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JAVIER ERICK LOBATÓN VILLA
AVALIAÇÃO DE CONSTITUINTES INORGÂNICOS EM CHOCOLATES COMERCIALIZADOS NO BRASIL
CAMPINAS 2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
JAVIER ERICK LOBATÓN VILLA
AVALIAÇÃO DE CONSTITUINTES INORGÂNICOS EM CHOCOLATES COMERCIALIZADOS NO BRASIL
ORIENTADOR: PROFa DRa SOLANGE CADORE
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM QUÍMICA NA ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR JAVIER ERICK LOBATÓN VILLA, E ORIENTADA PELA PROFa DRa SOLANGE CADORE.
_______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2015
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Dedico esta dissertação a minha mãe, Edith.
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“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.” (Arthur Schopenhauer)
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AGRADECIMENTOS
À professora Solange Cadore pela oportunidade, acolhimento e apoio; Aos amigos e colegas do GEAtom (Grupo de Espectrometria Atômica), pelo companheirismo no laboratório e pelos conhecimentos compartilhados, Rafaella, Catarinie, Manu, Beatriz, Lívia, Mirla, Ricardo, Mario, Rafael, Thiago;
Ao Davi e ao Diego, técnicos dos laboratórios, pela ajuda;
Aos professores Jarbas e Bertran pelas ótimas sugestões e os conhecimentos compartilhados;
Ao Instituto de Química, pela infraestrutura e facilidades para a realização deste trabalho;
E a todos os amigos e familiares que contribuíram de alguma forma com o desenvolvimento deste trabalho.
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SÚMULA CURRICULAR Javier Erick Lobatón Villa Peruano, natural de Lima
Formação Acadêmica
2006-2011: Bacharelado em Química – Facultad de Ciencias – Universidad Nacional de Ingeniería - Lima - Peru
Atividades Acadêmicas
2010-2011: Iniciação Científica - “Síntese e caracterização de nanopartículas de
quitosana”. Orientador: Prof. Me. Christian Jacinto.
2011-2012: Iniciação Científica - “Remoção de As (V) em aguas naturais
empregando quitosana”. Orientador: Prof. Dr. Adolfo la Rosa.
Trabalhos apresentados em congressos
1. “Cadmium, lead and their relationship with the cocoa content in chocolate bars
commercialized in Brazil”. Javier E. L. Villa, Rafaella R. A. Peixoto, Solange
Cadore. 13th Rio Symposium on Atomic Spectrometry, Yucatán, México, 2014.
2. “Rapid acid extraction for multielemental determinations in chocolate bars”. Javier E. L. Villa, Catarinie D. Pereira, Solange Cadore. European Winter Conference on Plasma Spectrochemistry, Münster, Alemanha, 2015.
Publicações
1. Villa J. E. L., Peixoto R. R. A., Cadore S. Cadmium and lead in chocolates commercialized in Brazil. J. Agric. Food Chem. 62, 2014, 8759-8763.
2. Villa J. E. L., Pereira D. C., Cadore S. A novel, rapid and simple acid extraction for multielemental determination in chocolate bars. Microchem. J., aceito para publicação.
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RESUMO
AVALIAÇÃO DE CONSTITUINTES INORGÂNICOS EM CHOCOLATES COMERCIALIZADOS NO BRASIL
Este trabalho descreve o desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação de constituintes inorgânicos, com ênfase no cádmio e no chumbo, em amostras de chocolate comercializadas no Brasil. A determinação de Cd e Pb foi feita utilizando Espectrometria de Absorção Atômica com Forno de Grafite (GF AAS) e de Al, Ba, Ca, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P e Zn por Espectrometria de Emissão Óptica com Plasma Indutivamente Acoplado (ICP OES) após mineralização ácida assistida por micro-ondas. Para isso, foram avaliadas a concentração de ácido nítrico, as condições instrumentais e o uso de modificador químico (para GF AAS). Os métodos otimizados foram aplicados para a determinação desses elementos em 27 amostras de chocolate de diferentes tipos e marcas, compradas no comércio local de Campinas-SP. Os resultados mostraram que os chocolates amargos apresentaram as concentrações mais altas para a maioria dos elementos determinados, com exceção de Na e Ca, encontrados em maiores concentrações nos chocolates brancos. Além disso, uma correlação linear foi observada entre as concentrações de Cd e Pb e o teor de cacau.
Um procedimento de preparo de amostra alternativo, baseado em uma extração ácida, foi estudado para a determinação de Cd por GF AAS e de Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P e Zn por ICP OES. Para isso, foram estudados em forma multivariada os parâmetros temperatura, tempo e concentração de ácido nítrico. Nas condições otimizadas, 6 min de extração, 100 °C e 20 mL de 1.4 mol L-1 HNO3 foram
selecionadas. A exatidão para a determinação de elementos por ICP OES foi avaliada analisando o material de referência certificado de chocolate, onde não houve diferença significativa entre as concentrações obtidas e as certificadas (test t-Student com 95% de confiança). Para a avaliação da exatidão na determinação de Cd por GFAAS foram feitos ensaios de adição de analito, com recuperações entre 96-102%. Além disso, não houve diferença significativa entre os resultados obtidos pelo método proposto e os obtidos empregando mineralização ácida assistida por micro-ondas.
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ABSTRACT
EVALUATION OF INORGANIC CONSTITUENTS IN CHOCOLATES COMMERCIALIZED IN BRAZIL
This work describes the development of analytical methods for the determination of inorganic constituents, with emphasis on cadmium and lead, in chocolate bars commercialized in Brazil. The determination of Cd and Pb was performed by Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry (GF AAS), and Al, Ba, Ca, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P e Zn by Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP OES) after microwave-assisted acid digestion. Nitric acid concentration, instrumental condition, and chemical modifiers (for GF AAS) were evaluated. The optimized methods were applied to determine these elements in twenty-seven chocolate samples from different types and brands, purchased in local market of Campinas-SP. The results showed that dark chocolates have higher concentrations for the majority of the studied elements, except for Ca and Na, found in higher concentrations in white chocolates. In addition, a linear correlation between cocoa content and Cd and Pb concentrations was observed.
An alternative sample preparation, based on acid extraction, was studied for the determination of Cd by GF AAS and Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P e Zn by ICP OES. Temperature, time and nitric acid concentration were studied in multivariate form. In the optimized conditions 100 °C, 20 mL of 1.4 mol L-1 HNO3 and 6 min of extraction
were selected. Accuracy was evaluated by analyzing a certified reference material for the elements determined by ICP OES and there was no significant difference between found and certified concentrations (test t-Student at 95% of confidence level). For the determination of Cd by GFAAS the accuracy was evaluated by addition and recovery studies, with recoveries between 96-102%. In addition, there was no significant difference between concentrations obtained by proposed method and those obtained by microwave-assisted acid digestion.
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SUMARIO
LISTA DE ABREVIATURAS ... XIV
LISTA DE TABELAS ... XV
LISTA DE FIGURAS ... XVIII
1
INTRODUÇÃO ... 1
1.1 O cacau e o chocolate ... 1
1.2 Processamento do cacau ... 2
1.3 Processo de produção do chocolate ... 5
1.3.1 Tipos de chocolate ... 7
1.4 Composição do cacau, chocolate e efeitos na saúde ... 8
1.4.1 Chumbo ... 9
1.4.2 Cádmio ... 10
1.5 Determinação de constituintes inorgânicos em chocolates... 11
1.5.1 Técnicas empregadas ... 11
1.5.2 Métodos de preparo de amostra ... 12
2
OBJETIVOS ...14
2.1 Objetivo Geral ... 14
2.2 Objetivos Específicos ... 14
3
PARTE EXPERIMENTAL ...15
3.1 Instrumentação ... 15
3.2 Reagentes, padrões e materiais de referência certificados ... 17
3.3 Amostras ... 17
3.4 Preparo de amostras ... 18
xiii
3.4.2 Preparo de amostra por extração ácida ... 19
3.5 Desenvolvimento de métodos analíticos ... 21
3.5.1 Determinação de Cd and Pb por GF AAS ... 21
3.5.2 Determinação de constituintes inorgânicos por ICP OES ... 21
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO ...23
4.1 Estudo da mineralização ácida assistida por micro-ondas... 23
4.1.1 Acidez residual e determinação de carbono orgânico total ... 23
4.1.2 Análise de ressonância magnética nuclear ... 25
4.2 Determinação de Cd e Pb por GF AAS ... 26
4.2.1 Determinação de Cd por GF AAS... 26
4.2.2 4.2.2 Determinação de Pb por GF AAS ... 31
4.2.3 Aplicação analítica ... 35
4.3 Determinações de constituintes inorgânicos por ICP OES ... 37
4.3.1 Otimização das condições instrumentais ... 37
4.3.2 Parâmetros de desempenho ... 38
4.3.3 Aplicação analítica ... 40
4.4 Estudo de preparo de amostra por extração ácida ... 46
4.4.1 Estudo multivariado da extração... 46
4.4.2 Determinação de Cd após extração ácida ... 51
4.4.3 Comparação com outros métodos de preparo de amostra ... 54
5
CONCLUSÕES...57
6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...59
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
AAS: do inglês, Atomic Absorption Spectrometry (Espectrometria de absorção atômica);
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária;
BEC: do inglês, Background Equivalent Concentration (Concentração equivalente ao sinal de fundo);
FAAS: do inglês, Flame Atomic Absorption Spectrometry (Espectrometria de absorção atômica com chama);
FAO: do inglês, Food and Agriculture Organization; FDA: do inglês, Food and Drug Administration;
GF AAS: do inglês, Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry (Espectrometria de absorção atômica com forno de grafite);
ICP: do inglês, Inductively Coupled Plasma (Plasma acoplado indutivamente); ICP OES: do inglês, Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (Espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente);
LOD: do inglês, Limit of Detection (Limite de detecção);
LOQ: do inglês, Limit of Quantification (Limite de quantificação); NIST: do inglês, National Institute of Standards and Technology; NMR: do inglês, Nuclear Magnetic Resonance;
RSD: do inglês, Relative Standard Desviation (Desvio padrão relativo);
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Temperaturas de fusão das formas polimórficas da manteiga de cacau [4]. ... 7 Tabela 2. Composição dos três tipos de chocolate (%) [4]. ... 9 Tabela 3. Programas de aquecimento otimizados no forno de grafite para a determinação de Cd e Pb por GF AAS após mineralização ácida assistida por micro-ondas. ... 16 Tabela 4. Condições experimentais otimizadas utilizadas para a determinação de constituintes inorgânicos por ICP OES. ... 16 Tabela 5. Amostras de chocolate de diferentes marcas e tipos. ... 18 Tabela 6. Programa de aquecimento utilizado no forno micro-ondas para o tratamento das amostras de chocolate. ... 18 Tabela 7. Fatores e níveis para o planejamento 23 com ponto central. ... 20 Tabela 8. Temperaturas de pirólise e de atomização para Cd com diferentes modificadores químicos. ... 29 Tabela 9. Determinação de Cd nos materiais de referência certificados (n=3). .... 30 Tabela 10. Resultados dos ensaios de adição e recuperação (%± s) para o Cd nos três tipos de chocolate (n=3). ... 30 Tabela 11. Parâmetros de desempenho para o método analítico para a determinação de Cd em chocolates por GF AAS. ... 31 Tabela 12. Temperaturas de pirólise e de atomização para Pb com diferentes modificadores químicos. ... 33 Tabela 13. Determinação de Pb nos materiais de referência certificados (n=3). .. 34
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Tabela 14. Resultados dos ensaios de adição e recuperação (%± s) para o Pb nos três tipos de chocolate (n=3). ... 34 Tabela 15. Parâmetros de desempenho do método analítico para a determinação de Pb em chocolates por GF AAS. ... 35 Tabela 16. Concentrações determinadas (µg kg-1 ± s) de Cd e Pb em 27 amostras de chocolates (n=3). ... 35 Tabela 17. Determinação de constituintes inorgânicos no material de referência certificado Baking chocolate (n=3). ... 39 Tabela 18. Ensaios de adição e recuperação para os elementos com concentração não declarada no material de referência (n=3). ... 39 Tabela 19. Limites de detecção e de quantificação para a determinação de constituintes inorgânicos em amostras de chocolate. ... 40 Tabela 20. Concentrações encontradas (mg kg-1 ± s) de constituintes inorgânicos em chocolates (n=3). ... 41 Tabela 21. Mediana e faixa de concentrações (mg kg-1) dos constituintes inorgânicos em amostras de chocolate branco (7), ao leite (9) e amargo (11). .... 45 Tabela 22. Resposta global (RG) para diferentes condições de extração do planejamento experimental 23. ... 47 Tabela 23. Concentrações obtidas (mg kg-1) analisando o material de referência
Baking chocolate por extração ácida. ... 50
Tabela 24. Limites de detecção e quantificação (mg kg-1) do procedimento proposto. ... 51 Tabela 25. Resultados dos ensaios de adição e recuperação (% ± s) para o Cd nos três tipos de chocolate (n=3) após extração ácida. ... 52
xvii
Tabela 26. Concentrações (µg kg-1) de cádmio em amostras de chocolate determinadas por extração ácida e por mineralização (n=3). ... 54 Tabela 27. Métodos alternativos de preparo de amostras de chocolate propostos na literatura. ... 56
xviii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Partes do cacau (adaptado de [7]). ... 2
Figura 2. Fermentação e secagem do cacau (adaptado de [10]). ... 3
Figura 3. Esquema do processo de produção do chocolate (adaptado de [4]). ... 5
Figura 4. Ingredientes básicos adicionados nos três tipos de chocolate. ... 8
Figura 5. Procedimento experimental para a extração ácida... 20
Figura 6. Porcentagem de carbono residual (RCC) para os três tipos de chocolate utilizando diferentes concentrações de ácido nítrico na etapa de mineralização das amostras... 24
Figura 7. Espectros de 1H RMN para os três tipos de amostra, mineralizadas com a maior (12 mol L-1) e a menor (6 mol L-1) concentração de ácido nítrico. ... 25
Figura 8. Curvas de pirólise e de atomização (A) sem modificador químico, (B) com 10 μg de NH4H2PO4, (C) com 3 μg de Mg(NO3)2 + 50 μg NH4H2PO4, (D) com 3 μg de Mg(NO3)2 + 5 μg Pd como modificador químico. ... 27
Figura 9. Perfis dos picos obtidos para Cd com diferentes temperaturas de pirólise (temperatura de atomização fixada em 1500°C) e diferentes temperaturas de atomização (temperatura de pirólise fixada em 600°C) para o modificador químico, preparado com 3 μg de Mg(NO3)2 + 50 μg NH4H2PO4. ... 28
Figura 10. Perfil dos picos e sinais de fundo para Cd, obtidas para uma amostra de chocolate amargo utilizando os modificadores C e D. ... 29
Figura 11. Curvas de pirólise e de atomização (A) Sem modificador químico, (B) com 10 μg de NH4H2PO4, (C) com 3 μg de Mg(NO3)2 + 50 μg NH4H2PO4, (D) com 3 μg de Mg(NO3)2 + 5 μg Pd como modificador para o Pb. ... 32
xix
Figura 12. Perfis dos picos obtidos para Pb com diferentes temperaturas de pirólise (temperatura de atomização fixada em 1600°C) e diferentes temperaturas de atomização (temperatura de pirólise fixada em 850°C) para o modificador químico C (3 μg de Mg(NO3)2 + 50 μg NH4H2PO4). ... 33 Figura 13. Correlação entre o conteúdo de cacau e as concentrações de cádmio e chumbo. ... 37 Figura 14. Variação das intensidades e do SBR com a potência do plasma e com a vazão de nebulização (monitorando a linha 257,610 nm do Mn). ... 38 Figura 15. Gráfico de Pareto para a resposta global (RG) do planejamento experimental 23 usado para o método de extração de metais em amostras de chocolate. ... 48 Figura 16. Curvas de nível para a resposta global (RG) com a variação da temperatura e da concentração de ácido nítrico. ... 49 Figura 17. Curvas de pirólise e de atomização para uma solução-padrão de Cd, e para uma amostra obtida após procedimentos de mineralização e de extração, empregando uma mistura de 3 µg Mg +5 µg Pd como modificador químico. ... 52 Figura 18. Correlação das concentrações obtidas empregando dois procedimentos de preparo de amostra (mineralização e extração ácida). ... 53
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 O cacau e o chocolate
O cacau é o fruto da árvore tropical Theobroma Cacao L., nativa da América do Sul e cujo cultivo foi estendido, inicialmente, até o sul do México e, posteriormente, a muitos outros países ao redor do mundo. Historicamente, os Maias utilizaram o cacau como alimento e os Astecas fizeram uma bebida baseada nesse fruto, no entanto, foram os espanhóis que popularizaram seu consumo no mundo inteiro com algumas modificações no preparo [1,2].
Existem principalmente três tipos de cacau: Criollo, Forastero e Trinitário. O Criollo é a variedade com a melhor qualidade, no entanto, é mais sensível às condições climáticas e mais facilmente atacado por doenças e pestes do que o Forastero. Apesar de ter uma qualidade inferior quanto às propriedades organolépticas, aproximadamente 95% da produção de cacau no mundo são do tipo Forastero, devido a sua resistência às doenças e a sua produtividade. O Trinitário é o tipo de cacau que possui características do Criollo e do Forastero, e representa aproximadamente 3% da produção total [1].
Atualmente, o maior produtor de cacau é a Costa do Marfim, na África, com aproximadamente 37% da produção mundial. Entretanto, a América produz 16%, sendo o Brasil e o Equador os maiores produtores desse fruto no continente [3].
O cacau passa por vários processos para a obtenção de produtos derivados como achocolatados, o chocolate em pó e os chocolates. Dentre esses produtos, o chocolate é o mais consumido ao redor do mundo, devido ao seu sabor, textura e sensação de bem-estar após a ingestão [1].
O chocolate pode ser definido como uma suspensão de partículas de cacau e açúcar dispersas em uma fase oleosa contínua [4] e, segundo a legislação brasileira, um chocolate deve conter pelo menos 25% de licor de cacau ou 20% de manteiga de cacau [5].
2
1.2 Processamento do cacau
Para que o cacau adquira seu sabor e aroma característico, deve passar pelo processo de fermentação e secagem para, posteriormente, ser utilizado na produção dos seus derivados. Na Figura 1 podem ser observadas as principais partes desse fruto.
Figura 1. Partes do cacau (adaptado de [7]).
As sementes de cacau (com a polpa branca ao redor) são retiradas da vagem e a fermentação acontece naturalmente em um processo exotérmico onde os açúcares são transformados em álcool e ácido acético, compostos que penetram no fruto, matando os germes e quebrando as paredes celulares das sementes. O tempo de fermentação não está bem definido e varia dependendo do critério do agricultor, demorando normalmente entre 2 e 8 dias [1,8].
A fermentação cessa com a secagem, que pode ser feita naturalmente (à luz do sol) ou mecanicamente, sendo a secagem à luz do sol a mais comum devido ao baixo custo e porque minimiza o risco de contaminação das sementes. O tempo de secagem depende do clima e pode demorar desde 1 até 4 semanas [1,9]. Na Figura 2 são mostrados os procedimentos de fermentação e de secagem do cacau.
3
Figura 2. Fermentação e secagem do cacau (adaptado de [10]).
Depois de finalizadas as etapas de fermentação e secagem, o cacau é comumente exportado para os países mais industrializados como os Estados Unidos e Japão, além de outros países da Europa. Em 2007, por exemplo, os três maiores consumidores per capita de chocolate no mundo foram a Suíça, a Áustria e a Noruega, com um consumo anual de aproximadamente 10, 9,4 e 8,5 kg por pessoa, respectivamente [6].
Para obter os produtos derivados após a secagem, o cacau é normalmente submetido aos seguintes procedimentos: Limpeza, quebra e peneiramento; Esterilização; Alcalinização; Torragem; Moagem dos nibs e tratamento do licor de cacau.
As sementes de cacau passam através de procedimentos de limpeza, quebra e peneiramento para obter os nibs de cacau (pedaços do cacau descascado, do inglês cocoa nibs), garantindo que estejam limpos, bem quebrados e apropriadamente descascados.
A limpeza das sementes é feita com o objetivo de retirar materiais estranhos, tais como pedaços de madeira ou partículas de solo. As sementes limpas são quebradas para separar a casca dos nibs de cacau (a quebra também pode ser feita após a torragem) envolvendo várias etapas. As frações obtidas são transportadas à cabine de peneiramento, onde as cascas mais leves são removidas empregando uma corrente de ar [6,11,12].
4
A esterilização é a exposição das sementes ou nibs de cacau a temperaturas suficientemente altas para destruir os micro-organismos que poderiam ter contaminado as sementes durante a coleta, fermentação ou transporte. Dependendo da fábrica e do equipamento empregado, esse procedimento pode ser feito antes ou depois do processo de torragem [6,11].
A alcalinização foi introduzida pela primeira vez pelo holandês Coenraad van Houten, em 1928, e por causa disso é também chamado de processo holandês. Este processo consiste em tratar as sementes de cacau com uma solução alcalina, aumentando o pH das sementes ou nibs desde 5,2-5,6 até perto da neutralidade, dependendo da solução empregada. A alcalinização tem por objetivo a modificação da cor e do sabor do cacau em pó e do licor de cacau (também conhecido como massa de cacau), bem como melhorar a facilidade de dispersão ou suspensão de sólidos de cacau na água [6,11].
A torragem das sementes de cacau contribui para o desenvolvimento do sabor que existe na forma de precursores formados nas etapas de fermentação e secagem. Durante este processo, acontecem várias mudanças físicas e químicas tais como perda da casca, perda de umidade, escurecimento dos nibs de cacau, redução adicional do número de micro-organismos, degradação de aminoácidos, perda de ácidos voláteis, etc. Essas mudanças vão depender principalmente do tempo e da temperatura da torragem, sendo que temperaturas entre 90 e 170 °C e tempos entre 0,5 e 2 horas são comumente empregados [6,11,13].
A torragem pode ser feita diretamente nas sementes ou nos nibs de cacau, sendo a torragem das sementes a forma tradicional de produzir o licor de cacau uma vez que a torragem dos nibs de cacau é feita após o peneiramento e não há uma boa separação prévia da casca. A torragem das sementes é feita antes do peneiramento, facilitando a remoção da casca das sementes que são quebradas pela colisão contra pratos metálicos [6].
A moagem dos nibs é feita com o objetivo de obter licor de cacau. A viscosidade desejada é a mais baixa possível para manter uma textura adequada do chocolate e para o posterior uso do licor de cacau. Durante esse processo, a moagem e o aquecimento dos nibs promovem a fusão e a liberação da manteiga de cacau (gordura associada às sementes de cacau), formando o licor de cacau com um tamanho de partícula acima de 30 µm.
5
A manteiga de cacau representa aproximadamente 55% da massa dos nibs de cacau e pode ser parcialmente removida (para seu posterior uso) do
licor de cacau por pressão, empregando prensas hidráulicas e pressões
elevadas. Dependendo do tempo e das configurações da prensa, o bolo resultante pode ter um teor de gordura entre 10 e 24% [6,11].
1.3 Processo de produção do chocolate
O processo de produção do chocolate envolve basicamente quatro etapas, esquematizadas na Figura 3 e descritas a seguir.
Figura 3. Esquema do processo de produção do chocolate (adaptado de [4]).
A. Mistura
Os ingredientes para a fabricação do chocolate são misturados em uma operação fundamental onde são controlados o tempo e a temperatura para obter a consistência desejada. Nesta etapa são misturados o licor de cacau, a manteiga de cacau, o açúcar, a gordura do leite e o leite (dependendo do tipo de produto) por um tempo entre 12 e 15 min, em uma temperatura entre 40 e 50 °C [6,13].
6 B. Refino
Este é um processo-chave para a obtenção da textura desejável do chocolate, pois o tamanho de partícula afeta criticamente as propriedades reológicas e sensoriais do produto. A mistura dos ingredientes é refinada para diminuir o tamanho de partícula até alcançar um tamanho menor que 30 µm, empregando de 2 até 5 rolos refinadores.
Os chocolates ao leite apresentam uma distribuição de partículas bimodal, com uma pequena proporção de partículas com um tamanho acima de 65 µm. Para o chocolate amargo, o tamanho de partícula ótimo é menor que 35 µm, sendo esse valor influenciado pelo tipo de produto e a composição. O refino não só diminui o tamanho de partícula, mas distribui as partículas na fase contínua recobrindo-as com lipídios [6,13].
C. Conchagem
A conchagem é também um processo essencial que contribui para o desenvolvimento da viscosidade, textura e sabor. É feita agitando o chocolate a uma temperatura maior do que 50 °C por algumas horas. Durante o processo a umidade é reduzida, os compostos voláteis não desejados (tal como o ácido acético) são removidos e são promovidas as interações entre a fase contínua e a dispersa. Além disso, esse processo reduz a viscosidade e contribui para a redução do tamanho de partícula. Para obter um chocolate com a viscosidade adequada, podem ser adicionadas manteiga de cacau e lecitina extra no final da conchagem, ou liquidificar o chocolate antes da etapa de temperagem [6,12,13].
D. Temperagem
A manteiga do cacau pode cristalizar em seis formas polimórficas diferentes, dependendo da composição de triglicerídeos, afetando a forma em que a fase oleosa vai ser solidificada. Na Tabela 1 são mostradas as temperaturas de fusão dessas seis formas polimórficas.
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Tabela 1. Temperaturas de fusão das formas polimórficas da manteiga de cacau [4]. Forma polimórfica da manteiga de cacau Temperatura de fusão (°C) Forma I (β’2) 16-18 Forma II (α) 21-22
Forma III (mistura) 25,5
Forma IV (β1) 27-29
Forma V (β2) 34-35
Forma VI (β’1) 36
Dentre as seis formas polimórficas (I-VI), as principais são α, β e β’. A forma V é a forma desejável e pode ser obtida em um chocolate bem temperado, dando-lhe uma aparência brilhante e boa resistência. Quando o chocolate não é bem temperado, a forma IV é obtida, e apesar dessa forma ser espontaneamente transformada na forma V, pode diminuir a qualidade do chocolate.
A temperagem envolve a mudança de temperatura desde a fusão do chocolate (50 °C), esfriamento até o ponto de cristalização (32 °C), cristalização (27 °C) e transformação de qualquer cristal instável (29-31 °C). Um chocolate bem temperado apresenta as seguintes propriedades: boa forma, cor, contração, brilho, resistência ao calor e maior tempo de vida útil [4].
1.3.1 Tipos de chocolate
Como mostrado na Figura 4, os chocolates podem ser classificados basicamente como branco, ao leite e amargo. A classificação dos chocolates depende, principalmente, das quantidades de massa de cacau, manteiga de cacau e leite, adicionadas no processo de produção. Dentre os três tipos de chocolate, o amargo possui o maior teor de licor de cacau e a menor quantidade de manteiga de cacau. Por outro lado, o chocolate branco e o chocolate ao leite possuem maiores teores de leite e de manteiga de cacau do que o chocolate amargo, sendo as suas composições parecidas, porém, o licor de cacau não é adicionado na produção do chocolate branco [4,14].
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Figura 4. Ingredientes básicos adicionados nos três tipos de chocolate.
1.4 Composição do cacau, chocolate e efeitos na saúde
A composição das sementes de cacau é complexa e varia dependendo da origem e dos processos a que são submetidas. O principal componente das sementes de cacau são os lipídios, que representam aproximadamente 50 % da massa, e são em sua maioria neutros. As proteínas, por outro lado, constituem entre 10 e 15% da massa das sementes de cacau e são o segundo constituinte em maior quantidade [1,15].
No cacau também podem ser encontrados polifenóis, que são usados como mecanismo de defesa da planta para se proteger dos predadores e são os responsáveis pelo seu sabor amargo. Durante a fermentação, a porcentagem de polifenóis aumenta desde 2 até 6% aproximadamente [1].
Como o cacau é o principal ingrediente na produção do chocolate, muitos dos compostos presentes neste fruto também podem estar presentes nos produtos após o processamento. A Tabela 2 mostra a composição aproximada dos três tipos de chocolate.
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Tabela 2. Composição dos três tipos de chocolate (%) [4].
Chocolate Carboidratos Lipídios Proteínas
Amargo 63,5 28,0 5,0
Ao leite 56,9 30,7 7,7
Branco 58,3 30,9 8,0
Apesar dos níveis de açúcar e de gordura relativamente altos presentes nos chocolates, alguns artigos publicados sugerem que a ingestão de chocolate (especialmente o chocolate amargo) e de outros produtos derivados do cacau pode beneficiar a saúde, contribuindo para a redução do risco de câncer, doenças cardiovasculares e hipertensão. Vários desses benefícios são atribuídos à presença dos polifenóis provenientes do cacau [16-21]. No chocolate também podem ser encontradas substâncias estimulantes, tais como a feniletilamina e o triptofano, com a capacidade de afetar o sistema nervoso central pela produção de serotonina, promovendo a sensação de bem-estar após o consumo [1].
Peixoto et al. [22], Pedro et al. [23] e Ieggli et al. [24] estudaram a composição inorgânica de achocolatados, bebidas com sabor de chocolate e chocolates, respectivamente, e mostraram que esses produtos podem ser uma boa fonte de nutrientes essenciais como sódio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio, zinco e ferro. No entanto, há evidência experimental da presença de alguns elementos potencialmente tóxicos ao ser humano no cacau e no chocolate [25-27].
Dentre os elementos potencialmente tóxicos encontrados em chocolates, destacam-se o cádmio e o chumbo. Dahiya et al. [28] e Jalbani et al. [29] determinaram as concentrações desses elementos em chocolates comercializados na Índia e no Paquistão, respectivamente, e concluíram que os chocolates amargos podem representar uma fonte importante desses elementos na dieta, especialmente em crianças.
1.4.1 Chumbo
O chumbo (Pb) é um elemento encontrado naturalmente no meio ambiente, tendo sido explorado por muitos anos e empregado em produtos como tintas, gasolina, tubos, solda, cristais e cerâmica. Como resultado de
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todas essas atividades houve um incremento na quantidade de chumbo no ambiente. Dentre as formas mais comuns de exposição, podem ser mencionadas: a ingestão de alimentos que contem chumbo proveniente do solo ou da água, a inalação de partículas de ar contaminadas e a ingestão de água, solo ou partículas contaminadas [30]. Esse elemento não possui função fisiológica conhecida no organismo e pode ser nocivo para o ser humano (especialmente em crianças), inclusive em níveis de traço.
Quando ingerido, o chumbo pode afetar o metabolismo do cálcio e outros nutrientes essenciais, competindo pelos sítios de ligação nos sistemas biológicos [31]. Nos adultos, o envenenamento por chumbo pode causar dor abdominal, hipertensão, dor de cabeça, incremento na pressão intracraniana, disfunção no sistema nervoso central, anemia e disfunção renal. Em crianças, os efeitos são mais severos e de longo prazo como, por exemplo, o atraso no crescimento, mudanças no comportamento, anemia, atraso na linguagem e, principalmente, no desenvolvimento neurológico [32-37].
Considerando esses efeitos negativos na saúde, no Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) estabeleceu o limite máximo permitido para chumbo de 200 µg kg-1 em chocolates com teores de cacau menores que 40% e de 400 µg kg-1 em chocolates com teores de cacau maiores que 40% [38].
1.4.2 Cádmio
O cádmio (Cd) pode ser encontrado na natureza em baixas concentrações, e está associado principalmente a minérios de chumbo, cobre e zinco. O Cd é empregado na indústria como estabilizador em produtos de PVC, ligas, nas baterias Cd-Ni e pode ser encontrado também como contaminante nos fertilizantes fosfatados. As fontes antrópicas e naturais de Cd podem provocar a contaminação do solo e, como o Cd é facilmente absorvido pelas plantas, aumenta os níveis de concentração desse elemento, especialmente nos frutos e verduras consumidos pelo ser humano [39].
O tabagismo é a maior fonte de exposição a este elemento, podendo aumentar entre 4 a 5 vezes a concentração de Cd no sangue quando
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comparada com uma pessoa não fumante. Em pessoas não fumantes, a maior exposição a esse elemento vem da ingestão dos alimentos [39].
A presença desse elemento no corpo humano pode provocar danos severos nos órgãos internos (especialmente no fígado e no rim) devido à sua acumulação, pudendo ficar retido por vários anos no rim e por meses no sangue. Além disso, o cádmio pode causar anemia, náuseas, vômito, dores abdominais, diarreia, entre outros efeitos [40,41].
O limite máximo permitido para o cádmio, também estabelecido pela ANVISA, é de 200 µg kg-1 para chocolates com teores de cacau menores que 40% e de 300 µg kg-1 para chocolates com teores de cacau maiores que 40% [38].
1.5 Determinação de constituintes inorgânicos em chocolates
O crescente interesse pela qualidade dos alimentos impulsionou numerosos trabalhos de pesquisa para a determinação de elementos essenciais e potencialmente tóxicos presentes nos mesmos, devido a seus diferentes efeitos biológicos nos seres vivos. Considerando que as crianças são grandes consumidoras de chocolates e que há um aumento no consumo de chocolate amargo no mundo inteiro, o desenvolvimento de métodos analíticos rápidos e eficientes, que permitam quantificar macro e micro constituintes inorgânicos desse produto é uma tarefa importante e, ao mesmo tempo, complexa, devido à natureza da matriz [1,6].
1.5.1 Técnicas empregadas
Dentre as técnicas analíticas comumente usadas para a determinação de nutrientes inorgânicos em chocolates encontram-se as técnicas baseadas na Espectrometria de Absorção Atômica (AAS) e em Plasma Acoplado Indutivamente (ICP) [24-29].
A espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (ICP OES) oferece a possibilidade da determinação rápida e multielementar de diversos elementos presentes em uma amostra em solução. Quando os átomos presentes na amostra são introduzidos no plasma (fonte de energia que alcança temperaturas entre 6000 e 10.000 K), eles absorvem energia. Os
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átomos e íons contidos no plasma são excitados e seus elétrons passam do estado fundamental para níveis superiores de energia. No entanto, o tempo de vida dos átomos excitados é curto e quando os elétrons retornam ao estado fundamental, emitem a energia absorvida na forma de fótons, gerando o espectro de emissão atômica com linhas características, onde a intensidade da emissão é proporcional à concentração do elemento na amostra [42]. Embora essa técnica analítica forneça limites de detecção relativamente baixos, não é possível determinar os teores de elementos traços, tais como Cd e Pb, presentes no chocolate.
Por outro lado, a Espectrometria de Absorção Atômica com Forno de Grafite (GF AAS) apresenta-se como uma técnica com sensibilidade e detectabilidade adequadas para a determinação dos elementos presentes em níveis de traços. Esta técnica é baseada na absorção de energia radiante por átomos neutros, não excitados, no estado gasoso, produzidos através do fornecimento de energia térmica, suficiente para dissociar os compostos químicos em átomos livres em um processo denominado atomização [42].
Alguns microlitros da amostra são injetados em um tubo de grafite juntamente com um modificador químico (compostos introduzidos para diminuir o efeito de matriz), para depois ser submetida a três etapas básicas de aquecimento: secagem da amostra, decomposição térmica da matriz (pirólise) e produção de átomos livres no estado vapor (atomização). O programa de aquecimento é cuidadosamente selecionado de acordo com o elemento a ser determinado e as medidas de absorbância são feitas durante a etapa de atomização, onde ocorre a formação da nuvem atômica do analito [42]. A espectrometria de absorção atômica com forno de grafite é, portanto, uma boa alternativa para a determinação de Cd e Pb em amostras de chocolate.
1.5.2 Métodos de preparo de amostra
Embora o desenvolvimento da instrumentação tenha possibilitado avanços em muitos aspectos, em muitos casos ainda não permite a análise de amostras na sua forma original (análise direta), pois elas podem conter interferentes ou serem incompatíveis com o equipamento analítico a ser utilizado. Nesse sentido, o preparo de amostra é uma etapa crítica dentro de
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um procedimento analítico e tem por objetivo a obtenção da espécie de interesse em um meio que permita a sua quantificação (comumente em solução). Para a escolha do método de preparo de amostra podem ser levados em consideração alguns critérios como, por exemplo, custo, quantidade de resíduos gerados, simplicidade, robustez, frequência analítica e aplicação multielementar [43].
Para analisar a composição inorgânica de amostras de chocolate, são comumente empregados tratamentos de amostra baseados na decomposição da matriz, como a digestão ácida convencional (calcinação e digestão úmida) e a digestão assistida por radiação micro-ondas [25-29,44]. No entanto, apesar de serem considerados eficientes, estes métodos normalmente empregam grandes quantidades de reagentes puros, geram resíduos perigosos e consomem muito tempo do procedimento analítico geral [45].
Alguns métodos de preparo de amostra alternativos, que não requerem decomposição da matriz, foram propostos para a determinação de macro e micro elementos em amostras de chocolate. Ieggli et al. [24,46] propuseram métodos baseados na formação de emulsões para a determinação de Na, K, Ca, Mn, Zn e Fe empregando F AAS e de Cu, Mn e Al utilizando GF AAS.
Apesar de serem métodos rápidos de preparo de amostra, pois não é necessária a sua decomposição, algumas limitações nestes tipos de métodos podem surgir devido à baixa estabilidade da emulsão, curvas analíticas de calibração em meio não aquoso, falta de homogeneidade, o uso de solventes orgânicos ou surfactantes, além das grandes quantidades de matéria orgânica. Devido a essas dificuldades, muitas das alternativas propostas são baseadas no desenvolvimento de métodos mais simples, empregando a mínima quantidade de reagentes, que permita a determinação rápida de constituintes inorgânicos em amostras complexas como o chocolate é um dos desafios da química analítica moderna.
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento, a validação e a aplicação de métodos analíticos para a determinação de constituintes inorgânicos, com ênfase no cádmio e no chumbo, em chocolates comercializados no Brasil empregando as técnicas de ICP OES e GF AAS.
2.2 Objetivos Específicos
Estudo do preparo de amostra empregando mineralização ácida assistida por micro-ondas, usando pequenos volumes de ácido nítrico.
Desenvolvimento de métodos para a determinação de Cd e Pb por GF AAS após mineralização ácida assistida por micro-ondas.
Avaliação dos teores de Cd e Pb e a sua correlação com o teor de cacau em chocolates comercializados no Brasil.
Desenvolvimento de um método para a determinação de Al, Ba, Ca, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P e Zn por ICP OES após mineralização ácida assistida por micro-ondas.
Estudo de um método de preparo de amostra alternativo, baseado em uma extração ácida, para a determinação de Cd por GF AAS e de Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P e Zn por ICP OES.
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3 PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Instrumentação
Para o tratamento das amostras foi utilizado um forno de micro-ondas modelo ETHOS 1600 (Milestone, Sorisole, Itália), equipado com frascos de Teflon fechados, de alta pressão, e sensores de temperatura e pressão.
Também foram empregados: um equipamento para determinar o conteúdo de carbono orgânico total das soluções mineralizadas (TOC-V CPN, Shimadzu, Kyoto, Japão), um equipamento para análise elementar nas amostras solidas (CHN, Perkin Elmer 2400) e um equipamento de ressonância magnética nuclear (Bruker Avance III), operando em 500 MHz e utilizando tetrametilsilano (Merck, Darmstadt, Alemanha) como padrão interno, com a finalidade de obter os espectros de 1H RMN das amostras após a sua mineralização.
As determinações de Cd e Pb foram feitas em um espectrômetro de absorção atômica com forno de grafite modelo AAnalyst 600 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) com corretor de fundo baseado no efeito Zeeman, equipado com auto-amostrador (modelo AS-800) e tubos de grafite pirolíticos com aquecimento transversal e plataforma de L’vov integrada. Argônio 99.999% (White Martins, São Paulo, Brasil) foi utilizado como gás de purga.
Para Cd, as medidas analíticas foram feitas em 228,8 nm usando uma lâmpada de descarga sem eletrodo, operando a 230 mA, como fonte de radiação. Para Pb, o comprimento de onda utilizado foi 283,3 nm e como fonte de radiação utilizou-se uma lâmpada de descarga sem eletrodo, operando a 440 mA.
A introdução das amostras e soluções no forno de grafite foram feitas utilizando-se 20 µL de amostra ou de solução-padrão do analito e 5 µL do modificador químico. Os sinais analíticos obtidos em GF AAS foram expressos como absorbância integrada (área do pico). Os programas de aquecimento empregados são descritos na Tabela 3.
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Tabela 3. Programas de aquecimento otimizados no forno de grafite para a determinação de
Cd e Pb por GF AAS após mineralização ácida assistida por micro-ondas.
Etapa Temperatura (°C) Tempo de rampa (s) Tempo de permanência (s) Vazão de Ar (mL min-1) Cd Pb Secagem 110 110 5 20 250 Secagem 130 130 15 30 250 Pirólise 700 850 10 20 250 Atomização 1500 1600 0 5 0 Limpeza 2450 2450 1 3 250
Para as determinações de Al, Ba, Ca, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P e Zn, foi usado um espectrômetro de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente, modelo OPTIMA 8300 (Perkin-Elmer). Argônio 99.996% (White Martins, São Paulo, Brasil) foi utilizado em todos os experimentos. O equipamento foi usado na configuração axial para a determinação de Al, Ba, Ca, Cr, Cu, Fe, Mg, Mn, P e Zn, e na configuração radial para K e Na. As condições instrumentais otimizadas são descritas na Tabela 4.
Tabela 4. Condições experimentais otimizadas utilizadas para a determinação de constituintes
inorgânicos por ICP OES.
Parâmetro Valor
Potência de RF (kW) 1,3
Fluxo de Nebulização (L min-1) 0,5 Fluxo do argônio auxiliar (L min-1) 1,5 Fluxo do argônio principal (L min-1) 15
Vazão de bombeamento (mL min-1) 1,0
Correção de fundo Tempo de integração (s) 2 pontos 1-5 Número de replicatas 3 Elementos (λ/nm)
Al(396,153), Ba(233,527), Ca(317,933), Cr(27,716), Cu(327,393), Fe(259,939), K(766,474), Mg(285,213), Mn(257,610),
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3.2 Reagentes, padrões e materiais de referência certificados
Água deionizada (resistividade 18,2 M cm) obtida com um sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA) e reagentes de grau analítico foram usados para preparar todas as soluções e padrões. Toda vidraria e frascos de polietileno foram lavados e deixados em banhos com ácido nítrico 10% v v-1, por 24 h, antes de serem usados. As soluções dos analitos foram preparadas, em balões aferidos, por diluição das soluções-padrão de 1000 ou 4000 mg L-1 (Merck, Darmstadt, Alemanha). Foram utilizados também ácido nítrico 65% v v -1
(Merck) e peróxido de hidrogênio 30% v v-1 (Merck).
A solução de paládio (10 g L-1) foi obtida da Perkin Elmer. O sal de nitrato de magnésio foi obtido da Merck, e a solução de trabalho (10 g L-1) foi preparada por diluição da quantidade adequada do sal em água ultrapura. Dihidrogenofosfato de amônio foi obtido da Fluka (Buch, Switzerland), e a solução de trabalho (100 g L-1) foi preparada diluindo uma quantidade adequada do sal em água ultrapura.
Quatro materiais de referência certificados (CRM), obtidos do Nacional
Institute of Standards and Technology (NIST, Gaithersburg, MD), foram usados
para avaliar a exatidão dos métodos: Baking chocolate (NIST 2384), Corn bran (NIST 8433), Wheat flour (NIST 1567a) e Whole milk powder (NIST 8435). A composição dos CRM analisados encontra-se descrita nos Apendices 1 a 4.
3.3 Amostras
Vinte e sete amostras de chocolate foram adquiridas no comércio local de Campinas-SP. Os tipos de amostra analisadas (de acordo com o rótulo) foram chocolate branco (7), ao leite (9) e amargo (11), designadas neste trabalho por CHB, CHL e CHA, respectivamente. A descrição das amostras analisadas é mostrada na Tabela 5.
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Tabela 5. Amostras de chocolate de diferentes marcas e tipos. Amostra Marca Conteúdo de
cacau (%) Amostra Marca
Conteúdo de cacau (%) CHB1 A n.i. CHL8 K 34 CHB2* B n.i. CHL9 K 41 CHB3 C n.i. CHA1 A 55 CHB4 D n.i. CHA2* B 60 CHB5 E n.i. CHA3 C 43 CHB6 F n.i. CHA4 E 53 CHB7 G n.i. CHA5 G 70 CHL1 A n.i. CHA6* I 75
CHL2* B n.i. CHA7 J n.i
CHL3 C n.i. CHA8 J 70
CHL4 D n.i CHA9 K 55
CHL5 E n.i. CHA10 K 70
CHL6 G n.i CHA11 K 85
CHL7 H n.i.
n.i.: não informado *chocolates importados
3.4 Preparo de amostras
3.4.1 Mineralização ácida assistida por micro-ondas
Para o estudo da mineralização ácida das amostras, 0,5 g de chocolate ou material de referência certificado foram pesados em frascos de Teflon e, em seguida, foram adicionados 6,5 mL de ácido nítrico em quatro diferentes concentrações: 12 (recomendado pelo fabricante), 9, 6 e 3 mol L-1 e 1,5 mL de peróxido de hidrogênio (30% v v-1). Depois disso, a amostra foi submetida a um programa de aquecimento, descrito na Tabela 6.
Tabela 6. Programa de aquecimento utilizado no forno micro-ondas para o tratamento das
amostras de chocolate. Tempo de rampa (min) Tempo de permanência (min) Temperatura (ºC) 3 3 80 3 4 140 8 16 200
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Após a mineralização, as amostras foram transferidas para balões volumétricos de 25 mL e o volume foi completado com água deionizada.
O teor de carbono orgânico total e a acidez residual foram determinados nas amostras mineralizadas. Para isso, 350 μL da amostra mineralizada foram transferidos para um balão volumétrico de 25 mL e seu volume foi completado com água deionizada. A acidez final foi avaliada empregando um procedimento de titulação volumétrica, onde as amostras mineralizadas foram tituladas com uma solução padronizada de NaOH (0,0989 mol L-1).
Para obter os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (1H RMN) das amostras mineralizadas foi necessário fazer uma extração em solvente orgânico. Para isso, adicionou-se uma mistura de 9 mL de éter etílico e 3 mL de clorofórmio à 6 mL de amostra mineralizada. Em seguida, separou-se a parte orgânica e esta passou por um processo de separou-secagem, o qual resultou em um sólido, que foi dissolvido em água deuterada para ser, posteriormente, analisado no equipamento de ressonância magnética nuclear.
3.4.2 Preparo de amostra por extração ácida
Além da mineralização ácida assistida por micro-ondas, um procedimento alternativo de preparo de amostra, baseado em uma extração ácida, foi estudado. Como mostrado na Figura 5, 0,3 g de amostra de chocolate ou material de referência certificado foram raspados (utilizando uma faca de cerâmica) e pesados em um béquer de 50 mL. A seguir, adicionou-se água (a uma determinada temperatura) e ácido nítrico 65% v v-1, submetendo-se a um período de agitação nessa temperatura constante. O conteúdo foi esfriado em banho de água para depois ser transferido a um tubo do tipo Falcon e completar o volume até 40 mL com água deionizada. Finalmente, a amostra foi filtrada (filtro de 45 μm, Merck) e analisada.
20
Figura 5. Procedimento experimental para a extração ácida.
O estudo dos parâmetros temperatura, volume de ácido nítrico e tempo de extração foram feitos em forma multivariada empregando um planejamento experimental 23 com ponto central. A matriz experimental é mostrada na Tabela 7
Tabela 7. Fatores e níveis para o planejamento 23 com ponto central.
Fatores Nível (-) Nível (0) Nível (+)
Tempo (min) 3 6 9
Temperatura (°C) 60 80 100
Concentração de HNO3 (mol L-1) 0,3 0,85 1,4
A avaliação dos resultados foi feita empregando uma resposta global (RG) [47,48], definida como:
n n 2 2 1 1 X MR X R ... X MR X R X MR X R RG , (1) onde21
MR(Xn): Maior porcentagem de recuperação para o analito n em todos os experimentos.
Para o tratamento estatístico dos resultados foi utilizado o programa Minitab 17.
3.5 Desenvolvimento de métodos analíticos
3.5.1
Determinação de Cd and Pb por GF AASNa otimização dos métodos analíticos para determinação de Cd e Pb por GF AAS foi avaliada a necessidade de uso de modificador químico. Para isso, a introdução da amostra no equipamento foi feita na ausência de modificador (A) e com três modificadores químicos diferentes: 10 μg NH4H2PO4 (B), 3 μg Mg + 50 μg NH4H2PO4 (C) e 3 μg Mg + 5 μg Pd (D).
As análises foram feitas usando a amostra CHA1 (chocolate amargo) e no caso do chumbo, a amostra foi enriquecida com 10 μg L-1
deste elemento. Assim, foram obtidas curvas de pirólise e de atomização para cada um dos modificadores (cada ponto foi medido em triplicata) e foram estabelecidas as temperaturas ideais para cada modificador químico.
Os limites de detecção e de quantificação foram calculados como 3s e 10s, respectivamente, onde s é a estimativa desvio padrão da concentração obtida medindo 10 vezes o branco das amostras [49]. A precisão foi calculada como o desvio padrão relativo de seis medidas da amostra CHA1 e a exatidão foi avaliada empregando três materiais de referência certificados (Corn Bran,
Whole Milk Powder e Wheat Flour) e por ensaios de adição e recuperação de
analito.
3.5.2 Determinação de constituintes inorgânicos por ICP OES
Os parâmetros estudados para as determinações por ICP OES foram a potência do plasma e a vazão de nebulização, visando obter a maior detectabilidade, expressa como intensidade de emissão e SBR (razão sinal analítico/sinal de fundo), monitorando a linha 257,610 nm do Mn, como recomendado pelo fabricante, utilizando a amostra mineralizada CHA1.
A exatidão foi avaliada empregando um material de referência certificado (Baking chocolate) e por ensaios de adição e recuperação. Os limites de
22
detecção e de quantificação foram calculados como 3xBECxRSD/100 e 10xBECxRSD/100, respectivamente, onde RSD é o desvio padrão relativo de dez medidas do branco e BEC é a concentração equivalente ao sinal de fundo (sinal médio do branco/sensibilidade da curva analítica) [50]. A precisão foi calculada como repetitividade, a qual foi obtida analisando seis vezes o material de referência certificado Baking chocolate.
23
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Estudo da mineralização ácida assistida por micro-ondas
O preparo de amostra é uma etapa crítica em muitos métodos analíticos de rotina para a determinação de elementos químicos em alimentos. Um preparo de amostra ideal deveria decompor totalmente a matéria orgânica presente na matriz usando a mínima quantidade de reagentes, minimizando custos e também a quantidade de resíduos gerados [51,52]. A possibilidade de redução do volume de reagentes é interessante devido não só à possibilidade de minimização da quantidade de resíduos gerados e redução nos custos, mas também pela obtenção de menores valores de branco e digeridos mais apropriados para a introdução em alguns equipamentos [43].
4.1.1 Acidez residual e determinação de carbono orgânico total
Nas condições estabelecidas para a mineralização das amostras, o ácido nítrico diluído reage com a matéria orgânica segundo a reação típica:
(CH2)n + HNO3 + calor CO2(g) + NO(g) + 2 H2O
As quantidades inicial e final de ácido apresentaram uma variação máxima de 30% (porcentagem de acidez final entre 70 e 90%, em todos os casos). Assim, não foram observadas mudanças significativas na acidez devido à regeneração do ácido nítrico na presença do oxigênio (obtido do ar e pela decomposição do peróxido de hidrogênio adicionado), como pode ser observado nas reações a seguir [43]:
2 NO(g) + O2(g) 2 NO2(g) 2 NO(g) + H2O(l) HNO3 + HNO2
2 HNO2 H2O + NO2(g) + NO(g)
A análise elementar para os três tipos de chocolate analisados neste trabalho mostrou que a porcentagem de carbono varia entre 56 e 61%.
24
Considerando esses valores, a massa de amostra, o volume da amostra mineralizada e as concentrações de carbono orgânico total nas amostras mineralizadas (entre 1500 e 5000 mg L-1 em todos os casos), foram calculadas as porcentagens de carbono residual (RCC) para os três tipos de chocolate após a mineralização.
Na Figura 6 são apresentados os resultados obtidos de RCC empregando diferentes concentrações de ácido nítrico para a mineralização de chocolate branco, ao leite e amargo. Alguns sólidos dissolvidos foram encontrados após a mineralização, quando foi usada a concentração 3 mol L-1 HNO3, razão pela qual os resultados não foram calculados nessa condição.
Branco Ao Leite Amargo
0 5 10 15 20 25 30 35 40 R C C ( %) Chocolate 12 mol L-1 9 mol L-1 6 mol L-1
Figura 6. Porcentagem de carbono residual (RCC) para os três tipos de chocolate utilizando
diferentes concentrações de ácido nítrico na etapa de mineralização das amostras.
Em geral, o comportamento observado foi semelhante para os três tipos de chocolate, pois a quantidade de carbono orgânico residual aumentou quando a concentração de ácido nítrico diminuiu. No entanto, observaram-se variações relativamente pequenas no RCC para o chocolate branco e ao leite (menor que 5%) quando foram empregadas diferentes concentrações de ácido nítrico na mineralização.
No caso do chocolate amargo, o RCC mostrou-se mais dependente da concentração de ácido nítrico e foi observada uma diferença de até 12%. Essa diferença pode ser explicada pela grande quantidade de macromoléculas
25
provenientes do cacau, precisando de maiores concentrações de ácido nítrico para a decomposição eficiente da matriz. Portanto, a escolha da mínima concentração de ácido nítrico necessária para a mineralização eficiente das amostras vai depender do tipo de chocolate analisado e, portanto, dos compostos presentes nas amostras mineralizadas, pois poderiam conter ainda compostos complexos que poderiam interferir nas análises.
4.1.2 Análise de ressonância magnética nuclear
Na Figura 7 são mostrados os espectros de RMN para os três tipos de chocolate estudados, na máxima (recomendada pelo fabricante) e na mínima concentração de ácido nítrico necessário para a mineralização completa das amostras. 8 7 6 5 4 3 2 1 0 8 7 6 5 4 3 2 1 0 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Chocolate ao Leite HNO3 12 mol L -1 HNO3 6 mol L-1 Chocolate Branco Chocolate Amargo Deslocamento Quimico (ppm)
Figura 7. Espectros de 1H RMN para os três tipos de amostra, mineralizadas com a maior (12 mol L-1) e a menor (6 mol L-1) concentração de ácido nítrico.
Através dos espectros de RMN foi possível concluir que os compostos presentes depois da mineralização, com a maior e a menor concentração de ácido nítrico, são basicamente compostos alifáticos (δ 0.5-3 ppm), uma vez que
26
não foi possível observar, para nenhuma das amostras estudadas, compostos aromáticos nos espectros das amostras mineralizadas. Além disso, os espectros mostram que os compostos remanescentes nas amostras mineralizadas são semelhantes, nos três tipos de chocolate.
Desta forma, após analisar os teores de carbono orgânico total e os espectros de RMN em conjunto, pode-se dizer que o uso de ácido nítrico 6 mol L-1 na mineralização apresenta-se como uma boa alternativa de preparo de amostra para a determinação de constituintes inorgânicos nos três tipos de chocolates estudados.
4.2 Determinação de Cd e Pb por GF AAS
4.2.1 Determinação de Cd por GF AAS
O uso de modificador químico e o comportamento do sinal analítico com a variação da temperatura foram avaliados. Para tal, foram feitas as curvas de pirólise e de atomização, mostradas na Figura 8, onde cada ponto foi obtido em triplicata e com um desvio padrão sempre menor do que 4%. É possível observar, como esperado [49], que a presença de modificador químico permite a utilização de maior temperatura de pirólise. Em um primeiro momento, considerando-se apenas os resultados obtidos para as curvas de pirólise, foi selecionada a mistura de 3 μg de Mg(NO3)2 + 50 μg NH4H2PO4.
27 300 400 500 1400 1600 1800 0.00 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15 400 500 600 700 800 1400 1600 1800 0.00 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15 400 600 800 1000 1400 1600 1800 0.00 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15 400 500 600 700 800 1400 1600 1800 0.00 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15 D C A b s o rb a n c ia In te g ra d a ( s ) Temperatura (°C) Pirólise (A) Atomização (A) A b s o rb a n c ia In te g ra d a ( s ) Temperatura (°C) Pirólise (B) Atomização (B) A b s o rb a n c ia In te g ra d a ( s ) Temperatura (°C) Pirólise (C) Atomização (C) B A b s o rb a n c ia In te g ra d a ( s ) Temperatura (°C) Pirólise (D) Atomização (D) A
Figura 8. Curvas de pirólise e de atomização (A) sem modificador químico, (B) com 10 μg de
NH4H2PO4, (C) com 3 μg de Mg(NO3)2 + 50 μg NH4H2PO4, (D) com 3 μg de Mg(NO3)2 + 5 μg
Pd como modificador químico.
As temperaturas de pirólise e de atomização foram selecionadas considerando-se o sinal analítico e também o perfil do pico analítico obtido. A Figura 9 mostra o comportamento no perfil do pico para diferentes temperaturas de pirólise e de atomização.
28 0 1 2 3 4 5 0.0 0.2 0.4 0.6 Ab sro b â n ci a Tempo (s) 500 °C 700 °C 900 °C 0 1 2 3 4 5 0.0 0.2 0.4 0.6 Ab so rb â n ci a Tempo (s) 1300 °C 1500 °C 1700 °C
Figura 9. Perfis dos picos obtidos para Cd com diferentes temperaturas de pirólise
(temperatura de atomização fixada em 1500°C) e diferentes temperaturas de atomização (temperatura de pirólise fixada em 600°C) para o modificador químico, preparado com 3 μg de
Mg(NO3)2 + 50 μg NH4H2PO4.
De acordo com a Figura 9, as temperaturas de pirólise mais baixas apresentaram um sinal analítico maior. Em relação ao perfil dos picos obtidos, as temperaturas mais baixas mostraram melhor comportamento, mas na temperatura de 500 oC os picos mostraram-se mais largos. Desta forma, considerando o perfil dos picos e os resultados obtidos para a etapa de pirólise (Figura 8) a temperatura de pirólise selecionada para o modificador químico C (3 μg de Mg(NO3)2 + 50 μg NH4H2PO4) foi de 600°C. Na etapa de atomização, maiores absorbâncias foram obtidas em temperaturas de atomização menores, porém, uma mudança no perfil do pico foi observada. A temperatura de atomização de 1300°C apresenta um sinal analítico maior, no entanto, o perfil do pico nesta temperatura fica mais largo quando comparado com uma temperatura de atomização maior. Assim, foi selecionada a temperatura de 1500°C para esse modificador, uma vez que apresentou um melhor perfil de pico sem mudar de forma significativa o sinal analítico.
De uma forma geral, todos os modificadores químicos estudados apresentaram um comportamento semelhante nas etapas de pirólise e de atomização, portanto, a escolha dessas temperaturas foi feita de forma análoga, e os resultados são mostrados na Tabela 8.
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Tabela 8. Temperaturas de pirólise e de atomização para Cd com diferentes modificadores
químicos.
Modificador Químico Temperatura de pirólise (ºC)
Temperatura de atomização (ºC)
Sem modificador (A) 350 1500
10 μg NH4H2PO4 (B) 600 1600
3 μg Mg(NO3)2 + 50 μg NH4H2PO4 (C)
700 1500
3 μg Mg(NO3)2 + 5 μg Pd (D) 600 1500
Como já descrito anteriormente, o uso de modificador químico é necessário pois, na sua ausência, o perfil do pico se mostrou pouco simétrico e com uma repetitividade menor. Os modificadores químicos C e D proporcionaram a obtenção dos maiores sinais analíticos e perfis de picos mais simétricos e, em princípio, qualquer um deles poderia ser usado para a determinação de Cd. No entanto, como mostrado na Figura 10, o modificador químico D apresentou um menor sinal de fundo.
0 1 2 3 4 5 0.0 0.2 0.4 0.6 Ab so rb a n ci a Tempo (s) Sinal (Modificador C)
Sinal de fundo (Modificador C) Sinal (Modificador D)
Sinal de fundo (Modificador D)
Figura 10. Perfil dos picos e sinais de fundo para Cd, obtidas para uma amostra de chocolate
amargo utilizando os modificadores C e D.
Desta forma, o modificador químico D, com uma temperatura de pirólise de 600°C e uma temperatura de atomização de 1500°C, foi escolhido para a determinação de Cd em amostras de chocolate.
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O material de referência certificado de chocolate (NIST 2384) não possui uma concentração de referência declarada para Cd ou Pb, portanto, a exatidão do método proposto foi avaliada utilizando outros dois materiais de referência certificados (NIST 8433 e NIST 1567a). Além disso, foram feitos estudos de adição e recuperação, em dois níveis de concentração, para cada tipo de chocolate. Os resultados obtidos para a determinação de Cd nos materiais de referência certificados utilizando o método proposto são mostrados na Tabela 9.
Tabela 9. Determinação de Cd nos materiais de referência certificados (n=3). CRM Valor certificado (µg kg-1 ± s) Valor encontrado (µg kg-1 ± s) Corn bran (NIST 8433) 12 ± 5 10 ± 2 Wheat flour (NIST 1567a) 26 ± 2 25 ± 1
Os resultados mostram que não houve diferença significativa entre os valores certificados e aqueles encontrados utilizando o método proposto, de acordo com o teste t-Student com 95% de confiança.
As concentrações para os ensaios de adição e recuperação foram selecionadas considerando as concentrações encontradas nos três tipos de chocolate, a faixa de trabalho e a faixa linear para o analito. As recuperações obtidas para os três tipos de chocolates são mostradas na Tabela 10.
Tabela 10. Resultados dos ensaios de adição e recuperação (%± s) para o Cd nos três tipos de
chocolate (n=3). Tipo de chocolate Nível 1 (0,2 μg L-1 ) Nível 2 (0,5 μg L-1 ) Branco 93 ± 6 96 ± 4 Ao leite 94 ± 6 92 ± 3 Amargo 96 ± 4 95 ± 5
De acordo com os resultados obtidos, o método proposto mostra-se adequado para a determinação de Cd em amostras de chocolate.
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Os parâmetros de desempenho foram obtidos para o método proposto e são apresentadas na Tabela 11. O LOD e o LOQ foram calculados como 3 e 10 vezes o desvio padrão obtido para as medidas do branco analítico, respectivamente. A precisão foi avaliada medindo-se seis vezes a concentração de uma amostra de chocolate amargo no mesmo dia e sob as mesmas condições instrumentais.
Tabela 11. Parâmetros de desempenho para o método analítico para a determinação de Cd em
chocolates por GF AAS.
Parâmetros de desempenho LOD (µg kg-1) LOQ (µg kg-1) Precisão (%) Faixa de Trabalho (μg L-1 ) R2 m0 (pg) Valor 0,5 1,7 1,0 0,03-2 0,9997 1,4
4.2.2 4.2.2 Determinação de Pb por GF AAS
Para a determinação de Pb por GF AAS também foi necessário selecionar um modificador químico adequado. Assim, foram feitas as curvas de pirólise e de atomização com diferentes modificadores químicos, mostradas na Figura 11, onde cada ponto foi feito em triplicata e com um desvio padrão sempre menor que 6%.
