Lucas Murara da Rocha
DETERMINAÇÃO DE ALUMÍNIO EM AMOSTRAS DE FÍGADO BOVINO POR ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA DE ALTA RESOLUÇÃO COM FONTE CONTÍNUA
EM FORNO DE GRAFITE
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Química.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Carasek da Rocha
Florianópolis 2019
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária
Lucas Murara da Rocha
DETERMINAÇÃO DE ALUMÍNIO EM AMOSTRAS DE FÍGADO BOVINO POR ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA DE ALTA RESOLUÇÃO COM FONTE CONTÍNUA
EM FORNO DE GRAFITE
Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Química e aprovada em sua forma final pelo Programa
Pós-Graduação em Química. Florianópolis, 22 de fevereiro de 2019.
________________________ Prof. Dr. Vanderlei Gageiro Machado
Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Química Banca Examinadora:
________________________ Prof. Dr. Eduardo Carasek da Rocha
Orientador
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof. Dr. Daniel Lazaro Gallindo Borges
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof. Dr.ª Daiane Paula Cunha de Quadro Instituto Federal Catarinense (IFC-Ibirama)
Este trabalho é dedicado à minha família.
AGRADECIMENTOS
Um agradecimento muito especial aos meus pais, Jorge e Denise, porque sempre me apoiaram durante todas as minhas decisões, estando sempre por perto me aconselhando, incentivando e comemorando as minhas conquistas, além de toda a paciência e carinho. Eles são meu suporte durante toda essa caminhada. Obrigado por serem grandes apoiadores da educação e ciência no país.
Aos meus irmãos, Gabriela e Victor, por me apoiarem e me darem forças, da forma que foi possível, mesmo sendo de longe.
Um eterno agradecimento mais que especial ao Professor Bernhard Welz (in memoriam). O senhor me ensinou muitas coisas durante os quatro anos que estivemos trabalhando juntos, principalmente a ser um bom profissional, com todas as suas grandes e geniais ideias que faziam os trabalhos serem incríveis. Era um grande contador de histórias, onde toda quarta-feira esperávamos ansiosamente pelo senhor para ouvir mais algumas de suas histórias de vida, tanto profissionais, quanto as grandes aventuras. O senhor será lembrado para sempre, pelos seus alunos e pela comunidade científica. Muito obrigado.
Ao Professor Eduardo Carasek que antes mesmo de se tornar meu orientador, já tinha minha admiração por ser um ótimo professor e um grande pesquisador. Muito obrigado por ter nos acolhido, pelos ensinamentos e conhecimento.
A Mauana que me ensinou tudo desde o começo, me acolheu no laboratório de forma grandiosa e não mediu esforços para me ajudar, mesmo ficando até de madrugada para terminar um trabalho, mais especificamente este. És uma grande pessoa, amiga e profissional.
A todos os meus amigos que fiz durante a graduação e mestrado, Amanda, Bea, Lucas Morés, Diogo, Fran, Josi, Marina, Duda, Helô, Sângela, Gabi Corazza, Leila, Nicole, Lucas Talamini, Michela, Vanessa e Ana. Os dias são melhores com vocês. Agradeço por todo o apoio, vocês são demais.
Aos meus membros do CroMaas, pelo companheirismo, ajuda profissional e pessoal, pelas risadas e momentos de descontração tanto dentro como fora do laboratório. Um agradecimento para os antigos membros do laboratório que de alguma forma cruzaram meu caminho e me ajudaram de alguma forma.
Aos meus amigos de Jaraguá, Ana, Vanessa, Wendell, Bruna, Leonardo, Marine, Débora, Thaís e Grazi. Obrigado por todo o apoio na minha jornada. Nossa história começou muito antes disso, por mais que a distância as vezes dificultou os nossos encontros, sempre conseguimos
manter contato e o melhor de tudo, conseguimos acompanhar a evolução de cada um. Vocês são e sempre serão meus melhores amigos.
Um agradecimento especial aos meus amigos Patty, Aleja, Marco e Nana. Nossa amizade começou há pouco tempo, porém quebra barreiras de culturas, idiomas, continentes e países. Obrigado por nossas aventuras mundo afora.
Meu muito obrigado aos membros da banca por terem aceitado prontamente o convite e pelas contribuições com este trabalho. Um agradecimento também a todos os professores do departamento de química da UFSC, por todo o ensinamento e dedicação. A Capes, INCT e Analytik Jena AG pelo auxílio financeiro, que permitiu a execução deste trabalho.
RESUMO
Alumínio é considerado um elemento potencialmente tóxico para animais e seres humanos quando encontrado em altas concentrações, sendo apontado como causador de diversas desordens. Sua presença é associada com doenças degenerativas como Alzheimer e Parkinson, o que faz o monitoramento de alumínio necessário para elucidar questões estudadas por pesquisadores das áreas de química e da saúde. Este trabalho propõe um método simples para a determinação de alumínio em fígado bovino por espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua em forno de grafite via análise direta de sólidos. O método desenvolvido usa o comprimento de onda de 394,3995 nm, uma linha de absorção menos sensível de Al para evitar diluições e preparos de amostra. Foi realizado o monitoramento das asas da linha analítica com dois pixels de cada lado do pico. O programa de temperaturas foi otimizado e as melhores condições foram alcançadas quando 1000 °C e 2400 °C nas etapas de pirólise e atomização, respectivamente, aplicando Zr como modificador químico permanente. A curva de calibração foi construída usando solução padrão de alumínio, com uma faixa linear de trabalho de 0,25 a 2,0 ng. Os limites de detecção e quantificação alcançados foram 0,03 µg g-1 e 0,11 µg g-1, respectivamente. O coeficiente de determinação linear (R2) foi 0,9995. Uma massa característica de 0,04 ng de alumínio foi obtida. A exatidão do método foi avaliada usando três CRM e mostrou boa concordância entre os valores encontrados e certificados. A concentração de alumínio foi determinada nas amostras e os resultados obtidos foram comparados com os valores de concentração obtidos por solubilização alcalina com TMAH. O fator de homogeneidade relativa foi avaliado mostrando que as amostras possuem altos valores de heterogeneidade.
Palavras-chave: Alumínio; Fígado Bovino; HR-CS GF AAS; Análise direta de sólidos.
ABSTRACT
Aluminum is considered a potentially toxic element for animals and humans when found in high concentrations, being pointed as causing several disorders. Its presence is associated with degenerative diseases as Alzheimer’s and Parkinson’s, which makes the monitoring of aluminum necessary to elucidated issues studied by researchers in the field of chemistry and health. This work proposes a simple method for the determination of aluminum in bovine liver by high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry via direct solid sample analysis. The developed method uses the wavelength of 394.3995 nm, a less sensitive absorption line of Al to avoid dilutions and sample preparation. Monitoring of the wings of the analytical line was also performed with two pixels on each side of the peak. The temperature program was optimized, and the best conditions were reached when 1000 oC and 2400 oC at pyrolysis and atomization step, respectively, applying Zr as chemical permanent modifier. The calibration curve was done using aqueous standard aluminum solution with a linear working range of 0.25 to 2.0 ng. The limits of detection and quantification achieved were 0.03 µg g-1 and 0.11 µg g-1 respectively. The linear determination coefficient (R2) was 0.9995. A characteristic mass of 0.04 ng Al was achieved. The accuracy of the method was evaluated using three CRM and agreed with the values found and certificates. The samples were quantified by direct solid sampling analysis and the results were compared with an open-vessel digestion, which the relative homogeneity factor was evaluated showing high heterogeneity values.
Keywords: Aluminum; Bovine Liver; HR-CS GF AAS; Direct solid sampling analysis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema do espectrômetro de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua. 1) lâmpada de arco curto de xenônio; 2) espelhos elipsoidais; 3) atomizador (chama ou forno de grafite); 4) fenda de entrada do monocromador; 5) espelhos parabólicos; 6) prisma Littrow; 7) fenda intermediária; 8) rede echelle; 9) detector CCD. ... 26
Figura 2. Sinal analítico para Al na linha de 394,3995 nm monitorado nas asas do pico, com a soma da absorvância integrada de dois pixels, um de cada lado do pico. ... 38
Figura 3. Curvas de pirólise e atomização para Al, usando solução padrão 50 µg L-1 de Al. Durante a otimização da etapa de pirólise, a temperatura de atomização foi fixada em 2400 °C. Já para a otimização da etapa de atomização, a temperatura de pirólise foi fixada em 1000 °C para (■) sem modificador químico permanente ou em solução; 1100 °C para (●) Zr como modificador químico permanente; 800 °C para (▲) Pd/Mg como modificador químico em solução; e 1100 °C para (▼) W como modificador químico permanente. ... 39
Figura 4. Curvas de pirólise e atomização para Al usando aproximadamente 0,100 mg de CRM NIST 1577b. Durante a otimização da temperatura de pirólise, a temperatura de atomização foi fixada em 2400 °C. Já para a otimização da atomização, a temperatura de pirólise foi fixada em 900 °C para (■) sem modificador químico permanente ou em solução; 1000 °C para (●) Zr como modificador químico permanente; 900 °C para (▲) Pd/Mg como modificador químico em solução; e 800 °C para (▼) W como modificador químico permanente. ... 40
Figura 5. Gráfico de resíduos de uma curva gerada com um intervalo de massas até 1,0 mg com CRM NIST 1577b. ... 43
Figura 6. Avaliação do efeito da massa de amostra utilizando um intervalo de 0 a 1,0 mg de CRM NIST 1577b. ... 44
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Programa de temperatura otimizado para a determinação de Al em amostras de fígado bovino usando HR-CS GF AAS por análise direta de sólidos; vazão de gás argônio de 2,0 L min-1, exceto na etapa de atomização, com o fluxo de gás interrompido. ... 34
Tabela 2. Programa de temperatura usado para a deposição térmica dos modificadores químicos permanentes dentro do tubo e na plataforma de grafite para análise direta de sólidos. Vazão de gás argônio de 2,0 L min-1 foi usada em todas as etapas, exceto na etapa de atomização, com o fluxo de gás interrompido. ... 35
Tabela 3. Parâmetros de mérito obtidos para a determinação de Al em fígado bovino por HR-CS GF AAS utilizando calibração com padrões aquosos. ... 45
Tabela 4. Verificação da exatidão do método proposto para a determinação de Al em CRM NIST 1577b, NIST 8414 e NCS ZC 71001 por HR-CS GF AAS via SS. ... 46
Tabela 5. Determinação de alumínio em amostras de fígado bovino por análise direta de sólidos e digestão aberta alcalina por HR-CS GF AAS, no comprimento de onda de 394,3995 nm. ... 47
Tabela 6. Fator de homogeneidade relativa, HE, para alumínio em CRM e amostras de fígado bovino. ... 49
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAS – Espectrometria de absorção atômica (Atomic Absorption Spectrometry);
CCD – Dispositivo de carga acoplada (Charge Coupled Device); CRM – Material de referência certificado (Certified Reference Material); CS AAS – Espectrometria de absorção atômica com fonte contínua (Continuum Source Atomic Absorption Spectrometry);
GF AAS – Espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry);
HE – Fator de homogeneidade relativa (Relative Homogeneity Fator);
HR-CS AAS – Espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua (High Resolution Continuum Source Atomic Absorption Spectrometry);
HR-CS GF AAS – Espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua em forno de grafite (High Resolution Continuum Source Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry);
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística; LOD – Limite de detecção (Limit of Detection);
LOQ – Limite de quantificação (Limit of Quantification);
LS AAS – Espectrometria de absorção atômica com fonte de linha (Line Source Atomic Absorption Spectrometry);
mo – Massa característica (characteristic mass);
R2 – Coeficiente de determinação linear (Linear Determination
Coefficient);
RSD – Desvio padrão relativo (Relative Standard Deviation); SD – Desvio padrão (Standard Deviation);
SS – Análise direta de sólidos (Direct Solid Sampling Analysis);
STPF – Forno com plataforma e temperatura estabilizada (Stabilized Temperature Platform Furnace);
TMAH – Hidróxido de tetrametilamônio (Tetramethylammonium hydroxide).
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 21
1.1 ALUMÍNIO ... 21
1.2 FÍGADO BOVINO ... 22
1.3 DETERMINAÇÃO DE ALUMÍNIO ... 23
1.4 ESPECTGROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA DE ALTA RESOLUÇÃO COM FONTE CONTÍNUA ... 24
1.5 ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA EM FORNO DE GRAFITE (GF AAS) ... 27
1.6 ANÁLISE DIRETA DE SÓLIDOS ... 28
2 OBJETIVOS ... 31 2.1 OBJETIVO GERAL ... 31 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 31 3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 33 3.1 INSTRUMENTAÇÃO ... 33 3.2 REAGENTES E AMOSTRAS ... 34 3.3 PROCEDIMENTOS ... 36
3.3.1 Análise Direta De Sólidos ... 36
3.3.2 Solubilização Alcalina com TMAH ... 36
3.3.3 Teste de Homogeneidade das Amostras ... 36
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 37
4.1 SELEÇÃO DO COMPRIMENTO DE ONDA ... 37
4.2 OTIMIZAÇÃO DO PROGRAMA DE TEMPERATURA .. 38
4.3 AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA MASSA DE AMOSTRA ... 42
4.4 CALIBRAÇÃO E PARÂMETROS DE MÉRITO ... 44
4.5 VERIFICAÇÃO DA EXATIDÃO ... 45
4.6 DETERMINAÇÃO DE ALUMÍNIO EM AMOSTRAS FÍGADO BOVINO POR HR-CS GF AAS ... 46
4.7 TESTE DE HOMOGENEIDADE DAS AMOSTRAS DE FÍGADO BOVINO ... 48
5 CONCLUSÃO ... 51 REFERÊNCIAS ... 53
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1 INTRODUÇÃO 1.1 ALUMÍNIO
Alumínio é um elemento que compreende cerca de 8% da crosta terrestre, sendo o terceiro mais abundante. Este, raramente é encontrado na sua forma metálica devido a sua natureza reativa, podendo fazer combinações com diversos elementos (Welz e Sperling, 1999), como silício, na forma de aluminossilicatos (Mackenzie e Welter, 2014); e oxigênio, onde é encontrado na forma de óxido de alumínio (bauxita).
A bauxita é a principal fonte para extração de alumínio (Ruys, 2019), sendo que o Brasil é o terceiro país com maior produção deste minério, com cerca de 35 milhões de toneladas produzidas por ano, ficando atrás apenas de Austrália e China. No Brasil, a extração do minério ocorre nos estados de Minas Gerais, Goiás e Pará, sendo o último, o estado que concentra a maior produção de bauxita, cerca de 91% (Alumínio, 2017). Entretanto, com a grande escala de mineração, a produção gera muitos rejeitos e impactos ambientais. Os principais rejeitos são argila e água, que são estocados em barragens para serem compactados. Os impactos ambientais causados são desmatamento, erosão e distúrbio hidrológico. Com isso, as empresas tentam minimizar os danos com a reutilização de água das barragens novamente no processo de produção e fazendo o reflorestamento de espécies nativas nas áreas que não possuem mais atividades de mineração (Alumínio, 2017).
Com a significativa produção da bauxita, a produção de alumínio também é muito elevada. Desta forma, há uma grande comercialização de alumínio no mercado industrial, sendo muito utilizado na construção civil, para a construção de edifícios energeticamente eficientes (Azari e Abbasabadi, 2018; Chel e Kaushik, 2018); indústrias automobilísticas (Das, 2014; Tisza e Czinege, 2018); e eletrônicos (Association, 2015).
Além de ser muito utilizado em diversos materiais e na indústria, o alumínio também pode ser encontrado no corpo humano, onde pode ser localizado cerca de 35 a 50 mg em diversos órgãos como pulmão, tecidos e ossos, com probabilidade de estar 50%, 25% e 25%, respectivamente (Association, 2015). A Organização Mundial da Saúde sugere a ingestão tolerável semanal de 1 mg Al kg-1 (Who, 2007). A ingestão excessiva deste mineral pode causar efeitos patogênicos de diversas doenças neurodegenerativas, entre elas as doenças de Parkinson e Alzheimer (Hegde et al., 2004; Bohrer et al., 2007; Komárek et al., 2007; Kazi et al., 2010; González-Domínguez et al., 2014; López-López et al., 2018).
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Como alumínio está em grande abundância na superfície terrestre e seus efeitos no sistema biológico não estão completamente elucidados, há um crescente interesse em analisar esse elemento. Uma forma de monitorar a presença de alumínio em seres vivos é a análise de tecidos de origem animal e humana (Mertz, 1986).
1.2 FÍGADO BOVINO
A produção de bovinos vem, atualmente, aumentando no Brasil e no mundo, devido a produção desses para fins nutricionais, como leite e carne, além de couro para indústrias têxteis. Conforme o Censo Agropecuário realizado em 2017, pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), o estado de Santa Catarina possui 3.725.827 cabeças de gado (Ibge, 2017). Estes animais têm como principal alimento o pasto, porém não é o suficiente para suprir as necessidades diárias de vitaminas e minerais, uma vez que dependendo da estação do ano, principalmente no período de seca, as pastagens oferecem baixa nutrição devido ao seu crescimento, assim acarretando para que o peso animal diminua (Lourenço et al., 1998; Gulati et al., 2018). Com isso, doses de suplementação alimentar são adicionadas à dieta dos animais, podendo ser introduzidas de forma intravenosa ou misturadas nas rações, tendo como principal objetivo o aumento do peso animal. Alguns desses suplementos alimentares podem ser produzidos a partir de matérias-primas que contenham muitos metais tóxicos. A ingestão excessiva de alumínio é apontada como causa comum de intoxicação em bovinos, onde seus efeitos danosos se manifestam por encefalopatia, efeitos teratogênicos e carcinogênicos, acumulando nos órgãos, como o fígado (Marçal et al., 2007).
O fígado desempenha um papel importante no organismo, tanto de animais como em seres humanos, pois contribui no metabolismo, síntese, armazenamento e distribuição de nutrientes através da corrente sanguínea. Uma função particularmente importante é a manutenção dos níveis de glicose no sangue. Quando os níveis de glicose no sangue diminuem, o fígado ativa a despolimerização do glicogênio armazenado e exporta os monômeros de glicose no sangue. Quando há o excesso de glicose acumulado no sangue, o fígado rapidamente converte para glicogênio. O fígado é o órgão responsável pela desintoxicação, removendo resíduos por meio da excreção biliar. A desintoxicação de metais e produtos tóxicos, drogas, produtos químicos e álcool também ocorre no fígado. Porém, quando ocorre alguma disfunção que suprima a desintoxicação, as substâncias nocivas se acumulam na corrente
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sanguínea e no órgão, causando diversos tipos de doenças como cirrose, hepatite e encefalopatia (Hamed et al., 2018; Miyamura e Nishina, 2018; Godfrey et al., 2019).
Em bovinos, o acúmulo de elementos e substâncias maléficas pode acarretar em alterações na carne e o leite. Desta forma, o fígado bovino é um dos tecidos animais mais utilizados para estudos, pois está presente nas refeições humanas, sendo oferecido na forma de carne, devido a ser uma fonte de proteína, gordura e minerais. Todavia, este alimento pode ser estudado como uma fonte de alumínio na dieta humana, sendo assim, um veículo de contaminação por este elemento (Da Silva et al., 2017). Atualmente, técnicas elementares, como a espectrometria de absorção atômica, são muito utilizadas para a análise, controle e monitoramento de alumínio em tecidos como fígado bovino.
1.3 DETERMINAÇÃO DE ALUMÍNIO
Devido à crescente utilização de alumínio em indústrias, sua presença na alimentação e sua associação a diversas doenças neurológicas, o interesse no monitoramento deste elemento tem aumentado. Com isso, a sua determinação tem sido proposta por diversas técnicas analíticas.
Estudos recentes mostram uma variedade de técnicas instrumentais para a determinação de alumínio, , espectrometria de fluorescência (López-López et al., 2018), espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado e ablação a laser (LA-ICP-MS) (Sajnóg et al., 2017), espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICPOES) (Gorgulla et al., 2015), voltametria (Suherman et al., 2018; Zuziak et al., 2018) e cromatografia líquida de alta eficiência com detector ultravioleta/visível (HPLC-UVVIS) (Frankowski, 2012). Contudo, essas técnicas e instrumentos precisam de um preparo prévio da amostra para posterior análise, pelo fato de não permitirem a introdução e determinação direta de amostras com matrizes complexas, como por exemplo amostras de fígado bovino, tornando mais laborioso o processo de análise (Trevizan et al., 2003). Na determinação de alumínio, a maior dificuldade é sua presença frequente diversos materiais. Isso eleva o risco de contaminação, ocasionando erros, afetando a repetitividade e aumentando os valores de branco (Welz e Sperling, 1999).
A espectrometria de absorção atômica (AAS) é uma técnica adequada para a determinação do elemento. Essa técnica permite a análise direta de amostras com matrizes complexas, o que é um diferencial quando comparada a outras técnicas (Nomura et al., 2008). Para a análise
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de amostras por AAS, com atomização em forno de grafite, não há a necessidade de um pré-tratamento para a remoção da matriz, pois a etapa de pirólise, do programa de temperatura apresenta essa função. No entanto, caso a remoção da matriz nessa etapa não seja eficiente, podem ser observadas interferências na determinação do analito. Assim, métodos de correção de fundo podem ser utilizados para minimizar as interferências, sem que a análise seja prejudicada. Espectrômetros de absorção atômica com fonte contínua são os equipamentos melhor equipados para a visualização do ambiente espectral e fundo causado pelos possíveis interferentes.
1.4 ESPECTGROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA DE ALTA RESOLUÇÃO COM FONTE CONTÍNUA
Com o avanço da técnica de AAS, novos equipamentos foram surgindo. Um grupo de pesquisa alemão, liderado pelo físico Helmut Becker-Ross, desenvolveu e construiu o primeiro espectrômetro de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua (HR-CS AAS). Eles basearam seus estudos para melhorar as limitações já encontradas no uso da espectrometria de absorção atômica com fonte contínua (CS AAS), determinando o que era necessário otimizar, para assim projetar nos instrumentos (Welz et al., 2014).
Os princípios da técnica de AAS são os mesmos para HR-CS AAS, porém o que difere são os componentes presentes nos instrumentos. A fonte de radiação na nova técnica é uma lâmpada de fonte contínua, que emite radiação em um espectro contínuo sobre uma ampla faixa de comprimento de onda, 190 a 900 nm, com uma lâmpada de arco curto de xenônio de alta pressão sendo utilizada, operando em modo hot spot com uma potência de 300 W, sendo ela constituída por dois eletrodos de tungstênio. A intensidade de emissão de uma lâmpada de fonte contínua é, em média, cerca de duas ordens de magnitude maior do que as linhas de emissão das lâmpadas de cátodo oco, o que aumenta a razão sinal/ruído. O sistema de atomização continuou sendo o mesmo usado em equipamentos com fonte de linha (LS AAS), forno de grafite ou chama. Um monocromador duplo de alta resolução é agora requerido, pois um feixe de radiação policromático emitido pela fonte contínua é separado em uma faixa de radiação. Assim, a radiação incidirá em um prisma e em uma rede de difração echelle, em um arranjo Littrow. O prisma serve como um pré-dispersor, que seleciona a parte de interesse do espectro, e a rede echelle concede a alta resolução, ou seja, faz a separação da linha analítica do intervalo espectral. O equipamento também conta com uma
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lâmpada de neônio emitindo linhas estreitas e intensas, servindo para a correção do posicionamento do prisma e da rede echelle.
Após a separação, a faixa de radiação é direcionada ao detector, que é constituído por um arranjo linear de dispositivos de carga acoplada (CCD), que é sensível na região do ultravioleta. Ele conta com o funcionamento independente e simultâneo de 512 pixels, entretanto apenas 200 pixels são utilizados para fins analíticos, o que torna possível a determinação simultânea de dois ou mais elementos. Frente a LS AAS que utiliza uma fonte de radiação específica para cada elemento, é uma vantagem a utilização de apenas uma fonte de radiação para diferentes analitos. Porém, requer que as linhas de absorção dos elementos estejam em um mesmo intervalo espectral, em uma região de 0,2 a 1,0 nm. Em média de 2 a 5 pixels são utilizados para o cálculo de absorvância integrada e os demais possibilitam a visibilidade do ambiente espectral. Essa é uma vantagem do detector CCD que possibilita obter informações de forma tridimensional sobre a vizinhança espectral da linha analítica, por meio de um gráfico tridimensional que relaciona a absorvância, o tempo de integração e os comprimentos de ondas vizinhos a linha analítica. Desta maneira, informações sobre fundo podem ser melhor obtidos do que por LS AAS (Borges et al., 2005; Welz et al., 2005; Welz et al., 2014). Na Figura 1 são mostrados os componentes básicos do instrumento de HR-CS AAS.
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Figura 1. Esquema do espectrômetro de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua. 1) lâmpada de arco curto de xenônio; 2) espelhos elipsoidais; 3) atomizador (chama ou forno de grafite); 4) fenda de entrada do monocromador; 5) espelhos parabólicos; 6) prisma Littrow; 7) fenda intermediária; 8) rede echelle; 9) detector CCD.
Fonte: Adaptado de Welz et al. (2005).
A correção de fundo é muito importante para AAS, pois um fundo não corrigido leva a interferência espectral, causando problemas na análise e na exatidão do método. A correção de fundo nos instrumentos de LS AAS é realizada, geralmente, com uma lâmpada de deutério, é capaz de corrigir apenas fundos espectrais contínuos, emitindo uma radiação contínua. Na HR-CS AAS o fundo e sua distribuição espectral podem ser visualizados, devido à alta resolução espectral e ao detector CCD. Deste modo, facilitando qual forma é a mais apropriada para a correção do mesmo. Outro ponto é que a absorção atômica e o fundo são medidos simultaneamente, possibilitando visualizar os sinais de fundo que são formados rapidamente durante a atomização (Borges et al., 2005).
Há quatro formas de corrigir fundos na HR-CS AAS. Na primeira delas, a correção é feita automaticamente via software. Esse tipo de correção é utilizado para fundos de eventos contínuos, ou seja, o fundo afeta todos os pixels. O segundo método de correção é feito por uma separação temporal do sinal analítico e do fundo, fazendo-se o ajuste através do intervalo de integração, ou seja, só pode ser utilizado quando sinal do fundo e do analito surgem em períodos diferentes durante a atomização. A terceira maneira de fazer a correção é fazendo uma separação espectral do sinal analítico e do sinal de fundo. Esse modo é
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utilizado quando os concomitantes não absorvem radiação no mesmo comprimento de onda do analito. Para fundos estruturados um quarto modo de correção pode ser utilizado, fazendo-se a separação espectral do sinal analítico do sinal do fundo, ou seja, há uma sobreposição dos sinais, com isso uma subtração do espectro do fundo é feita através de um algoritmo de mínimos quadrados. Um espectro de referência do fundo estruturado, já previamente identificado e salvo, é utilizado para realizar a subtração via software do espectro gerado pela amostra, assim restando apenas o sinal do analito (Welz et al., 2005).
Quando determinações estão sendo realizadas por análise direta de sólidos, a correção de fundo por algoritmo de mínimos quadrados pode ser requisitada, uma vez que amostras com matrizes complexas são inseridas diretamente no forno de grafite, o que pode conter concomitantes que sobrepõem o sinal do analito.
1.5 ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA EM FORNO DE GRAFITE (GF AAS)
Na espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GF AAS), a atomização é realizada em um tubo de grafite, no qual a amostra é introduzida. Este tubo de grafite é aquecido pela resistência à passagem de corrente elétrica, sendo assim, o aquecimento é controlado por meio de um programa de temperatura adequado. O programa de temperatura é composto pelas seguintes etapas: secagem, para a evaporação de solvente; pirólise, para a eliminação de concomitantes da matriz; atomização, etapa em que ocorre a formação da nuvem de átomos do analito no estado livre; e limpeza, onde ocorre a eliminação de qualquer resíduo existente no tubo, para posterior análise. Para que o tubo de grafite não oxide em consequência da combinação das altas temperaturas, durante a aplicação do programa de temperaturas, e do contato com O2(g) atmosférico, todo o forno de grafite é selado em um bloco metálico e vedado por duas janelas de quartzo. Gás argônio (Ar(g)) é então inserido, sendo utilizado como gás de proteção do tubo. O Ar(g) também é utilizado para a redução e/ou eliminação de concomitante antes da etapa de atomização, assim interferentes não irão absorver radiação proveniente da lâmpada (Welz e Sperling, 1999).
Na GF AAS, a utilização de modificadores químicos é bem-vinda, pelo fato de ajudar a reter o analito a temperaturas mais elevadas durante a etapa de pirólise e auxiliar remoção de concomitantes antes da etapa de atomização. Assim, os modificadores químicos podem aumentar a estabilidade térmica do analito e/ou aumentar a volatilidade da matriz,
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ocasionando uma melhora de sensibilidade (Tsalev et al., 2000). Para a técnica também foi proposto por Slavin et al. (1981) o uso do conceito STPF (Forno e plataforma com temperatura estabilizada). Este conceito lista medidas a serem adotadas para reduzir interferências durante as análises, onde devem ser usadas ao mesmo tempo para melhorar a sensibilidade do método e reduzir, ou até mesmo eliminar, o risco de interferências. O conceito STPF ajudou na construção dos espectrômetros de absorção atômica, tanto equipamentos de fonte de linha, como equipamentos mais modernos, como os de fonte contínua, porque já eram e são comercializados com o objetivo de atenderem a todos os conceitos publicados.
1.6 ANÁLISE DIRETA DE SÓLIDOS
A análise direta de sólidos (SS) é usada desde o começo das investigações da espectrometria, onde Kirchhoff e Bunsen compararam as linhas pretas no espectro do sol com a emissão e absorção do espectro obtido com sais puros (Welz et al., 2007).
A espectrometria de absorção atômica permite que amostras sólidas sejam analisadas de forma direta. A análise direta de sólidos, independente da técnica analítica que for usada, possui diversas vantagens sobre procedimentos que envolvem digestão ácida ou qualquer outro método de dissolução (Welz et al., 2005). As suas vantagens são: alto poder de detecção, pelo fato de não precisar de nenhuma diluição da amostra; rápido tempo de análise, mesmo que um mínimo preparo de amostra seja necessário, como homogeneização de materiais heterogêneos; risco de contaminação e perda de analito é reduzido; uso de reagentes químicos tóxicos e corrosivos é evitado; as amostras são pesadas diretamente na plataforma de grafite, onde posteriormente são introduzidas no atomizador (Welz et al., 2007).
Entretanto, a SS possui algumas desvantagens associadas, como dificuldades em encontrar padrões de calibração, ou seja, a calibração externa por padrões aquosos pode não ser representativa, sendo necessário o uso de matérias de referência certificados (CRM), o que aumenta o custo das análises; e a baixa precisão devido a heterogeneidade das amostras, assim afetando a exatidão do método. Porém, apesar das desvantagens, a técnica apresenta uma melhor veracidade dos resultados, pelo fato do risco de perda e contaminação do analito ser reduzido (Welz et al., 2005).
Atualmente, os instrumentos de AAS mais modernos facilitaram a introdução de amostras sólidas, porque oferecem ferramentas de
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introdução manual e automáticas. Os conceitos STPF na SS também são requisitados para que a análise seja bem-sucedida. Devido ao programa de temperatura dos instrumentos AAS, a análise direta de sólidos se torna possibilidade rápida para a determinação de elementos e moléculas, pois um pré-tratamento térmico da amostra na etapa de pirólise é realizado, facilitando a remoção de parte dos contaminantes que provocam interferências durante a etapa de atomização. A adequação e otimização do programa de temperaturas para SS, aliado ao uso de modificadores químicos, possibilitam, na maioria das vezes, a calibração do equipamento com padrões aquosos (Welz et al., 2007).
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2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver um método eficiente e rápido para a determinação de alumínio em amostras de fígado bovino usando espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua em forno de grafite com análise direta de sólidos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Otimizar o programa de temperatura através de curvas de pirólise e atomização com padrão aquoso e material de referência certificado;
Estudar o uso de modificadores químicos Zr, W e Pd/Mg; Avaliar a influência da massa de amostra introduzida no tubo
de grafite;
Verificar a exatidão do método proposto por meio da análise de materiais de referência certificados;
Aplicar o método desenvolvido para determinação de alumínio em amostras de fígado bovino;
Comparar os valores obtidos pelo método desenvolvido com um método de preparo de amostra por digestão aberta alcalina; Avaliar a homogeneidade das amostras de fígado bovino.
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3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 INSTRUMENTAÇÃO
Todas as medidas foram realizadas usando um espectrômetro de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua modelo ContrAA 600 (Analytik Jena AG, Jena, Alemanha). O instrumento é equipado com forno de grafite de aquecimento transversal; lâmpada de arco curto de xenônio de 300 W como fonte de radiação, operando em modo hot-spot, que emite um espectro contínuo de comprimento de onda entre 190 e 900 nm, desta forma, o comprimento de onda utilizado foi 394,3995 nm; um monocromador duplo de alta resolução, que consiste de um prisma pré-monocromador e um pré-monocromador de alta resolução com rede echelle; um detector CCD de 512 pixels operando de forma simultânea e independente, onde dos quais, 200 são usados para propósitos analíticos (Heitmann et al., 1996). O espectrômetro é controlado por um computador com um processador “Intel(R) Atom(TM)”, 1,60 GHz, utilizando um programa de aquisição de dados Aspect CS 2.1.2.0.
Tubos de grafite com recobrimento pirolítico, plataforma integrada e orifício de injeção (Analytik Jena, Part No. 407-A81.025), tubos de grafite sem plataforma e orifício de injeção (Analytik Jena, Part No. 407-152.023), e plataformas de grafite (Analytik Jena, Part No. 407-A81.303) para análise direta de sólidos foram utilizados para a otimização do método com solução padrões de Al em meio aquosos, otimização do método, calibração e análise das amostras. Uma microbalança M2P (Sartorius, Göttingen, Alemanha) foi usada para pesar as amostras diretamente na plataforma de grafite. Um acessório manual para a análise direta de sólidos, SSA6 (Analytik Jena) com uma pinça pré-ajustada, foi usada para a introdução da plataforma no tubo de grafite.
Padrões aquosos, modificadores em solução e amostras digeridas foram injetadas manualmente dentro do tubo de grafite com auxílio de uma micropipeta com volume máximo de 50 µL. Argônio com pureza de 99,996% (White Martins, São Paulo, Brasil) foi utilizado como gás de purga e proteção com um fluxo de 2,0 L mim-1 durante todas as etapas, exceto durante a etapa de atomização, sendo o fluxo interno de gás foi interrompido. O programa de temperatura utilizado para todas as determinações com HR-CS GF AAS é mostrado na Tabela 1.
O tratamento dos dados experimentais foi realizado utilizando Microsoft Excel 2013 e Origin 8.
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Tabela 1. Programa de temperatura otimizado para a determinação de Al em amostras de fígado bovino usando HR-CS GF AAS por análise direta de sólidos; vazão de gás argônio de 2,0 L min-1, exceto na etapa de atomização, com o fluxo de gás interrompido.
Etapa Temperatura / °C Rampa / °C s-1 Permanência / s Secagem 1 90 10 20 Secagem 2 110 15 10 Pirólise 1000 50 20 Atomização 2400 3000 7 Limpeza 2650 500 4
Fonte: Autoria própria (2019).
3.2 REAGENTES E AMOSTRAS
Todos os reagentes usados neste trabalho possuíam grau analítico de pureza. Utilizou-se água ultrapura com resistividade de 18,3 MΩ cm para preparo e diluição de padrões aquosos, sendo obtida de um sistema de purificação modelo Mega ROUP Megapurity (Equisul, Pelotas, Brasil). Solução estoque de 1000 mg L-1 de Al (Sigma-Aldrich, St Louis, EUA), foi usada para preparo de padrão aquoso de Al de 500 µg L-1 e soluções de calibração.
As seguintes soluções estoques de Zr 1000 mg L-1 (Fluka, Neu-Ulm, Alemanha), W 1000 mg L-1 (Sigma-Aldrich) e Pd/Mg 1000 mg L-1 (Sigma-Aldrich), foram usadas para a investigação como modificadores químicos permanentes. Os modificadores Zr e W foram depositados termicamente dentro dos tubos e nas plataformas de grafite para análise direta de sólidos através de dez injeções repetidas de 40 µL, seguido por aplicação de um programa de temperatura específico, como é apresentado na Tabela 2. Sendo assim, foi recoberto com uma massa de 400 µg dos modificadores permanentes ao fim dos processos. O modificador em solução Pd/Mg foi adicionado juntamente com a amostra no tubo de grafite e/ou plataforma.
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Tabela 2. Programa de temperatura usado para a deposição térmica dos modificadores químicos permanentes dentro do tubo e na plataforma de grafite para análise direta de sólidos. Vazão de gás argônio de 2,0 L min -1 foi usada em todas as etapas, exceto na etapa de atomização, com o fluxo de gás interrompido. Etapa Temperatura / °C Rampa / °C s-1 Permanência / s Secagem 1 110 10 40 Secagem 2 120 10 50 Pirólise 350 100 25 Atomização 1100 300 5 Limpeza 2300 500 5
Fonte: Autoria própria (2019).
O material de referência certificado NIST 1577b “Fígado bovino” (National Institute of Standard and Technology, Gaithersburg, MD, EUA) foi utilizado para a otimização do método por meio da temperatura de pirólise e atomização e para a avaliação da exatidão do método. Os demais materiais de referência certificados NIST 8414 “Pó de músculo bovino” (National Institute of Standard and Technology) e NCS ZC 71001 “Fígado de boi” (China Nacional Accreditation of Registrars, Pequim, China) foram utilizados apenas para a avaliação da exatidão do método proposto.
Seis amostras de fígado bovino foram analisadas, sendo elas fornecidas pela NIST com o código 1577c “Fígado bovino”. Essas amostras são CRM, porém não para alumínio. Desta forma, foram fornecidas para a realização do ensaio de certificação para alumínio. Todas as amostras necessitaram de uma peneiração em peneira de 325 mesh para homogeneização.
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3.3 PROCEDIMENTOS 3.3.1 Análise Direta De Sólidos
No método proposto, cerca de 0,1 mg de amostra ou CRM foram pesados diretamente na plataforma de grafite recoberta com o modificador adequado. A plataforma foi então inserida no tubo de grafite e foi aplicado o programa de temperatura, conforme apresentado na Tabela 1.
A curva de calibração foi realizada em uma faixa de trabalho de 0,25 a 2,0 ng de solução padrão de Al, sendo injetado uma alíquota de 10 µL da solução na plataforma de grafite e conseguinte a aplicação do programa de temperatura.
3.3.2 Solubilização Alcalina com TMAH
Para comparação da exatidão do método, foi realizada digestão aberta alcalina com hidróxido de tetrametilamônio (TMAH) (Sigma-Aldrich) das amostras de fígado bovino. O procedimento foi reportado na literatura por Noremberg et al. (2015), onde foi adicionado 0,5 mL de TMAH em aproximadamente 0,3 mg de amostra e levado para um banho termostático por uma hora. Após o banho, as amostras foram deixadas para esfriar a temperatura ambiente durante 24 horas e diluídas com 5,0 mL de água ultrapura, sendo levadas posteriormente para análise por HR-CS GF AAS.
3.3.3 Teste de Homogeneidade das Amostras
Foram testadas dez diferentes massas das seis amostras de fígados bovino, em uma faixa de 0,100 a 0,130 mg. O material de referência certificado NIST 1577b também foi usado para avaliar a homogeneidade, em comparação com as outras amostras. Para tanto, foram testadas dez massas do CRM em uma faixa de 0,100 a 0,116 mg.
A Equação 1 foi utilizada para calcular a homogeneidade, conforme o método publicado por Kurfürst et al. (1993) para avaliar a micro homogeneidade, onde RSD é o desvio padrão relativo e m é a massa média de amostra em mg.
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4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 SELEÇÃO DO COMPRIMENTO DE ONDA
A determinação de alumínio foi realizada através do monitoramento do sinal analítico na linha secundária de 394,3995 nm. Foi escolhido trabalhar com uma linha analítica de menor sensibilidade devido à alta concentração do analito nas amostras de fígado bovino, evitando assim diluições desnecessárias da amostra e tornando possível a utilização de análise direta de sólidos.
As primeiras otimizações foram realizadas utilizando solução padrão aquosa de alumínio, usando como configuração a soma da absorvância integrada de três pixels (CP±1) com o pixel central definido no centro do sinal analítico. No entanto, conforme publicado por Welz et al. (2005), as determinações e registros do sinal analítico podem ser feitas não apenas no pixel central para HR-CS AAS, mas também podem ser realizadas em todo o volume do pico, utilizando os pixels laterais. Considerando-se a alta concentração de Al nas amostras foi escolhido monitorar as asas do sinal analítico. Para isso foi utilizado a soma da absorvância integrada de dois pixels, um de cada lado do pico, sendo que a absorvância no pixel central não é considerada. Escolheu-se trabalhar nessas condições, mesmo que reduzindo a sensibilidade do método analítico, para que fosse evitado perdas de linearidade que poderiam ser causadas pelos altos valores de alumínio nas amostras. Desta forma a faixa linear para a determinação de alumínio foi, consequentemente, aumentada (Heitmann et al., 2007).
A Figura 2 apresenta o sinal analítico sendo monitorado nas asas da linha analítica. A linha em vermelho representa o centro do pico e as linhas em amarelo representam os pixels selecionados de cada lado do pico, região em que as leituras das absorvâncias foram realizadas. A absorvância integrada final é a soma das absorvâncias integradas de cada lado do pico.
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Figura 2. Sinal analítico para Al na linha de 394,3995 nm monitorado nas asas do pico, com a soma da absorvância integrada de dois pixels, um de cada lado do pico.
Fonte: Obtida e adaptada a partir do software Aspect CS versão 2.1.2.0 do instrumento HR-CS AAS (2019).
4.2 OTIMIZAÇÃO DO PROGRAMA DE TEMPERATURA
Para a obtenção de bons resultados para a quantificação de alumínio em amostras de fígado bovino, é necessário que o programa de temperaturas utilizado no método seja o mais adequado possível. Com isso, o programa de temperatura pode ser otimizado por meio das temperaturas de pirólise e atomização.
Para as otimizações com padrão aquoso, foram realizadas injeções de 10 µL de uma solução padrão de Al com concentração de 50 µg L-1, e foram avaliadas quatro condições: sem a utilização de modificador químico; Pd/Mg como modificador químico em solução; e W e Zr como modificadores químicos permanentes. A Figura 3 apresenta as curvas de pirólise e atomização para Al, com as condições avaliadas para padrão aquoso.
De acordo com a Figura 3, na etapa de pirólise foi possível aplicar temperaturas acimas de 1300 °C sem perda de sinal para todas as condições avaliadas. O sinal analítico com maior intensidade foi
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alcançado usando Zr como modificador químico permanente com as temperaturas 1100 °C e 2500 °C, para pirólise e atomização, respectivamente, sendo as temperaturas e condição ótima para Al com padrão aquoso. A avaliação sem a utilização de modificador químico permanente ou solução mostrou a menor intensidade de sinal analítico comparado com os outros modificados, o que significa que o uso de modificadores químicos permanentes ou em solução é essencial para a determinação de alumínio neste método.
Figura 3. Curvas de pirólise e atomização para Al, usando solução padrão 50 µg L-1 de Al. Durante a otimização da etapa de pirólise, a temperatura de atomização foi fixada em 2400 °C. Já para a otimização da etapa de atomização, a temperatura de pirólise foi fixada em 1000 °C para (■) sem modificador químico permanente ou em solução; 1100 °C para (●) Zr como modificador químico permanente; 800 °C para (▲) Pd/Mg como modificador químico em solução; e 1100 °C para (▼) W como modificador químico permanente.
Fonte: Autoria própria (2019).
O comportamento térmico de Al foi avaliado também em CRM de fígado bovino. Os estudos das temperaturas de pirólise e atomização
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foram realizados utilizando o CRM NIST 1577b nas mesmas condições avaliadas anteriormente. As medidas foram realizadas por análise direta de sólidos para o CRM. A massa de CRM utilizada para a otimização foi de aproximadamente 0,100 mg. Os resultados são apresentados na Figura 4 para as curvas de pirólise e atomização.
Figura 4. Curvas de pirólise e atomização para Al usando aproximadamente 0,100 mg de CRM NIST 1577b. Durante a otimização da temperatura de pirólise, a temperatura de atomização foi fixada em 2400 °C. Já para a otimização da atomização, a temperatura de pirólise foi fixada em 900 °C para (■) sem modificador químico permanente ou em solução; 1000 °C para (●) Zr como modificador químico permanente; 900 °C para (▲) Pd/Mg como modificador químico em solução; e 800 °C para (▼) W como modificador químico permanente.
Fonte: Autoria própria (2019).
Quando se usou Zr como modificador químico permanente, um sinal analítico simétrico e com boa intensidade foi obtido, sendo escolhido para utilização no método proposto. As temperaturas de 1000 °C e 2400 °C para pirólise e atomização, respectivamente, aceitas como as temperaturas ótimas. É possível observar que temperaturas acima de
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2400 °C para Zr apresentaram alta intensidade. Contudo, uma cauda no sinal analítico foi observada, portanto essas temperaturas não puderam ser utilizadas, uma vez que a cauda pode representar um efeito de matriz, pois o analito não é eliminado completamente na etapa de limpeza do programa de temperaturas. A repetitividade do método foi melhor quando Zr foi usado, comparando-se os resultados obtidos com a curva de pirólise e atomização sem modificador químico permanente ou em solução. Uma possível explicação é que como Al é um elemento formador de carbetos refratários (Welz e Sperling, 1999), Zr sendo utilizado como modificador permanente ajuda a inibir a interação de Al com a superfície de grafite, melhorando a eficiência na atomização. Este comportamento também já foi observado por Castilho et al. (2015) quando determinou Al em amostras de loções de hidratantes corporais.
Em relação ao uso de W como modificador químico permanente, é possível observar uma boa intensidade do sinal analítico. No entanto, utilizando este modificador, o analito apresentou uma estabilidade térmica baixa, com a melhor temperatura de pirólise sendo 800 °C, o que não é adequado para SS, uma vez que, neste caso, é necessário aplicar altas temperaturas de pirólise para uma efetiva eliminação da matriz, sem que haja perdas de analito. Para este modificador, o analito também apresentou altos valores de desvio padrão relativo (RSD), acima de 28%, afetando a repetitividade e a precisão entre as análises. Outro fator que resultou na não escolha de W como modificador químico permanente foi o perfil do sinal analítico para Al. Os sinais não apresentaram perfis simétricos, o que pode ter resultado na perda de precisão entre as medidas. Para o modificador químico em solução, Pd/Mg, pode-se observar o mesmo comportamento térmico do W. A maior temperatura de pirólise sem perdas significativas de sinal analítico foi de 900 °C quando a mistura de Pd/Mg foi utilizada como modificador químico em solução. Nessa temperatura de pirólise foi visualizada a presença de fumaça no caminho óptico durante a etapa de atomização, significando que a matriz não foi eficientemente removida durante a pirólise. Desta forma, há o espalhamento da radiação, de formam a produzir resultados errôneos por meio de interferências espectrais, o que afetaria a exatidão do método criado, porque o detector não consegue fazer a leitura dos comprimentos de onda, uma vez que a radiação não chega a ele.
O programa de temperaturas otimizado pode ser observado na Tabela 1, para a determinação de Al por SS em HR-CS GF AAS, adotando Zr como modificador químico permanente, com as temperaturas de 1000 °C e 2400 °C, para pirólise e atomização, respectivamente. Já foi reportado na literatura por Quadros et al. (2011); Castilho et al. (2015),
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que a utilização de Zr como modificador químico permanente para Al, também apresentou melhores resultados comparado com outros modificadores, para diferentes amostras. Além disso, a utilização Zr como modificador químico permanentes, ou seja, recoberto na plataforma de grafite, fez com que a durabilidade da plataforma aumentasse. Com isso, é imprescindível a avaliação dele para a otimização do programa de temperaturas. As condições descritas acima foram aceitas como ótimas e utilizadas nos demais estudos apresentados neste trabalho.
4.3 AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA MASSA DE AMOSTRA A massa de amostra foi otimizada com o objetivo de estudar de que maneira a quantidade de amostra dentro do tubo de grafite pode afetar a análise. Sabe-se que o uso de grandes quantidades de amostra pode resultar em menor eficiência na eliminação da matriz durante a etapa de pirólise, causando problemas na etapa de atomização do analito, pois grandes volumes de concomitantes atomizam junto com o analito e interferências na análise podem ocorrer. Para este estudo, massas em uma faixa de 0 a 1,0 mg foram pesadas diretamente da plataforma de grafite, posteriormente inserida no tubo de grafite e submetida ao programa de temperaturas. A Figura 5 mostra o gráfico de resíduos das diferentes massas pesadas.
Pode-se ver que massas até 0,875 mg estão em um intervalo de p=0,05, sendo aceitáveis para a análise, dentro de um intervalo de 95% de confiança. Massas acima de 0,875 mg não são aceitáveis, pois mostram perda de linearidade, não podendo ser usadas durantes as análises, devido à alta presença de matriz. Na Figura 5, também é possível observar que massas até 0,5 mg estão próximas da linha, o que significa que possuem grande representatividade na curva de calibração.
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Figura 5. Gráfico de resíduos de uma curva gerada com um intervalo de massas até 1,0 mg com CRM NIST 1577b.
Fonte: Autoria própria (2019).
A Figura 6 mostra a influência da massa de amostra na sensibilidade, havendo uma correlação entre a absorvância integrada e a massa de amostra pesada. A partir da figura é observado essa correlação nos pontos com massas até cerca de 0,7 mg. Apesar do gráfico de resíduos da Figura 5 mostrar que massas de amostra acima de 0,875 mg estão fora do intervalo de confiança, é necessário levar em consideração que 0,7 mg já é uma quantidade considerável de massa dentro do tubo de grafite. A utilização de altas massas de amostra geralmente faz com que a sensibilidade do método seja boa, devido a maior quantidade de analito na amostra, fazendo a amostra ser mais representativa. Entretanto, neste trabalho foi observado que altas massa podem causar perdas de sensibilidade, sendo uma consequência da baixa estabilidade térmica, pois a temperatura de pirólise não é alta o suficiente para remover toda a matriz da amostra, o que pode ocasionar interferências devido à alta concentração de concomitantes no caminho óptico durante a etapa de atomização.
Para a análise das amostras foi considerada apenas a utilização de massas menores que 0,5 mg. Essa escolha foi feita com o objetivo de
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evitar que ocorressem problemas de repetitividade e baixa sensibilidade no método durante a determinação de Al nas amostras de fígado bovino. Figura 6. Avaliação do efeito da massa de amostra utilizando um intervalo de 0 a 1,0 mg de CRM NIST 1577b.
Fonte: Autoria própria (2019).
4.4 CALIBRAÇÃO E PARÂMETROS DE MÉRITO
Os parâmetros de mérito do método foram determinados, sendo eles: limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), coeficiente de determinação (R2) e massa característica (m
o). A Tabela 3 resume os resultados obtidos.
A curva de calibração foi realizada com padrões aquosos de Al e apresentou linearidade em uma faixa de trabalho 0,25 a 2,0 ng de Al. O LOD foi calculado como sendo a multiplicação de três vezes o desvio padrão de dez medidas consecutivas do branco (3σ), dividido pelo coeficiente angular da curva de calibração (S); o LOQ foi calculado como sendo a multiplicação de dez vezes o valor de dez medidas do desvio padrão do branco (10σ), divido por S. Conforme calculado, os valores obtidos foram 0,03 µg g-1 e 0,11 µg g-1, para o LOD e LOQ,
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respectivamente. A mo, definida como a massa de analito que fornece uma absorvância integrada de 0,0044 s (correspondente a transmitância de 99%), foi calculada e o resultado obtido foi de 0,04 ng.
Tabela 3. Parâmetros de mérito obtidos para a determinação de Al em fígado bovino por HR-CS GF AAS utilizando calibração com padrões aquosos.
Parâmetros de mérito Valores encontrados Faixa linear (ng) 0,25 – 2,0
Equação da reta y=0,101x + 0,0209
R2 0,9995
LOD (µg g-1)a 0,03
LOQ (µg g-1)a 0,11
mo (ng) 0,04
a Calculado para 0,9 mg de amostra. Fonte: Autoria própria (2019).
4.5 VERIFICAÇÃO DA EXATIDÃO
Para verificação da exatidão a concentração de alumínio foi determinada em três CRM e os resultados obtidos foram comparados com valores certificados ou de referência, sendo os CRM: NIST 1577b, NIST 8414 e NCS ZC 71001. Os resultados obtidos na determinação de Al por HR-CS GF AAS por meio da SS são apresentados na Tabela 4. Eles foram calculados com a média de 4 medidas ± desvio padrão (SD).
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Tabela 4. Verificação da exatidão do método proposto para a determinação de Al em CRM NIST 1577b, NIST 8414 e NCS ZC 71001 por HR-CS GF AAS via SS.
CRM Valor certificado (µg g-1) Valor determinado (µg g-1) NIST 1577b1 3,0 2,52 ± 0,52 NIST 8414 1,70 ± 1,40 1,82 ± 0,51 NCS ZC710011 12,0 11,32 ± 0,95 1 Valores informados. Fonte: Autoria própria (2019).
De acordo com o teste-t realizado, dentro de um intervalo de confiança de 95%, os valores determinados não se mostraram significativamente diferentes dos valores certificados dos CRM, o que demonstra a exatidão do método proposto. É possível observar que os valores determinados apresentaram valores de RSD entre 8% e 28%. Esses valores são aceitáveis, pois a determinação foi realizada através da técnica de SS, pelo fato de valores altos de RSD já são esperados devido a possível falta de homogeneidade da amostra. Essa é uma informação importante que pode ser fornecida pela observação de altos valores de RSD. Se as amostras houvessem passado por algum preparo de amostra e estivessem em meio aquoso, provavelmente os valores de RSD seriam menores, pois o elemento estaria distribuído homogeneamente. Porém, os resultados expressos poderiam ser afetados por erros sistemáticos provenientes da perda ou contaminação decorrente do procedimento de pré-tratamento.
4.6 DETERMINAÇÃO DE ALUMÍNIO EM AMOSTRAS FÍGADO BOVINO POR HR-CS GF AAS
O método desenvolvido foi aplicado em seis amostras de fígado bovino. Os resultados foram obtidos por análise direta de sólidos e comparados com um método de preparo de amostra por solubilização alcalina utilizando TMAH. Esse procedimento já foi publicado por Noremberg et al. (2015), que também analisaram alumínio em fígado bovino. No método de preparo de amostra publicado, após a digestão, diluiu-se as amostras para um volume final de 10 mL. Porém, no presente trabalho, após o processo de digestão, as amostras foram diluídas para um
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volume final de 5 mL, o que concentrou mais o analito em solução, e reduz pela metade o volume de resíduos gerados pela digestão aberta alcalina.
Os valores determinados para ambos os métodos aplicados foram calculados pela média de três medidas. Todos os resultados passaram por um teste estatístico, teste-t com dois graus de liberdade indicando um t-crítico de 4,30, para um intervalo de confiança de 95%. Os resultados para ambos os métodos são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Determinação de alumínio em amostras de fígado bovino por análise direta de sólidos e digestão aberta alcalina por HR-CS GF AAS, no comprimento de onda de 394,3995 nm.
Amostra SS (µg g-1)
Solubilização alcalina com TMAH
(µg g-1) NIST 1577c / 39 1,6 ± 1,2 0,94 ± 0,18 NIST 1577c / 56 1,3 ± 1,1 0,69 ± 0,18 NIST 1577c / 89 1,07 ± 0,7 1,34 ± 0,27 NIST 1577c / 132 1,3 ± 0,9 0,97 ± 0,09 NIST 1577c / 161 1,5 ± 0,8 1,14 ± 0,03 NIST 1577c / 165 1,1 ± 0,8 1,17 ± 0,006 NIST 1577b1 2,52 ± 0,52 2,36 ± 0,20 1 Valor de referência: 3,0 µg g-1. Fonte: Autoria própria (2019).
Embora as amostras não certificadas de fígado bovino tenham a mesma origem e passem pelo mesmo tratamento até serem analisadas, elas apresentam diferentes concentrações de Al. Além disso, as amostras não são provenientes do mesmo lote, ou seja, a coleta e procedimento de liofilização pode ter ocorrido em dias diferentes, o que pode ser uma possível explicação para os diferentes resultados obtidos entre as amostras, sendo elas determinadas por SS ou pela digestão alcalina aberta. Os resultados para a solubilização alcalina com TMAH apresentaram valores de SD menores do que SS, o que já era esperado, pois a amostra quando digerida torna o analito homogêneo em solução.
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Como as amostras NIST 1577c foram fornecidas com o objetivo de serem certificadas para alumínio, quando se utiliza SS os resultados não são satisfatórios para que sejam publicados e usados em um ensaio de certificação, pois valores de concentração muito diferentes foram obtidos para o analito entre as determinações, além altos valores de SD também apresentados.
Como Al não é um elemento presente no organismo, podendo estar distribuído de forma não homogênea, tanto em seres humanos como em animais, desta forma é esperado uma alta heterogeneidade do analito nas amostras e por isto, altos valores de desvio padrão entre as medições. Por esta razão, um pré-tratamento, com o objetivo de homogeneizá-las é necessário.
4.7 TESTE DE HOMOGENEIDADE DAS AMOSTRAS DE FÍGADO BOVINO
A homogeneidade das amostras pode ser calculada como o fator de homogeneidade relativa (HE) publicado por Kurfürst et al. (1993), sendo calculado, como já citado anteriormente na Seção 3.5, pela Equação 1. A equação é utilizada principalmente para calcular a micro homogeneidade. Portanto, o fator de homogeneidade relativo é melhor usado e adequado, particularmente, para descrever a homogeneidade em amostras com massas pequenas. O HE está relacionado particularmente ao quão homogêneo o elemento está em cada amostra. A Tabela 6 mostra os valores de HE para o CRM NIST 1577c e para as seis amostras de fígado bovino, de forma que dez medidas de cada amostra foram realizadas para se obter os resultados.
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Tabela 6. Fator de homogeneidade relativa, HE, para alumínio em CRM e amostras de fígado bovino.
Amostra Número de medidas HE (Al) NIST 1577b 10 7,15 NIST 1577c / 39 10 27,64 NIST 1577c / 56 10 26,13 NIST 1577c / 89 10 20,28 NIST 1577c / 132 10 21,98 NIST 1577c / 161 10 15,45 NIST 1577c / 165 10 21,66
Fonte: Autoria própria (2019).
O fator de Kurfürst et al. (1993) considera uma homogeneidade muito boa quando valores de HE < 10 (Sonntag e Rossbach, 1997). As amostras de fígado bovino apresentaram valores acima do indicado, o que explica os altos valores de RSD obtidos para a determinação de Al. Entretanto, devido à alta heterogeneidade das amostras, o método proposto ainda é considerado adequado para analisar esse tipo de amostra quando se utiliza pequena quantidade de massa, o que já foi observado a partir das Figuras 5 e 6 se estabeleceu a utilização de massas menores que 0,7 mg para que não haja perda de linearidade e sensibilidade do método. Vale ressaltar que as amostras foram peneiradas em uma peneira com granulometria de 325 mesh a fim de se obter uma amostra mais homogênea. Caso este procedimento não fosse realizado, os valores obtidos para HE poderiam ser ainda maiores, necessitando de um método de pré-tratamento mais elaborado antes da análise. No entanto, por mais que a amostra possua características não homogêneas, os parâmetros de mérito e a exatidão demonstram que a quantificação de Al não foi prejudicada.
Para o CRM NIST 1577b, o valor de HE está em dentro da faixa aceitável, porém como é uma amostra certificada, é esperado que o fator
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de homogeneidade relativa estivesse na margem proposta por Kurfürst et al. (1993).
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5 CONCLUSÃO
Um método simples e rápido foi desenvolvido para a determinação de alumínio em amostras de fígado bovino por espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua em forno de grafite por análise direta de sólidos. Foram utilizadas massas de aproximadamente 0,1 mg de amostra. O programa de temperaturas foi otimizado, obtendo as condições ótimas para a determinação de Al nas amostras de fígado bovino, com as temperaturas de 1000 °C e 2400 °C para pirólise e atomização, respectivamente, utilizando Zr como modificador químico permanente. Com isso, a calibração com padrão aquoso de alumínio foi realizada, onde os parâmetros de mérito demonstraram boa aplicabilidade do método.
A determinação de alumínio foi executada em amostras certificadas e outras amostras de Al à certificar. Altos valores de RSD foram obtidos nas amostras a certificar, mostrando que estas amostras de fígado bovino são heterogêneas, e que para a certificação de Al nas amostras NIST 1577c, o método utilizando SS não pode ser aplicado. Um teste de homogeneidade foi executado, salientando a micro-heterogeneidade das amostras, sendo uma limitação da técnica. No entanto, essa heterogeneidade das amostras, embora tenha afetado a precisão, não afetou a exatidão do método, que foi verificada a partir da análise de materiais de referência certificados e por comparação de métodos. Contudo, para as amostras certificadas e com baixa heterogeneidade, o método apresentou precisão adequada para a técnica.
