TÍTULO: ESTUDO MORFOLÓGICO DO FÍGADO DE ANIMAIS SUBMETIDOS À ISQUEMIA E REPERFUSÃO INTESTINAL PRÉ- TRATADOS COM ATENOLOL
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): VANESSA COELHO GASPAR AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): ITAMAR SOUZA DE OLIVEIRA JUNIOR ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): ANDRÉA RAMOS LIRA COLABORADOR(ES):
CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES
METROPOLITANAS UNIDAS
NÚCLEO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO DE BIOMEDICINA
VANESSA COELHO GASPAR
ESTUDO MORFOLÓGICO DO FÍGADO DE ANIMAIS SUBMETIDOS À ISQUEMIA E REPERFUSÃO INTESTINAL PRÉ-TRATADOS COM ATENOLOL
SÃO PAULO 2014
ESTUDO MORFOLÓGICO DO FÍGADO DE ANIMAIS SUBMETIDOS À ISQUEMIA E REPERFUSÃO INTESTINAL PRÉ-TRATADOS COM ATENOLOL
Vanessa Coelho Gaspar1, Andréa Ramos Lira2, Itamar Souza de Oliveira Junior3 1Aluna de Iniciação Científica do Centro Universitário das Faculdades Metropolitanas
Unidas; 2Co-Orientadora Especialista da Divisão de Transplante Hepático do
Hospital Beneficência Portuguesa de São Paulo; 3Docente-Orientador do curso de
Biomedicina do Centro Universitário das Faculdades Metropolitanas Unidas e do Programa de Pós-Graduação em Medicina Translacional da Universidade Federal de São Paulo.
1. RESUMO
Introdução: A isquemia mesentérica intestinal aguda é uma emergência clinica/
cirúrgica que pode levar o paciente a óbito devido a uma obstrução transitória, parcial ou total de uma artéria ou veia mesentérica, superior ou inferior, causando diminuição ou cessação do fluxo sanguíneo levando a complicações em todo o sistema. A necessidade do reestabelecimento do fluxo sanguíneo (reperfusão) imediata é essencial para evitar lesão tecidual e consequentemente a necrose.
Objetivo: Nosso objetivo visou avaliar o tecido hepático de ratos submetidos à
isquemia-reperfusão intestinal e pré-tratados com atenolol. Metodologia: Para a realização da pesquisa utilizamos 18 ratos Wistar (adultos), e divididos em: Grupo I (n=6) o controle; Grupo II (n=6) submetidos a isquemia por 45 minutos e reperfusão por 120 minutos; e Grupo III (n=6) com infusão prévia de atenolol seguido de isquemia por 45 minutos e reperfusão por 120 minutos. Os animais sob anestesia foram submetidos a uma laparotomia mediana e os animais do Grupo II e Grupo III tiveram artéria mesentérica superior clampeada por 45 minutos e a reperfusão se deu por 120 minutos. Ao final do experimento retiramos uma parte do fígado que foi submetido a análise histológica e as lâminas coradas pela técnica de hematoxilina-eosina. Resultados: Os resultados demonstraram que os animais do Grupo II apresentaram áreas com vacuolização do citoplasma e infiltrado de leucócitos polimorfonucleares, por outro lado os animais do Grupo III apresentaram evidente redução destes sinais. Conclusão: Conforme a análise histológica pode-se observar que o atenolol foi efetivo na proteção hepática.
2. INTRODUÇÃO
A isquemia e reperfusão constituem a fisiopatologia de muitas situações médicas diárias, como grandes operações e transplante de órgãos. No entanto, as taxas de morbidade e mortalidade relacionadas com a lesão que acompanha esses processos levaram a pesquisar sobre os procedimentos que podem interferir direta ou indiretamente para reduzir a lesão do tecido (BLANKENSTEIN e TERPSTRA, 1991; BELZER e SOUTHERLAND, 1998).
Embora o benefício da reperfusão seja inquestionável, dada a associação entre a duração da isquemia e reversibilidade do dano gerado, a reintrodução de oxigênio em um ambiente isquêmico inicia uma complexa cadeia de eventos que culmina em lesões teciduais adicionais, a partir da qual se destaca a migração, adesão, ativação de leucócitos e a produção de radicais livres de oxigênio (SLATER, 1984; McCORD, 1985; STHAL et al., 1989; KOMATSU et al., 1992; SHREENIWAS et al., 1992; ARNOULD et al., 1993; ZIMMERMAN e GRANGER, 1994; MAIER e BULGER, 1996; SCANNELL, 1996; ABU-ELMAGD e BOND, 2003).
Assim a disfunção endotelial é de grande importância, pois se caracteriza pela diminuição da produção de óxido nítrico (NO) que deriva das células endoteliais, músculo liso, macrófagos, entre outras e esta redução parece ocorrer por conta da inibição da oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (RUFFOLO e FEUERSTEIN, 1997; ABE et al., 2009).
Desta forma a disponibilidade de NO se demonstrou benéfica em vários modelos experimentais, uma vez que a infusão de doadores de NO ou suplementação com precursores de NO minimizou a lesão com melhora na microcirculação hepática (LIU et al., 2000; SCHWENTKER e BILLIAR, 2002; VARDANIAN et al., 2008; KNOTT e BOSSY-WETZEL, 2009).
Os mecanismos acima mencionados, especialmente a produção de espécies reativas de oxigênio e a indução de resposta inflamatória, são responsáveis pela disfunção orgânica no local afetado. No entanto, o processo de lesão inerente a isquemia e reperfusão não esta restrito ao local diretamente afetado, mas também afeta órgãos distantes como a resposta inflamatória sistêmica secundária que pode, na pior das hipóteses, levar à disfunção de múltiplos órgãos, ou seja, a isquemia
seguida de reperfusão pode resultar em danos a órgãos distantes (TERADA et al., 1992). Neste contexto, estudos anteriores demonstraram que o atenolol (AT), um agente beta-bloqueador (adrenérgico) amplamente utilizado em doenças do coração e na hipertensão arterial sistêmica, reduz o dano causado pelo processo anterior (TAHA et al., 2010; CAMPOS et al., 2012). No entanto, os mecanismos pelos quais o atenolol age ainda não estão esclarecidos.
3. OBJETIVOS
Investigar as alterações funcionais e estruturais do fígado de animais submetidos à isquemia e reperfusão intestinal pré-tratados com atenolol.
4. MÉTODOS
Para a realização do estudo o mesmo obteve aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (5980160514/24) e os procedimentos foram realizados seguindo as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e do “National Institutes of Health (NIH) Guidelines Regarding Animal Experimentation” (EUA). Utilizamos 18 ratos Wistar, machos, EPM1, pesando entre 220 e 280 g, fornecidos pelo Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Os animais foram mantidos no Biotério da Disciplina de Cirurgia Experimental por um período de 24 horas antes do início do experimento, para a adaptação às condições locais de confinamento em gaiolas próprias. Os animais foram mantidos sob condições padronizadas de luminosidade (ciclo claro/escuro de 12:12 horas), umidade (60-70%), temperatura ambiente (22ºC) e alimentação ad libitum.
5. DESENVOLVIMENTO
Os animais foram distribuídos, por sorteio, em três grupos (n= 6/grupo): Grupo I: realizamos o procedimento cirúrgico (conforme descrição a seguir), mas sem clampeamento da mesentérica; Grupo II: realizamos o procedimento cirúrgico, seguido de infusão de solução salina e 30 minutos depois realizamos o clampeamento da mesentérica por 45 minutos e reperfusão por 120 minutos; Grupo III: realizamos o procedimento cirúrgico, seguido de infusão de atenolol e 30 minutos
depois realizamos o clampeamento da mesentérica por 45 minutos e reperfusão por 120 minutos.
Preparo do atenolol
O atenolol (Sigma, Brasil) foi diluído em solução salina para administração intravenosa (femoral) na dose de 2 mg/kg que foi infundido por 20 minutos antes do clampeamento apenas no Grupo III.
Procedimentos operatórios
Para o procedimento operatório, os animais foram submetidos ao jejum de 8 horas para sólidos e 2 horas para água, sendo então pesados em balança de precisão e anestesiados com injeção intraperitoneal de cloridrato de cetamina (50 mg/kg) e cloridrato de xilazina (10 mg/kg) até abolição dos reflexos corneanos, palpebral e cutâneo. Os animais anestesiados foram colocados em decúbito dorsal sobre a mesa cirúrgica e imobilizados com fita adesiva em posição supina. Os pelos da região abdominal foram retirados com creme depilatório, antissepsia com solução de álcool iodado a 2% e delimitação da área operatória com campos cirúrgicos.
Foi realizada uma laparotomia mediana longitudinal, com quatro centímetros de comprimento, iniciando-se abaixo do processo xifóide, em sentido crânio-caudal, com diérese dos planos anatômicos. Após a laparotomia, foi identificada a artéria mesentérica superior que foi submetida ao processo abaixo descrito.
Procedimento de Isquemia-Reperfusão e Ventilação Mecânica
A artéria mesentérica intestinal foi individualizada, nos Grupos II e III, com a dissecção e isolamento da mesma sendo realizado seu clampeamento com uso de miniclampes metálicos específicos (Bulldog®, Harvard Apparatus, MA, EUA) por um período de 45 minutos e a reperfusão se deu pela retirada do miniclampe por 120 minutos.
Os animais foram ventilados (Harvard Ventilator, Harvard Apparatus, EUA) com ar ambiente na frequência respiratória de 60-70 ciclos por minuto e volume corrente de 5 mL/kg.
Eutanásia
de solução alta dose anestésica para eutanásia. Imediatamente após a eutanásia retiramos o lobo médio do fígado para análise histológica.
Análise Histológica
Os fragmentos do fígado de cada animal foram convenientemente fixados em formaldeído a 10% tamponado (tampão fosfato) por 8 horas e depois desidratados em concentrações crescentes de álcool etílico, diafanizados pelo xilol e impregnados pela parafina líquida em estufa, regulada à temperatura de 59ºC, segundo a metodologia preconizada para inclusão em parafina. O material foi incluído em parafina e os blocos cortados em micrótomo do tipo Minot (Accu-Cut®, SaKura), ajustado para 4 µm. Alguns cortes assim obtidos foram colocados em lâminas previamente untadas com albumina de Mayer e mantidos em estufa regulada à temperatura de 37 ºC, durante 24 horas, para secagem e colagem. Uma lâmina de cada animal foi então submetida ao método de coloração pela hematoxilina e eosina (H.E) para análise morfológica. Na análise morfológica foi utilizado microscópio de luz, da marca Carl Zeiss, com objetivas variando de 4 a 400 X para caracterização e descrição de cada corte histológico, sendo as imagens apresentadas em 20 µm.
Análise Estatística
Os resultados foram expressos por análise descritiva histopatológica por um patologista que não sabia a que grupo cada lâmina pertencia. Utilizamos para a apresentação dos resultados uma lâmina por grupo escolhida aleatoriamente.
6. RESULTADOS
O Grupo I não demonstrou alterações marcantes, por outro lado os animais do Grupo II apresentaram áreas com vacuolização do citoplasma e infiltrado de leucócitos polimorfonucleares, os animais do Grupo III apresentaram evidente redução destes sinais.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Conforme a análise histológica pode-se observar uma lesão considerável no fígado por IR intestinal, o que demonstra a lesão em órgão distante e, que o uso do atenolol levou a uma importante citoproteção hepática apontando para mais pesquisas na área.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
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