CENTRO UNIVERSITÁRIO FUNDAÇÃO SANTO ANDRÉ
GINA PLOEGER MANSUELI
DANIELLE FÉLIX DOS SANTOS
RELATÓRIO FINAL DO PROJETO “PADRONIZAÇÃO E
SISTEMATIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA DE
PROTOZOÁRIOS”
SANTO ANDRÉ
2007
GINA PLOEGER MANSUELI (BOLSISTA)
DANIELLE FÉLIX DOS SANTOS (COLABORADORA)
RELATÓRIO FINAL DO PROJETO “PADRONIZAÇÃO E
SISTEMATIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA DE
PROTOZOÁRIOS”
Relatório final apresentado ao Programa de Incentivo à Iniciação Científica do Centro Universitário Fundação Santo André
Orientador:
Prof. Dr. José Luis Laporta Colaboradores:
Marcelo dos Santos Márcia Teixeira Garcia
SANTO ANDRÉ
2007
RESUMO
O Projeto de Iniciação Científica teve como objetivo geral a padronização e sistematização de meios de cultura de protozoários, preparados a partir de amostras coletadas no lago das iguanas, localizado no biotério do Centro Universitário Fundação Santo André. A coleta das amostras foi realizada durante 40 dias, no horário das 9:00 e das 12:00 horas, assim como a medição da temperatura e do valor de pH. A análise desses dados permitiu estabelecer um padrão de temperatura (entre 22OC e 30O C) e pH (entre 5,0 e 9,0), a ser utilizado para a preparação e manutenção de meios de cultura de protozoários. Definidos tais valores, foram realizados testes para estabelecer quais deles seriam os ideais para a preparação dos meios de cultura. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que os valores de pH ideais para o preparo e manutenção de tais meios variam de 5,0 a 7,0 e que todos os valores de temperatura testados são propícios para a manutenção dos meios de cultura.
SUMÁRIO
1 Introdução 05
1.1 Características gerais dos protozoários 06
1.2 Classificação dos protozoários 06
1.3 Morfologia dos protozoários 07
1.3.1 Organelas de locomoção 09
1.4 Ecologia dos protozoários 09
1.4.1 Protozoários de vida livre 09
1.5 Processos reprodutivos dos protozoários 10
1.5.1 Reprodução assexuada 11 1.5.1.1 Divisão binária 11 1.5.1.2 Divisão múltipla 11 1.5.1.3 Gemulação 11 1.5.2 Reprodução sexuada 12 1.5.3 Regeneração 12
1.6 Características dos principais grupos de protozoários 12
1.6.1 Amebas (Classe Sarcodina) 12
1.6.1.1 Morfologia 13
1.6.1.2 Locomoção 13
1.6.1.3 Nutrição, respiração e excreção 13
1.6.1.4 Comportamento 14
1.6.1.5 Reprodução 15
1.6.1.6 Alguns protozoários amebóides 15
1.6.2 Flagelados (Classe Mastigophora) 15
1.6.2.1 Morfologia 16
1.6.2.2 Comportamento 16
1.6.2.3 Nutrição 16
1.6.2.4 Reprodução 17
1.6.3 Ciliados (Classe Ciliata) 17
1.6.3.1 Morfologia 17
1.6.3.2 Locomoção 18
1.6.3.3 Nutrição, respiração e excreção 18
1.6.3.4 Comportamento 19
1.6.3.5 Reprodução 19
1.6.3.6 Alguns protozoários ciliados 19
1.6.4 Esporozoários 20
1.7 Meios de cultura de protozoários 20
1.8 Estudo dos protozoários 21
2 Objetivos 22
3 Materiais e métodos 23
4.1 Primeira etapa 25
4.2 Segunda etapa 30
5 Conclusão 36
Referências 37
Apêndice A – Roteiro de preparação e manutenção de meios 38 de cultura de protozoários
1 INTRODUÇÃO
O Filo Protozoa compreende geralmente protistas unicelulares semelhantes a animais, de tamanho microscópico. Estrutural e funcionalmente, a única célula de um protozoário é mais complexa do que a célula de um animal metazoário, e por este motivo, estes organismos estão classificados no Reino Protista. (STORER et al., 2003).
Alguns protozoários têm estrutura muito simples e outros são complexos, com organelas (órgãos celulares) que executam processos vitais particulares e são funcionalmente análogas aos sistemas de órgãos dos animais multicelulares. (STORER et al., 2003).
Um total de 50.000 tipos de Protozoa é conhecido e, em número de indivíduos, excedem de longe o de todos os animais. Cada espécie vive em determinado habitat úmido (na água do mar ou no fundo do oceano, em água doce, salobra ou poluída, na terra, no solo ou matéria orgânica em decomposição). (STORER et al., 2003).
Muitos protozoários são de vida e de natação livre, enquanto outros são sésseis e alguns, de ambas as categorias, formam colônias. Ainda outros vivem sobre ou dentro de protistas, algumas plantas e de todos os tipos de animais, inclusive do homem. Em diferentes casos, as inter-relações variam de ocorrência casual até parasitismo estrito. Por sua vez, alguns tipos de bactérias vivem sobre ou dentro de protozoários, casualmente, como simbiontes ou como parasitas. (STORER et al., 2003).
Os protozoários ocupam importante papel nas cadeias alimentares das comunidades naturais, servindo de alimento para outros organismos diminutos. De especial significação na economia de muitas comunidades, tanto em habitats terrestres úmidos quanto em ambientes aquáticos, são os protozoários saprófitas e que ingerem bactérias, fazendo uso de substâncias e organismos envolvidos na decomposição final das cadeias alimentares e, assim, fazendo recircular a matéria orgânica. Algumas espécies são úteis na purificação de filtros de água e de esgotos em estações de tratamento, enquanto outras são causadoras de doenças, como a disenteria amebiana, a malária e a doença africana do sono, no homem. (STORER et al., 2003).
1.1 Características gerais dos protozoários
Os protozoários são pequenos (entre 2 e 4 µm), geralmente unicelulares, alguns em colônias de poucos a muitos indivíduos semelhantes. A simetria é bilateral, radial, esférica ou ausente. A forma da célula é geralmente constante, oval, alongada, esférica, ou outra, variada em algumas espécies e mudando com o ambiente ou idade em muitas. O núcleo é distinto, único ou múltiplo. Apresentam outras partes estruturais, como organelas; sem órgãos ou tecidos. (STORER et al., 2003).
A locomoção é realizada através de flagelos, cílios, pseudópodes ou movimentos da própria célula. Algumas espécies têm envoltórios protetores (tecas). Muitas produzem cistos ou esporos resistentes para sobreviver a condições desfavoráveis e para dispersão. (STORER et al., 2003).
A reprodução assexual ocorre por divisão binária, divisão múltipla ou brotamento, enquanto a reprodução sexual ocorre pela fusão de gametas ou por conjugação. (STORER et al., 2003).
1.2 Classificação dos protozoários
A classificação dos Protozoa é complexa, envolvendo quatro Subfilos e oito Classes ou Superclasses. Estima-se em 50.000 o número de espécies de protozoários. Desse total, cerca de 20.000 são fósseis, 23.000 são formas de vida livre e 7.000 são parasitas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Os principais grupos de protozoários são apresentados no Quadro 1. Como ali se verifica, a locomoção é um critério muito importante na diferenciação dos grupos. As amebas se movem por expansões de seu citoplasma. Os ciliados se movimentam por meio de finos apêndices, ou cílios, que impulsionam a célula através de ondulações sincrônicas. Os flagelados têm apêndices filiformes, ou flagelos, usualmente localizados numa das extremidades do corpo celular, que movem as células em ambiente líquido. Os esporozoários se locomovem por deslizamento (flexões somáticas), já que não possuem organelas de locomoção externas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Grupos principais Características
Subfilo Sarcomastigophora Flagelos, pseudópodes ou ambos os tipos de organelas locomotoras; núcleo
único; não há formação de esporos Superclasse Mastigophora
(flagelados)
Um ou mais flagelos tipicamente presentes em trofozoítos; solitários ou
coloniais; reprodução assexuada basicamente por fissão binária; reprodução sexuada desconhecida em
muitos grupos; nutrição fototrófica, heterotrófica ou ambas Superclasse Sarcodina (amebas) Pseudópodes geralmente
presentes; flagelos, quando presentes, restritos às fases de desenvolvimento; corpo nu ou com esqueletos externos ou
internos de vários tipos e variada composição química; reprodução assexuada por fissão; reprodução sexuada, se presente, com gametas
flagelados ou, mais raramente, amebóides
Subfilo Sporozoa Esporos geralmente presentes; núcleo único; cílios e flagelos ausentes;
todas as espécies parasitas
Subfilo Ciliophora (ciliados) Cílios simples ou organelas ciliares compostas, ao menos em uma etapa do
ciclo vital; dois tipos de núcleo; fissão binária na reprodução assexuada; reprodução sexuada por conjugação;
nutrição heterotrófica Quadro 1 – Principais grupos do Filo Protozoa
Fonte: PELCZAR; REID; CHAN, 1980.
1.3 Morfologia dos protozoários
Em geral, a célula individual dos protozoários representa um organismo completo. Como todas as células eucarióticas, a célula dos protozoários também consiste em citoplasma e núcleo (ou núcleos). (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
O citoplasma é um material mais ou menos homogêneo, composto de moléculas protéicas globulosas, frouxamente reunidas para formar uma moldura molecular tridimensional. Embebidas em seu interior, encontram-se as várias estruturas que dão aos protozoários seu aspecto característico. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
A contratibilidade dos protozoários é devida à presença de fibrilas protéicas submicroscópicas no citoplasma. Em diversas formas de protozoários, pigmentos se difundem no citoplasma, que, na maioria desses organismos, diferencia-se em ectoplasma e endoplasma. O ectoplasma é mais semelhante a um gel, enquanto o endoplasma é mais volumoso e fluido. A mudança de uma camada para a outra é gradual. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Como outras células eucarióticas, os protozoários possuem sistemas membranosos no citoplasma. Estes formam uma rede mais ou menos contínua de canais e de lacunas, dando origem ao retículo endoplasmático. Outras estruturas intracitoplasmáticas incluem ribossomos, complexo de Golgi, mitocôndrias, vacúolos nutritivos e contráteis e núcleos. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
O citoplasma, com suas diversas estruturas, está separado do ambiente externo pelo envelope celular. Este funciona não somente na proteção, mas também no controle das trocas de substâncias e é o sítio de percepção dos estímulos químicos e mecânicos, servindo, igualmente, para estabelecer contatos com outras células. Este envelope contém, às vezes, uma película, intimamente aposta à membrana celular. Sua espessura, sua flexibilidade e seu número de camadas são variáveis. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Existem outros tipos de membranas protetoras, produzidos pelos protozoários, que são coberturas externas à película. São elas: carapaças, testes, loricas e cistos. Tais envelopes consistem em materiais diferentes e, em geral, possuem uma matriz orgânica reforçada pela incrustação de substâncias inorgânicas, tais como carbonato de cálcio ou sílica. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Cada protozoário tem, ao menos, um núcleo eucariótico. Muitos protozoários, contudo, possuem núcleos múltiplos durante a maior parte de seus ciclos vitais. Os núcleos são de várias formas, tamanhos e estruturas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Em diversas espécies, cada indivíduo tem dois núcleos similares. Os macronúcleos controlam as atividades metabólicas e os processos de regeneração; os micronúcleos estão relacionados com os processos de reprodução. Os elementos estruturais básicos do núcleo são os cromossomos, a substância nucleolar, a membrana nuclear e o carioplasma (nucleoplasma). (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.3.1 Organelas de locomoção
Os protozoários podem se locomover por meio de três tipos de organelas: pseudópodes, flagelos e cílios. Além disso, algumas espécies podem desenvolver um movimento de deslizamento por flexões do corpo, sem o uso de organelas especializadas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Um pseudópode é uma projeção temporária de parte do citoplasma dos protozoários que não apresentam uma película rígida. Tais organelas são, portanto, típicas das amebas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
O flagelo é uma extensão filamentosa do citoplasma, extremamente fina. Como regra geral, o número de flagelos presentes num indivíduo varia de um até oito. O flagelo se compõe de duas partes: um filamento elástico, chamado axonema, e a bainha citoplasmática contrátil, que envolve o axonema. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Os cílios são extensões celulares finas, curtas e filiformes. Podem apresentar comprimento uniforme ou não, dependendo de sua localização. De modo geral, se dispõem em fileiras longitudinais, oblíquas ou espiraladas, inseridos em arestas ou em sulcos. Além de sua função locomotora, os cílios também auxiliam na ingestão de alimentos e servem, muitas vezes, como organelas tácteis. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.4 Ecologia dos protozoários
Do ponto de vista ecológico, os protozoários podem ser divididos em formas de vida livre e aquelas que vivem em outros organismos. Este último grupo é denominado de simbiótico ou parasita. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.4.1 Protozoários de vida livre
As fases vegetativas (tróficas) dos protozoários de vida livre ocorrem em qualquer tipo de água doce ou salgada, de areia, de solo ou de matéria orgânica em decomposição. Os fatores que influenciam sua distribuição e o seu número num
habitat compreendem a umidade, a temperatura, a luz, a presença de nutrientes e outras condições físicas e químicas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Temperatura: na fase encistada (estrutura de parede espessa num período inativo), os protozoários podem suportar variações térmicas muito maiores do que na fase trófica. A tolerância térmica varia com as diferentes condições ambientais. A maior parte dos protozoários, contudo, apresenta uma temperatura ótima entre 16 e 25oC, estando o limite máximo entre 36 e 40oC. As temperaturas baixas são menos prejudiciais. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Luz: a luz solar é essencial para os protozoários portadores de cromatóforos, que efetuam fotossíntese. Assim, os protozoários exigentes de microorganismos fotossintéticos para sua alimentação também requerem a luz solar, ainda que indiretamente. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Concentração hidrogeniônica (pH): alguns protozoários podem tolerar uma ampla variação de pH (por exemplo, de 3,2 a 8,7). Para a maioria, no entanto, a faixa de pH entre 6 e 8 representa o ótimo para sua máxima atividade metabólica. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Nutrientes: a população de protozoários num ambiente aquático é influenciada pelos constituintes químicos da água. Alguns protozoários conseguem viver em águas ricas em oxigênio, com baixo teor de matéria orgânica; outros requerem água rica em sais minerais. Certos tipos crescem em águas onde houver ativa oxidação e degradação de materiais orgânicos (a maioria dos protozoários de água doce). Ainda outros preferem água com pouco oxigênio, mas abundante em produtos de decomposição. O suprimento nutritivo, num determinado habitat, é o principal fator determinante da distribuição e do número de protozoários. Como regra geral, aqueles que se alimentam de uma variedade de organismos demonstram larga distribuição; os que são mais seletivos têm distribuição limitada. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.5 Processos reprodutivos dos protozoários
Os protozoários reproduzem-se por diversos processos sexuados e assexuados.
1.5.1 Reprodução assexuada
A reprodução assexuada ocorre por simples divisão celular, que pode ser igual (originando células-filhas iguais) ou desigual (originando células-filhas diferentes). Divisão binária é aquela na qual ocorre formação de duas células-filhas. Divisão múltipla é aquela na qual ocorre a formação de muitas células-filhas. A gemulação é uma variante da divisão celular desigual. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.5.1.1 Divisão binária
A forma mais elementar de divisão binária é verificada entre as amebas. Nos flagelados, a divisão é geralmente longitudinal. A fissão transversa é característica para a maior parte dos ciliados, embora também possa ocorrer a divisão longitudinal em algumas espécies. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.5.1.2 Divisão múltipla
Na divisão múltipla, uma única célula-mãe se divide para formar muitas células-filhas. Usualmente, é precedida pela multiplicação nuclear, no interior da célula-mãe, que se cliva rapidamente a fim de formar um número correspondente de células-filhas. Nos ciliados e nos flagelados, este tipo de divisão é encontrado somente em algumas espécies. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.5.1.3 Gemulação
A gemulação é a formação de uma ou mais células menores, a partir de uma célula original. Em seu uso estrito em protozoologia, esta denominação deve ser reservada para aqueles casos em que a célula-mãe permanece séssil e libera uma ou mais células-filhas natatórias. Essas diferem da célula-mãe, não apenas quanto ao seu menos grau de diferenciação, mas também porque possuem organelas locomotoras especiais. A gemulação pode ser exógena (que envolve a formação e a separação da gêmula para fora) ou endógena (na qual a célula natatória é formada dentro da célula-mãe). (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.5.2 Reprodução sexuada
Vários tipos de reprodução sexuada foram observados entre os protozoários. A fusão sexuada de dois gametas ocorre em diversos grupos. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
A conjugação, geralmente uma união temporária de dois indivíduos para troca de material nuclear, é observada, exclusivamente, nos ciliados. Depois da troca de núcleos, os conjugantes se separam e cada um dá origem à sua respectiva progênie por fissão ou gemulação. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Quando os gametas são morfologicamente iguais, recebem a denominação de isogametas. Quando são morfologicamente diferentes, chamam-se anisogametas (podendo ser microgametas ou macrogametas). Os microgametas são móveis, relativamente pequenos e usualmente numerosos, em contraste com os macrogametas. Os anisogametas são comuns entre os esporozoários. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.5.3 Regeneração
A capacidade de regenerar partes perdidas é característica de todos os protozoários, desde as formas mais simples até aquelas que apresentam estruturas altamente complexas. Quando um protozoário é cortado em dois, a porção nucleada se regenera, mas a porção anucleada degenera. Isto demonstra que, em geral, o núcleo é necessário para que acorra a regeneração. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.6 Características dos principais grupos de protozoários
1.6.1 Amebas (Classe Sarcodina)
A ameba parece ser a forma de vida mais simples do Reino Protista, uma célula independente com núcleo e citoplasma, mas com poucas organelas permanentes. A despeito da sua aparente simplicidade, ela pode mover-se, capturar, digerir e assimilar alimento complexo, eliminar resíduos não digeridos, respirar, produzir secreções e excreções, responder a estímulos de vários tipos (tanto do
ambiente interno quanto do externo), crescer e reproduzir-se. Realiza, assim, todas as atividades vitais essenciais e mostra especialização fisiológica em vários processos sem ter muitas partes estruturalmente diferenciadas para fazê-lo. (STORER et al., 2003).
1.6.1.1 Morfologia
As amebas se compõem de protoplasma, diferenciado em membrana citoplasmática, citoplasma e núcleo. O citoplasma apresenta grânulos e vacúolos contendo alimentos. A membrana mais externa é seletiva e permite a passagem de certos nutrientes solúveis para dentro da célula e de materiais para fora. O núcleo funciona na reprodução, no metabolismo e na transmissão dos caracteres hereditários. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.6.1.2 Locomoção
As amebas movimentam-se formando e estendendo projeções temporárias, os pseudópodes (gr. pseudos, falso + podos, pé), em qualquer lugar do seu corpo. Este tipo de fluxo irregular é chamado movimento amebóide. É provável que o movimento amebóide não seja só de um tipo, mas que seja diferente nos vários organismos que o utilizam. Três aspectos importantes da locomoção são: fixação ao substrato, possivelmente por uma secreção; transformação do plasmagel em plasmassol na extremidade posterior e o processo oposto na extremidade anterior; e aumento da força elástica do plasmagel à medida que ele passa para trás. A fixação faz-se melhor em superfícies ásperas, mas depende da natureza do líquido que circunda o protozoário e de suas condições fisiológicas. (STORER et al., 2003).
1.6.1.3 Nutrição, respiração e excreção
As amebas também utilizam os pseudópodes para capturar alimentos. As projeções cercam as partículas alimentares, que são armazenadas no interior de vacúolos, dentro do citoplasma. Com a passagem de enzimas da célula para o vacúolo, o alimento é digerido e assimilado. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
As amebas comem outros protozoários, algas, rotíferos e protoplasma morto, preferindo pequenos flagelados e ciliados vivos. Cada ameba pode comer vários paramécios ou várias centenas de pequenos flagelados diariamente e mostra-se capaz de selecionar o alimento. O alimento pode ser tomado em qualquer parte da superfície celular. Os materiais absorvidos servem para crescimento e reprodução, assim como fornecem a energia para a locomoção. Os resíduos não digeridos são eliminados em qualquer parte da superfície celular. (STORER et al., 2003).
O oxigênio dissolvido na água na qual a ameba vive difunde-se através da membrana celular. (STORER et al., 2003).
O metabolismo resulta na produção de produtos de excreção, tais como dióxido de carbono e uréia, que são eliminados principalmente por difusão através da membrana celular. O vacúolo contrátil atua na excreção, mas sua função principal é regular o conteúdo de água no corpo celular. (STORER et al., 2003).
1.6.1.4 Comportamento
As amebas reagem aos vários estímulos físicos e químicos do ambiente. As respostas a estímulos ou mudanças em seu ambiente interno ou externo constituem seu comportamento. A fome é um estímulo interno ao qual a ameba responde com a procura de alimento. O contato com uma partícula alimentar é um estímulo externo ao qual ela responde emitindo pseudópodes para capturar o alimento. (STORER et al., 2003).
A resposta ao toque ou contato é variada. Como na natureza a ameba é exposta à luz de intensidades variáveis, ela não responde a mudanças graduais de iluminação. A resposta à temperatura é demonstrada pelas mudanças na locomoção e ritmo de alimentação, que diminuem à medida que a temperatura da água se aproxima do congelamento. A locomoção é acelerada em temperaturas altas, mas cessa acima de 30oC. Às soluções salinas fortes a ameba responde negativamente, mas a substâncias difundidas do alimento ela responde positivamente. (STORER et al., 2003).
1.6.1.5 Reprodução
A reprodução das amebas se realiza pelo simples processo assexuado da fissão binária. Como proteção durante períodos desfavoráveis ao crescimento, algumas amebas mostram a capacidade de encistamento. Nesta condição, suas atividades metabólicas se reduzem ao mínimo, formando-se um cisto, que permite sua sobrevivência até que retornem os fatores favoráveis ao seu desenvolvimento. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.6.1.6 Alguns protozoários amebóides
Alguns protozoários amebóides de vida livre são os foraminíferos, muitos dos quais produzem uma carapaça com numerosas câmaras. Esses organismos obtêm sua alimentação por meio de pseudópodes, que se projetam através de poros presentes nas finas carapaças. Os radiolários são formas marinhas, que, em sua maioria, constroem carapaças de sílica. Os depósitos de seus esqueletos são incorporados em rochas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Espécies do gênero Entamoeba habitam o intestino de muitos vertebrados. Muitas delas, como as que vivem na cavidade oral e no intestino humano são inócuas. No entanto, Entamoeba hystolitica é a causadora da disenteria amebiana nos seres humanos. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.6.2 Flagelados (Classe Mastigophora)
A presença de um ou mais flagelos longos e delicados, em algum ou em todos os estágios do ciclo vital, é característica dos Mastigophora. Os flagelos servem para locomoção e captura de alimentos e podem ser receptores sensitivos. O corpo celular é usualmente de forma definida (oval, longa ou esférica), coberto por uma película firme. Muitos flagelados são de vida livre e solitários, outros são sésseis e alguns formam colônias de poucos até milhares de indivíduos. Abundam em água doce e salgada e diversas espécies habitam o solo. (STORER et al., 2003).
Os flagelados dividem-se em dois grupos: as formas semelhantes a plantas (fitoflagelados) e as formas semelhantes a animais (zooflagelados). Os fitoflagelados
geralmente contêm clorofila e são fotossintéticos. Os zooflagelados não possuem clorofila e realizam sua nutrição de modo heterotrófico. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.6.2.1 Morfologia
O corpo desses protozoários é de forma constante e apresenta uma extremidade anterior arredondada, que habitualmente se desloca dirigida para a frente e uma extremidade posterior, que é pontiaguda. A forma do corpo é mantida por uma membrana de revestimento fina e flexível (película). A extremidade anterior contém um citóstoma, que conduz a uma citofaringe. Um longo flagelo estende-se para fora através do citóstoma. (STORER et al., 2003).
1.6.2.2 Comportamento
Os movimentos dos flagelados ocorrem pelo batimento dos flagelos para trás e para frente, arrastando o protozoário através da água, com uma rotação em espiral, seguindo um curso reto. O flagelado pode também rastejar por movimentos espirais do corpo. Geralmente, esses protozoários reagem positivamente à luz, nadando na direção de uma fonte de intensidade favorável, mas realizam uma reação de repulsa à luz solar direta. STORER et al., 2003).
1.6.2.3 Nutrição
Alguns flagelados de vida livre capturam pequenos organismos, os quais são tomados dentro da citofaringe e digeridos em vacúolos digestivos no citoplasma (nutrição holozóica). (STORER et al., 2003).
A nutrição realizada através da fotossíntese, na qual os alimentos são sintetizados dentro do corpo, é denominada holofítica. (STORER et al., 2003).
A nutrição saprofítica consiste na absorção de materiais nutrientes dissolvidos na água. (STORER et al., 2003).
1.6.2.4 Reprodução
Os flagelados reproduzem-se, freqüentemente, por fissão binária longitudinal. O núcleo divide-se em dois por mitose, então as organelas anteriores são duplicadas e o organismo fende-se em dois longitudinalmente. Também apresentam estágios inativos, quando se tornam imóveis e encistam-se. O encistamento é estimulado por falta de alimento ou pela presença de clorofila. (STORER et al., 2003).
1.6.3 Ciliados (Classe Ciliata)
Os ciliados possuem cílios durante toda a vida, os quais servem para locomoção e captura de alimento. Cada espécie possui forma constante e característica e a maioria delas tem um macronúcleo grande, relacionado com as funções vegetativas e um ou mais micronúcleos pequenos, importantes na reprodução. (STORER et al., 2003).
Os ciliados são os protozoários mais especializados, por terem várias organelas para realizar processos vitais particulares. Isto resulta em divisão de trabalho entre as partes do organismo, análoga àquela de sistemas de órgãos em um animal multicelular. (STORER et al., 2003).
Os ciliados constituem o maior grupo de protozoários, com cerca de 6 mil espécies e abundam em águas doces e salgadas. Muitos são de vida livre, alguns são comensais ou parasitas e outros são sésseis. (STORER et al., 2003).
1.6.3.1 Morfologia
O corpo celular longo é arredondado na extremidade que se move para frente (anterior), sendo a extremidade posterior afilada. A superfície externa é coberta pela película, com cílios finos, dispostos em séries longitudinais e de comprimento uniforme. Internamente à película, o conteúdo celular consiste de uma camada externa, ectoplasma, ao redor do endoplasma. (STORER et al., 2003).
Esses protozoários apresentam citóstoma (boca celular), que abre-se em uma citofaringe. Logo atrás desta localiza-se o citoprocto (ânus celular), o qual pode ser visto apenas quando partículas são descarregadas através dele. No endoplasma, há
vacúolos digestivos de vários tamanhos, que contêm material em processo de digestão e, na direção de cada extremidade do corpo, há um vacúolo contrátil. (STORER et al., 2003).
1.6.3.2 Locomoção
Os ciliados movimentam-se muito rapidamente, devido ao pulsar rítmico dos cílios. Uma vez que estes podem pulsar em qualquer direção, torna-se possível tanto o movimento para frente como para trás e o organismo é capaz, também, de girar em qualquer direção. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
Os cílios batem para trás para deslocar o organismo para frente e, como suas vibrações são oblíquas, este gira em seu eixo longitudinal. Para nadar para trás, o batimento ciliar é invertido, assim como o percurso da rotação. Se, quando nadando para frente, o ciliado encontra algum estímulo químico desfavorável, ele executa uma reação de repulsa: o batimento ciliar inverte-se, de modo que o protozoário move-se para trás. (STORER et al., 2003).
1.6.3.3 Nutrição, respiração e excreção
Os ciliados alimentam-se de bactérias, pequenos protozoários, algas e fermentos. Os ciliados ingerem o alimento através de um poro bucal fixo, situado na base de um sulco oral. As partículas alimentícias são dirigidas pelos cílios para dentro da célula e são coletadas em vacúolos intracelulares, onde são digeridas por enzimas. As partículas não digeridas são eliminadas pelo poro anal. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
O oxigênio dissolvido na água circundante difunde-se através da película e daí por todo o organismo. O dióxido de carbono e os restos orgânicos resultantes do metabolismo são excretados por difusão na direção oposta. Os líquidos usados são coletados nos vacúolos contráteis, que têm posições fixas e regulam o conteúdo de água no corpo. (STORER et al., 2003).
1.6.3.4 Comportamento
A resposta ao contato é variada nos ciliados. Temperaturas altas (maior que 28oC) estimulam movimentos rápidos e reação de repulsa até que os protozoários escapem ou morram. Em água gelada eles também procuram escapar. À gravidade, há geralmente uma resposta negativa. Em uma lenta corrente de água os ciliados geralmente se alinham com a direção desta, opondo a extremidade anterior à corrente. A resposta é negativa à maioria das substâncias químicas. (STORER et al., 2003).
1.6.3.5 Reprodução
Os ciliados se reproduzem assexuadamente por fissão binária ou sexuadamente por conjugação. No primeiro processo, cada um dos núcleos se alonga e se divide em duas metades. A célula em si sofre um processo de constrição ao longo de uma linha mediana, produzindo duas células-filhas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
A conjugação realiza-se quando duas amostras diferentes de uma mesma espécie de ciliado entram em contato mútuo. Embora essas células não sejam diferenciadas como masculina e feminina, dois indivíduos, em circunstâncias especiais, podem se reunir. Quando se unem, seus núcleos sofrem divisões. Em cada conjugante, dois núcleos haplóides se fundem, originando um núcleo diplóide. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.6.3.6 Alguns protozoários ciliados
Os protozoários ciliados são representados por muitas formas. Colpoda é um gênero comum de águas doces. O gênero Didinium se alimenta de paramécios, que são capturados por uma estrutura especial e engolidos inteiros. O gênero Stentor compreende grandes protozoários. Ciliados coloniais ocorrem em grupos, presos a uma longa haste fibrosa. Os agrupamentos desses organismos são constituídos por muitas células-filhas. O único ciliado parasita é o Balantidium coli. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.6.4 Esporozoários
O Subfilo Sporozoa compreende um grupo de protozoários esporogênicos, que são relativamente pequenos e obrigatoriamente parasitas. As formas adultas não possuem órgãos de locomoção. Sua alimentação deriva, em sua maior parte, das células hospedeiras ou dos líquidos orgânicos em que vivem. Muitas espécies apresentam ciclos vitais complexos, com algumas fases se desenvolvendo em um hospedeiro e outras fases em hospedeiros diferentes. Pode ocorrer uma fase reprodutiva sexuada durante o ciclo vital. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
O corpo celular simples é arredondado ou alongado, com um núcleo e sem organelas locomotoras ou vacúolo contrátil. Alguns movem-se por modificações na forma do corpo. A respiração e a excreção ocorrem por simples difusão. (STORER et al., 2003).
A maioria dos esporozoários multiplica-se rapidamente por divisão assexual múltipla, na qual a célula torna-se multinucleada por sucessivas mitoses e então o citoplasma se divide. Os merozoítos resultantes continuam a disseminar o esporozoário através dos tecidos do hospedeiro. Após uma fase de maturação, os merozoítos produzem macro e micro gametas, que se reúnem formando um zigoto. Este, em muitas espécies, produz esporozoítos, estágio no qual os organismos são espalhados de um indivíduo hospedeiro para outro. (STORER et al., 2003).
Os esporozoários são os organismos parasitas de mais larga ocorrência. Espécies distintas ocorrem em diversos organismos, de protozoários a mamíferos. Alguns vivem dentro das células do hospedeiro e outros, nos líquidos ou cavidades do corpo. Podem habitar o trato digestivo, músculos, sangue, rins ou outros órgãos. Entre os mais importantes estão os agentes etiológicos da malária (todos do gênero Plasmodium). (STORER et al., 2003).
1.7 Meios de cultura de protozoários
De acordo com PELCZAR; REID; CHAN, 1980, os cientistas aprenderam a cultivar muitos tipos de microrganismos, conseguindo fazê-los crescer e mantê-los viáveis. O estudo dos protozoários geralmente é feito por meio de preparações a fresco, obtidas de infusões, de culturas mistas ou puras, quando são utilizados
corantes vitais, supravitais e certas técnicas sem corantes. No entanto, várias observações são feitas em lâminas permanentes, onde os protozoários são eventualmente anestesiados, fixados, corados e finalmente montados num meio apropriado.
Diversas são as fórmulas utilizadas para a preparação dos nutrientes oferecidos aos meios de cultura. Entre elas, há a utilização de recipientes com alguns grãos de arroz cru, que atua como fonte de matéria orgânica. Há também a afirmação que para um bom desenvolvimento destes seres, é necessário que o local seja moderadamente iluminado, pois locais escuros impedem o desenvolvimento de plantas microscópicas, que são parte importante para a nutrição dos protozoários e locais expostos à luz solar direta também deve ser evitada, pois aquece excessivamente os recipientes. (RODRIGUES, 1978).
A compreensão dos meios físicos, como temperatura, pH, luminosidade, dentre outros, são fatores principais, pois juntos criam as condições ideais para o desenvolvimento celular. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).
1.8 Estudo dos protozoários
O estudo dos protozoários é realizado na disciplina de Ciências nas escolas de ensino fundamental, em aulas de Biologia do ensino médio e nas aulas de Zoologia no ensino superior.
De acordo com KRASILCHIK, 1983, ouvir falar sobre um organismo é em geral muito menos interessante e eficiente do que ver diretamente a realidade.
Nos cursos de Biologia, as aulas práticas realizadas em laboratórios são essenciais, porque permitem um contato direto do aluno com os organismos observados. Mesmo reconhecendo essa importância, na realidade formam uma parcela muito pequena dos cursos de Biologia porque, segundo os professores, não há tempo suficiente para a preparação do material. (KRASILCHIK,1983).
Para que se concretize, é importante a disponibilidade desses organismos, tornando-se necessária a preparação de meios de cultura, os quais contenham nutrientes e meios físicos apropriados para fornecer a eles crescimento e ambiente propícios à proliferação.
2 OBJETIVOS
Objetivo geral
Padronizar culturas de diferentes espécimes de protozoários, a partir de matrizes encontradas na água do recinto das tartarugas aquáticas, localizadas no biotério do Centro Universitário Fundação Santo André.
Objetivos específicos
Cultivar matrizes in-vitro, reproduzindo suas necessidades ambientais. Implementar a sistematização contínua de culturas de protozoários.
Elaborar roteiro de preparação e manutenção dos meios de cultura para as aulas de biologia.
Oferecer aos professores e graduandos resultados satisfatórios de visualização nas aulas práticas de microscopia com protozoários.
Subsidiar informações complementares sobre protozoários para os professores de escolas da região.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Inicialmente, foram realizadas, durante 10 dias, coletas de amostras de água do lago das iguanas e do lago das tartarugas (localizados no Biotério do Centro Universitário Fundação Santo André). Tais coletas foram feitas em dois horários: às 9:00 e às 12:00 horas. As amostras coletadas foram observadas entre lâmina e lamínula, ao microscópio óptico, do Laboratório de Zoologia do Centro Universitário Fundação Santo André, para a visualização de espécimes de protozoários.
Baseado nas observações realizadas nos 10 primeiros dias de coleta, concluiu-se que o melhor local para a retirada de amostras era o lago das iguanas e que o horário que apresentava melhores resultados era o das 12:00 horas. Assim, foram coletadas, durante 30 dias, amostras deste recinto, neste horário, anotando-se as temperaturas interna e externa (medidas com o uso de termômetro, cuja escala variava de 0OC a 100oC) o valor de pH do lago (medido com o uso de fitas indicadoras de pH, cuja escala de valores variava de 0 a 14) e a luminosidade do ambiente. Assim como as 10 primeiras, essas amostras também foram utilizadas para a observação de protozoários.
Ao término dos 40 dias de coleta, foi feito um levantamento dos dados obtidos, com o objetivo de estabelecer um padrão de temperatura e pH a ser utilizado para a preparação e manutenção de meios de cultura de protozoários.
Definidos os valores de pH e temperatura a serem utilizados, foram realizados testes para estabelecer quais deles seriam os ideais para a preparação dos meios de cultura.
Os valores de pH testados foram mantidos com o uso de substâncias-tampão, preparadas, inicialmente, com a utilização de uma solução de cloreto de sódio a 0,9% (os ajustes necessários para a obtenção de cada valor foram feitos com o uso de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico) e, posteriormente, com a utilização de cloreto de sódio misturado a água diluída.
Os meios preparados com as substâncias-tampão e amostras de protozoários coletadas no lago das iguanas, foram mantidos em estufa (utilizada para manter estáveis as temperaturas a serem testadas) por um período de 24 horas. Posteriormente, com a impossibilidade da utilização de substâncias-tampão
(verificada a partir dos testes realizados), foi utilizada água proveniente de caixa d’água para manter os meios.
Finalizados os testes, foi estabelecida uma faixa de pH e temperatura ideal para a manutenção de meios de cultura de protozoários, assim como foi elaborado um roteiro de preparação e manutenção desses meios (Apêndice A), para que possam ser utilizados em aulas práticas de Biologia.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Primeira etapa
A primeira etapa do Projeto “Padronização e Sistematização de meios de cultura de protozoários” consistiu em se realizar, durante 40 dias, coletas de amostras de água do recinto das tartarugas e do recinto das iguanas, localizados no Biotério do Centro Universitário Fundação Santo André.
As dez primeiras coletas foram realizadas em dois horários diferentes, às 9:00 horas da manhã e às 12:00 horas, e tiveram como objetivo estabelecer qual dos dois horários apresentava melhores condições para a realização da segunda etapa do Projeto.
Somente o lago das tartarugas seria utilizado para as coletas das dez primeiras amostras. No entanto, logo no início do desenvolvimento do Projeto, percebeu-se que este local provavelmente não apresentaria condições satisfatórias para a sua realização. Por ser lavado com uma freqüência maior que o lago das iguanas (todo dia ou a cada dois dias), seus padrões de pH e temperatura mudam constantemente, o que poderia afetar o resultado das coletas. Decidiu-se, então, realizar as coletas também no lago das iguanas, que apresentava mais estabilidade quanto às variáveis envolvidas no estudo (por não ser lavado com a mesma freqüência que o lago das tartarugas). Assim, seria possível comparar qual dos dois recintos apresentaria as melhores condições para a observação de espécimes de protozoários.
Como pode ser observado na Tabela 1 e no Gráfico 1, que apresentam os resultados obtidos com as coletas realizadas no lago das tartarugas, foram feitas coletas nos dois horários especificados acima, durante dez dias. Das 20 coletas realizadas (10 em cada horário), 12 não apresentaram resultados satisfatórios, provavelmente devido à limpeza periódica do lago. Observou-se que, no dia da limpeza ou 1 dia após, não havia protozoários na amostra coletada. Os protozoários observados nas demais amostras pertenciam a 2 grupos: Ciliata (que possuem cílios como organela de locomoção) e Mastigophora (que apresentam flagelos como organela de locomoção). O objetivo era que houvesse, também, a observação de
protozoários do grupo Sarcodina (que realizam movimentos através dos pseudópodes), o que não ocorreu.
Tabela 1: Resultados obtidos a partir das dez primeiras coletas realizadas no lago das tartarugas, no período de 08 a 22 de fevereiro de 2006
Dia Horário TO ext. (oC)
TO int. (oC)
Luminosidade pH Amostras 9:20 23,5 22 Parc. nublado 6,0 Ciliados 1
12:00 25 23,5 Parc. nublado 6,0 Nada
9:15 21,5 21 Parc. nublado 6,0 Ciliados e flagelados 2
12:00 25 23 Ensolarado 6,0 Nada
9:15 21,5 21,5 Parc. nublado 6,0 Nada
3 12:00 28,5 23,5 Ensolarado 7,0 Nada 9:10 23,5 21 Ensolarado 7,0 Ciliados e flagelados 4 12:00 29,5 23,5 Ensolarado 7,0 Ciliados 9:10 25,5 23,5 Ensolarado 7,0 Ciliados 5 12:00 32 26 Ensolarado 5,5 Nada 8:50 24 23 Nublado 5,5 Nada 6
11:40 30 24 Parc. nublado 5,5 Nada
9:00 24 23 Parc. nublado 6,0 Ciliados
7
12:15 28 25,5 Ensolarado 6,0 Ciliados
9:00 26 23 Parc. nublado 6,0 Nada
8
12:00 27,5 24 Parc. nublado 6,0 Nada
9:15 22 21,5 Chuvoso 6,0 Nada
9
12:00 23 21,5 Nublado 6,5 Nada
9:25 24 22,5 Nublado 5,0 Nada
10
11:50 29,5 24,5 Parc. nublado 6,0 Ciliados
0 0,5 1 1,5 2 2,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1o horário 2o horário
Gráfico 1: Resultados obtidos a partir das dez primeiras coletas realizadas no lago das tartarugas, no período de 08 a 22 de fevereiro de 2006
De acordo com a observação dos resultados obtidos a partir das dez coletas iniciais, pode-se notar que a temperatura externa variou de 21,5oC a 32oC, enquanto a temperatura interna oscilou entre 21oC e 26oC. O valor do pH variou de 5,0 a 7,0.
A Tabela 2 e os Gráfico 2 e 3 apresentam os dados obtidos a partir das coletas realizadas no lago das iguanas, também às 9:00 e às 12:00 horas (exceto no primeiro dia, em que foi realizada apenas às 13:30). Algumas amostras coletadas não apresentaram protozoários. No entanto, nas amostras em que eles foram observados, estes pertenciam aos 3 grupos objetos do estudo: ciliados, flagelados e sarcodinos (amebas). A presença de protozoários desses 3 grupos nas amostras coletadas no lago das iguanas foi fundamental para a escolha desse recinto como o local que seria utilizado para a realização das 30 coletas subseqüentes.
As amostras coletadas no lago das iguanas foram feitas em dois pontos diferentes: no fundo e no tronco (localizado no meio do lago), pois julgou-se que eles apresentariam diferentes resultados. No entanto, observou-se, com a análise dos dados obtidos, que estes pontos não apresentavam diferenças significativas quanto aos espécimes observados.
De acordo com o observado na Tabela 2, a temperatura externa oscilou entre 21,5oC e 30oC, enquanto temperatura interna variou entre 20oC e 25,5oC. O valor de pH ficou entre 5,5 e 7,0.
Comparando-se os dados obtidos a partir das amostras coletadas no lago das tartarugas e no lago das iguanas, pode-se concluir que foram muito semelhantes. Isso evidencia que a observação de protozoários nas amostras coletadas em ambos os recintos não foi determinada, exclusivamente, pelas temperaturas interna e externa ou pelo pH, mas principalmente pela lavagem menos freqüente do lago das iguanas. Ou seja, a lavagem periódica do lago das tartarugas influenciou o resultado, de modo que não foi possível observar protozoários na maioria das amostras nele coletadas.
Com relação ao horário, concluiu-se que este, provavelmente, não influenciava na presença de protozoários nas amostras coletadas. Assim, o horário das 12:00 foi o escolhido para a realização das 30 coletas subseqüentes.
Tendo sido escolhido o lago das iguanas (devido à sua maior estabilidade) e o horário das 12:00 horas como local e período ideais para a próxima etapa do Projeto,
foram realizadas 30 coletas (uma por dia), nas quais foram observados e anotados as temperaturas externa e interna, o pH e a luminosidade.
Tabela 2: Resultados obtidos a partir das nove primeiras coletas realizadas no lago das iguanas, no período de 09 a 22 de fevereiro de 2006
Dia Horário TO ext. (oC) TO int. (oC) Luminosidade pH Amostras (fundo) Amostras (tronco)
13:30 27 24 Ensolarado 6,0 Nada Nada
1
9:15 21,5 21,5 Parc. nublado 6,0 Ciliados Ciliados e flagelados 2
12:00 28,5 24,5 Ensolarado 6,0 Ciliados Ciliados 9:10 23,5 20 Ensolarado 6,0 Ciliados Ciliados 3
12:00 29,5 25,5 Ensolarado 6,0 Nada Ciliados
9:10 25,5 22,5 Ensolarado 6,0 Nada Nada
4
12:00 32 25,5 Ensolarado 5,5 Ciliados Nada
8:50 24 23 Nublado 5,5 Nada Nada
5
11:40 30 25 Parc. nublado 5,5 Ciliados Nada 9:00 24 22,5 Parc. nublado 5,5 Ciliados,
amebas e flagelados
Nada 6
12:15 28 25,5 Ensolarado 5,5 Ciliados Ciliados 9:00 26 23 Parc. nublado 5,5 Nada Ciliados 7
12:00 27,5 24,5 Parc. nublado 6,0 Ciliados Ciliados 9:15 22 21,5 Chuvoso 6,0 Ciliados Ciliados 8
12:00 23 21,5 Nublado 6,5 Ciliados Ciliados
9:25 24 22,5 Nublado 7,0 Nada Ciliados
9
12:00 29,5 24 Parc. nublado 7,0 Ciliados Ciliados e amebas 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1o horário 2o horário
Gráfico 2: Resultados obtidos a partir das nove primeiras coletas realizadas no lago das iguanas, no período de 09 a 22 de fevereiro de 2006
0 0,5 1 1,5 2 2,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1o horário 2o horário
Gráfico 3: Resultados obtidos a partir das nove primeiras coletas realizadas no lago das iguanas, no período de 09 a 22 de fevereiro de 2006
A Tabela 3 apresenta os resultados obtidos com as amostras coletadas durante 30 dias. De acordo com os dados observados, pode-se notar que a temperatura interna variou de 17,5oC a 24oC, enquanto a temperatura externa oscilou entre 19oC e 30oC. O valor de pH ficou entre 5,5 e 9,0. Pode-se observar que 8 das 30 coletas realizadas não permitiram a observação de espécimes de protozoários, provavelmente devido à lavagem do lago no dia da coleta.
Inicialmente, seriam realizadas 50 coletas nessa fase do Projeto. No entanto, o lago das iguanas teve que passar por uma reforma devido à ocorrência de rachaduras e vazamentos. Foi necessário cimentar o recinto, o que impediu a realização das coletas complementares. Independente disso, as 30 coletas realizadas foram suficientes para determinar um padrão de temperatura, pH e luminosidade ideal, que será utilizado para a preparação e manutenção de meios de cultura de protozoários.
Tabela 3: Resultados obtidos a partir de 30 coletas, realizadas no lago das iguanas, às 12:00 horas, no período de março a abril de 2006
Dia TO int. (oC)
TO ext. (oC)
pH Luminosidade Amostras
1 24 26,5 6,0 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas
2 24 30 6,0 Ensolarado Ciliados
3 23 29 5,5 Ensolarado Ciliados
4 24 28 6,0 Ensolarado Ciliados
5 21,5 25 6,0 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas
6 22,5 28 7,0 Ensolarado Ciliados
7 23 26 6,0 Nublado Ciliados e flagelados
8 24 25 6,0 Nublado Ciliados
9 23,5 25 6,0 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas
10 23 26 5,5 Nublado Nada
11 24 27 6,0 Parc. nublado Nada
12 24 28,5 6,0 Nublado Ciliados, flagelados e amebas
13 22 23,5 5,5 Nublado Ciliados
14 24 28 6,0 Ensolarado Nada
15 22 22,5 6,5 Nublado Ciliados, flagelados e amebas
16 21 23,5 6,0 Nublado Nada
17 21,5 23 6,0 Nublado Ciliados
18 20 19 7,0 Parc. nublado Ciliados
19 21 22 7,0 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas
20 20 21 7,0 Nublado Nada
21 24 23 7,0 Ensolarado Ciliados, flagelados e amebas 22 20 22,5 6,0 Ensolarado Ciliados e flagelados 23 21 19 7,0 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas
24 19 19 6,0 Chuvoso Ciliados e amebas
25 20 20,5 8,5 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas
26 19 21 7,0 Nublado Nada
27 20 22 6,0 Nublado Ciliados e flagelados
28 19 20 6,0 Nublado Ciliados e flagelados
29 20,5 21 7,0 Nublado Nada
30 17,5 20,5 9,0 Ensolarado Nada
4.2 Segunda etapa
De acordo com as coletas e observações realizadas na primeira etapa do Projeto, foi possível estabelecer uma faixa de pH e temperatura ideal para a manutenção de um meio de cultura de protozoários. Assim, os valores de pH
utilizados e testados na segunda etapa foram: 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 e 9,0 e os de temperatura foram: 22oC, 24oC, 26oC, 28oC e 30oC.
A segunda etapa do Projeto consistiu na realização de testes in-vitro com amostras que apresentavam diferentes valores de pH, mantidas em diferentes temperaturas.
As amostras de protozoários utilizadas nos testes foram retiradas do lago das iguanas (localizado no biotério do Centro Universitário Fundação Santo André), local que apresentou melhores resultados na etapa anterior. Estas amostras foram mantidas em estufa para estabilizar os diferentes valores de temperatura a serem testados.
Os valores de pH a serem testados foram obtidos a partir da preparação de soluções-tampão, utilizando-se, inicialmente, uma solução de cloreto de sódio a 0,9% (os ajustes necessários para a obtenção de cada valor foram feitos com o uso de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico). Posteriormente, com a necessidade de se preparar uma outra solução-tampão, foi utilizado cloreto de sódio misturado com água diluída.
O primeiro teste realizado foi em relação à temperatura de 30oC. Uma amostra de protozoários do lago das iguanas (0,25mL) foi adicionada a 15mL de solução-tampão para os diferentes valores de pH a serem testados. Assim, as cinco amostras foram colocadas em placas de Petri e mantidas, por 24 horas, na temperatura de 30oC, na estufa. Um tubo controle contendo apenas a amostra retirada do lago (portanto, sem a adição de qualquer solução-tampão) também foi mantido nessa temperatura. O resultado obtido foi o seguinte: três amostras retiradas do tubo controle apresentaram espécimes de protozoários; porém, três amostras retiradas de cada uma das placas de Petri não apresentaram protozoários vivos.
O mesmo teste foi realizado, mantendo-se as amostras na temperatura de 28oC, também por 24 horas. O resultado obtido foi o mesmo do teste anterior, o que demonstrou que a variável temperatura, provavelmente, não era a responsável pela morte dos protozoários.
Assim, mais um teste foi realizado, novamente na temperatura de 28oC, mas mudando-se as concentrações da solução-tampão e da amostra retirada do lago. Dessa vez, foi acrescentado 10mL da solução-tampão e 10mL da amostra. No entanto, a observação, após 24 horas, das três amostras retiradas de cada placa,
permitiu concluir que o problema estava nas soluções-tampão, uma vez que todos os protozoários presentes nas amostras estavam mortos. As amostras retiradas do tubo controle, mantido na mesma temperatura, apresentaram espécimes vivos.
Frente a esses resultados, uma nova solução-tampão foi preparada. No entanto, apenas uma solução-tampão foi feita, com valor de pH=6,0, utilizada para a realização de um teste que demonstraria se a preparação de uma solução-tampão com outros componentes modificaria o resultado.
Desse modo, foram adicionados 5mL da nova solução-tampão e 5mL de uma amostra retirada do lago das iguanas em uma placa de Petri, mantida a 30oC por 24 horas. Um tubo controle, contendo 5mL da mesma amostra e 5mL de água proveniente de uma caixa d’água (cujo valor de pH era 5,5) foi mantido nas mesmas condições. As três amostras retiradas da placa após o período de 24 horas não apresentaram espécimes vivos de protozoários. No entanto, mais uma vez, as três amostras retiradas do tubo controle apresentaram espécimes vivos.
A partir dos resultados obtidos, foi possível concluir que não seria viável manter as amostras em uma solução-tampão. Isso porque, provavelmente, as soluções-tampão preparadas não foram capazes de reproduzir e/ou manter as condições naturais presentes no lago das iguanas, ou por serem fortes demais (independentemente da quantidade adicionada às amostras) ou por interferir diretamente no equilíbrio do meio.
Como não seria possível utilizar soluções-tampão para manter os valores de pH a serem testados, um teste foi realizado com o uso de água proveniente de uma caixa d’água, com objetivo de verificar se seria possível manter uma cultura de protozoários nessas condições. O teste foi feito da seguinte maneira: 10mL de água da caixa e 10mL de amostra retirada do lago das iguanas foram adicionados a uma placa de Petri. O valor de pH da água era 5,5. Uma placa controle também foi preparada, contendo apenas a amostra, cujo valor de pH era 7,0. As placas foram mantidas em temperatura ambiente por 24 horas. Após esse período foram observadas três amostras retiradas de cada placa, que apresentavam pH = 6,0. Todas as amostras apresentaram espécimes vivos de protozoários.
Desse modo, a partir dos resultados obtidos, o mesmo teste foi realizado, dessa vez mantendo-se as placas nas diferentes temperaturas a serem testadas, sempre por um período de 24 horas. Todas as amostras de água provenientes de
caixa d’água e utilizadas na preparação dos meios apresentaram pH=5,5. Um tubo controle (contendo apenas a amostra retirada do lago) foi preparado e mantido nas mesmas condições que o meio a ser testado para cada temperatura. Para quantificar a quantidade de espécimes de protozoários presentes na amostra (antes e depois de ser mantida na estufa), uma lâmina foi preparada e 4 campos foram observados, de modo que foi possível determinar uma média de espécimes presentes em cada campo.
O primeiro teste realizado foi com a temperatura de 30oC. A amostra retirada do lago apresentava valor de pH=5. A montagem de uma lâmina com esta amostra e a observação de 4 campos nela presentes evidenciou uma média de 13 espécimes de protozoários por campo. Após essa observação, 5mL da amostra e 5mL de água de torneira foram acrescentadas a uma placa de Petri, mantida na temperatura a ser testada por 24 horas. Após esse período, a lâmina preparada para a observação do meio revelou uma média de 15 protozoários por campo. A mesma observação foi realizada com uma amostra retirada do tubo controle, que apresentou uma média de 11 protozoários por campo.
O mesmo procedimento foi utilizado no teste seguinte: 5mL da amostra retirada do lago (pH=5,5) e 5mL de água de torneira foram acrescentados a uma placa de Petri e mantidos durante 24 horas a uma temperatura de 28OC. A amostra retirada antes de colocar os tubos na estufa apresentou uma média de 18 protozoários, enquanto a amostra retirada após esse período apresentou uma média de 13. O tubo controle evidenciou 9 protozoários por campo.
Seguindo-se as mesmas etapas, realizou-se o teste com a temperatura de 26oC. A amostra retirada do lago (pH=6,0) apresentou uma média de 4 protozoários por campo antes e depois de ser mantida na estufa, enquanto a amostra retirada do tubo controle apresentou apenas 3.
No teste realizado com a temperatura de 24OC a amostra retirada do lago (pH=5,5) apresentou 7 protozoários, em média, por campo. Após 24 horas, a média observada foi de 8 protozoários. O tubo controle apresentou 4 protozoários por campo.
O último teste realizado foi com a temperatura de 22OC. A amostra retirada do lago (pH=5,5) apresentou uma média de 7 protozoários por campo antes e depois
de ser mantida na estufa. O tubo controle apresentou uma média de 9 protozoários por campo.
Como os valores de pH das amostras retiradas do lago das iguanas (utilizadas nos testes in-vitro) não apresentaram uma diferença significativa (uma vez que variaram entre 5,0 e 6,0) é possível afirmar que não interferiram nos resultados observados, do mesmo modo que a amostra de água adicionada ao meio (proveniente de caixa d’água e que, em todos os testes realizados, apresentou valor de pH=5,5). O número de espécimes de protozoários observados nas amostras retiradas dos meios de cultura antes e depois de serem mantidos na estufa também não apresentou uma grande variação (Gráfico 4).
0 5 10 15 20 22 24 26 28 30 Amostras coletadas antes Amostras coletadas depois
Gráfico 4: Número médio de protozoários observados (por campo, num total de quatro) em três amostras coletadas dos meios de cultura antes e depois de serem mantidas na estufa
O Gráfico 5 apresenta a média de protozoários observados por campo (de um total de 4) presentes nas amostras coletadas dos meios de cultura e dos tubos-controle, após estes serem mantidos na estufa por um período de 24 horas (para cada temperatura testada).
0 4 8 12 16 22 24 26 28 30 Amostras do meio de cultura Amostras do tubo controle
Gráfico 5: Número médio de protozoários observados em três amostras coletadas dos meios de cultura e tubos controle mantidos na estufa por um período de 24 horas
Como é possível observar nos Gráficos 4 e 5, a temperatura não foi um fator determinante para o número de protozoários observados nas amostras coletadas tanto dos meios de cultura preparados (antes e depois de serem mantidos na estufa) quanto dos tubos controle mantidos nas mesmas condições.
Assim, a partir dos resultados obtidos, é possível concluir que todos os valores de temperatura testados são propícios para a manutenção de meios de cultura de protozoários. Do mesmo modo, mesmo com a impossibilidade de se testar os valores de pH pré-determinados com o uso de substâncias-tampão, foi possível concluir que os valores de pH ideais para o preparo e manutenção de tais meios variam de 5,0 a 7,0 (valores mais comumente encontrados nas amostras utilizadas para o preparo dos meios).
5 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos a partir dos testes realizados tanto na primeira quanto na segunda etapa do Projeto, referentes a diferentes valores de pH e temperatura a serem utilizados para a preparação e manutenção de meios de cultura de protozoários, permitiram concluir que há mais de um valor, para ambas as variáveis, que pode ser utilizado de maneira satisfatória para esse fim.
A partir de uma amostra coletada de um local que apresente um número considerável de espécimes de protozoários (como um lago, por exemplo, que apresente um valor de pH entre 5,0 e 7,0), é possível preparar e manter um meio de cultura que apresente as condições necessárias para o seu desenvolvimento. Tal meio de cultura pode ser preparado com o uso de água proveniente de torneira, desde que esta apresente um valor de pH entre 5,0 e 6,0, devendo ser mantido a uma temperatura que pode variar entre 22OC e 30OC. Portanto, o meio de cultura preparado dessa maneira pode ser mantido em estufa na temperatura desejada, até que seja necessário recorrer à técnica de repicagem, para evitar a superpolução de protozoários e, assim, manter o equilíbrio do meio.
Portanto, fica evidenciado que o processo de preparação e manutenção de meios de cultura de protozoários envolve um baixo custo e, assim, pode ser implantado e mantido em qualquer escola, da rede pública ou privada de ensino, que apresente as mínimas condições necessárias.
Com o uso de materiais simples e disponíveis na maioria das escolas de Ensino Médio, é possível preparar e manter um meio de cultura de protozoários a ser utilizado para a observação de espécimes em aulas práticas de Biologia, o que permite um melhor aprendizado e fixação do conteúdo pelos alunos, além de estimulá-los a aprender e entender esta matéria tão importante e necessária nos dias atuais.
REFERÊNCIAS
KRASILCHIK, Miriam. Prática de ensino de biologia. São Paulo: Harbra, 1983. 203 p.
PELCZAR, Michael; REID, Roger; CHAN, E. C. S. Microbiologia. São Paulo: McGraw-Hill, 1980. 1v. 566 p.
RODRIGUES, José Manuel Costa; MORAIS, Wladimir Teobaldo de. Biociências: Seres vivos morfologia taxonomia. São Paulo: Ed. Nacional, 1978. 265 p.
STORER, Tracy I. et al. Zoologia geral. 6. ed. São Paulo: Ed. Nacional, 2003. 816 p.
APÊNDICE A – Roteiro de preparação e manutenção de meios de cultura de protozoários
1. Coletar amostras de protozoários de um ambiente propício ao seu desenvolvimento (lago, solo, etc.), que apresente um valor de pH entre 5,0 e 7,0. 2. Observar, ao microscópio óptico, a ocorrência de espécimes de protozoários nas amostras coletadas.
3. Preparar, em uma placa de Petri, um meio de cultura contendo 5mL das amostras coletadas e 5mL de água de torneira (proveniente de caixa d´água e cujo pH varie de 5,0 a 6,0).
4. Manter os meios de cultura preparados em estufa, em uma temperatura que pode variar de 22OC a 30OC. Pode ser utilizado um outro meio que mantenha estável a temperatura a ser utilizada.
5. Fazer repicagens esporádicas nos meios de cultura para evitar a superpolução de protozoários.
6. Para a observação de protozoários em aulas práticas de Biologia, utilizar os meios preparados para a montagem de lâminas.
