UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Julia Leme Pablos
Diversidade genética e estrutura populacional do complexo de
espécies de Morpho epistrophus (Lepidoptera: Nymphalidae)
na Mata Atlântica
Campinas
2019
Julia Leme Pablos
Diversidade genética e estrutura populacional do complexo de espécies de
Morpho epistrophus (Lepidoptera: Nymphalidae) na Mata Atlântica
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Animal, na área de Biodiversidade Animal.
Orientador: PROF. DR. ANDRÉ VICTOR LUCCI FREITAS
Co-Orientadora: PROFA. DRA. KARINA LUCAS DA SILVA-BRANDÃO
CAMPINAS
2019
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA
PELA ALUNA JULIA LEME PABLOS E
ORIENTADA PELO PROF. DR. ANDRÉ VICTOR LUCCI FREITAS.
Pablos, Julia Leme,
P112d PabDiversidade genética e estrutura populacional do complexo de espécies de
Morpho epistrophus (Lepidoptera: Nymphalidae) na Mata Atlântica / Julia Leme
Pablos. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
PabOrientador: André Victor Lucci Freitas.
PabCoorientador: Karina Lucas da Silva-Brandão.
PabDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Pab1. Genética de populações. 2. Biogeografia. 3. Borboleta. I. Freitas, André Victor Lucci, 1971-. II. Silva-Brandão, Karina Lucas. III. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Genetic diversity and population structure of the species complex
of Morpho epistrophus (Lepidoptera: Nymphalidae) in the Atlantic Forest
Palavras-chave em inglês:
Population genetics Biogeography Butterflies
Área de concentração: Biodiversidade Animal Titulação: Mestra em Biologia Animal
Banca examinadora:
André Victor Lucci Freitas [Orientador] Fábio Sarubbi Raposo do Amaral Clarisse Palma da Silva
Data de defesa: 28-08-2019
Programa de Pós-Graduação: Biologia Animal
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-5352-9608 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/6141472044633564
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. André Victor Lucci Freitas
Profa. Dra. Clarisse Palma da Silva
Prof. Dr. Fábio Sarubbi Raposo do Amaral
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
À minha avó, Darci
eu disse que queria fazer biologia!). Agradeço o suporte, desde o primeiro dia de aula na nova escola, na prova muito louca de Física, nas maratonas de vestibular, nos quatro anos de graduação para enfim chegar até os últimos dois anos de mestrado. Agradeço aos meus avós, Darci e Edésio, os meus grandes torcedores, e também à minha irmã Marcella, por me apoiar e ser a primeira amiga que tive.
Agradeço aos meus orientadores, André e Karina, por terem me supervisionado, apoiado, ensinado e até acalmado ao longo de todo este processo. Foi um prazer tê-los tido como professores e não poderia ter desejado melhores orientadores, projeto ou laboratório! Agradeço à Ana Kristina, que dividiu comigo parte de seu trabalho e esforço.
Agradeço encarecidamente à Tamara, minha mestra em montagem de borboletas e curadoria; à Leila e Luisa, que me levaram para o campo e ensinaram a coletar; à Luiza, que me conduziu, desde a graduação, na bancada e experimentos e, finalmente, à Noemy, minha mestra em análises populacionais, R, inputs, entre outros. Obrigada a todas por dividirem comigo seus conhecimentos.
A todos os colegas do Labbor: agradeço por me introduzirem no caminho das borboletas e por dividirem comigo seus trabalhos, ideias e amizade. André Tacioli, Augusto Rosa, Eduardo Barbosa, Giselle Martins, Jessie Pereira, Junia Carreira, Leila Shirai, Luísa Mota, Luiza Magaldi, Mario Alejandro Uribe, Noemy Seraphim, Patrícia Gueratto, Patrícia Machado, Simeão Moraes, Tamara Moreira e Thamara Zacca, já é hora do café?
Gostaria de agradecer a todos que participaram deste projeto através da coleta das Morpho brancas: Ana Kristina da Silva, André Victor Lucci Freitas, Augusto Rosa, Cristiano A. Iserhard, Eduardo Barbosa, Eduardo Carneiro, Jessie Pereira dos Santos, Jorge Bizarro, Marcio Romero M. Carvalho, Marlon Paluchi, Noemy Seraphim, Onildo Marini-Filho, Renato Rogner Santos, Roberto Greve, Ronaldo Francini e Rudi Mattoni.
Agradeço à Profa. Anete Pereira de Souza por ceder a mim e meus colegas borboleteiros o espaço no Laboratório de Análise Genética e Molecular! Enquanto aprendia a lidar com a bancada, pipetas, termocicladores e a interpretar manchas estranhas em géis de agarose, tive grande ajuda dos colegas que conheci no laboratório da professora Anete. Então, agradeço aos técnicos: Aline, Carlos, Danilo, Juverlande e Patrícia; e aos alunos Camila, Carla, Fábio, Luís Paulo, Marianne, Paulo, Patrícia e Thamires, por toda a colaboração nessa trajetória.
continuarem, desde sempre, comigo; à Livia, minha amiga de longa distância; à Paty, minha companheira de “sufocos” no Barracão (e muitas vezes no Labbor também); à Lu, que nunca falha em me surpreender com paçocas, chocolates e castanhas; ao Pi, meu companheiro de rolês tranquilos, filmes e voltinhas na Praça da Paz; à Sarah Christine, por ter estado ao meu lado em toda essa jornada (e inclusive em outras!). Agradeço também às minhas amigas de lar, Batata, Carol, Carolzinha e Dani, por me acompanharam nas últimas etapas deste processo.
Agradeço às integrantes da minha banca de Qualificação, Profa. Maria Imaculada Zucchi, Profa. Mariana Nery e à Dra. Prianda Laborda; e também aos membros da Pré-Banca e Banca.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. Agradeço, ainda, à UNICAMP e Instituto de Biologia.
Atlântica, bem como investigar a interação dos eventos geológicos, fatores climáticos passados e atuais com aspectos da ecologia e história natural dos organismos. As borboletas do complexo de espécies de Morpho epistrophus (que inclui Morpho epistrophus e sua espécie irmã, M. iphitus), são endêmicas da Mata Atlântica, distribuindo-se ao longo de toda a sua extensão. Uma das principais características distintivas das espécies é a sua distribuição geográfica, sendo que M. iphitus relaciona-se às florestas montanas do interior e M. epistrophus é principalmente relacionada às matas de baixada e da Serra do Mar. Considerando-se sua ampla distribuição e a heterogeneidade de condições ambientais a que estão submetidas, uma análise da estruturação e distribuição da diversidade genética de suas populações suscita questões sobre os processos vigentes no domínio. No presente trabalho foram desenvolvidos 11 locos polimórficos de marcadores microssatélites e genotipadas 22 populações do complexo de espécies de M. epistrophus. Foram estimada as estatísticas básicas de genética de populações, análises de atribuição de cluster, fluxo gênico e genética da paisagem. FST e outras estatísticas descritivas apontaram para alta diversidade genética (He = 0,606), estruturação moderada a alta (FST = 0,170), perda de heterozigotos e endogamia (FIS = 0,287. O fluxo gênico ocorre entre todas as populações, sendo que as maiores estimativas de migração são para as populações de Piraquara, Paranapiacaba e São Francisco de Paula. As taxas de permanência nas populações variam de 67,65% a 82,56%. Testes de atribuição indicaram a existência de três clusters genéticos, um que se estende do Uruguai até Foz do Iguaçu, e outros dois ao norte do Paraná até João Pessoa. Os padrões de estruturação das populações em três grupos genéticos, com turnover no estado do Paraná, coincide com os padrões de variação ambiental já descritos para a Mata Atlântica. As variações termopluviométricas explicam melhor a diversidade genética das Morpho brancas do que a delimitação taxonômica tradicional.
as well as to investigate the interaction of geological events, past and current climatic factors with aspects of the ecology and natural history of organisms. The butterflies of the Morpho epistrophus species complex (which includes M. epistrophus and M. iphitus) are endemic to the Atlantic Forest and distributed throughout its range. One of the main distinguishing characteristics of the species is the geographic distribution, M. iphitus being related to the montane forests of the interior and M. epistrophus is originally related to the lowland forests and the Serra do Mar. Considering their wide distribution and the heterogeneity of environmental conditions to which they are subjected, an analysis of the structure and distribution of the genetic diversity of their populations raises questions about the current processes of the domain. In the present work, 11 polymorphic loci of microsatellite markers were developed and 22 populations of the M. epistrophus species complex were genotyped. The basic statistics of population genetics, cluster attribution analyzes, gene flow and landscape genetics were estimated. FST and other descriptive statistics indicated high genetic diversity (He = 0.606), moderate to high structuring (FST = 0.170), loss of heterozygotes and inbreeding (FIS = 0.287). Gene flow occurs among all populations, with the highest migration estimates for the populations of Piraquara, Paranapiacaba and São Francisco de Paula. The permanence rates of the populations range from 67.65% to 82.56%. Attribution tests indicated the existence of three genetic clusters, one extending from Uruguay to Foz do Iguaçu, and two from Paraná to João Pessoa. The patterns of population structure of the Morpho epistrophus species complex in three genetic groups, with turnover in the state of Paraná, coincides with the environmental variation patterns already described for the Atlantic Forest. The thermopluviometric variations better explain the genetic diversity of white Morpho than traditional taxonomic delimitation.
Objetivos...17
Material e Métodos...18
Amostragem...18
Extração de DNA...21
Obtenção dos marcadores microssatélites...22
Amplificação e genotipagem...22
Checagem de erros...24
Análises de diversidade...26
Análises de estruturação e migração...26
Análise de variáveis ambientais...29
Resultados...29
Amplificação, genotipagem e checagem de erros...29
Análises de diversidade...32
Análises de estruturação e migração...36
Análises de variáveis ambientais...51
Discussão...64 Conclusão...72 Bibliografia...73 Material Suplementar...84 Anexo 1...91 Anexo 2...92
Introdução
A Mata Atlântica é um domínio fitogeográfico formado por um mosaico de biomas (Coutinho, 2006), que se distribui por uma extensão de 3300 km e uma área de 1,1 milhão de km² ao longo de toda a costa brasileira (Morellato & Haddad, 2000; Oliveira-Filho & Fontes, 2000). A Mata Atlântica está presente em 17 estados brasileiros, além do Paraguai e da Argentina, possuindo limites complexos com os Pampas, a Caatinga, o Pantanal e o Cerrado (Morellato & Haddad, 2000; Ribeiro et al., 2009).
Desde a sua formação, com a quebra continental de Gondwana, a Mata Atlântica esteve sob efeito de diferentes tipos de processos e condições ambientais. Dentre esses, destacam-se a orogenia, que originou sua complexa composição topográfica, eventos climáticos (como as oscilações climáticas do Pleistoceno), efeitos de outras formações florestais (tais como da Floresta Amazônica, ao norte, e formações andinas, ao sul), diferença de solos e a grande amplitude latitudinal que ocupa (Imbrie et al., 1992; Almeida & Carneiro, 1998; Petit et al., 1999; Sobral-Souza et al., 2015). O conjunto destas condições levaram a Mata Atlântica a ser uma das formações com maiores taxas de riqueza de espécies e endemismo do planeta, bem como apresentar grande heterogeneidade de ambientes e formações (Brown & Brown, 1992; Morellato & Haddad, 2000; Mittermeier et al., 2000). O domínio é caracterizado por apresentar diversas formações vegetais como as florestas ombrófilas úmidas na região litorânea e nas encostas das serras, as matas semidecíduas em áreas mais distantes do litoral, as matas de galeria cortando os Cerrados (Oliveira-Filho et al., 2006), além das as florestas de pinheiros (Morrone, 2006) e os campos de altitude, em altitudes maiores, e das dunas, mangues e matas de restinga no litoral (Scarano, 2002).
A grande biodiversidade concentrada no domínio da Mata Atlântica tem suscitado diferentes perguntas quanto à sua origem e processo de diversificação e, infelizmente, quanto aos efeitos da perda de habitat, já que atualmente este domínio encontra-se extremamente ameaçado. Estudos de genética de populações permitem entender como a diversidade genética das espécies está distribuída ao longo do espaço, bem como elucidar processos históricos, padrões biogeográficos, os efeitos do fluxo gênico, deriva genética, endogamia e das pressões seletivas nas populações (Wayne & Morin, 2004; Allendorf, 2007). Em ambientes ameaçados, tais como a Mata Atlântica, estes estudos são fundamentais para a realização de planos de conservação mais eficientes, com a escolha de regiões prioritárias que concentrem altas taxas de diversidade genética e estabilidade histórica, e a criação de corredores biológicos entre fragmentos de floresta com baixa conectividade (Carnaval & Moritz, 2008).
Os estudos genéticos de populações tiveram uma longa trajetória desde os primeiros estudos até a criação das sofisticadas técnicas moleculares utilizadas atualmente. Até 1966 a genética de populações havia acumulado extenso conteúdo teórico graças aos trabalhos de pesquisadores como Fisher, Haldane e Wright (Charlesworth & Charleswoth, 2017). Com o passar das décadas, diferentes metodologias foram desenvolvidas e permitiram que o vasto conhecimento teórico de genética de populações, construído nos anos anteriores, fosse testado empiricamente (Allendorf, 2017). Há mais de 50 anos foram publicados os primeiros trabalhos com alozimas, que permitiram quantificar a diversidade genética pela identificação de diferenças estruturais em proteínas (por Harris, 1966; Lewontin & Hubby, 1966); a investigação dos marcadores RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms), na década de 70, e do DNA mitocondrial, na década de 80, permitiram novos avanços nos estudos genéticos de populações naturais (Allendorf, 2017). O surgimento do sequenciamento Sanger, nos anos 80, suscitou a descoberta de regiões altamente variáveis no genoma, as regiões microssatélites. Os microssatélites são repetições em cadeia de sequências simples que variam de 2 a 6 pares de bases e são marcadores codominantes, multialélicos e altamente polimórficos (Li et al., 2002). Refletem elevada variabilidade de alelos por loco e, mesmo em estudos com baixas amostragens populacionais, os microssatélites podem ser informativos, considerando-se que o número de bases por alelo pode variar muito entre eles (Habel et al., 2010).
No final dos anos 80, percebeu-se pela primeira vez que o polimorfismo das regiões microssatélites poderia ser facilmente acessado através da recém descoberta técnica de PCR (Sunnucks, 2000; Wright & Bentzen, 1995). Apesar de artefatos de PCR poderem causar erros na genotipagem dos locos e de ainda não se entender totalmente o modelo de evolução destes marcadores, microssatélites são numerosos, bem distribuídos no genoma, geralmente são seletivamente neutros e seu isolamento tem custo relativamente baixo.
As altas taxas de mutação em relação a outras regiões do genoma tornam os microssatélites ideais para estudos de diversidade genética no nível de populações (Hodel et al., 2016). Estes marcadores podem ser utilizados para a investigação da estrutura genética de populações naturais, dispersão e, por refletirem processos demográficos recentes, são utilizados em estudos de conservação, identificação de rotas de dispersão, identificação de áreas prioritárias e reconstrução da história de uma região (Allendorf, 2017). Na Mata Atlântica, há principalmente estudos com plantas (Paggi et al., 2008; Pinheiro et al., 2008; Nazareno et al., 2008; Cazé et al., 2012; Francisco, et al., 2018), seguidos dos vertebrados (Gravitol et al., 2001; Galbusera & Gillemot, 2008; Banhos et al., 2008) e então estudos realizados com insetos (de Moura et al. 2012; Duarte et al., 2014; Seraphim et al., 2016). Dentre os estudos realizados com
insetos, destacam-se descrições de bibliotecas de microssatélites (Duarte et al., 2012) e estudos de conservação, como com abelhas sem ferrão do gênero Scaptotrigona (de Moura et al., 2012), com borboletas do gênero Heliconius (Duarte et al., 2014) e com as borboletas ameaçadas da espécie Parides ascanius (Seraphim et al., 2016).
Borboletas estão entre os grupos mais bem estudados de insetos, incluindo publicações em praticamente todas as áreas da biologia e de ciências afins (Silva-Brandão & Freitas, 2011). Estão distribuídas em todos os continentes, com exceção da Antártida, e sua popularidade, bem como aspectos comportamentais e de história natural, como a conspicuidade, hábito diurno, ciclo de vida fitófago e diversidade fenotípica conspícua do clado, levaram as borboletas a serem utilizadas como modelos em diversos estudos ecológicos e evolutivos (Boggs & Ehrlich, 2003).
Com um total de 3452 espécies, o Brasil está entre os países mais ricos em borboletas no mundo, perdendo apenas para o Peru (Mielke et al., 2019; Lourido & Duarte, 2019; Duarte & Robbins, 2019; Casagrande et al., 2019; Carneiro, 2019; Leviski & Casagrande, 2019; Dolibaina et al., 2019). A Mata Atlântica apresenta a maior concentração de inventários de borboletas (sobretudo em regiões próximas a grupos de pesquisa, no Rio Grande do Sul, Paraná e São Paulo), e concentra a maior parte de espécies ameaçadas: 51 das 58 espécies listadas, incluindo três que não são registradas a mais de 60 anos (Freitas et al., 2018). Essa predominância pode, no entanto, ser consequência do maior conhecimento que se tem nessas áreas, ou da acelerada perda de habitats que a Mata Atlântica vem sofrendo continuamente (Shirai et al., 2019, in press). Assim, a distribuição do grupo em florestas tropicais, conhecimento taxonômico e filogenético disponíveis, bem como a sua suscetibilidade a alterações ambientais (e.g., mudanças térmicas e de circulação de ventos), faz com que sejam interessantes sistemas de estudo para a compreensão de padrões e processos que ocorreram na história evolutiva da Mata Atlântica.
O gênero Morpho Fabricius, 1807 (Lepidoptera, Nymphalidae)
Em 1807 Fabricius descreveu um dos grupos de borboletas mais carismáticos da região Neotropical, o gênero Morpho (Penz & DeVries, 2002). Conhecido devido à variedade de formas, tamanho grande dos indivíduos e tons de azul metálico que muitas de suas espécies podem apresentar (Penz & DeVries, 2002) (Figura 1), o grupo está difundido em inúmeras coleções particulares e já apresentou uma grande abundância de nomes, tendo acumulado mais de 780 táxons atribuíveis a subgêneros, espécies e variedades (Penz & DeVries, 2002).
Figura 1. Visão dorsal da variação morfológica das espécies (A) Morpho helenor, (B) Morpho
epistrophus, (C) Morpho hercules e (D) Morpho aega.
Atualmente considera-se que existem 29 espécies válidas para o gênero Morpho (Blandin, 2007b), distribuídas desde a Argentina até o México (Blandin, 2007a). A diversidade do grupo diminui à medida que se aproxima dos limites latitudinais do gênero, sendo que sua distribuição está principalmente relacionada à das florestas tropicais úmidas (Blandin & Purser, 2013). Algumas espécies, no entanto, podem ocorrer em locais mais secos, como na região oeste do Equador e Peru, e na região central da Bolívia (Blandin, 2007a; Nakahara & Blandin, 2010; Gareca & Blandin, 2011). As espécies de Morpho apresentam ampla tolerância altitudinal, distribuindo-se desde o nível do mar até mais de 3000 metros de altitude (Blandin & Purser, 2013).
O grupo teria surgido há aproximadamente 32 milhões de anos, nas encostas dos Andes (Blandin, 2007b; Wahlberg et al., 2009; Penz & DeVries, 2012). O período foi caracterizado por grandes eventos de diversificação de espécies e linhagens devido ao dinamismo geomorfológico pelo qual a América do Sul passava durante o Terciário (Penz & DeVries, 2012). Há 20 milhões de anos, linhagens de Morpho passaram a se alimentar de plantas eudicotiledôneas durante os estágios larvais, divergindo de outros gêneros próximos, que se alimentam exclusivamente de monocotiledôneas (Penz & DeVries, 2012). A mudança de grupo de planta hospedeira, juntamente com o surgimento do voo planado para atingir estratos superiores da floresta, ocorridos há 13 milhões de anos (Penz & DeVries, 2012), são
sugeridos como principais promotores dos eventos de diversificação e radiação adaptativa do grupo, que passou a ocupar novos ambientes e nichos.
A colonização da Mata Atlântica por linhagens de Morpho provavelmente ocorreu de modo independente seis vezes, possibilitada por rotas de dispersão da Amazônia pelo Norte, ou pelos Andes até o Sul do Brasil (Penz & DeVries, 2012). Algumas regiões da Mata Atlântica podem apresentar até sete espécies em simpatria, como na região serrana do estado do Rio de Janeiro e Espírito Santo, onde Morpho hercules, M. anaxibia, M. portis, M. aega, M. menelaus, M. helenor e M. epistrophus co-ocorrem (Blandin & Purser, 2013; Brown & Freitas, 2000; AVLF, com. pess.).
As populações de Morpho brancas da Mata Atlântica são reconhecidas como duas espécies Morpho epistrophus (Fabricius, 1796) e M. iphitus C. Felder & R. Felder, 1867, e ocorrem ao longo da costa atlântica desde a Argentina até o Rio Grande do Norte (Blandin, 2007a) (Figura 2). O táxon Morpho epistrophus está subdividido em quatro subespécies, M. epistrophus epistrophus (Fabricius, 1796), M. epistrophus catenária (Perry, 1811), M. epistrophus argentinus Fruhstorfer, 1907 e M. epistrophus nikolajewna Weber 1951, enquanto Morpho iphitus está subdividido em duas subespécies, M. iphitus iphitus C. Felder & R. Felder, 1867 e M. iphitus titei Le Moult & Réal, 1962 (Blandin, 2007a). Ambas espécies apresentam as asas com coloração de fundo branca iridescente tingida de tons azuis-esverdeados, marmorizada por manchas marrom escuras (muito variáveis em tonalidade e extensão de cobertura) e com uma série de ocelos submarginais escuros (que variam em forma e tamanho). Apesar do baixo dimorfismo sexual que apresentam, as fêmeas são em média maiores e suas asas apresentam um tom mais verde-amarelado (Blandin, 2007a).
Figura 2. Locais de registro das subespécies de Morpho epistrophus (M. e. nikolajewna, M. e.
epistrophus, M. e. catenária e M. e. argentinus) e Morpho iphitus (M. i. iphitus e M. i. titei) segundo Blandin (2007a).
Com base nos dados disponíveis, todas as populações conhecidas tanto M. epistrophus quanto M. iphitus apresentam apenas uma geração ao ano (univoltinas), mas o período de voo varia entre as populações, sendo de março a maio nas localidades ao norte (como na Paraíba), do final de dezembro a início de março mais ao sul, e de fevereiro a início de maio nas localidades centrais da Mata Atlântica, com pico de abundância em janeiro e fevereiro (Blandin, 2007a). Apesar das duas espécies ocorrem desde o nível do mar até maiores altitudes, a maior abundância ocorre acima de 600 metros com preferência na floresta ombrófila úmida, mais preservada e de clima ameno. Uma das principais características apontadas como importantes na distinção de M. epistrophus de sua espécie irmã, M. iphitus, é a distribuição geográfica de ambas as espécies, com Morpho iphitus mais relacionada às florestas montanas do interior, ocorrendo nos estados de Minas Gerais, Espírito Santo e São Paulo (em áreas mais distantes do litoral), e em Matas de Galeria em Goiás (Blandin, 2007a). Por outro lado, M. epistrophus ocorre desde a Argentina até o Rio Grande do Norte (Blandin, 2007a),
principalmente nas matas de baixada e na Serra do Mar ao longo do litoral. Na região Sudeste, onde M. iphitus se distribui principalmente pelo interior, M. epistrophus ocupa as regiões litorâneas (Blandin, 2007a).
A presente separação taxonômica de M. epistrophus e M. iphitus é baseada principalmente nas diferenças de distribuição que as populações dos táxons apresentam, além de variações muitas vezes sutis no formato dos ocelos das asas posteriores (sendo supostamente mais arredondados em M. epistrophus e comprimidos lateralmente em M. iphitus). No entanto, as similaridades morfológicas dos táxons sugerem duas hipóteses: 1) as Morpho brancas da Mata Atlântica seriam apenas uma única espécie ou 2) as espécies de Morpho brancas da Mata Atlântica formam um complexo de espécies crípticas – ou seja, pode tratar-se de espécies de difícil distinção quando descritas apenas com base em caracteres morfológicos (Paterson, 1991).
Assim, as Morpho brancas da Mata Atlântica podem representar bons modelos para o entendimento dos processos ambientais que ocorreram recentemente no domínio da Mata Atlântica, já que são endêmicas dele e ocorrem em toda a sua extensão. Ademais, considerando-se a ampla distribuição das Morpho brancas e a evidente heterogeneidade de condições ambientais a qual estão submetidas, o entendimento das relações inter e intrapopulacionais das espécies de Morpho brancas na Mata Atlântica através do uso de marcadores moleculares microssatélites permitiria novas interpretações sobre a diversificação genética dessas espécies ao longo da sua distribuição, em especial sobre a estruturação genética ao longo de sua distribuição geográfica.
Objetivos
O principal objetivo do presente trabalho foi compreender as relações intra e interpopulacionais do complexo de espécies de Morpho epistrophus, através do uso de marcadores microssatélites, ao longo de toda a distribuição das espécies na Mata Atlântica. Para isso, foram desenvolvidos os seguintes objetivos específicos:
1. Investigar a distribuição da diversidade genética entre e dentro (d)as populações de Morpho brancas na Mata Atlântica;
2. Estudar os padrões de composição da diversidade genética das populações de Morpho epistrophus e Morpho iphitus amostradas.
3. Com base nas evidências encontradas, reavaliar o status taxonômico dos táxons Morpho epistrophus e Morpho iphitus;
Material e Métodos
Amostragem
Foram amostradas 22 populações de Morpho epistrophus e Morpho iphitus em 22 localidades ao longo da Mata Atlântica (Tabelas 1 e 2). Destas 22 localidades, sete foram atribuídas a M. iphitus: Pirenópolis (PI*), Ouro Preto (OP*), Tiradentes (TI*), Itatiaia (IT*), Campos do Jordão (CJ*), Atibaia (AT*) e em Santa Tereza d’Oeste (SO*), seus códigos são acompanhados de asterisco (*). Os pontos de coleta de M. iphitus têm em média 900m de altitude, variando de 700m (SO*) a 1700m (CJ*). O estado de conservação das áreas variou entre as sete localidades, desde protegidas por Parques Estaduais (PI*) e Nacionais (IT* e SO*) até desprotegidas em mosaicos de matas e matas secundárias (que foram cultivadas após eventos de desflorestamento), como ocorre com OP*, TI*, CJ* e AT*. Os tipos de vegetação em que os indivíduos de M. iphitus foram coletados foram principalmente Floresta semidecídua (OP*, TI*, AT* e SO*), mas foram encontrados também em Mata ciliar de Cerrado (PI*), Floresta ombrófila de altitude (CJ*) e em Floresta ombrófila (IT*).
As 15 populações atribuídas à M. epistrophus apresentaram uma grande amplitude de altitudes, desde 50m, no Parque Nacional do Superagui (SU), até 1000m em Santa Virgínia (SV) e em Ribeirão Grande (RG), com uma média em 450m de altitude entre os pontos de coletas. As localidades apresentam diferentes estados de conservação, incluindo: 1) ambientes de mata contínua e bem conservados fora de Unidades de Conservação, como no Vale do Rio Quilombo (RQ) ou em Campina Grande do Sul (CG); 2) pequenos fragmentos com alto grau de perturbação, como no Parque Urbano em João Pessoa (JP); e 3) em Unidades de Conservação, a maioria bem preservadas, como na Estação Ecológica Estadual Wenceslau Guimarães (WG), Parque Estadual da Serra do Mar (SV), Parque Estadual de Intervales (RG), no Parque Nacional do Superagui (SU), Reserva Ecológica de Guapiaçu (GU), Área de Proteção Ambiental da Serra do Mar em Piraquara (PQ) na Floresta Nacional de São Francisco de Paula (SF). Entre os tipos de vegetação das localidades estão a Floresta de Tabuleiro (JP), Floresta Semidecidual (WG), Mata com Araucárias (SF), Matas de galeria nos Pampas (PL e UR) e a Floresta Ombrófila, onde a maioria das amostras se concentra (GU, SV, PP, RQ, RG, SU, CG, PQ, SA e MQ).
Tabela 1. Códigos, táxon atribuído, número amostral, altitude, variáveis ambientais e coordenadas dos diferentes sítios de coleta das espécies
Morpho epistrophus e Morpho iphitus. Chuva = Precipitação pluviométrica anual; Temperatura = temperatura média anual
Localidades Código Táxon atribuído Nº Indivíduos Altitude Chuva (mm) Temperatura (ºC) Latitude Longitude
Jd. Botânico Benjamin Maranhão, João Pessoa, PB, Brasil JP M. epistrophus nikolajewna 9 40m 1936 25,3 -7,14 -34,86
Est. Ecol. Est. Wenceslau Guimarães, BA, Brasil WG M. epistrophus epistrophus 4 550m 626 21,5 -13,58 -39,70
Pq. Est. da Serra dos Pireneus, Pirenópolis, GO, Brasil PI* M. iphitus titei 2 1.100m 1524 21,5 -15,85 -48,74
Ouro Preto, MG, Brasil OP* M. iphitus iphitus 9 1.200m 1592 17,7 -20,38 -43,50
Refúg. de Vida Silvestre Libélulas, Tiradentes, MG, Brasil TI* M. iphitus iphitus 13 1.000m 1479 19,8 -21,09 -44,17
Maromba, Pq. Nacional do Itatiaia, Itatiaia, RJ, Brasil IT* M. iphitus iphitus 18 900 – 1100m 1649 16,7 -22,43 -44,61
Res. Ecol. de Guapiaçu, Cachoeiras de Macacu, RJ, Brasil GU M. epistrophus epistrophus 14 70m 1409 22,7 -22,45 -42,77
Alto da Boa Vista, Campos do Jordão, SP, Brasil CJ* M. iphitus iphitus 18 1.700m 1868 13,5 -22,71 -45,60
Grota Funda, Atibaia, SP, Brasil AT* M. iphitus iphitus 15 900 – 1.000m 1538 15,9 -23,18 -46,53
Pq. Est. da Serra do Mar, N. Sta. Virgínia, Ubatuba, SP, Brasil SV M. epistrophus epistrophus 16 900 – 1.000m 1728 16,4 -23,32 -45,10 Pq. Nat. Municipal de Paranapiacaba, Santo André, SP, Brasil PP M. epistrophus catenaria 16 880m 2863 16,4 -23,76 -46,29
Vale do Rio Quilombo, Santos, SP, Brasil RQ M. epistrophus catenaria 7 70m 3066 19,4 -23,81 -46,30
Pq. Est. Intervales, Ribeirão Grande, SP, Brasil RG M. epistrophus catenaria 15 900 – 1000m 1354 17,8 -24,19 -48,34
Pq. Nac. do Iguaçu, Santa Tereza do Oeste, PR, Brasil SO* M. iphitus titei 9 700m 1845 18,2 -25,07 -53,65
Pq. Nac. de Superagüi, Guaraqueçaba, PR, Brasil SU M. epistrophus catenaria 3 20m 2390 22,1 -25,32 -48,16
Campina Grande do Sul, PR, Brasil CG M. epistrophus catenaria 14 900m 1614 17,2 -25,31 -49,05
APA da Serra do Mar, Piraquara, PR, Brasil PQ M. epistrophus catenaria 18 950m 1574 17 -25,44 -49,06
Santo Amaro da Imperatriz, SC, Brasil SA M. epistrophus catenaria 13 100 – 180m 1604 18,4 -27,72 -48,80
FLONA, São Francisco de Paula, RS, Brasil SF M. epistrophus catenaria 20 900m 2032 15,5 -29,42 -50,39
Fepagro Litoral Norte, Maquiné, RS, Brasil MQ M. epistrophus catenaria 15 50m 1547 18,6 -29,66 -50,21
Cascata, Pelotas, RS, Brasil PL M. epistrophus argentinus 9 150m 1410 17,7 -31,62 -52,49
Tabela 2. Código, tipo de ambiente (vegetação), estado de conservação e área dos sítios de
coleta das espécies Morpho epistrophus e Morpho iphitus. Estado de conservação: “++” = bem conservado; “+“ = pouco perturbado; “-“ = muito perturbado.
Código Tipo de ambiente Estado de conservação Unidade de Conservação Área (ha)
JP Floresta de tabuleiro - Sim 515
WG Floresta semidecidua + Sim 2.418
PI* Mata ciliar de Cerrado e Campo Rupestre ++ Sim 2.833
OP* Floresta semidecidua + Não -
TI* Floresta semidecidua + Não -
IT* Floresta ombrófila ++ Sim 28.084
GU Floresta ombrófila ++ Sim ~ 200
CJ* Floresta ombrófila de altitude + Não -
AT* Floresta semidecidua + Não -
SV Floresta ombrófila ++ Sim 332.000
PP Floresta ombrófila ++ Sim 400
RQ Floresta ombrófila + Não -
RG Floresta ombrófila ++ Sim 41.700
SO* Floresta semidecidua ++ Sim 185.262
SU Floresta ombrófila ++ Sim 33.998
CG Floresta ombrófila + Não -
PQ Floresta ombrófila ++ Sim ~ 67.000
SA Floresta ombrófila ++ Não -
SF Floresta ombrófila com Araucaria ++ Sim 1.606 ha
MQ Floresta ombrófila ++ Não -
PL Mata ciliar nos pampas + Não -
Figura 3. Localidades de coleta das populações de Morpho brancas ao longo de sua distribuição
na Mata Atlântica. Códigos referentes às 22 populações apresentadas na Tabela 1. * = populações atribuídas a M. iphitus, as demais são supostamente M. epistrophus.
Extração de DNA
Os indivíduos coletados tiveram uma ou duas pernas retiradas para a extração de DNA. O restante de cada indivíduo foi mantido em congelador à -20ºC e poderá ser utilizado para estudos futuros que necessitem de mais material. As pernas foram armazenadas em solução saturada de NaCl2, DMSO 20% e posteriormente tiveram o DNA genômico total extraído com
o protocolo DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen AG), mantido posteriormente a -20ºC. A concentração do DNA foi medida com um espectrofotômetro NanoDrop UV (Techno Scientific) e todas as amostras foram padronizadas para uma concentração de 5 ng/μl.
Obtenção dos marcadores microssatélites
A biblioteca de microssatélites foi desenvolvida usando o protocolo de clonagem por enriquecimento (Enrichment-Cloning) (Billotte et al., 1999). O DNA genômico de Morpho (da localidade de Itatiaia Tabela 1) foi digerido com a endonuclease Rsa I (New England Biolabs), para que fossem gerados múltiplos fragmentos de DNA. A solução foi enriquecida com microssatélites usando sondas marcadas com biotina (CT)8 e ligadas a esferas magnéticas recobertas por estreptavidina. As duas substâncias possuem alta afinidade, o que possibilita o uso de um ímã e das sondas marcadas para a seleção de fragmentos de interesse (Weber et al., 1989). Após realizada a hibridização dos fragmentos de interesse com as sondas, foram realizadas múltiplas lavagens, o DNA foi eluído e recuperado após reação de amplificação. Os fragmentos enriquecidos foram clonados com o protocolo pGEM-T (Promega).
Os produtos da ligação foram então utilizados para transformar células de Escherichia coli XL1-blue, através de eletroporação, em células competentes. Os clones positivos foram selecionados usando o gene da b-galactosidase e meio seletivo contendo ampicilina. Logo, para se identificar os transformantes, o marcador seletivo para b-galactosidase codificado pelos plasmídeos das células E. coli confere um novo fenótipo que permite identificar as formas recombinantes. Após a seleção das colônias competentes, foram obtidos os clones dos fragmentos de microssatélites, com as respectivas regiões flanqueadoras.
Os clones foram sequenciados e as regiões contendo as sequências únicas foram utilizadas para a construção dos pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers). Para tal, as sequências brutas tiveram os adaptadores removidos, assim como os trechos de baixa qualidade. As sequências foram comparadas com outras no banco de dados do Genbank e checadas para contaminações. O programa SSRIT (Simple Sequence Identification Tool) foi utilizado na identificação dos locos microssatélites contidos nas sequências obtidas e os pares de oligonucleotídeos iniciadores foram, então, construídos com o programa Primer 3plus (Untergasser et al., 2007).
Amplificação e genotipagem
Os pares de oligonucleotídeos iniciadores desenhados com o programa Primer 3plus foram otimizados para a reação de PCR e testados para indivíduos de diferentes localidades. Os resultados foram analisados em gel de poliacrilamida, cujo poder de resolução é altamente acurado (fragmentos com apenas um nucleotídeo de diferença podem ser discriminados), e corados com prata para a visualização dos alelos. Ao final do processo, 11 locos polimórficos de microssatélites foram selecionados (Tabela 3) e os oligonucleotídeos
iniciadores diretos foram re-sintetizados, incluindo sequências de nucleotídeos inespecíficos (M13) ao genoma acopladas à extremidade 5’ do iniciador direto de cada loco (Missiaglia e Grattapaglia, 2006). Estas sequências inespecíficas foram ligadas a fluoróforos de diferentes cores (6-FAM, VIC, NED e PET, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) na reação de amplificação. Assim, no PCR, as sequências complementares eram sintetizadas juntamente com o iniciador que pareia com a fita de DNA. A partir do terceiro ciclo, a sequência era marcada com fluoróforos, e toda a cadeia complementar também era marcada.
Tabela 3. Informações dos locos microssatélites desenvolvidos, contendo os motivos
repetitivos, fluoróforo utilizado nas amplificações, faixa de tamanhos dos fragmentos (pb), temperatura de anelamento (Ta), e as sequências direta (F) e reversa (R) dos oligonucleotídeos iniciadores.
Loco SSR Motivo Repetido Fluoróforo Tamanho (bp) Ta (°C) Oligonucleotídeo
MEF1 (CA)4 VIC 258-298 55 F- GAGAGCTATAGCCTGTGAGTGTCA
R- TTCGAACAACCAGAGCCAAT
MEG1 (AC)8 NED 179-199 61 F- ACGTCAAGCCGTTGTAGCTT
R- GTCCGTGCGGAATATTGAAC
MED6 (CT)3 PET 287-497 59 F- CAACGGCCTGGAATCAAGTC
R- GGCCTCATAAAACCCTGTAGAA
MEE6 (GT)7 FAM 182-198 59 F- CGAATCCTGCATCTCATGGT
R- ACCAACACTTCAGCCTGGAC
MEF5 (ATTG)3 VIC 244-278 59 F- CCGGTCATTCAACCATTACT
R- CGCATAGGTCTTCTCTCAAGC
MEF6 (CT)8 NED 262-360 59 F- AACAATACGAATTAATTGAACA
R- GAAGAGACCTATGTCCAACAC
MEH4 (TG)11 PET 221-277 55 F- ATTGGCGATTATATGATTAG
R- TTACAAGAAGGACGTGAC
MED9 (GT)7 FAM 140-164 59 F- TTGTGCTGCATACGTTACGA
R- TCAAGTCACATCCGATCACG
MED10 (TG)12 VIC 211-391 61 F- TTGTTAGTGTGAATGTGTATGTG
R- CAATTGAGTCATGTGCAATATC
MEE10 (TC)13 NED 290-352 58 F- TCGAGACTCAAAAGATCAGGTAGA
R- TTAAATTGATGACGAAAACAGAAA
MEE11 (CA)4 PET 158-334 61 F- TGAGAAACGCCGCACAGA
R- GCACGTATTATATGTTCGCTGGTT
As condições de PCR foram: 2 mM de Solução Tampão (Promega); 0,4 mM de dNTP; 1,6 mM MgCl2; 2 mM DMSO 5%; 0,4 mM de cada primer; 0,15 mM de fluoróforo; 7,5 ng de DNA genômico e 0,2 mM de taq DNA polymerase Promega. O programa do PCR foi: denaturação inicial a 94ºC por 5 minutos; 30 ciclos de: denaturação a 94ºC por 30 segundos,
anelamento por 45 segundos a temperaturas específicas (Tabela 2) e extensão a 72ºC por 1 minuto e 30 segundos; extensão final a 72ºC por 10 minutos. As amostras amplificadas foram submetidas a corrida em gel de agarose 1,5 % com tampão Tris-acetato (TAE) 50 mM (pH 7,5 - 7,8) para que a qualidade da amplificação fosse checada antes de as sequências serem levadas ao sequenciador automático.
Todas as amostras foram diluídas (10 - 20%) para a genotipagem dos 11 locos microssatélites usando as diferentes cores de fluoróforos em reações multiplex. A diluição das amostras de cada loco dependeu da eficiência da amplificação dos locos e da leitura dos diferentes fluoróforos no sequenciador automático ABI 3500 Genome Analyzer (Life Technologies). Foram utilizados na reação 8,925μl do marcador de peso molecular (Liz GeneScan 600, Life Technologies), 0,4μl de formamida HI-DI (Applied Biosystems) e até 2 μl das PCRs diluídas em multiplex. Cada reação de genotipagem em sequenciador automático teve um conjunto de até quatro locos em multiplex.
O programa Geneious v 7.1.2 (http://www.geneious.com, Kearse et al., 2012) foi utilizado com o plugin de microssatélites para interpretar os resultados da reação no sequenciador automático e para genotipar os alelos. Os picos de fluorescência de cada fluoróforo correspondem às diferentes formas alélicas de um loco, e a região em que se localiza o pico indica os seus respectivos comprimentos. Cada indivíduo diplóide pode apresentar até dois picos por loco, sendo que a ausência de picos pode ser indicativa de alelo nulo ou dificuldade de amplificação na PCR, assim como a presença de apenas um pico nem sempre representa homozigose verdadeira (o segundo alelo pode não ter amplificado). Após a realização do reconhecimento todos picos (peak calling) de todos os locos para todos os indivíduos, bins são sobrepostos aos picos de fluorescência para a identificação e padronização dos alelos. O programa gera uma tabela alélica final para todos os alelos genotipados, com a qual as análises são posteriormente realizadas. Os indivíduos com mais de quatro locos sem amplificação (que apresentaram alelos nulos) foram retirados das análises, visto que a falta de informações em vários locos pode gerar ruídos nas análises de diversidade e estruturação que seriam realizadas posteriormente.
Checagem de erros
A checagem de erros da genotipagem foi realizada usando o programa MicroChecker (van Oosterhout et al., 2004). Degradação do DNA utilizado nas amplificações, baixa concentração de DNA e mutações nas regiões flanqueadoras das repetições microssatélites podem levar a erros na genotipagem dos marcadores microssatélites, e o
programa testa a genotipagem para as três consequências mais comuns: perda de alelos grandes, erros de digitação devido a bandas duplicadas e alelos nulos. Estes três tipos de erros podem gerar desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg e uma má interpretação dos resultados de estrutura e diversidade genética das populações. A perda de alelos grandes ocorre quando existe a amplificação preferencial de alelos de menor comprimento; os erros de digitação devido a bandas duplicadas se dão quando ocorre escorregamento das fitas de DNA durante a amplificação na reação de PCR que cria “falsos picos”, geralmente com uma unidade de repetição de diferença, dificultando a identificação dos homozigotos; os alelos nulos são mutações nas regiões flanqueadoras dos locos microssatélites que podem levar a não amplificação de alguns alelos.
Cada tipo de erro gera um tipo de “assinatura” específica nos dados de genotipagem, que o programa identifica após a construção de genótipos aleatórios a partir dos alelos observados em todos os locos. Os genótipos efetivamente observados nas populações são então comparados com os gerados pelo MicroChecker, que discrimina os desvios devido a erros de genotipagem. Para fins estatísticos, cada localidade foi considerada uma população.
As populações que apresentaram stuttering para algum loco tiveram a genotipagem checada novamente no programa Geneious v 7.1.2 para verificar a possibilidade de correção. Houve o registro das populações que apresentaram alelos nulos para determinados locos microssatélites.
Além de identificados pelo MicroChecker, os alelos nulos tiveram as frequências estimadas através do método de Brookfield (1996), implementado no programa GENEPOP on the Web 4.2 (Raymont & Rousset, 1995).
As frequências alélicas e genotípicas dos locos foram calculadas no pacote hierfstat, implementado no programa R (Goudet, 2005) e então submetidas a um teste de aderência (teste exato de Fisher) para o cálculo das proporções de Equilíbrio de Hardy-Weinberg, conforme definido por Weir (1996), utilizando o programa Genepop (Raymond & Rousset, 1995). Este programa segue o procedimento em cadeia de Markov para estimar o valor exato de P, definido por 5000 desmemorizações, 2000 batchs e 2000 iterações, considerando-se um valor de alpha de 0,05, o qual, após ser corrigido por Bonferroni, foi transformado em um valor nominal de 0,001. Para verificar se as frequências alélicas esperadas sob acasalamento ao acaso não estão sob efeito de desequilíbrio de ligação, foi realizado um teste de desequilíbrio de ligação por meio do programa FSTAT (Goudet, 2009). O valor de significância foi ajustado pela correção de Bonferroni sequencial, para um nível de significância (p-value) de 0,05.
Análises de diversidade
Para caracterizar a diversidade populacional, as médias do tamanho amostral, o número de alelos diferentes observados, o número de alelos efetivos e o de alelos privados, por locos e por populações, foram estimadas no programa GenAlEx 6.5 (Peakall & Smouse, 2012). As frequências de heterozigotos observadas e esperadas para locos e para populações (separadamente), também foram calculadas no GenAlEx 6.5. As frequências de heterozigotos observadas e esperadas por locos e por populações, por sua vez, foram estimadas a partir do pacote do R, hierfstat.
Análises de estruturação e migração
Primeiramente foram calculadas as estatísticas F para a investigação de estruturação populacional, considerando-se que são um dos métodos mais antigos para medir a diferenciação genética de populações e são bons indicadores de divergência entre subpopulações e endogamia (Allendorf & Luikart, 2007). Para este fim, foi utilizado o pacote do R hierfstat(Goudet, 2005), que realiza os cálculos a partir das estatísticas F de Nei (Nei, 1987; Goudet, 2005). O FST par a par das populações, com seus respectivos valores de significância, foram calculados no programa Arlequin v3.5.2 (Excoffier & Lischer, 2010).
Para inferir a correlação entre as distâncias genéticas e geográficas entre pares de populações foi rodado um teste de Mantel no programa Arlequin v3.5.2 (Excoffier & Lischer, 2010), correlacionando duas matrizes de dissimilaridade (divergência genética e distância geográfica) para verificar a existência de dependência espacial nas populações. Isto é, o teste de Mantel verifica a existência do padrão genético populacional chamado “Isolamento por distância”, que resulta do fluxo gênico limitado pela distância geográfica.
Para estimar a estruturação genética entre as populações estudas foi realizada uma análise de variância molecular (Analysis of Molecular Variance - AMOVA) (Weir & Cockerham, 1984; Excoffier et al., 1992) no programa Arlequin v3.5.2 (Excoffier & Lischer, 2010). A análise identifica os níveis de diversidade genética existente entre populações, entre indivíduos e entre os indivíduos dentro das populações (Excoffier et al., 1992; Schneider, 2000).
A Análise Discriminante de Componentes Principais (Discriminant Analysis of Principal Components - DAPC), disponível no pacote Adegenet (Jombart et al., 2010; Jombart & Collins, 2015a) foi utilizada para a atribuição dos indivíduos a grupos genéticos. A DAPC usa componentes multivariados principais para discriminar entre agrupamentos de indivíduos nas amostras, tendo um importante papel na sumarização da variabilidade genética. Para a
identificação dos grupos genéticos (clusters), é necessária a identificação de grupos definidos previamente (as populações escolhidas para o estudo) (Jombart & Collins, 2015a). O provável número de clusters para diferentes soluções de agrupamento (K) foi testado apresentado em um gráfico de Critério de Informação Bayesiana (Bayesian Information Criterion - BIC). O valor ótimo de K é, geralmente, o que apresenta um dos menores valores de BIC, ou o valor que estiver na extremidade de um “cotovelo” do gráfico. Para a interpretação do número ideal de agrupamentos na DAPC foi preciso levar em consideração, também, a alternativa que melhor explica a distribuição da diversidade genética das populações estudadas. A função de encontrar clusters foi aplicada para o K ótimo e um gráfico relacionando populações amostradas com os grupos genéticos foi gerado. Quanto mais uniformemente distribuído o gráfico, maior troca de genes e migração podem estar ocorrendo entre as diferentes subpopulações. As populações foram reorganizadas no gráfico de acordo com as suas latitudes. Os indivíduos dos clusters foram plotados em um gráfico de dispersão (scatterplot), utilizando a análise de componentes discriminantes.
Uma análise espacial de componentes principais (Spatial Analysis of Principal Components - sPCA), também implementada no pacote Adegenet, foi utilizada para testar a estruturação genética espacial (Jombart et al., 2008b; Jombart, 2015b). A informação espacial fica “armazenada” em outra matriz, com dados de distâncias geográfica entre populações ou indivíduos. Essas informações foram transformadas em uma rede de conexões entre populações. Foi realizada uma autocorrelação espacial de frequências alélicas, usando o índice I de Moran (Moran, 1948; Moran, 1950). Além disso, foi calculada a contribuição relativa de cada alelo para o primeiro eixo da sPCA.
As taxas de migração recente entre populações foram estimadas utilizando o programa BAYESASS v3.04 (Wilson & Rannala, 2003). O programa utiliza Markov Chain Monte Carlo (MCMC) e identifica cada indivíduo como imigrante, não imigrante, prole de indivíduos imigrantes ou prole de indivíduos nativos da população. Os níveis de migração assumidos pelo programa são relativamente baixos e este considera que os locos estão em equilíbrio de ligação (apesar de desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg serem permitidos). A análise foi repetida para a obtenção de diferentes cadeias, alterando os valores de seeds e outros parâmetros até que os taxas de aceitação estivessem adequadas. Cada corrida teve 50 milhões de interações, com burnin de 15 milhões e amostragem a cada 5000 cadeias. O conjunto de parâmetros iniciais utilizados foram frequências alélicas a = 0,75, taxas de migração m = 0,5 e coeficiente de endogamia f = 0,95. As corridas foram conferida no programa Tracer v1.7
(Rambaut et al., 2016) e todas as cadeias resultantes foram então resumidas no pacote do R CODA (Plummer et al., 2006) para que a matriz de migrações fosse montada.
Análise de variáveis ambientais
Para a comparação dos resultados de estruturação genética das populações com as características ambientais de onde ocorrem, foi construído um mapa com os dados termo pluviométricos representados através de Diagramas Climáticos de Walter-Lieth (Walter & Lieth, 1960). As normais climáticas e pluviométricas, dos anos de 1970 a 2000, foram obtidas através do WorldClim (Global Climate Data) (Hijmans et al., 2005). Os diagramas foram obtidos nos pacotes do R raster, rgdal e rgeos (; Bivand & Rundel, 2013; Hijmans & van Etten, 2014; Bivand et al., 2014).
Foi realizada uma PCA ambiental (Principal Component Analysis) para converter um conjunto de 19 variáveis ambientais, possivelmente correlacionadas, num conjunto de valores de variáveis linearmente não correlacionadas. A análise pode ser utilizada, portanto, para investigar como as variáveis ambientais (tais como temperatura média anual, sazonalidade, precipitação média anual, entre outras) podem estar influenciando o padrão de estruturação encontrado no conjunto de dados. A PCA foi escalonada, para que todas as variáveis tivessem o mesmo peso. As 19 variáveis, para todas as localidades, foram obtidas pelo WorldClim (Hijmans et al., 2005) e as populações foram agrupadas em clusters genéticos (obtidos pela DAPC) para a realização da PCA. Foram utilizados os pacotes do R raster, vegan e ggfortify (Oksanen et al., 2007; Hijmans & van Etten, 2014; Tang, Horikoshi & Li, 2016). Foram realizados diagramas de caixas (Boxplots) para representar graficamente a influência de cada variável climática entre os grupos.
Resultados
Amplificação, genotipagem e checagem de erros
No total foram genotipados 265 indivíduos em 22 populações, com um número médio de 12,04 indivíduos amostrados por população (variação de dois a vinte indivíduos), em 11 locos. Os locos MEF5, MEG1 e MED9 apresentaram a menor quantidade de indivíduos não amplificados (três, sete e oito indivíduos do total, respectivamente), enquanto os locos MEF1, MEF6 e MEH4 apresentaram maiores dificuldades de amplificação, com mais de 40 indivíduos sem amplificação (Tabela 4).
Tabela 4. Número de alelos, porcentagem de indivíduos não amplificados em relação ao total
e observações sobre os 11 locos desenvolvidos.
Locos No. alelos Indivíduos não amplificados Observações
MEE6 9 11,7% -
MEF1 19 21,9%
Dificuldade de amplificação em TI* e OP*
MEG1 11 2,6% -
MED6 58 6,8% Não amplificou para nenhum JP
MED9 12 3,0% - MEF5 10 1,1% - MEF6 25 15,5% - MEH4 22 15,1% Dificuldade de amplificação em GU e JP
MED10 35 12,5% Dificuldade de amplificação em GU
MEE10 29 12,8% Dificuldade de amplificação em JP
MEE11 62 10,9% Dificuldade de amplificação em SU
Total 292 - -
A checagem de erros no programa MicroChecker foi realizada para todos os locos e para 15 populações, sendo que para as populações JP, WG, PI*, OP*, TI*, GU e SU o programa não realizou as análises devido a dados insuficientes (baixo número de indivíduos nas populações, ou muitos locos com alelos nulos). Foram identificados erros causados por bandas duplicadas no loco MEE6 para as populações IT, AT, PP e SA, no loco MEF5 para a população SA, no loco MEH4 para SA e no loco MED9 para as populações PP, RG e SA. Isso se deve à tendência do Geneious de marcar picos heterozigotos com apenas uma repetição de diferença como bandas duplicadas (“falsos picos” que dificultam a discriminação entre homozigotos e heterozigotos). Nestes casos, os picos foram conferidos e corrigidos manualmente caso apresentassem intensidades similares, bem como se ambos alelos fossem registrados também em outros indivíduos. Os bins também foram conferidos e, em alguns casos,
reorganizados para que contemplassem todos os alelos da forma mais precisa. No entanto, ao final das correções de genotipagem, o loco MEE6 para a população AT e o loco MED9 para a SA continuaram indicando bandas duplicadas. Além disso, o loco MEF1, para a população SF, passou a apresentar sinais de bandas duplicadas após a reorganização dos bins, pois alguns de seus alelos foram atribuídos a bins diferentes em relação a primeira vez em que foram genotipados. Contudo, a correção da genotipagem do loco contemplou de forma satisfatória todos os alelos das demais populações.
Foram encontradas 53 ocorrências de populações com locos indicando alelos nulos no MicroChecker. Foram encontrados alelos nulos para todos os locos com exceção de MEG1, MED9 e MEF5. Os locos que apresentaram o maior número de populações com alelos nulos foram MEE11, MED10 e MEH4, com onze, nove e oito populações, e as populações com mais locos apresentando alelos nulos foram IT* e AT*, ambas para sete locos. Alternativamente, as populações PL e UR não indicaram alelos nulos para nenhum loco e a população MQ apenas para o loco MED10.
Destas 53 ocorrências de populações com locos indicando alelos nulos no MicroChecker, 40 coincidiram com as que apresentaram altas frequências de alelos nulos no GENEPOP (frequências maiores que 0,15) (Tabela 5). No entanto, foram 77 ocorrências de populações com alelos nulos no GENEPOP, onde todos os locos apresentaram ao menos duas populações com alelos nulos. MEG1, MEE6 e MEF5 apresentaram os menores números de populações com alelos nulos (dois, três e três populações, respectivamente) e MEE11 e MEH4 apresentaram os maiores números de populações (15 e 11). O loco MED9, que não apresentou populações com alelos nulos no MicroChecker, teve até seis populações quando analisado pelo GENEPOP.
A média de locos com alelos nulos dentro das populações foi 3,4 locos, sendo que a população IT* apresentou o maior número de locos (6). UR e MQ não apresentaram alelos nulos, JP e PI* apresentaram apenas um (no entanto, tinham dois e quatro locos faltantes nas análises, respectivamente, além de PI* ter apenas dois indivíduos, o que pode enviesar os resultados). A frequência média de alelos nulos nas amostras, por locos e por populações, foi 10,88%.
Tabela 5. Frequências de alelos nulos estimadas por locos e populações calculada no Genepop.
Populações organizadas em ordem da menor para a maior latitude (de cima para baixo na tabela). Os códigos das populações estão apresentados na Tabela 1. * = populações atribuídas a M. iphitus, as demais são supostamente M. epistrophus.
MEE6 MEF1 MEG1 MED6 MED9 MEF5 MEF6 MEH4 MED10 MEE10 MEE11
JP 0,0000 0,1454 0,0000 - 0,0000 0,0000 0,0000 - 0,0413 0,0000 0,2408 WG 0,0000 0,1967 - 0,2222 0,3869 0,0000 0,0000 0,0000 0,5000 0,0000 0,2783 PI* 0,0000 - - 0,0000 0,0000 0,0000 0,7071 - 0,0000 - 0,0000 OP* 0,0000 0,3333 0,2481 0,1173 0,1563 0,0000 0,1279 0,1884 0,0448 0,2629 0,1151 TI* 0,2872 0,3150 0,1482 0,0428 0,0103 0,0046 0,0533 0,3760 0,1278 0,1547 0,0307 IT* 0,0464 0,1602 0,0000 0,1079 0,0236 0,2643 0,1642 0,2625 0,2267 0,1438 0,3388 GU 0,2509 0,0336 0,1266 0,3940 0,0000 0,1891 0,1356 0,2238 - 0,1053 0,1855 CJ* 0,0316 0,3980 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,2270 0,3186 0,0954 0,2735 0,2689 AT* 0,2531 0,2442 0,0133 0,0183 0,0361 0,0000 0,0904 0,2248 0,2494 0,2379 0,3327 SV 0,0556 0,0370 0,0000 0,0277 0,0000 0,0340 0,4146 0,1155 0,4114 0,3093 0,4328 PP 0,0651 0,2571 0,1074 0,0000 0,1291 0,0000 0,2117 0,2800 0,0898 0,1829 0,2915 RQ 0,0000 0,0000 0,1667 0,0000 0,0599 0,1891 0,1775 0,0000 0,2449 0,0476 0,4615 RG 0,1147 0,0568 0,1156 0,1398 0,2561 0,2000 0,0853 0,1895 0,0635 0,0367 0,2284 SO* 0,0313 0,2890 0,0000 0,0000 0,0773 0,0000 0,2863 0,0731 0,0000 0,1235 0,1890 SU 0,0000 0,0000 0,0000 0,2222 0,3150 0,0000 0,0000 0,0000 - 0,0000 0,0000 CG 0,0982 0,1191 0,0000 0,1642 0,0000 0,0000 0,1501 0,2506 0,0000 0,1420 0,1823 PQ 0,0946 0,0443 0,0000 0,2604 0,0000 0,0000 0,0000 0,1552 0,1131 0,0000 0,1954 SA 0,0747 0,1064 0,0000 0,1749 0,2518 0,0000 0,0000 0,1598 0,0965 0,0835 0,2030 SF 0,0000 0,1274 0,0000 0,1806 0,0881 0,0000 0,0000 0,0000 0,1880 0,0000 0,0380 MQ 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,1031 0,0000 0,0000 0,0833 0,0822 0,0000 0,0000 PL 0,0000 0,1618 0,0000 0,0000 0,1542 0,0000 0,0000 0,0000 0,3314 0,0000 0,0000 UR 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,1239 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 - 0,0000 Valores maiores de 0,15 destacados em negrito.
Não foi constatado desequilíbrio de ligação entre quaisquer pares de locos. No teste exato de Hardy-Weinberg, para locos e populações (Tabela 6), o loco com a maior quantidade de populações em desequilíbrio (com p valor maior que 0,05) foi o MEE11, com 14 populações (também o loco com o maior número de populações com alelos nulos, como indicado na Tabela 5), seguido de MED10, com 11. O loco MEF5, por sua vez, não apresentou populações em desequilíbrio, e o loco MEG1 apresentou apenas duas (OP* e TI*, ambas populações próximas). As populações PP, AT* e RG apresentaram as maiores quantidades de locos em desequilíbrio (oito, sete e sete, respectivamente), todas no estado de São Paulo. As populações com mais locos em desequilíbrio não apresentaram um padrão entre as espécies Morpho epistrophus e M. iphitus (populações de ambas espécies estão dentre as com mais locos em desequilíbrio). As populações PI*, SU e UR não apresentaram locos em desequilíbrio, no entanto, não apresentam valores de p para oito, três e três locos, respectivamente (devido ao baixo número amostral nestas populações). MQ apresentou apenas um loco em desequilíbrio (assim como JP, no entanto, essa tem valores de p faltantes para três locos), seguida de PL e WG, ambas com dois. O teste exato de Hardy-Weinberg foi repetido sem as populações WG, PI*, RQ, SU e UR
(populações que possuem números amostrais menores que nove), contudo, as variações nos valores de p foram mínimas (Tabela S1, material suplementar).
Tabela 6. Valores de p do Teste exato de Hardy-Weinberg, por locos por populações.
MEE6 MEF1 MEG1 MED6 MED9 MEF5 MEF6 MEH4 MED10 MEE10 MEE11
JP - 0,123 1,000 - 1,000 0,709 0,466 - 0,328 1,000 0,000 WG 0,453 0,145 - 0,065 0,033 - 1,000 0,489 0,335 0,655 0,031 PI* - - - 1,000 0,335 - 0,331 - - - - OP* 1,000 0,331 0,008 0,172 0,017 0,344 0,087 0,004 0,492 0,000 0,464 TI* 0,001 0,199 0,046 0,221 0,371 0,551 0,454 0,000 0,003 0,000 0,252 IT* 0,395 0,004 0,215 0,067 0,444 0,248 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 GU 0,033 0,143 0,163 0,000 0,147 0,165 0,161 0,069 - 0,020 0,002 CJ* 0,132 0,000 0,190 0,368 0,194 1,000 0,000 0,000 0,022 0,000 0,000 AT* 0,001 0,000 0,383 0,904 0,355 1,000 0,015 0,002 0,000 0,001 0,000 SV 0,124 0,554 0,376 0,766 0,519 0,450 0,000 0,078 0,000 0,000 0,000 PP 0,001 0,000 0,132 0,392 0,048 1,000 0,001 0,000 0,028 0,000 0,001 RQ 1,000 0,591 0,451 0,322 0,193 0,422 0,040 0,394 0,001 0,242 0,000 RG 0,005 0,016 0,147 0,000 0,001 0,451 0,012 0,000 0,177 0,384 0,023 SO* 0,087 0,034 1,000 0,342 0,227 1,000 0,015 1,000 - 0,108 0,015 SU 0,402 1,000 1,000 0,072 0,199 1,000 0,229 - - 0,483 - CG 0,123 0,168 1,000 0,000 1,000 1,000 0,012 0,005 0,729 0,028 0,001 PQ 0,006 0,080 1,000 0,000 0,056 1,000 0,644 0,014 0,018 0,789 0,000 AS 0,034 0,048 0,739 0,000 0,001 1,000 0,652 0,003 0,080 0,486 0,009 SF 0,340 0,013 1,000 0,002 0,221 0,715 0,748 0,585 0,004 1,000 0,283 MQ 0,426 0,261 1,000 0,078 0,150 1,000 0,396 0,459 0,006 1,000 0,905 PL 1,000 0,111 1,000 0,442 0,013 1,000 0,878 0,807 0,003 0,593 0,674 UR 1,000 - 1,000 1,000 0,381 - 1,000 0,848 0,163 - 1,000 Valores menos de 0,05 destacados em negrito.
Análises de Diversidade
Foram encontrados 292 alelos para todos os locos (Tabela 4). O loco que apresentou a menor quantidade de alelos foi o MEE6, com apenas nove, seguido pelo MEF5 e MEG1, com 10 e 11 alelos, respectivamente. Em contrapartida, os locos MED6 e MEE11 apresentaram as maiores diversidades alélicas, com 58 e 62 alelos.
SF e IT* tiveram as maiores médias de tamanhos populacionais (ou seja, número de indivíduos amplificados para todos os locos), com 19,5 e 16,9 respectivamente (Tabela 7). PI* e SU, por outro lado, apresentaram as menores (1,5 e 2,4). IT* e PP foram as populações com as maiores médias do número de alelos diferentes observados (10,9 e 9). As populações com as menores médias foram PI* (1,82) e SU (2,55), seguidas de JP (2,82) e UR (2,91). Os padrões das médias de alelos efetivos foram semelhantes, com IT* e PP com as maiores (6,12
e 5,81) e PI*, UR e JP com as menores (1,68, 1,79 e 1,87). IT* e RG apresentaram as maiores médias de alelos privados (0,91 e 0,64), enquanto SU não apresentou alelos privados e JP, PI*, SU, SA, MQ e UR apresentaram todos 0,09.
Tabela 7. Médias populacionais do tamanho amostral, do número de alelos diferentes
observados (Na), número efetivo de alelos (Ne) e número de alelos privados (Np). Frequência de heterozigotos esperada (He) e observada (Ho) para as populações. * = populações atribuídas a M. iphitus, as demais são supostamente M. epistrophus.
População Tamanho amostral Na Ne Np Ho He
JP 6,9 2,82 1,87 0,09 0,372 0,361 WG 3,5 3,64 2,99 0,45 0,447 0,586 PI* 1,5 1,82 1,68 0,09 0,364 0,318 OP* 7,9 4,73 2,80 0,55 0,375 0,596 TI* 10,5 5,73 3,76 0,18 0,451 0,705 IT* 16,9 10,09 6,12 0,91 0,518 0,783 GU 11,3 5,27 3,07 0,55 0,384 0,547 CJ* 15,8 7,09 4,20 0,36 0,492 0,729 AT* 13,8 7,18 4,62 0,55 0,447 0,712 SV 13,8 6,91 4,33 0,27 0,409 0,710 PP 15,4 9,00 5,81 0,27 0,492 0,739 RQ 6,7 6,91 5,08 0,18 0,602 0,768 RG 13,8 7,73 4,98 0,64 0,519 0,698 SO* 7,5 4,00 2,79 0,18 0,418 0,555 SU 2,4 2,55 2,33 0,00 0,606 0,515 CG 13,2 6,27 3,70 0,27 0,417 0,573 PQ 16,1 6,73 3,76 0,45 0,534 0,644 SA 12,8 6,45 3,60 0,09 0,483 0,629 SF 19,5 6,91 3,50 0,27 0,583 0,635 MQ 14,1 6,18 3,82 0,09 0,577 0,580 PL 8,5 4,18 2,63 0,27 0,578 0,580 UR 7,9 2,91 1,79 0,09 0,476 0,379
No geral, os valores de heterozigosidade esperada foram maiores que a observada (Tabela 7) entre as populações. Apenas as populações JP, PI*, SU e UR apresentaram a frequência de heterozigotos observada maior que a esperada, contudo, a diferença foi pequena (entre 0,1 e 0,011) e essas estão entre as populações com os menores tamanhos amostrais, logo, estes resultados podem estar comprometidos pela baixa amostragem. MQ e PL apresentaram as frequências observadas iguais as esperadas (0,577 e 0,580; 0,578 e 0,580. O restante das populações apresentou valores de heterozigosidade esperada maior que a observada, o que indica perda de heterozigotos na maioria das populações de Morpho brancas amostradas.
Quando as frequências de heterozigosidade foram calculadas por locos e populações (Tabela 8), a população UR é a única que apresenta, no geral, valores de heterozigosidade observada maiores que a esperada. JP também apresenta mais locos com
frequência de heterozigotos observada maior que a esperada em comparação com outras populações. Da população SO* até o extremo sul da distribuição, as populações apresentam, no geral, mais locos com frequências observadas maiores ou parecidas com as esperadas. Os locos MED6 para a população JP, MEF1 para PI*, e MED10 para SU (populações com números amostrais menores que nove) não tiveram He e Ho calculados pois nenhum indivíduo amplificou para estes locos. Já o He não foi calculado para locos em que apenas um indivíduo amplificou (como ocorreu em PI*, GU e SU).
