Desenvolvimento embrionário dos órgãos linfoides do Tubarão-azul, Prionace glauca (Linnaeus, 1758), Elasmobranchii, Carcharhiniformes

Texto

(1)CARLOS EDUARDO MALAVASI BRUNO. Desenvolvimento embrionário dos órgãos linfoides do Tubarãoazul, Prionace glauca (Linnaeus, 1758), Elasmobranchii, Carcharhiniformes. São Paulo 2016.

(2) CARLOS EDUARDO MALAVASI BRUNO. Desenvolvimento embrionário dos órgãos linfoides do Tubarão-azul, Prionace glauca (Linnaeus, 1758), Elasmobranchii, Carcharhiniformes. Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Departamento: Cirurgia. Área de Concentração: Anatomia. dos. Animais. Domésticos. Silvestres. Orientador: Prof. Dr. José Roberto Kfoury Junior. São Paulo 2016. e.

(3) Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.. DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo). T.3424 FMVZ. Bruno, Carlos Eduardo Malavasi Desenvolvimento embrionário dos órgãos linfoides do Tubarão-azul, Prionace glauca (Linnaeus, 1758), Elasmobranchii, Carcharhiniformes / Carlos Eduardo Malavasi Bruno. -- 2016. 77 f. : il. Tese (Doutorado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Cirurgia, São Paulo, 2016. Programa de Pós-Graduação: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres. Área de concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres. Orientador: Prof. Dr. José Roberto Kfoury Junior.. 1. Timo. 2. Órgão epigonal. 3. Órgão de Leydig. 4. Baço. 5. Embriogenese. I. Título..

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(5) Dedicatória Dedico essa tese a todos os trabalhadores do mar, que vivem uma vida dura e sofrida, mas sempre com alegria a pesar de todo o trabalho e perigo, em especial ao Linaldo Gaudino de Brito “Boris” “in memorian” que faleceu honrosamente trabalhando no mar. Dedico também a minha esposa Jéssica Leite Cavalcanti Bruno, pessoa fundamental para que essa tese e toda a minha vida acadêmica, agradeço pela ajuda e carinho por todo esse juntos, você tem grande participação em tudo isso, você é parte fundamental para conseguir passar por mais essa etapa da vida..

(6) Agradecimentos Agradeço a todos os Orixás que sempre estiveram ao meu lado iluminando todo o meu caminho. Agradeço ao meu orientador Prof. José Roberto Kfoury Junior pela paciência, ajuda nos embarques e por todo o ensinamento. Agradeço ao Prof. Dr. Alberto Ferreira de Amorim, por ser um verdadeiro pai me acolhendo não só na orientação do trabalho, aulas e cursos, mas também na orientação de vida. Por confiar e acreditar sempre em mim. Agradeço à Chistina Amorim pelo carinho por ser uma “mami” para mim, por me acolher na “pensão” inúmeras vezes, pelas sopas, e chás e conversas e por cuidar de mim como um filho. Agradeço a Dra. Rose Eli Grassi Rici, que mais uma vez foi como uma mãe pata mim, principalmente no final dessa tese. Agradeço ao Sr. José Kowaslky da empresa Kowalsky Comércio e Industria de Pescados, pelos embarques concedidos a equipe. E também ao Gabriel Calzavara, Victor Calzavara e Victor Cantidio da empresa Atlantico Tuna, pelo embarque concedido e pela ajuda neste tabalho. Agradeço aos tripulantes do Marbella I, Ramos, Edson, Ninho, Fábio, Ricardo, Arthur, Sevéro, Massa Bruta, Eriberto e Tenório pela paciência do primeiro embarque e todo o cuidado da tripulação. Agradeço aos tripulantes do Ouled Si Mohand , Marino Lampón, Moreno, Gessino, Comparsa e muitos outros que ajudavam no dia a dia do barco A Minha mãe biológica Rita e ao meu Pai Geraldo Gonçalves Bruno Junior “in memorian”, a mãe Silvia, a minha mãe Preta Regina e a minha mãe Japonesa Márcia, que me mostraram que com muita luta e dedicação pode-se conseguir tudo. O Filho de vocês está sendo Negrão!!!!! A minha sobrinha “princesa do tio” Nicolle Rocha Malavasi, amor do tio que me faz rir sempre com suas perguntas sobre a biologia. Ao Jairo e Irailde, anjos que caíram do céu para me ajudar no momento em que mais precisei, por serem meus ouvintes, por nunca me deixarem desistir e por sempre se empolgarem.

(7) comigo. Ao Jejé e Jack por sempre estarem ao meu lado, e me apoiarem, e por me ouvirem sempre, mesmo quando não estão entendendo nada o que estou falando. Agradeço ao meu melhor amigo, Daniel Janini Delphino, sei que você não tem ideia do que falo muitas vezes, mas sempre me ouviu, voltamos a nos encontrar depois de 20 anos, mas amizades de 35 anos, não sabem o que é o tempo longe, e volta com força total. Ao Bernardo, Renatinho e a tia Fátima, sempre ao meu lado e claro pelos bolinhos de chuva. Agradeço ao meu grande amigo, e mais que irmão Thierry Salmon, por toda a ajuda no trabalho e as muitas risadas muito obrigado por sempre estar ao meu lado, pelas coletas iniciais e pelo incentivo de sempre. Agradeço, as minha melhores amigas e irmãs, Cristiane Cagnoni Ramos e Fernanda Cardoso, por toda a ajuda não só no trabalho, mas sempre, pelas muitas risadas sempre, pelas saídas, escaladas e tudo o que fizemos juntos, duas amigas inseparáveis da minha, vida, e desse agradecimento. Agradeço ao grande amigo André Luiz Veiga Conrado “Bianor”, pela paciência, ensinamentos na histologia, amizade, risadas, e muita conversa, você foi muito importante em várias decisões. Agradeço a Luana Félix de Melo, pela ajuda nas laminas, no IBIMM e em toda a vida acadêmica. Agradeço a toda a equipe do IBIMM (Instituto de Biologia Marinha e Meio Ambiente), Edris, Lara, Rubens, Aquira, Amora, Larinha, Darinha, Sarinha e Rodolfa por todo carinho, conhecimento e oportunidades. Ao Junior “Pepinão” e Bruna pelo carinho e inúmeras risadas. Agradeço ao meu amigo e capitão de barco Eduardo Delfin e a Mirian Delfin, “muchas gracias amigo por enseñarme un poco de la pesca y por toda las charlas, tragos y risas”. Agradeço a Ione “cabeça” que resurgiu no momento que mais precisei, e demonstrou como ser uma grande amiga “Valeu cabeça, agora vamos acabar logo essa faculdade”. Agradeço aos meus alunos de IC e TCC, Aline Poscai (Alinete), Aninha, Augusta, Carolina, Julia, Ju Marinho, Iran, Jana, Grazi, Will, Biazinha, Le, Mariana, Pamela e.

(8) Thays Caneloi, pelo carinho, paciência e por seguramente me ensinarem muito mais do que consegui ensinar para vocês. Agradeço aos Funcionários do Setor de Anatomia da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de São Paulo, a funcionária Jaqueline, pelas conversas risadas, e conselhos e Aninha da limpeza, pelas conversas, cafés e carinho. Agradeço a Prof. Dra. Maria Angélica Miglino que me acolheu quando estagiário e por me abrir o caminho nas pesquisas com tubarões. Agradeço ao técnico de laboratório Ronaldo, por toda a ajuda na histologia e dicas diárias de laboratório, e por toda a paciência em me ensinar a rotina de um laboratório de histologia. Agradeço também ao técnico de laboratório Ednaldo “Índio” pela ajuda e por sempre estar disposto a me ajudar com os tubarões e pelas inúmeras dicas. Duas pessoas muito importantes para todos os pesquisadores do departamento. Vocês com certeza fazem parte deste trabalho. Agradeço aos funcionários do Instituto de Pesca de Santos, Agar, Thays, Lili e D. Ana, por todo o carinho e por sempre me receberem muito bem. Agradeço aos meus alunos do Curso Pré Universitário Tetris e todos os professores e coordenadores. Obrigado por fazer meus sábados mais animados #C.F. As minhas tias e avós e bisavós do Fórum a qual eu admiro demais, muito obrigado por sempre estarem ao meu lado. E por fim, mas não menos importante, agradeço aos meus Tios Gerson e Carolina, meus primos, Daniel, Levi e Ligia, por todo o carinho durante a minha existência, Amo Muito Vocês!!!!!!.

(9) “Los pescadores somos los primeros que respetamos nuestros mares y nos jugamos la vida a diario para traer un producto fresco y de alta calidad ”. (Autor desconhecido).

(10) “Not in this lifetime” (W. Axl Rose).

(11) FOLHA DE AVALIAÇÃO. Nome: BRUNO, Carlos Eduardo Malavasi Título: Desenvolvimento embrionário dos órgãos linfoides do Tubarão-azul, Prionace glauca (Linnaeus, 1758), Elasmobranchii, Carcharhiniformes Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências. Data: _____/_____/_____ Banca Examinadora. Prof. Dr.____________________________________________________________________ Instituição:__________________________ Julgamento:_____________________________. Prof. Dr.____________________________________________________________________ Instituição:__________________________ Julgamento:_____________________________. Prof. Dr.____________________________________________________________________ Instituição:__________________________ Julgamento:_____________________________. Prof. Dr.____________________________________________________________________ Instituição:__________________________ Julgamento:_____________________________. Prof. Dr.____________________________________________________________________ Instituição:__________________________ Julgamento:_____________________________.

(12) RESUMO. BRUNO, C. E. M. Desenvolvimento embrionário dos órgãos linfoides do Tubarão-azul, Prionace glauca (Linnaeus, 1758), Elasmobranchii, Carcharhiniformes. [Embryonic development of lymphatic organs blue-shark, Prionace glauca (Linnaeus, 1758), Elasmobranchii, Carcharhiniformes] 2016. 77 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. O tubarão-azul, Prionace glauca (Linnaeus, 1758) é uma espécie cosmopolita, de alto valor comercial, principalmente capturado por embarcações que operam em alto mar e vendido em mercados e feiras-livres. Poucos dados biológicos estão disponíveis sobre esta espécie, principalmente quanto à sua sanidade e, o conhecimento do desenvolvimento de seus órgãos linfoides pode trazer importantes informações neste contexto. Desta forma, o objetivo do trabalho é descrever o desenvolvimento embrionário dos órgãos linfoides em embriões de tubarão-azul: timo, órgão epigonal, baço e órgão de Leydig, quanto à estrutura e arquitetura macroscópica, microscópica e ultraestrutural, pelas técnicas de microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Foram coletados cinco espécimes de cada fase representativa do desenvolvimento embrionário: I, II, III e IV e do animal adulto. O timo foi visível macroscopicamente nas fases III e IV e microscopicamente da fase I a IV. O órgão de Leydig está presente nas fases II, III e IV. O baço e o órgão epigonal estão presentes em todas as fases embrionárias e no adulto. O timo apresentou principalmente populações de timócitos em diversos estágios de maturação e melanomacrófagos, o baço apresentou melanomacrófagos linfócitos em diversos estágios de maturação, neutrófilos, trombócitos e grande quantidade de eritrócitos. O órgão epigonal apresentou um grande número de células imaturas, principalemente de linfócitos e células polimorfonucleares. A função do órgão de Leydig é perdida quando adulta, sendo substituída pelo órgão epigonal. Os resultados desse trabalho permitem sugerir que esses órgãos apresentam uma função hematopoiética desde o inicio da embriogênese até a fase adulta.. Palavras-chave: Timo. Órgão epigonal. Órgão de Leydig. Baço. Embriogenese..

(13) ABSTRACT. BRUNO, C. E. M. Embryonic development of lymphatic organs blue-shark, Prionace glauca (Linnaeus, 1758), Elasmobranchii, Carcharhiniformes. [Desenvolvimento embrionário dos órgãos linfoides do Tubarão-azul, Prionace glauca (Linnaeus, 1758), Elasmobranchii, Carcharhiniformes]. 2016. 77 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. The blue shark (Prionace glauca) is a cosmopolitan species of high commercial value, easily caught by vessels operating on the high seas and sold in markets and street fairs. Few biological data are available on this species, mainly from their sanity. Studies on development of these lymphoid organs can provide important information in this regard. Thus, the aim of this study is to describe the gross, microscopic and ultraestrutural morphology of the embryonic development of lymphoid organs: thymus, epigonal organ, spleen and the Leydig organ by light microscopy and transmission electron techniques. Five specimens were collected from each representative stage of embryonic development: II, III and IV besides adult specimens. Thymus was visible macroscopically at phases III and IV and microscopically from phase I to IV. Leydig organ is presente in phases II, III and IV. Spleen and epigonal organ are present in all embrionic phases and adult. Thymus presented mainly thymocytes populations in several maturation stages and melanomacrophages, spleen presentes melanomacrophages and lymphocytes, neutrophyls, trombocytes and huge amount of erytrocytes. Epigonal organ presented many immature cells, mainly lymphocytes and polimorphonuclear cells. Leidig’s organ function is lost in adulthood being replaced by the epigonal organ. The results of this work allow to suggest that these organs present a hematopoietic function since the early development until the adult phase.. Key-words: Thymus. Epigonal organ. Spleen. Leydig organ. Embryogenesis..

(14) SUMÁRIO. 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 15. 2. OBJETIVO ............................................................................................................... 17. 2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................... 17. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 17. 3. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 18. 3.1. TUBARÃO-AZUL...................................................................................................... 18. 3.2. SISTEMA IMUNOLÓGICO ....................................................................................... 20. 3.3. ONTOGENIA DOS ÓRGÃOS LINFOIDES NOS PEIXES............................................... 22. 3.4. ÓRGÃOS DO SISTEMA LINFÓIDE ............................................................................ 24. 3.4.1. Timo ....................................................................................................................... 24. 3.4.2. Órgão de Leydig ..................................................................................................... 25. 3.4.3. Baço ....................................................................................................................... 27. 3.4.4. Órgão Epigonal ...................................................................................................... 29. 3.5. CÉLULAS DOS ÓRGÃOS LINFÓIDES ........................................................................ 29. 3.5.1. Linfócitos ............................................................................................................... 29. 3.5.1.1. Linfócito T .............................................................................................................. 30. 3.5.1.2. Linfócito B .............................................................................................................. 31. 3.5.2. Monócitos .............................................................................................................. 31. 3.5.3. Macrófagos ............................................................................................................ 32. 3.5.4. Eritrócitos .............................................................................................................. 32. 3.5.5. Eosinófilos ............................................................................................................. 33. 3.5.6. Basófilos ................................................................................................................ 33. 4. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 35. 4.1. ANIMAIS E AMBIENTE DE EXPERIMENTAÇÃO ....................................................... 35. 4.2. COLETA DE MATERIAL............................................................................................ 35. 4.3. INCLUSÃO E CORTE DE MATERIAL ......................................................................... 36. 4.3.1. Fixação e Processamento das Amostras para Microscopia de Luz ..................... 36. 4.3.2. Coloração por Hematoxilina-Eosina ..................................................................... 36.

(15) 4.3.3. Coloração por May Grünwald - Giemsa ............................................................... 37. 4.3.4. Coloração Tricrômio de Masson ........................................................................... 37. 4.3.5. Microscopia eletrônica de transmissão ............................................................... 38. 4.3.5.1. Corte semifino ....................................................................................................... 38. 4.3.5.2. Corte Ultrafino ....................................................................................................... 38. 4.4. FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS ................................................................. 39. 5. RESULTADOS ......................................................................................................... 40. 5.1. ANÁLISES MACROSCÓPICAS .................................................................................. 40. 5.1.1. Macroscopia das Fases embrionárias................................................................... 40. 5.1.2. Macroscopia dos Orgãos Linfóifes ........................................................................ 42. 5.1.2.1. Timo............ ........................................................................................................... 42. 5.1.2.2. Orgão de Leydig ..................................................................................................... 44. 5.1.2.3. Baço.... ................................................................................................................... 46. 5.1.2.4. Órgão Epigonal....................................................................................................... 48. 5.3. ANÁLISES MICROSCÓPICAS.................................................................................... 50. 5.1.3. Microscopia dos Orgãos Linfóifes ......................................................................... 50. 5.1.3.1. Timo... .................................................................................................................... 50. 5.1.3.2. Órgão de Leydig ..................................................................................................... 52. 5.1.3.3. Baço... .................................................................................................................... 53. 5.1.3.4. Órgão Epigonal....................................................................................................... 55. 6. DISCUSSÃO ............................................................................................................ 58. 6.1. DESENVOLVIMENTO DO EMBRIÃO........................................................................ 58. 6.2. MACROSCOPIA ÓRGÃOS LINFOIDES:..................................................................... 59. 6.3. MICROSCOPIA DOS ÓRGÃOS LINFOIDES: .............................................................. 62. 7. CONCLUSÕES ......................................................................................................... 66 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 67.

(16) 15. 1 INTRODUÇÃO. No Brasil podem ser encontradas 127 espécies de elasmobrânquios (LESSA et al., 1999) destas, 32 são encontradas no litoral do estado de São Paulo (FIGUEIREDO, 1977). O Tubarão-azul (Prionace glauca) é uma espécie cosmopolita, sendo a espécie mais abundante entre os tubarões (NAKANO; SEKI, 2003; LEGAT; VOOREN, 2008; QUAGGIO et al., 2008), habitando as regiões da plataforma continental, em águas superficiais (VASKE-JUNIOR et al., 2009; KOTAS et al, 2010). Sua captura por embarcações que operam em alto mar é relativamente fácil (NAKANO; SEKI, 2003; QUAGGIO et al., 2008), principalmente em pescaria por grandes barcos espinheleiros nos Oceanos Pacífico e Atlântico, (CAMPANA et al., 2009). Esta espécie é fonte de alimentação no Brasil e em alguns países da América do Sul e são normalmente vendidos em postas em mercados e feiras livres (CAMPANA et al., 2009). São espécies de tamanhos relativamente grandes, podendo atingir até 3 metros de comprimento total quando adultos, em ambos os sexos (KOHLER, 2002). O Prionace glauca é vivíparo placentário, ou seja, desenvolve uma placenta que se conecta ao útero da mãe em um determinado estágio embrionário (BONE; MOORE, 2008). O período gestacional é estimado entre 9 a 12 meses (SUDA, 1953; PRATT, 1979) e o número de embriões pode variar de 4 a 135 por fêmea (GUBANOV; GREDOR´YEV, 1975; PRATT, 1979). Nos peixes o sistema imunológico é complexo, cujos órgãos incluem o timo, baço, o fígado desenvolvido e o rim cefálico, sendo os dois últimos descritos somente para os teleósteos (ZAPATA; CHIBÁ; VARAS, 1996). Nos elasmobrânquios, os órgãos do sistema imunológico são constituidos pelo timo, baço, órgão de Leydig e epigonal, estes últimos equivalendo-se à medula óssea dos mamíferos, uma vez que estes animais possuem o esqueleto cartilaginoso. Estes órgãos são responsáveis pela função hematopoiética nos elasmobrânquios (FANGE; MATTISSON, 1981)..

(17) 16. Os estudos sobre o desenvolvimento do sistema imunológico de peixes são importantes, pois permitem a compreensão dos mecanismos que asseguram o estado de sanidade do animal. A base do sistema imunitário já é evidente apresenta durante a embriogênese em aves e mamíferos, sendo pouco conhecida no desenvolvimento. embrionário. dos. elasmobrânquios,. faltando. informações. detalhadas de macroscopia, histologia e ultraestrutural para essa classe (HAMLETT, 1999). O desenvolvimento embrionário do tubarão-azul foi descrito por Vargas em 2009, onde o autor separa os embriões e fetos conforme suas características morfológicas e morfométricas, bem como a presença ou ausência de pigmentação ao longo do corpo. O autor descreve um total de seis fases de desenvolvimento embrionário para o Prionace glauca, variando entre o menor tamanho 6 cm a embriões acima de 40 cm de comprimento total. Uma vez que o tubarão-azul constitui uma espécie de extrema importância na economia mundial e pela escassa quantidade de informações biológicas, principalmente relativas à área imunológica, à morfologia e ao desenvolvimento dos órgãos desse sistema, esse trabalho teve por objetivo descrever a macroscopia, microscopia e ultraestrutura do timo, órgão de Leydig, baço e órgão epigonal nas principais fases do desenvolvimento embrionário segundo Vargas (2009) e no adulto dessa espécie, pelas técnicas de microscopia de luz e eletrônica de transmissão, buscando fornecer subsídios iniciais para a melhor compreensão do sistema imunitário e da sanidade do P. glauca..

(18) 17. 2 OBJETIVO. 2.1 OBJETIVO GERAL. O Objetivo do trabalho é de descrever o desenvolvimento embrionário dos órgãos linfoides: timo, órgão de Leydig, órgão epigonal e baço de embriões do tubarão-azul (Prionace glauca).. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. Identificar e acompanhar o desenvolvimento embriológico do timo, baço e órgão epigonal quanto aos seguintes aspectos: o Estrutura e arquitetura macroscópica o Estrutura e arquitetura microscópica pela microscopia de luz o Estrutura microscópica pela microscopia eletrônica de transmissão..

(19) 18. 3 REVISÃO DE LITERATURA. 3.1 TUBARÃO-AZUL. O tubarão-azul (Prionace glauca) é a espécie de tubarão mais abundante no ambiente marinho, é considerada uma espécie oceânica circunglobal, ou seja, frequenta águas tropicais e subtropicais dos tres oceanos. (NAKANO; SEKI, 2002; BORNATOWISK; SCHWINGEL, 2008; QUAGGIO et al., 2008; LEGAT; VOOREN, 2008). Na costa brasileira é o tubarão mais abundante (HAZIN; LESSA, 2005), Esta espécie de tubarão é capturada pela frota que opera em alto mar (KAKANO; SEKI, 2002; QUAGGIO et al., 2008), principalmente em pescaria de grandes navios nos Oceanos Pacíficos e Atlântico (CAMPANA et al., 2009). É capturado na pesca de espinhel de atum e espadarte na região sudeste-sul do Brasil (MOURATO, 2007). É fonte de alimentação no Brasil e em alguns países da América do Sul (CAMPANA et al., 2009). O tubarão azul é uma espécie altamente migratória, possui padrões complexos relacionados com a reprodução e distribuição de suas presas, que podem variar desde a plataforma continental a região pelágica (KOTAS et al., 2010). Esta espécie pode ser encontrada em profundidades de 150 m a 400 m. (BONATOWISK et al., 2008; KOTAS, 2010), com uma migração nictimeral vertical para cada indivíduo, podendo chegar a se deslocar da superfície até 400 m de profundidade durante o dia e 150 m de profundidade durante a noite (LEGAT; VOOREN, 2008). Vivem em temperaturas variando de 5º C a 27º C, conforme a latitude e profundidade onde é encontrado (VASKE-JUNIOR; RINCÓN-FILHO, 1998; WALSH; KLEIBER, 2001; NAKANO; SEKI, 2003). Sua relativa abundancia diminui em águas equatoriais, aumentando conforme a latitude (QUAGGLIO et al., 2008). São comuns a presença de juvenis desta espécie em zonas temperadas altamente produtivas, com abundância de alimento disponível como ocorre em algumas regiões do Atlântico Norte e Sul. Sendo os machos desta espécie, segundo.

(20) 19. Kotas et al. (2010), mais abundantes do que as fêmeas na maior parte do ano na região sudeste sul do Brasil. As fêmeas do tubarão azul migram, desde o sudeste e sul do Brasil, onde ocorre a cópula, seguida da fertilização e gravidez, para o Golfo da Guiné, onde são encontradas fêmeas no começo de gravidez (HAZIN; LESSA, 2005; QUAGGLIO et al., 2008; VALEIRAS; ABAD, 2009). Todo o período gestacional acontece no sudeste e sul do Brasil (AMORIM, 1992). Porém já houve relatos de fêmeas recém-prenhas também no Golfo da Guiné. Entrando em período de parto em águas temperadas, como na região Sul da África, onde há uma grande disponibilidade de alimento (QUAGGIO et al., 2008). A época de acasalamento desta espécie no Atlântico Sul Ocidental ocorre geralmente nos meses de março e maio, e o parto geralmente no período de julho a setembro (KOTAS et al., 2010); porém, segundo Amorim (1992) e Schwingel et al. (2001), ocorrem variações temporais no período de parto evidenciando que a população de Prionace glauca não tem um período reprodutivo definido. A cópula do tubarão azul ocorre no período entre dezembro e fevereiro, em regiões distantes do sudeste brasileiro, porém a fertilização ocorre fora do nordeste brasileiro, no período entre abril e junho, período em que as temperaturas da superfície da água nesta região são mais altas, sendo provável que as fêmeas sejam sexualmente mais propícias em águas mais rasas e quentes, o que facilita a ovulação, fertilização e desenvolvimento primário dos embriões (HAZIN; LESSA, 2005). A gestação dura em média nove meses, seu nascimento no Pacífico Norte ocorre na época entre dezembro e abril. O tamanho médio dos embriões é de aproximadamente 39 cm de comprimento total (PRATT, 1979). Porém Vargas (2009) descreve o crescimento para a mesma espécie de embriões com tamanhos maiores que 40 cm de comprimento total. Segundo Domingo et al. (2002), o tubarão-azul foi encontrado na região que abrange desde o Uruguai até o litoral da Bahia, fêmeas com desenvolvimento embrionário prestes a parir no período de janeiro a maio. As maiores taxas de embriões foram ao período da primavera, porém o estudo revelou que mais próximo ao continente Africano, próximo à linha do Equador e próximo à linha do trópico de.

(21) 20. Capricórnio na região da África do Sul, foram encontrados indivíduos juvenis menores a 120 m.. 3.2 SISTEMA IMUNOLÓGICO. Diferente dos vertebrados superiores, a maioria dos peixes desde sua fase embrionária já são organismos de vida livre, como esses animais vivem em ambientes aquáticos, devem possuir mecanismos de defesa que os proteja contra os patógenos existentes neste ambiente (ROMBOUT et al., 2005). Os peixes, assim como todos os vertebrados, possuem uma resposta imunológica humoral e celular em órgãos centrais cuja principal função é a defesa do organismo (TORT et al., 2003). A maior parte dos órgãos linfoides encontrados em mamíferos também existe nos peixes com exceção dos nódulos linfáticos e medula óssea (PRESS; EVENSEN, 1999). Peixes e mamíferos apresentam algumas semelhanças e diferenças em relação a sua função imunológica (NELSON, 1994). No lugar da medula óssea dos mamíferos, esta é substituída nos peixes ósseos pelo rim cefálico que assume a função hematopoiética (MESEGUER et al., 1995; ZAPATA et al., 1996). Ao contrário dos mamíferos, este órgão é o principal responsável pela fagocitose (DANNEVING et al., 1994), processamento de antígeno (KAATTARI; IRWIN, 1985; BRATTGIERD; EVENSEN, 1996) e formação de IgM e memória imunológica através dos centros de melanomacrófagos (HERRAEZ; ZAPATA, 1986; TSUJII; SENO, 1990). Nos peixes cartilaginosos, a medula óssea é substituída pelo órgão de Leydig e órgão epigonal (CARRIER et al., 2004). Nas lampreias, o tecido hematopoiético é encontrado em uma invaginação da parede do intestino (FINSTAD; GOOD, 1964). Nos elasmobrânquios, essas estruturas associadas ao intestino, são encontradas no órgão de Leydig, este localizado na região do esôfago, e na válvula espiral do intestino. Nestes peixes, a formação de células sanguíneas também ocorre no órgão epigonal (HANSEN; ZAPATA, 1998; BOEHM et al., 2012)..

(22) 21. Nos teleósteos, o timo e o baço são considerados os principais órgãos linfoides (ROMBOUT et al., 2005). O timo e o rim cefálico são considerados órgãos linfoides primários, ou seja, responsáveis pela depuração de antígenos solúveis que são lançados na circulação sanguínea (WHYTE, 2007). O baço dos teleósteos também participa da depuração de antígenos oriunda da corrente sanguínea, tendo um papel na apresentação de antígeno e no início da resposta imunitária adaptativa (WORKENHE et al., 2010). Os tecidos linfoides são áreas reconhecidas pela característica de justaposição de células hematopoiéticas especificas do estroma e componentes distintos (BRENDOLAN et al., 2007; BUETTNER et al., 2010; BAJOGHLI et al., 2011). Os componentes do estroma dos órgãos linfoides não só definem a localização destes tecidos, mas também fornecem sinais necessários para a atração, especificação, maturação e diferenciação de células imunológicas (BOEHM et al., 2010). Em geral esses tecidos abrigam células tronco hematopoiéticas, que são capazes de dar origem a todas as linhagens de células sanguíneas (BOEHM et al., 2010) e células de defesa imunitárias inespecíficas e específicas (ELLIS, 1977). As células imunológicas dos peixes apresentam as mesmas características de outros vertebrados (TORT et al., 2003). A morfologia e funcionalidade de células imunológicas dos peixes demonstram uma similaridade a dos mamíferos, tais como os macrófagos, neutrófilos, monócitos, trombócitos, linfócito B, plasmócitos, linfócito T, células natural-killer - NK e eosinófilos (MANNING; NEHLS, 1996; WHYTE, 2007). Os linfócitos são as células mais produzidas pelos órgãos linfoides, estas se dividem em linfócitos B e linfócitos T (ROWLEY et al., 1988; MILLER, 1998). Outros tipos de células são os mastócitos, célula citotóxica não especifica e as células dendríticas (MILLER et al., 1985; EVANS; JASO-FRIEDMANN, 1992; AVILÉSTRIGUEROS; QUESADA, 1995; REITE, 1998). Os melanomacrófagos são populações distintas presentes nos tecidos hematopoiéticos do baço e rim cefálico nos peixes ósseos e nas áreas periportais do fígado (ROBERTS, 1975; WOLKE, 1992). Os elasmobrânquios possuem órgãos do sistema imunológico encontrados em todos os vertebrados e outros específicos desta classe (CARRIER et al., 2004). Os principais órgãos linfoides nestes peixes são o timo e o baço, os quais são bem.

(23) 22. desenvolvidos e possuem semelhanças estruturais com os vertebrados superiores (ZAPATA, 1980). Esses dois órgãos são essenciais para a produção de células imunológicas nos vertebrados superiores, tendo sua primeira aparição filogenética nos Chondricthyes. Como os tubarões não possuem medula óssea e linfa, estes são substituídos por órgãos equivalentes à medula óssea (CARRIER et al., 2004). Nestes. órgãos. são. encontradas. estruturas. linfomielóides,. principalmente. granulopoieticas (ZAPATA, 1980).. 3.3 ONTOGENIA DOS ÓRGÃOS LINFOIDES NOS PEIXES. Durante o período embrionário, os peixes dependem de seu sistema imunológico inato, este provavelmente se desenvolve em uma idade embrionária mais precoce (ROMBOUT et al., 2005). Nos teleósteos o desenvolvimento embrionário e a hematopoiese são processos separados e distintos, sendo semelhante aos descritas para os mamíferos (GALLOWAY; ZON, 2003). Embriologicamente, em Scyliorhinus canicula o primeiro tecido do sistema imunológico a se formar é o timo, este órgão deriva da parede dorsal a partir do segundo e quinto pares de bolsas faríngeas (LLOYD-EVANS, 1993; CARRIER et al., 2004). O aglomerado de células que irá tornar o órgão funcional aparece pela primeira vez em torno de três semanas, podendo aparecer até o final do primeiro trimestre de desenvolvimento do embrião. Porém, nesta fase de desenvolvimento embrionário, ainda não são organizados em regiões corticais e medulares. Durante a quarta e quinta semanas os lóbulos já começam a se separar a partir do epitélio da faringe onde continuam crescendo lateralmente para futuramente se ligar e formar uma massa continua de lóbulos. Até o final do segundo semestre, ou seja, oitava semana, o córtex e a medula já são aparentes. Em teleósteos, entre a sexta e sétimas semanas após o nascimento, o timo sofre atrofia completa (LLOYD-EVANS, 1993; CARRIER et al., 2004)..

(24) 23. O tamanho e localização do timo estão relacionados ao crescimento somático do animal em fetos e neonatos, o timo pode ser facilmente identificado quando exposto, porém, com o crescimento do animal e o seu amadurecimento, o aumento da massa muscular na região do timo torna difícil à sua localização (ZAPATA, 1980). Este órgão, em algumas espécies de salmonídeos, pode ser encontrado antes da eclosão do ovo (ELLIS, 1977; RAZQUIN et al., 1990). Contudo, em algumas espécies de peixes marinhos, o timo é encontrado após o nascimento do peixe, sendo o último órgão linfoide a se desenvolver durante a embriogênese (O'NEILL, 1989; CHANTANACHOOKHIN et al., 1991; JOSEFSSON; TATNER, 1993; ABELLI et al., 1996; PADRÓS; CRESPO, 1996; BREUIL et al., 1997; SCHRODER et al., 1998; DOS SANTOS et al., 2000; LIU et al., 2004; MULERO, 2007). A involução do timo com a idade, como ocorre em vertebrados superiores, não é uma característica consistente entre os peixes, podendo variar entre as espécies. Processos apoptóticos ocorrem durante o desenvolvimento do timo em peixes teleósteos, porém esse fenômeno diminui com a idade do animal (ABELLI et al., 1998). A involução do timo pode variar com as mudanças sazonais e com os ciclos hormonais dos peixes (NAKANISHI, 1986). Em animais jovens, esse órgão pode ser mais dificl de se localizar em decorrência do tamanho do animal (COSTA, 2007). O baço é formado a partir da região interna das brânquias, desde o quarto mês de gestação, porém, nesta fase, ainda não está organizado em polpa vermelha e branca, onde só serão diferenciados no oitavo mês de gestação em Scyliorhinus canicula (LLOYD-EVANS, 1993; CARRIER et al., 2004). O órgão de Leydig começa a aparecer durante a quinta semana, onde são visíveis como grupos celulares tanto dorsal quanto ventral ao esôfago em desenvolvimento nos elasmobrânquios (CARRIER et al., 2004). Os tecidos que vão se diferenciar em órgão epigonal são os últimos da área linfomieloide a surgir, mesmo com uma crista genital já visível ao final da terceira semana. Os granulócitos, entretanto não aparecem até a sétima semana, assim como o desenvolvimento das gônadas, que ocorrem da nona a décima segunda semana (CARRIER et al., 2004). A estrutura dos órgãos linfoides e a presença de linfócitos em seu interior não tem correlação com a sua atividade funcional e o grau de maturação das células,.

(25) 24. indicando que a imunocompetência é atingida algum tempo após a formação dos órgãos linfoides, após a formação de diferentes populações de leucócitos (MULERO et al., 2007).. 3.4 ÓRGÃOS DO SISTEMA LINFÓIDE. 3.4.1. Timo. O timo está localizado na região dorso-medial para ambas as regiões das brânquias. Em alguns peixes teleósteos, esse órgão não se separa completamente a partir da faringe e não sofre o processo de migração ao longo da vida do animal (LE DOUARIN et al., 1984; LAM et al., 2002; GREVELLEC; TUCKER, 2010). Este órgão é envolvido por um tecido, formando assim uma bolsa tímica (BOWDEN et al., 2005), sendo bem desenvolvido, tanto nos peixes ósseos quanto nos cartilaginosos, porém é ausente nos Agnatas (PASTORET et al., 1998). Em elasmobrânquios, é organizado em lóbulos distintos, cada lóbulo consiste em um córtex externo e uma medula interna (PRESS; EVENSEN, 1999; RODEWALD, 2008). Possuem variações de células, posição anatômica, estrutura dos lóbulos tímicos e quanto à origem do desenvolvimento (GE; ZHAO, 2013). Nos teleósteos em geral, o timo não é bem definido, não sendo possível diferenciar medula de córtex (ROMANO et al., 1999), porém segundo Rodewald (2008), muitas espécies de teleósteos possuem apenas um timo composto por dois lobos bilaterais. Nos mamiferos, o timo tem um papel chave no início da vida. O córtex e a medula histologicamente revelam que ambos podem conter timócitos em diferentes estágios de maturação, embora uma pequena porcentagem destes irá completar sua maturação no timo antes de serem liberados para a circulação periférica como linfócitos derivados do timo, conhecidos como linfócitos T (CARRIER et al., 2004). Nos teleósteos, o córtex é a camada mais externa do timo, onde apresenta normalmente densidade mais elevada de timócitos e relativamente poucas células epiteliais, estas, quando presentes, são caracterizadas por projeções celulares.

(26) 25. longas e delgadas (PRESS; EVENSEN, 1999). A região cortical é composta por numerosos linfócitos e linfoblastos, alguns em mitose, numa rede de células reticulares muito ramificados, que são unidas por desmossomas. Algumas das células contêm monofilamentos, células mioides que, assim como em vertebrados superiores, têm citoplasma repleto de miofilamentos, tubos de T, e inclusões lipídicas. Existe também a presença de manchas medulares menos densas com fibras reticulares e macrófagos. Nos elasmobrânquios há ausência dos corpúsculos tímicos de vertebrados superiores, e cistos epiteliais são escassos (HAMLETT, 1999). A medula é menos densamente povoada com células, mas as células epiteliais são mais proeminentes formando assim uma malha de apoio. O suprimento vascular para o timo é mais desenvolvido na medula e há indícios de que a barreira hemato-tímica exista e, que os vasos sanguíneos são a única ligação para outros órgãos (PRESS; EVENSEN, 1999). Alguns autores propõem que as células epiteliais produzem fatores importantes para a maturação dos timócitos e a aquisição de características especifica de timócitos (CHILMONCZYK, 1992). Nos elasmobrânchios, o timo também é fonte de vários peptídeos, incluindo o hormônio de timulina, envolvidos na comunicação entre os sistemas imunológico e neuroendócrino (HAMLETT, 1999). Os estágios iniciais da diferenciação dos linfócitos T ocorrem na região cortical do timo, enquanto que as fases subsequentes da diferenciação ocorrem na região medular (PETRIE; ZUNIGA-PFLUKER, 2007). Embora as células T progenitoras serem originadas de tecidos hematopoiéticas, estas migram para o ambiente tímico especializado para uma maior diferenciação (ANDERSON et al., 2007).. 3.4.2. Órgão de Leydig. Nos anfíbios, aves e mamíferos, a medula óssea é o local onde ocorre a hematopoiese,. nos. peixes. ósseos,. esta. ocorre. no. rim. cefálico.. Nos. elasmobrânquios, essa função ocorre no órgão de Leydig e no órgão epigonal. O.

(27) 26. primeiro aparece como uma grande massa branca rosa na parede do esôfago, estendendo-se dorsalmente desde a região ventral da boca até a região cárdica. Neste órgão são encontradas células eosinófilicas, granulócitos, heterófilos e linfócitos (HAMLETT, 1999). Segundo Mattson e Fänge (1982), o órgão de Leydig, é constituído de duas massas esbranquiçadas nas regiões dorsal e ventral do esôfago (MATTSON; FÄNGE, 1982). Tubarões das espécies Prionace glauca e Ginglymostoma cirratum têm um órgão de Leydig ausente ou muito pequeno (HAMLETT, 1999). Seu tecido é constituído de grandes números de leucócitos maduros e imaturos e tecido conjuntivo. Os lóbos são formados por pequenos amontoados de células. e. separado. por. espaços. onde. se. encontram. veias. irregulares.. Histologicamente, o tecido se assemelha a medula óssea dos vertebrados terrestres, embora não produzam células vermelhas e não possuem gordura em seu tecido (MATTSON; FÄNGE, 1982). A maioria das células do órgão de Leydig é semelhante às células sanguíneas dos vertebrados e mesmo de alguns invertebrados (BESSIS, 1973). Os leucócitos encontrados no órgão de Leydig são muitas vezes encontrados em grupos difusos ou folículos, ocorrendo principalmente com células eosinófilas granulóciticas e pequenos linfócitos que, quando submetidos à coloração de Giemsa, pode-se verificar que o tecido se apresenta em mosaicos de granulócitos manchados e de células não granuladas em azul (MATTSON; FÄNGE, 1982). Segundo Mattson e Fänge (1982), para uma melhor identificação dos tipos de leucócitos, é necessário à microscopia eletrônica de transmissão, onde é possível identificar detalhes estruturais das células para uma identificação mais segura. Quando submetido à técnica de microscopia eletrônica de transmissão, o órgão de Leydig apresentou grânulos em formas esféricas, porém, em contraste com o que geralmente são encontrados, os grânulos contêm um núcleo cristalino. A periferia é disposta de grânulos. Estas células são circundadas por grânulos e normalmente possuem um reticulo endoplasmático rugoso circundado por grânulos. As células eosinofílicas, fazem parte de apenas 5% do total de células granulocíticas (MATTSON; FÄNGE, 1982). No citoplasma das células do órgão de Leydig são encontradas estruturas semelhantes ás encontradas em plasmócitos dos mamíferos, as características de.

(28) 27. cisternas e retículos endoplasmáticos, com a presença de ribossomos, indicam que a principal função das células é a síntese de proteínas. Estudos demonstram uma eficiente produção de imunoglobulinas que estimula a resposta antigênica nos elasmobrânquios que ocorre no órgão de Leydig (LITMAN et al., 1976; MARCHARLONIS, 1977), o que demonstra que este órgão possui uma função fundamental no sistema imunológico destes animais (MATTSON; FÄNGE, 1982). 3.4.3. Baço. Evolutivamente o baço é o órgão linfoide secundário mais antigo, embora o papel. de. remoção. de. células. sanguíneas. envelhecidas. ou. danificadas. provavelmente anteceda as funções imunológicas deste órgão (BRENDOLAN et al., 2007). Nos peixes em geral é o órgão hematopoiético mais importante (FANGE, 1985), sendo o principal responsável pela síntese de anticorpos. Assim como nos mamíferos, os plasmócitos, linfócitos B diferenciados, são responsáveis pela produção de anticorpos. Macrófagos são comuns dentro dos elipsoides e estão localizados dentro da polpa branca (HAMLETT, 1999). Nos elasmobrânquios, o baço é facilmente localizado devido à sua coloração vermelha escura arroxeada. Nos tubarões o baço é alongado e posicionado ao longo da margem exterior da região do estômago (ZAPATA, 1980). O sangue é drenado para o interior da veia porta-hepática, a partir da artéria celíaco-mesentérica. Este material é constituído de uma massa de polpa branca, localizada principalmente em torno dos grandes vasos sanguíneos, com polpa vermelha entre os dois. A polpa é constituída de tecido eritróide, e contém alguns granulócitos e plasmócitos e numerosos linfócitos, monócitos e macrófagos (HAMLETT, 1999). Histologicamente, o baço é composto das regiões de células vermelhas e brancas, apresentando uma organização estrutural semelhante à de outros vertebrados (ZAPATA, 1980). As regiões dispersas da polpa branca são acúmulos densos de pequenos linfócitos com artérias centrais assimetricamente colocados (CARRIER et al., 2004). As áreas de polpa branca são circunscritas por áreas menos densas de polpa vermelha compostas de seios venosos preenchidas.

(29) 28. primeiramente por eritrócitos e, em uma menor quantidade, por linfócitos (ANDREW; HICKMAN, 1974). A polpa branca é constituída por massas de linfócitos (HAMLETT, 1999), onde os mesmos se multiplicam (ANDREW; HICKMAN, 1974). Nesta mesma região ocorre o alinhamento dos macrófagos aos interstícios da polpa vermelha, removendo os eritrócitos avariados ou envelhecidos (PRESS; EVENSEN, 1999). Em Scyliorhinus canícula e Gimglymostoma cirratum jovens, as células linfoides da polpa branca consistem principalmente de linfócitos B. Em animais adultos, nestas áreas também são encontradas uma zona central de linfócitos T, e células dendríticas (LLOYD-EVANS, 1993; RUMFELT et al., 2002). Na truta-arco-iris e zebrafish, os linfócitos se tornam detectáveis somente depois de presentes no timo e no rim cefálico como tecido hematopoiético e no baço como órgão linfoide secundário (ZAPATA et al., 2006). Embora a presença de células maduras, imaturas e em divisão, impressões esplênicas confirmam que este tecido seja um local para a produção de linfócitos, e granulócitos (CARRIER et al., 2004). Numerosos eritrócitos são armazenados na polpa vermelha, que são liberados pela contração do baço, na ocorrência de uma súbita necessidade de aumento da capacidade de transporte de oxigênio do sangue, durante o exercício vigoroso ou hemorragia (HAMLETT, 1999). Os melanomacrófagos do baço são as principais células de destruição dos eritrócitos (AGIUS; AGBEDE, 1984; ZAPATA; COOPER, 1990). A capacidade dos melanomacrófagos de reter antígenos por longos períodos, possivelmente seja devido à sua formação imuno-complexa, semelhante aos vertebrados superiores (ELLIS; DE SOUSA, 1974; FERGUSON, 1976; AGIUS, 1980). Em espécies de peixes teleósteos que não pertencem à classe dos salmonídeos, as agregações de melanomacrófagos formam um centro destas células, que podem ser ligados a uma fina capsula rodeada de polpa branca e associada com paredes finas e vasos sanguíneos estreitos (AGIUS, 1980; HERRAEZ; ZAPATA, 1986; ELLIS et al., 1989)..

(30) 29. 3.4.4. Órgão Epigonal. O órgão epigonal é encontrado apenas nos elasmobrânquios, e se encontra continuo caudalmente a partir da margem posterior das gônadas em todas as espécies de tubarões e raias (SMITH et al., 2004). Está intimamente associado ao mesentério em que ocorre o desenvolvimento gonadal (LLOYD-EVANS, 1993). Sua forma e tamanho variam dependendo principalmente das espécies (CARRIER et al., 2004). Histologicamente, o órgão epigonal é composto de estruturas que lembram os da medula óssea dos mamíferos, exceto pela ausência de células adiposas. É constituído por um estroma de fibrócitos e fibras colágenas dispostas entre os vasos sanguíneos (BIRCAN-YILDIRIM et al., 2011). O parênquima do órgão epigonal é constituído por grande quantidade de leucócitos em diversos estágios de desenvolvimento, localizados no estroma, este formado por tecido conjuntivo e vasos sanguíneos. São também encontradas quantidades significativas de granulócitos (FÄNGE; MATTISON, 1981; ZAPATA, 1980; CARRIER et al., 2004; SMITH et al., 2004). Bircan-Yldirim et al. (2011), em estudos com Rhinobatos rhinobatos, descreve que a atividade mitótica dos eritrócitos é frequentemente detectada no órgão epigonal, demonstrando que a replicação, bem como a maturação destas células ocorrem regularmente neste órgão.. 3.5 CÉLULAS DOS ÓRGÃOS LINFÓIDES. 3.5.1. Linfócitos. Em Ginglymostoma cirratum, os linfócitos são células arredondadas e de tamanho variado, seu núcleo é arredondado e grande, cobrindo a maior parte do citoplasma e não possuem grânulos visíveis (PINZÓN; ALDANA, 1996). Nos.

(31) 30. mamíferos, apresentam projeções citoplasmáticas, facilitando a diferenciação (MATOS; MATOS, 1995). Na microscopia eletrônica de transmissão são observadas poucas organelas e numerosos ribossomos e algumas mitocôndrias quando visto em células grandes (SMITH et al., 2004). Estas células possuem papel importante na imunidade adaptativa dos elasmobrânquios, existindo dois tipos de linfócitos, B e T (RUMFELT et al., 2002).. 3.5.1.1. Linfócito T. Os linfócitos T são células localizadas no córtex tímico, onde chegam pelas artérias, migrando em direção à medula, onde adentram a corrente sanguínea (MESQUITA-JUNIOR. et. al.,. 2010).. Desempenham. um. papel. chave. em. determinadas respostas imunitárias do organismo (LIEM et al., 2001). Participam na resposta mediada por células, em que as células atacam diretamente as células infectadas por vírus, fungos e outras células estranhas. Porém outras células T auxiliam na ativação de linfócitos B. (LIEM et al., 2001). A maturação do linfócito T nos mamíferos, ocorre em etapas envolvendo a recombinação somática e a expressão do TCR, proliferação celular, expressão dos co-receptores CD4 e CD8 e a seleção positiva e negativa induzida por apresentação de antígenos próprios pelas células presentes no estroma tímico (MESQUITAJUNIOR et al., 2010). Estas células reconhecem os antígenos intracelulares, destruíndo os patógenos ou a célula infectada. Possuem antígenos na membrana e reconhecem apenas os peptídeos antigênicos ligados a proteínas do hospedeiro, que são codificados pelos genes. do sistema principal de. histocompatibilidade, se. expressando nas superfícies de outras células (MAISEY et al., 2010)..

(32) 31. 3.5.1.2. Linfócito B. Nos mamíferos, os linfócitos B são produzidos inicialmente no saco vitelínico e posteriormente, durante a vida fetal, é produzido no fígado e medula óssea. As células que vão se diferenciar em linfocitos B permanecem na medula óssea até que se mature. Já os Linfócitos B maduros, deixam a medula e adentram a corrente sanguínea, posteriormente migrando para os órgãos linfoides secundários (MESQUITA-JUNIOR et al., 2010). Nos teleósteos essas células são produzidas no rim cranial (SCAPIGLIATI et al., 1999). Estas células são responsáveis pela imunidade humoral que produz e libera anticorpos capazes de neutralizar ou destruir antígenos. Com a ativação do linfócito B ocorre o processo de proliferação e diferenciação desse tipo de célula (MESQUITA-JUNIOR et al., 2010). O desenvolvimento e maturação das células B em peixes assim como as demais células sanguíneas, ocorrem no rim cefálico, porem em algumas espécies também podem ocorrer no baço (SCAPIGLIATI et al., 1999).. 3.5.2. Monócitos. Os monócitos do Gimglymostoma cirratum são células grandes de forma esférica, normalmente arredondada. Possui o núcleo pequeno, redondo ou alargado em forma de rim e descentralizado, com cromatina densa e ausência de nucléolo (PINZÓN; ALDANA, 1996). O citoplasma é basofílico podendo apresentar prolongamentos citoplasmáticos e presença de vacúolos, com ausência de grânulos (TAVARES-DIAS; MORAES, 2004; THRALL et al., 2007). Estas células atuam na reação inflamatória e na resposta imunológica, são responsáveis pela fagocitose, sendo importante na defesa contra organismos estranhos. Além de possuírem função de fagocitar antígenos, os monócitos possuem habilidades citotóxicas não especificas (CARRIER et al., 2004; THRALL et al., 2007)..

(33) 32. Nos demais vertebrados, o termo monócito é designado a células imaturas e o termo macrófago designa-se a células encontradas em tecidos maduros. Nos peixes em geral, essa designação não é feita (CARRIER et al., 2004). Segundo Hyder et al. (1983) e Carrier et al. (2004), em estudos com tubarão lixa, descreve que a diferenciação dos monócitos imaturos para a diferenciação plena para macrófagos ocorre na circulação no sangue periférico. Hyder et al. (1983) não é um apud pq o artigo está disponível na internet. Apud geralmente usamos para obra de dicifil acesso.. 3.5.3. Macrófagos. São células grandes de formato irregular, o núcleo é excêntrico com margem irregular e em alguns casos apresentam nucléolos. No citoplasma é possível encontrar lisossomos de variados tamanhos (ELLIS, 1976; FERGUSON, 1976). Os macrófagos são as principais células fagocíticas, desempenham papéis importantes na reposta imunológica especifica e não especifica (BUENTELLO; GATLIN, 1999). Estas células participam da defesa contra agentes invasores, funcionando como células acessórias para a resposta linfocitária (CARRIER; MUSICK; HEITHAUS, 2004).. 3.5.4. Eritrócitos. Nos elasmobrânquios, a morfologia dos eritrócitos se assemelha a de outros vertebrados, exceto aos dos mamíferos. Suas células maduras são ovais, com citoplasma homogêneo, que pode apresentar uma variável quantidade de pontos claros rarefeitos, e presença de vacúolos associados à degeneração das organelas (THRALL, 2007), possui o núcleo condensado de forma ovalado no centro da célula (PINZÓN; ALDANA, 1996; SMITH et al., 2004)..

(34) 33. No desenvolvimento dos eritrócitos, as células em fase inicial são tipicamente arredondadas contendo um grande núcleo redondo com pouca cromatina condensada (ZAPATA, 1980; HYDER et al., 1983). Nos elasmobrânquios, os eritrócitos possuem função de troca gasosa e do equilíbrio ácido-base assim como nos mamiferos (CLAIBORNE et al., 2002).. 3.5.5. Eosinófilos. Os eosinófilos. possuem tamanhos diversos. citoplasmáticos com quantidades. e tamanhos. e apresentam grânulos. variáveis.. Possui. o núcleo. arredondado e excêntrico, em alguns casos bilobulados, com cromatina compacta (RODRÍGUEZ, 1991) e apresentam grânulos dispostos por todo o citoplasma. Esta célula é abundante no tecido hematopoiético, mucosa intestinal, mesentério e brânquias (TAVARES-DIAS et al., 2005). Os eosinófilos dos elasmobrânquios são diferenciados dos heterófilos por sua forma, tamanhos e pela morfologia dos grânulos, núcleo condensado podendo ser redondo ou multilobulado (SMITH et al., 2004). Na observação pela microscopia eletrônica de transmissão, observa-se que o citoplasma dos eosinófilos contem heterocromatina arredondada e elipsoidal, grânulos muitas vezes com um componente fibrilar central, grânulos moderadamente densos e ausência de inclusões cristalinas (SMITH et al., 2004).. 3.5.6. Basófilos. Os basófilos são células de formato arredondado e contorno irregular. O núcleo é centralizado e normalmente lobulado, variando de arredondado a oval, apresentando cromatina compacta e ausência de nucléolos (WALSH; LUER, 2004). O citoplasma é redondo e com grânulos basofílicos, que recobrem o núcleo e possuem dimensões menores que os neutrófilos (PINZÓN; ALDANA, 1996; RANZANI-PAIVA; SILVA-SOUZA, 2004)..

(35) 34. Nos peixes, os basófilos são morfologicamente diferentes entre as espécies, bem como na mesma espécie conforme seu estágio de maturação (SATAKE et al., 2009, TAVARES-DIAS et al., 2005)..

(36) 35. 4 MATERIAL E MÉTODOS. O protocolo experimental está de acordo com os princípios éticos de experimentação animal adotado pela Sociedade Brasileira de Ciências de Animais de Laboratório (SBCAL) e foi aprovado pela comissão de ética no uso de animais (CEUA) da FMVZ-USP nº 9396271113. Autorizado pelo Ministério do Meio Ambiente – MMA, Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade – ICMBio. Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade – SISBIO nº 47691-1.. 4.1 ANIMAIS E AMBIENTE DE EXPERIMENTAÇÃO. Foram coletados cinco espécimes nas fases I (5 a 10 cm); II (15 e 20 cm) e III (25 a 35 cm), IV (40 a 45 cm) e adulto (2 a 3 m), de fêmeas capturadas no mês de Março, Julho e dezembro de 2014, no sul do Brasil, pela frota espinheleira de Itajaí, oriundos da pesca comercial e doadas pela empresa Kowalsky Pescados LTDA. Também foram coletados em Julho de 2015, no nordeste do Brasil, pela frota espinheleira de Natal, oriundos da pesca comercial, doadas pela empresa Atlantic Tuna LTDA.. 4.2 COLETA DE MATERIAL. Os embriões foram retirados do útero e eutanasiados por dessensibilizarão do encéfalo com o auxílio de uma tesoura. Em seguida foram fotodocumentados ”in situ”. Os animais foram dissecados com o auxílio de uma pinça e bisturi. No convés do barco fez-se uma incisão na região dorsal do condocrânio, expôs-se o tecido tímico, que foi fotodocumentado e coletado. Na região ventral dos animais, fez-se uma incisão longitudinal ventral, expondo-se os órgãos internos, que também foram fotodocumentados antes de serem coletados..

(37) 36. As amostras de timo, baço, órgão epigonal e órgão de Leydig, foram coletadas em tubo falcon de 50 ml, fixadas em formaldeído 4%, pH 7.2. Após 72h a solução foi substituída por álcool 70% e mantida até seu processamento no laboratório de Histologia do Departamento de Anatomia (FMVZ/USP). Para a análise morfológica das células foi utilizada a coloração de May-Grünwald-Giemsa-Wright (TAVARES-DIAS; MORAES, 2004), Tricrômio de Masson e hematoxilina eosina.. 4.3 INCLUSÃO E CORTE DE MATERIAL. 4.3.1. Fixação e Processamento das Amostras para Microscopia de Luz. Os órgãos epigonal, timo e baço coletado foram fixados recortados em cubos com lados medindo aproximadamente 0,5cm e colocados em solução fixadora de formalina tamponada a 10%, permanecendo por 24-48 horas para completa fixação. Em seguida o material foi desidratado em série de etanóis em concentrações crescentes (de 70 a 100%) e diafanizado em xilol, com posterior inclusão em paraplast (BANCROFT; STEVENS, 1996). O processamento dos blocos de parafina incluiu corte em micrótomo (Leica® RM 2065) com espessura de 3 μm e adesão dos fragmentos obtidos em lâminas de vidro (Starfrost, Kinnitel Glaser) e mantidos em estufa a 60ºC por 24 horas depois as laminas foram submetidas a passagem em baterias de xilol e álcool para as respectivas colorações. A montagem das lâminas foi feita com resina Permount® (Fischer scientific).. 4.3.2. Coloração por Hematoxilina-Eosina. A técnica de coloração com Hematoxilina- Eosina é uma técnica utilizada para a coloração de tecidos em histologia, esta técnica permite diferenciar áreas basófilas pela hematoxilina dando um tom azul-púrpura no núcleo celular e acidófila ou.

(38) 37. eosinofílicas pela eosina conferindo afinidade pelas proteínas do citoplasma da célula, corando-o de róseo a vermelho. O tecido emblocado em parafina foi cortado em micrótomo (3 µm), colocado em banho-maria (30oC) e aderidos em lâminas de vidro. Em seguida, a lâmina foi colocada. numa. estufa. a. 60ºC. overnight. e. submetida. ao. protocolo. de. desparafinização em xilol, hidratação em álcoois e água e foram coradas por HE. As leituras das laminas foram realizadas em microscópio de luz Nikon Eclipse E-800. As amostras foram utilizadas para determinação do exame histológico.. 4.3.3. Coloração por May Grünwald - Giemsa. A coloração de May Grünwald - Giemsa é indicado para coloração de células de sangue periférico, medula óssea ou para estudo citológico de elementos celulares. As laminas foram mergulhadas no corante May Grünwald- Giemsa por três minutos. Decorrido este tempo, as laminas foram lavadas com destilada para tirar o excesso, depois que secaram foram submetidas à montagem e leitura no microscópio de luz Nikon Eclipse E-800.. 4.3.4. Coloração Tricrômio de Masson. Esta. coloração. é. empregada. em. diferentes. aplicações. a. fim. de. distinguir células do tecido conjuntivo, colágeno, músculo dentre outros elementos histológicos. Após desparafinização em xilol por 5 minutos, as laminas foram hidratadas em álcool 99%, 95%, 70% e lavadas em água destilada, em seguida foram submetidas a imersão com hematoxilina férrica de Weigert e lavadas com água destilada novamente, depois, colocadas em solução alcoólica de ácido pícrico por 6 minutos e lavadas em água destilada, depois as laminas foram colocadas em.

(39) 38. solução de fucsina Ponceau por 4 minutos, lavadas em água destilada e colocadas na solução ácida fosfomolíbdica por 5 minutos e depois mergulhadas na solução de azul de anilina de Masson por 5 minutos, então foram lavadas em água destilada pela última vez, desidratadas e submetidas a montagem das mesmas.. 4.3.5. Microscopia eletrônica de transmissão. As amostras foram fixadas em glutaraldeído 3%, pós-fixadas em tetróxido de Ósmio a 1%, desidratado em séries crescentes de álcoois em concentrações de 50%, 70%, 90% e 100%, lavadas em óxido de propileno, mantidas em óxido de propileno/ resina Spurr, colocadas em resina “Spurr” pura e na sequência em moldes para consolidar a polimerização da resina. Do bloco foram obtidos cortes semifinos sob lâminas e ultrafinos sob telas. As telas foram contrastadas com uranilae citrato de chumbo e analisadas e fotodocumentadas ao microscopio eletrônico de transmissão–MORGANI 365 (Phillips FMVZ/USP).. 4.3.5.1. Corte semifino. Os cortes semifinos foram feitos com um ultramicrótomo (Leica Reichert Supernova) com 0,5-1 µm de espessura e colocados sobre lâminas histológicas para a realização da coloração com azul de toluidina a 0,5% em bórax a 2,5% (pH 11) por 2 minutos.. 4.3.5.2. Corte Ultrafino. Após a confecção dos cortes semifinos, seguiu-se com os cortes ultrafinos medindo 60 nm de espessura. Estes cortes foram colocados em grades de cobre de.

(40) 39. 200 mesh e cobertas com membranas de formvar seguido de contraste com solução de citrato de chumbo. A análise dos cortes ultrafinos foi avaliada em um microscópio eletrônico de transmissão (Morgagni 268 D, FEI Co.; Netherlands) com sistema de captura de imagens integrado (MegaView).. 4.4 FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS. A análise microscópica, as leituras das lâminas serão realizadas em microscópio de luz Nikon Eclipse E-800..