível diferença signifi-cativa com relação a esse parâmetro no grupo controle; po-rém, para o FBB, o infiltrado inflamatório no período de 10 dias (escore 2) foi significativamente maior que aos 60 dias (escore 0, p < 0,05).
A presença de vasos sanguíneos foi semelhante em ambos os grupos nos respectivos períodos experimentais (p > 0,05). Da mesma forma, não se observou variação significativa para a presença de vasos sanguíneos no grupo controle. No grupo
FBB, a redução do escore de 2 para 0 foi significativamente diferente (p < 0,05).
O grau de fibrosamento foi semelhante entre os grupos con-trole e FBB, mas, para o grupo controle, ao longo dos perío-dos, aumentou significativamente de 0, aos 10 dias, para 2 aos 30 e 60 dias (p < 0,05). Entretanto, no grupo FBB, a variação de grau 0 de fibrosamento aos 10 dias para grau 1 (20 dias), grau 2 (30 dias) e grau 1 (60 dias) não foi estatisticamente significativa.
DISCUSSÃO
A busca de um biomaterial ideal que possa servir como material carreador de moléculas sinalizadoras e/ ou células para a engenharia tecidual vem sendo realizada por muitos pesquisadores. Segundo Jin et al, uma propriedade importan-te do biomaimportan-terial é importan-ter geometria com formato 3D apresentan-do porosidade e ter tamanho das partículas adequaapresentan-do(17).
Se-gundo os mesmo autores, a continuidade e interconexão dos poros são de suma importância para a migração celular, inva-são capilar e angiogênese. Nesse sentido, salientamos que a matriz aqui testada (FBB) apresenta essas características ade-quadas, uma vez que as suas porosidades e espaços internos foram rapidamente preenchidos por tecido conjuntivo normal característico da região, demonstrando a biocompatibilidade do material(17).
Uma das desvantagens apontadas por alguns autores(5,18)
para a utilização de matriz de osso homóloga e heteróloga como material de enxerto seria o risco de transmissão de doen-ças(5,18). No entanto, sabe-se que materiais mineralizados ou
desmineralizados liofilizados possuem menor risco para a transmissão viral em relação aos frescos congelados, devido à maneira pela qual são processados(19).
Estudos relatam que os materiais ósseos desmineralizados possuem propriedades osteoindutoras(20-23). Essa capacidade
de osteoindução origina-se da presença de proteínas morfo-genéticas ósseas (bone morphogenetic protein, BMP) na ma-triz óssea que, quando liberadas, induzem células mesenqui-mais indiferenciadas a se diferenciarem em condroblastos,
estimulam a vascularização do novo tecido e desencadeiam a ossificação endocondral.
Salientamos que, no presente trabalho, em nenhum dos períodos analisados foi notada a ocorrência de ossificação ectópica, como observada para a matriz óssea cortical huma-na em sítio heterotópico ou matriz óssea cortical bovihuma-na em sítio ortotópico de animais de laboratório nos períodos de 12 a 15 dias(22-24). A ausência de BMPs ou a sua presença em
quan-tidade insuficiente na matriz de osso fetal bovino poderiam explicar a não ocorrência de osteogênese, ou, ainda, as BMPs estarem em estado inativo nessa matriz(25). Outra hipótese para
explicar a ausência de formação óssea sugerida por vários pesquisadores em experimentos similares seria a ocorrência de reação imunológica inativando as BMPs porventura exis-tentes e bloqueando a neoformação óssea(26). Killey et al,
ana-lisando a resposta celular ao osso bovino misto, isto é, con-tendo tanto a porção mineral como a orgânica, denominado
Kiel bone (B. Braun®, Melsungem, Alemanha), implantado
na calvária de coelhos, observaram que o aparecimento de células gigantes e a absorção do material estavam associados a uma infiltração linfoplasmocitária, que poderia ter impedi-do a osteogênese(27). Contrapondo-se a essa hipótese,
salien-te-se que no presente estudo não foram observados linfócitos ou plasmócitos em quantidade que indicasse reação imunoló-gica ao material em nenhum dos períodos analisados. De fato, a matriz de osso fetal bovino (FBB), apesar de ter induzido um infiltrado inflamatório inicial mais intenso, diminuiu signi-ficativamente até o período de 60 dias, integrando-se aos tecidos do leito receptor, sendo absorvido lentamente, pro-cesso esse mediado, principalmente, por células mononu-cleares.
CONCLUSÃO
Considerando que o material não induziu destruição teci-dual ou recrutamento de células do sistema imunológico, foi parcialmente absorvido e bem tolerado pelo tecido, concluí-mos que o osso fetal bovino foi biocompatível.
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