Estudo sobre a utilização de saneantes na indústria alimentícia para controle de Listeria Monocytogenes

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UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RIO

GRANDE DO SUL – UNIJUI

FABIANA PIENIZ DIDONET

ESTUDO SOBRE A UTILIZAÇÃO DE SANEANTES NA INDÚSTRIA

ALIMENTÍCIA PARA CONTROLE DE LISTERIA MONOCYTOGENES

Ijuí 2018

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FABIANA PIENIZ DIDONET

ESTUDO SOBRE A UTILIZAÇÃO DE SANEANTES NA INDÚSTRIA

ALIMENTÍCIA PARA CONTROLE DE LISTERIA MONOCYTOGENES

Trabalho de Conclusão de Curso de Engenharia Química apresentado como requisito parcial para obtenção do título de Engenheira Química.

Orientador(a): Fernanda da Cunha Pereira

Ijuí 2018

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FABIANA PIENIZ DIDONET

ESTUDO SOBRE A UTILIZAÇÃO DE SANEANTES NA INDÚSTRIA

ALIMENTÍCIA PARA CONTROLE DE LISTERIA MONOCYTOGENES

Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado para a obtenção do título de ENGENHEIRA QUÍMICA e aprovado em sua forma final pelo professor orientador e pelo membro da banca examinadora.

Ijuí, 21 de dezembro de 2018

Prof. Fernanda, da Cunha Pereira Doutor pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Orientador Prof. Fernanda, da Cunha Pereira Coordenador do Curso de Engenharia Civil/UNIJUÍ BANCA EXAMINADORA

Prof. Joice Viviane de Oliveira (UNIJUÍ) Mestre pela Universidade Federal do Rio de Janeiro

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Dedico este trabalho a minha família, que me incentivou sempre e ofereceu apoio nos momentos crítico.

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AGRADECIMENTOS

A minha família pelo apoio e dedicação empregados nesta minha caminhada; Ao meu namorado pela paciência, compreensão, apoio e colaboração;

À minha orientadora, professora Fernanda, pelos fins de semana e feriados no laboratório e a dedicação para encontrar uma forma de elaborar este trabalho.

Ao professor Rogério Cansian e a URI- Erechim, pela doação das cepas que deram início a este trabalho.

A Unijuí, por permitir o uso dos laboratórios nos fins de semana e feriados, possibilitando a realização do estudo experimental.

As laboratoristas Andreia e Katherine pela colaboração.

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A felicidade não se resume na ausência de problemas, mas sim na sua capacidade de lidar com eles. Albert Einstein

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RESUMO

DIDONET, F. P. Estudo sobre a utilização de saneantes na indústria alimentícia para controle de Listeria monocytogenes. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso. Curso de Engenharia Química, Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul – UNIJUÍ, Ijuí, 2018.

A L. monocytogenes é um microorganismo patógeno aos seres humanos, podendo ocasionar uma serie de doenças relacionadas ao trato gastrointestinal e até mesmo em casos mais severos pode levar a morte. Sabendo que a maior parte dos casos desta doenças são gerados a partir da ingestão desta bactéria as autoridades de saúde pública e a indústria alimentícia tem se preocupado com formas de controle deste microrganismo. A utilização de saneantes é uma alternativa para este controle, porém para serem comercializados, não é necessário que estes produtos sejam testados especificamente em L. monocytogenes. Neste trabalho, foram comparados os resultados de alguns autores que testaram diferentes saneantes para inibição deste microrganismo, os resultados encontrados demontram que o ácido peracético é eficaz no controle de L. Monocytogenes e que o desempenho dos saneantes dependem do material e da condição da superfície contaminada. Desta forma, é necessário avaliar as condições ambientais para definir o saneante a ser utilizado.

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ABSTRACT

DIDONET, F. P. Utilização de saneantes na indústria alimentícia para controle de Listeria monocytogenes. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso. Curso de Engenharia Química, Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul – UNIJUÍ, Ijuí, 2018. L. monocytogenes is a microorganism that is pathogenic to humans, which can lead to a series of diseases related to the gastrointestinal tract and even in more severe cases can lead to death. Knowing that most of the cases of this disease are generated from the ingestion of this bacterium the public health authorities and the food industry has been concerned with ways of controlling this microorganism. The use of sanitizers is an alternative to this control, but to be marketed, it is not necessary that these products be specifically tested on L. monocytogenes. In this work, the results of some authors who tested different sanitizers for inhibition of this microorganism were compared, the results showed that peracetic acid is effective in the control of L. monocytogenes and that the performance of sanitizers depends on the material and the condition of the contaminated surface. Thus, it is necessary to evaluate the environmental conditions to define the sanitizer to be used.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Imagem microscópica de Listeria monocytogenes ... 17 Figura 2- Ciclo celular da invasão de L. monocytogenes ... 22 Figura 3-Delineamento de pesquisa ... 35

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1-Análise da formação de colônias de L. Monocytogenes, após sanitização e incubação de 24 horas ... 39

Tabela 2-Vantagens e desvantagens do uso de compostos clorados, compostos de quaternário de amônio e ácido peracético na indústria de alimentos... 40

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LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1-Análise experimental da capacidade de sanitização após 3 horas da aplicação dos saneantes (0,5%), em superfícies de polipropileno novas e utilizadas na indústria alimentícia contaminadas por cepas de L. Monocytogenes ... 38

Gráfico 2- Análise experimental da capacidade de sanitização do ácido peracético (0,07%) e nisina ... 38

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LISTA DE SIGLAS

L. monocytogenes Listeria monocytogenes

SUS Sistema Único de Saúde

HCPA Hospital das Clínicas de Porto Alegre ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

DTA Doenças Transmitidas por Alimentos

RNA Ácido Ribonucleico

pH Potencial Hidrogênionico

UFC Unidades Formadoras de Colônias

HClO Ácido Hipocloroso

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 13 1.1 CONTEXTO ... 14 1.2 PROBLEMA ... 15 1.2.1 Questões de Pesquisa ... 15 1.2.2 Objetivos de Pesquisa ... 15 1.2.3 Delimitação ... 16 2 REVISÃO DA LITERATURA ... 17 2.1 LISTERIA MONOCYTOGENES ... 17

2.1.1 Características da Listeria Monocytogenes ... 17

2.1.1.1 Sorovares ... 19

2.1.1.2 Efeito do pH ... 19

2.1.1.3 Efeito da temperatura... 20

2.1.1.4 Efeito do Cloreto de sódio ... 20

2.1.1.5 Efeito da atividade de água (Aw) ... 20

2.1.1.6 Crescimento em meio de cultura... 20

2.1.2 Patogenicidade da L. monocytogenes... 21 2.1.2.1 Mecanismos de virulência ... 21 2.1.2.2 Manifestações clínicas ... 23 2.1.2.3 Imunologia ... 23 2.1.2.4 Diagnóstico ... 24 2.1.2.5 Tratamento e prevenção ... 24 2.1.2.6 Epidemiologia ... 24 2.1.2.7 Histórico de estudo ... 25

2.1.3 Surtos de Listeria monocytogenes ... 26

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2.2.1 Principais causas de contaminação ... 27

2.2.2 Pontos de controle para evitar contaminação na indústria alimentícia ... 27

2.2.3 Regulamentação sobre L. monocytogenes em alimentos ... 29

2.3 CONTROLE DE MICRORGANISMOS ATRAVÉS DE SANEANTES ... 30

2.3.1 Regulamentação dos Saneantes ... 31

2.3.2 Utilização correta dos saneantes ... 31

2.3.3 Saneantes utilizados na indústria de alimentos ... 32

3 MÉTODO DE PESQUISA ... 35

3.1 ESTRATÉGIA DE PESQUISA ... 35

3.2 DELINEAMENTO ... 35

4 RESULTADOS ... 37

4.1 Inibição do crescimento de L. monocytogenes através de diferentes saneantes37 4.2 Vantagens de desvantagens dos principais saneantes utilizados na indústria de alimentos... ... 39

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 42

REFERÊNCIAS ... 43

APÊNDICE A – ESTUDO EXPERIMENTAL DA CAPACIDADE BACTERICIDA E INIBITÓRIA DE QUATERNÁRIO DE AMÔNIO SOBRE L. MONOCYTOGENES ... 47

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______________________________________________________________________________ Estudo sobre a utilização de saneantes na indústria alimentícia para controle de Listeria monocytogenes

1 INTRODUÇÃO

Dentre as oito espécies do gênero listeria atualmente reconhecidas, somente a L. monocytogenes é considerada consistentemente patogênica a seres humanos (RAMASWAMY, 2007), sendo ela a causadora de listeriose, que é o nome genérico atribuído ao grupo de quadros sintomáticos (DIAS, 2008). Esta bactéria, encontra-se disseminada em diversas fontes ambientais, habitando solos, esgotos, água e vegetação deteriorada.

Desta forma, as oportunidades de contaminação em alimentos por L. monocytogenes durante o processo produtivo são numerosas. Muitos estudos têm demonstrado a presença de alimentos contaminados com estes microrganismos em carnes, vegetais, leite e seus derivados (NOJIMOTO et al., 1994; CEZAR et al., 2013; COSTA, 2013).

A contaminação na planta de processamento de alimentos ocorre através do contato do microrganismo com este, direta ou indiretamente. Sendo assim, a garantia da inocuidade destes produtos depende de fatores com a falha na higiene, a contaminação cruzada, o processamento e o armazenamento inadequados, os equipamentos contaminados e a contaminação por manipuladores (CEZAR et al., 2013; DIAS, 2008).

A persistência de L. monocytogenes nas superfícies pode ser influenciada por propriedades específicas da cepa, tais como diferenças na capacidade de aderência ao aço inoxidável e susceptibilidade aos desinfetantes, além da formação de biofilmes. Para isto tem sido proposta a rotatividade de desinfetantes utilizados na indústria de alimentos, além do uso de concentrações adequados de saneantes, pois o uso de doses subletais favorece a resistência das cepas ao desinfetante utilizado (DIAS, 2008).

Cezar et al. (2013), ressaltam que “ O uso de desinfetantes não elimina a necessidade do uso das boas práticas de fabricação, sendo necessária limpeza prévia com detergentes apropriados para eliminação de matéria orgânica. Pois quanto maior for a limpeza, melhor será a atuação dos desinfetantes”.

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_____________________________________________________________________________________________ Fabiana Pieniz Didonet (fabididonet@hotmail.com). Trabalho de Conclusão de Curso. Ijuí. DCEENG/UNIJUÍ, 2018 1.1 CONTEXTO

Algumas epidemias de listeriose impulsionaram o estudo sobre a doença, tornando L. monocytogenes um microrganismo conhecido como causador de enfermidades transmitidas por alimentos desde a década de 80 (DIAS, 2008; CRUZ, 2008). De acordo com dados apresentados por Vranjac (2013), nos Estados Unidos há uma incidência de aproximadamente 1600 casos de listeriose por ano. Já no Brasil, há registros que no período entre 1995 e 2007 foram diagnosticados um total de 193 casos de listeriose através do Sistema Único de Saúde (SUS), atingindo uma média de 14,8 casos anualmente, porém em muitos casos a doença é subdiagnosticada e subnotificada (CEZAR et al., 2013; VRANJAC, 2013). Cruz (2008), destaca que no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), durante o ano de 2000, foram realizadas coletas de dez placentas provenientes de abortos ou partos prematuros e 50% das amostras analisadas foram positivas para L. monocytogenes.

Um caso recente da contaminação de alimentos por L. monocytogenes ocorreu na cidade de Porto Alegre em agosto de 2017 em fatiados da rede Zaffari, levando a interdição da unidade de fatiamento do Bourbon Ipiranga, local onde foi encontrado o microrganismo em uma peça de queijo (MATOS, 2017).

Um desafio no controle deste microrganismo é o crescimento psicotrófico, permitindo seu desenvolvimento em alimentos que se encontram sob refrigeração, representando um considerável risco para a saúde humana e um ponto crítico dentro da indústria (CEZAR, 2013). Segundo Franco e Landgraf (1996 apud CEZAR et al., 2013, p. 102), a L. monocytogenes é uma das células vegetativas de maior resistência térmica, por isso, deve-se impedir a sua entrada no ambiente da indústria de alimentos. Uma alternativa para realização deste controle é o uso de saneantes, porém se não forem utilizados corretamente as células dos microrganismos podem contribuir para a formação de uma complexa comunidade microbiana o que comprometerá a qualidade e segurança dos alimentos (BELTRAME, 2014). A formação de biofilmes pode ocorrer em praticamente todas as superfícies envolvidas no processamento de alimentos. Desde as rugosas que apresentam fissuras e fendas que podem alojar os microrganismos até as consideradas mais lisas (BELTRAME, 2014 apud FLACH et al., 2005, p. 15), para isso, a escolha de um saneante adequado é muito importante para o alcance de um resultado final satisfatório nos índices microbiológicos (BELTRAME, 2014).

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No Brasil, a eficácia dos desinfetantes é fiscalizada através de padrões determinados pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), que determina a comprovação de eficácia de desinfetantes e saneantes, de uso em indústrias alimentícias e afins, através da utilização de cepas controles de Staphylococcus aureus, Salmonella choleraesuis e Escherichia coli (ANVISA, 2007), sendo que para todas as outras cepas não há necessidade de comprovação. Desta forma, diante a grande variedade de microrganismos patógenos ao homem juntamente com o aumento da incidência de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA), o poder de eficácia dos desinfetantes disponíveis no mercado torna-se questionável frente aos diferentes tipos de patógenos (CEZAR, 2013).

Beltrame (2014) destaca que há carência de dados e materiais técnico-científicos isentos de interesse que possam auxiliar os profissionais responsáveis por esta importante área de higienização nas indústrias de alimentos, dificultando assim a tomada de decisões mais precisas e economicamente mais viáveis as indústrias, sem ocasionar riscos à saúde dos consumidores. Desta forma, neste trabalho serão comparados os resultados de diferentes autores quanto a eficiência de saneantes no controle de L. monocytogenes, além de realizar um comparativo das vantagens e desvantagens do uso de diferentes produtos utilizados na indústria alimentícia para este fim. 1.2 PROBLEMA

Neste trabalho busca-se verificar quais os saneantes apresentam as melhores características para o combate de L. monocytogenes.

1.2.1 Questões de Pesquisa

Busca-se definir os saneantes que apresentam melhores resultados no combate à L. monocytogenes, além de verificar qual melhor se adapta a indústria alimentícia.

1.2.2 Objetivos de Pesquisa

Inicialmente, buscou-se avaliar a capacidade bactericida e inibitória do quaternário de amônio em cepas de L. monocytogenes, porém ao realizar o experimento notou-se que as características morfológicas do microrganismo não estavam de acordo com o especificado pela

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_____________________________________________________________________________________________ Fabiana Pieniz Didonet (fabididonet@hotmail.com). Trabalho de Conclusão de Curso. Ijuí. DCEENG/UNIJUÍ, 2018 literatura, conforme descrito no apêndice A. Desta forma, o objetivo deste trabalho torna-se realizar pesquisa bibliográfica, com a finalidade de comparar os resultados obtidos pelos demais pesquisadores, referente ao comportamento dos saneantes utilizados indústria alimentícia para o combate de L. monocytogenes. Além disso, busca-se entender quais são as principais vantagens e desvantagens de cada produto.

1.2.3 Delimitação

A pesquisa será delimitada à pesquisa em artigos de revistas e periódicos, teses e dissertações que tratem da eficiência dos saneantes no controle da bactéria L. monocytogenes. Para avaliar as vantagens e desvantagens dos saneantes, serão utilizados os produtos mais difundidos na indústria alimentícia.

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2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 LISTERIA MONOCYTOGENES

L. monocytogenes tem sido reconhecida como um microrganismo de importância, tanto para as autoridades de saúde pública, como para a indústria de alimentos, devido a sua patogenicidade (RODRÍGUEZ, 2017; TRABULSI et al., 1999). Na última década, esta bactéria tem sido responsabilizada por um amplo número de surtos e casos esporádicos, de extensão variada e vinculados com diversos tipos de alimentos (RODRÍGUEZ, 2017).

2.1.1 Características da Listeria monocytogenes

Os microrganismos do gênero Listeria são pequenos, com morfologia cocóide a coco bacilar, gram-positivos, anaeróbico facultativo não esporulados e não coram pela coloração do ácido rápido (SILVA, 2009; TRABULSI et al., 1999). São catalase-positivas, oxidase- negativas e fermentam glicose formando ácido (SILVA, 2009). Células jovens, quando observadas microscopicamente, apresentam-se na forma lisa, medindo de 1,0 a 2,0µm por 0,5µm. Após três a cinco dias de incubação, se apresentam como bacilos longos, medindo de 6 a 20µ, conforme apresentada na Figura 1. L. monocytogenes é móvel devido a presença dos flagelos (FRANCO & LANDGRAF,1996).

Figura 1- Imagem microscópica de Listeria monocytogenes

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Em certo momento, acreditou-se que as Listerias estivessem relacionadas a bactérias corineformes e, de fato, elas foram colocadas na família das Corynebacteriaceae. Atualmente, sabe-se que estão mais relacionadas aos gêneros Bacillus, Lactobacillus e Streptococcus. A partir da sequência do RNA ribossomal 16S, a Listeria está classificada próximo a Bonchothrix; estes dois gêneros, juntamente com Staphylococcus e Kurthia, ocupam uma posição entre o grupo dos Bacillus e dos Lactobacillus/Streptococcus dentro da ramificação dos Clostridium-Lactobacillus-Bacillus (JAY, 2005).

A Listeria monocytogenes é um microrganismo patogênico que se encontra distribuído em uma ampla variedade de habitats, como a microbiota indígena de animais silvestres, ruminantes e seres humanos hígidos. Além disso, pode ser encontrado no solo, água, esgoto, fertilizantes e vegetação em decomposição (silagem), fazendo parte naturalmente destes ambientes (RODRÍGUEZ, 2017; TRABULSI et al., 1999; U.S. DEPARTAMENT, 2017).

São conhecidas sete espécies constituem o gênero Listeria: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi, L. murray. As espécies L. innocua, L. welshimeri e L. seeligeri são consideradas avirulentas. Destas, apenas a L. grayi e a L. murray, não são contaminantes de alimentos (SILVA,2009).

Este microrganismo causa preocupação na indústria alimentícia, uma vez que sobrevive e se multiplica em diferentes condições ambientais, características que lhe permitem superar barreiras impostas durante o processamento de alimentos (RODRÍGUEZ, 2017).

L. monocytogenes é capaz de tolerar e crescer em temperaturas de refrigeração e congelamento, resiste a altas concentrações de sal (como em soluções de salmoura sem cloro), tolera condições ácidas e é mais resistente ao calor do que muitos outros patógenos veiculados por alimentos que não formam esporos (RODRÍGUEZ, 2017, U.S. DEPARTAMENT, 2017).

A ingestão de alimentos contaminados por L. monocytogenes pode causar uma doença leve e não invasiva (chamada de gastroenterite listerial) ou uma doença invasiva grave (chamada listeriose). A listeriose é caracterizada por uma taxa de mortalidade relativamente alta em comparação com doenças causadas pela maioria dos outros patógenos transmitidos por alimentos (U.S. DEPARTAMENT, 2017).

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______________________________________________________________________________ Estudo sobre a utilização de saneantes na indústria alimentícia para controle de Listeria monocytogenes 2.1.1.1 Sorovares

Sorovares são diferentes variedades de uma determinada espécie de bactéria, tendo por base a especificidade imunológica de determinados componentes da superfície da célula como os da parede celular ou do flagelo (Sorovar, 2018).

A espécies de Listeria são caracterizadas pelos seus antígenos, que determinam 17 sorovares. Sendo que, a espécie L. monocytogenes, é representada por 13 sorovares, alguns dos quais são compartilhados com L. innocua e L. seeligeri (JAY, 2005). A L. monocytogenes pode ser tipada com base em seus antígenos O e H, sendo predominantes os sorotipos 1a, 1b e 4b, que são diferenciados pela caracterização microbiológica (TRABULSI, 1999).

Antes dos anos 1960, parecia que o tipo 1 existia predominantemente na Europa e África e o tipo 4, na América do Norte, mas esse padrão parece ter mudado. Tais informações foram confirmadas pelos isolados de alimentos, embora sorovares 1a, 2a e 4b apresentem algumas diferenças geográficas (ABRAHÃO, 2008).

Nos EUA e no Canadá, o sorovar 4b tem sido encontrado em 65 a 80% de todas as linhagens (JAY, 2005; SILVA, 2009). Nos surtos onde a listeriose foi diagnosticada, foram identificados como responsáveis os sorotipos de L. monocytogenes 1/2a, 1/2b, e mais frequentemente o 4b (ABRAHÃO, 2008).

2.1.1.2 Efeito do pH

O pH ótimo para o crescimento desta bactéria é entre 6 e 8, porém ela pode crescer em uma faixa maior, entre cinco e nove. Ambientes com pH inferior a 4,5 e superior a 9,5 são considerados adversos a L. monocytogenes (FRANCO & LANDGRAF, 1996). Os ácidos sórbico e benzóico são inibidores do crescimento de L. monocytogenes, sua suscetibilidade a estes compostos tem estreita interação com a temperatura e pH, sendo a inibição mais efetiva em pH 5 e 4 °C (ABRAHÃO, 2008). Amostras expostas a condições de moderada acidez desenvolvem tolerância à acidez, tornando-se mais hábeis na sua capacidade de invadir e proliferar em culturas celulares ou mesmo em alimentos (ABRAHÃO, 2008).

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_____________________________________________________________________________________________ Fabiana Pieniz Didonet (fabididonet@hotmail.com). Trabalho de Conclusão de Curso. Ijuí. DCEENG/UNIJUÍ, 2018 2.1.1.3 Efeito da temperatura

L. monocytogenes apresenta crescimento na faixa de 2,5 a 44 ºC, embora existam relatos a baixas temperaturas. Este microrganismo suporta repetidos congelamentos e descongelamentos (FRANCO & LANDGRAF,1996).

Estudos têm sugerido que mudanças na composição dos ácidos graxos da membrana polar lipídica sejam responsáveis por manter a integridade dessa membrana em uma ampla faixa de temperatura do microrganismo permitindo sua multiplicação em temperaturas baixas (ABRAHÃO, 2008).

2.1.1.4 Efeito do Cloreto de sódio

L. monocytogenes é um halotolerante. Pode tolerar concentrações de 10 % a 30 % de cloreto de sódio (NaCl). A adaptação de microrganismos do gênero Listeria em altas concentrações de soluto envolve acúmulo intracelular de compostos orgânicos chamados de osmólitos (glicina, betaina), que atuam contrabalançando a força osmótica, impedindo, desta forma a perda de água pela célula (ABRAHÃO, 2008).

2.1.1.5 Efeito da atividade de água (Aw)

A Aw ótima para o crescimento da bactéria é próxima a 0,97. Contudo, ela possui a capacidade de se multiplicar em atividade de água 0,92; que é considerada baixa para a multiplicação de patógenos (FRANCO & LANDGRAF, 1996), e apenas os estafilococos são capazes de crescer em valores inferiores de Aw (JAY, 2005).

2.1.1.6 Crescimento em meio de cultura

As necessidades nutricionais das Listerias são típicas das bactérias Gram-positivas. Elas crescem bem em meios comuns como o BHI (brain heart infusion), caldo triptona e caldo tripticase-soja. Embora muitas das necessidades nutricionais tenham sido descritas especificamente para L. monocytogenes, acredita-se que as demais espécies tenham necessidades similares (SILVA, 2009).

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Pelo menos quatro vitaminas do complexo B são necessárias: biotina, riboflavina, tiamina e ácido tioctico, bem como os aminoácidos cisteína, glutamina, isoleucina e valina. Esta bactéria multiplica-se em aerobiose ou anaerobiose e prefere ambientes microaerofílicos (SILVA, 2009). 2.1.2 Patogenicidade da L. monocytogenes

Esta causa a doença conhecida como listeriose, que é caracterizada por casos de gastroenterites, septicemia, meningite, meningoencefalite, entre outras infecções. A forma que a doença se manifesta está diretamente ligada com o estado de saúde de cada pessoa (SILVA, 2009).

A listeriose humana é uma doença esporádica observada durante todo o ano, porém ocorre com maior frequência nos meses mais quentes. A L. monocytogenes é uma causa incomum, mas preocupante de intoxicação alimentar, com um percentual muito elevado de casos fatais, atingindo cerca de 30 % dos casos. O maior número de mortes está relacionado com pacientes que se enquadram no grupo de risco, sendo idosos, crianças e pessoas imunocomprometidas. (TRABULSI et al., 1999).

2.1.2.1 Mecanismos de virulência

A L. monocytogenes pode infectar o homem e outros animais pelas vias: oral, ocular, cutânea, respiratória ou urogenital. A forma mais comum de contaminação dessa bactéria é pela ingestão de alimentos contaminados, portanto o trato gastrointestinal é a principal porta de entrada para o microrganismo no hospedeiro, através da adesão à mucosa intestinal (ABRAHÃO, 2008; SILVA, 2009).

A bactéria possui motilidade por flagelos, porém só é móvel a temperaturas entre 20 ºC a 25 ºC. Como o corpo humano não se encontra entre estas temperaturas, o microrganismo desenvolveu outra estratégia para movimentar-se, sendo este um ponto chave para a sua virulência. Sendo assim, o microrganismo requisita actina da célula hospedeira para se mover através e entre as células do hospedeiro (TRABULSI et al., 1999).

L. monocytogenes é um parasita intracelular facultativo, com habilidade de invadir e multiplicar dentro de macrófagos e em outras células não fagocíticas como células epiteliais e

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_____________________________________________________________________________________________ Fabiana Pieniz Didonet (fabididonet@hotmail.com). Trabalho de Conclusão de Curso. Ijuí. DCEENG/UNIJUÍ, 2018 endoteliais, fibroblastos, hepatócitos e vários tipos de células nervosas (ABRAHÃO, 2008; SILVA, 2009).Este microrganismo tem a capacidade de evitar a resposta do sistema imune humoral, por se multiplicar dentro da célula hospedeira, e escapar da resposta imune celular, por disseminar-se através da passagem intercelular.

Em células eucarióticas a bactéria desenvolve um ciclo celular que pode ser dividido em três etapas: escape do fagossomo após a fagocitose, multiplicação na célula hospedeira e invasão da célula vizinha (CRUZ, MARTINEZ e DESTRO,2008).

A invasão é decorrente da polimerização de ﬁlamentos de actina que impulsionam através de movimentos rotatórios a bactéria pelo citosol até encontrar a membrana plasmática e chegar à célula adjacente, provocando a formação de invaginações e fagocitose, começando assim, um novo ciclo como demonstrado na Figura 2 (ABRAHÃO, 2008; CRUZ, MARTINEZ e DESTRO, 2008).

Figura 2- Ciclo celular da invasão de L. monocytogenes

Fonte: Martinez e Destro, 2008.

A espécie patogênica produz as toxinas listeriolisina O e a fosfolipase C que acidificam o meio e rompem o vacúolo. Porém o fator de virulência mais significativo associado com L. monocytogenes é a listeriolisina O, pois é um potente estimulador inflamatório (ABRAHÃO, 2008; SILVA, 2009).

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De acordo com Abrahão (2008), após um a dois dias da penetração, as bactérias são carregadas pela linfa ou pela corrente sanguínea. Desta forma, o patógeno pode atingir os linfonodos, a placenta, o fígado e o baço. Além disso, utilizando o mesmo sistema de invasão celular, a espécie virulenta pode atravessar a barreira placentária e chegar ao feto, além de infectar o sistema nervoso central.

2.1.2.2 Manifestações clínicas

As manifestações associadas com L. monocytogenes em humanos incluem meningoencefalite, sintomas de gripe, baixo grau de septicemia no período pré-natal, síndrome de mononucleoses, septicemia em adultos, pneumonia, endocardites, abscessos localizados, lesões cutâneas papular ou pustular, conjuntivites, uretrites e ocorrência de abortos. Também pode causar danos cerebrais e retardamento mental (ABRAHÃO, 2008).

O tempo de latência para as formas graves de listeriose é desconhecida, variando de poucos dias a três semanas. O tempo de aparecimento de sintomas gastrointestinais também é desconhecido, mas provavelmente é maior do que 12 horas (SILVA, 2009). Indivíduos saudáveis, que não se encontram no grupo de risco, são altamente resistentes à infecção pela bactéria em questão, sendo que existem poucas evidências de que estes indivíduos tenham contraído listeriose clínica (SILVA, 2009).

Estão susceptíveis a manifestação clínica desta infecção: gestantes, fetos, pessoas imunodeprimidas devido ao uso de medicamentos, pacientes com câncer (leucêmicos e particular), diabéticos, pacientes com cirrose hepática, asmáticos, idosos, portadores do vírus HIV e cardíacos. O índice de mortalidade para pacientes no grupo de risco pode atingir de 20 % a 30 % (ABRAHÃO, 2008; SILVA, 2009).

2.1.2.3 Imunologia

Percebe-se que após uma listeriose, há um aumento de anticorpos anti-somáticos e antiflagelares, no entanto, em indivíduos saudáveis estes anticorpos já estão presentes. A imunidade que ocorre após a infecção por Listeria é basicamente celular (TRABULSI et al., 1999).

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_____________________________________________________________________________________________ Fabiana Pieniz Didonet (fabididonet@hotmail.com). Trabalho de Conclusão de Curso. Ijuí. DCEENG/UNIJUÍ, 2018 2.1.2.4 Diagnóstico

De acordo com Trabulsi et al. (1999), o diagnóstico é feito por exame bacteriológico do material proveniente do foco infeccioso. Este material pode ser sangue, liquor aspirado de medula óssea e secreção de garganta, onde será realizado o cultivo primário da bactéria, que pode ser facilitado pelo crioenriquecimento, com manutenção do meio semeado a 4 ºC, e subcultivos repetidos em ágar-sangue.

O diagnóstico também é feito através isolamento do agente infeccioso na placenta, mecônio e lavado gástrico. No entanto, não existe um teste de triagem de rotina para a listeriose durante a gravidez, como existe para rubéola e outras infecções congênitas. Se a pessoa possui sintomas como febre ou rigidez do pescoço, ela deve consultar um médico, um exame de sangue é um meio para definir se os sintomas apresentados estão relacionados a esta infecção (SILVA, 2009). A pesquisa da bactéria em alimentos é fundamental, para isso são tomadas alíquotas do material e inoculadas em caldo de enriquecimento para este microrganismo. É realizado subcultivo em ágar seletivo e incubação em microaerofilia (TRABULSI et al., 1999).

2.1.2.5 Tratamento e prevenção

Para o tratamento de listeriose indica-se a escolha de antibióticos como a ampicilina, cloranfenicol e eritromicina, pois a sensibilidade da bactéria a estes agentes é, de maneira geral, uniforme (TRABULSI et al., 1999). As tetraciclinas também eram indicadas para o tratamento (TRABULSI et al., 1999), porém recentemente observou-se resistência da bactéria a este antibiótico. Cabe destacar que, mesmo com tratamento imediato, algumas infecções resultam em morte, mas isso ocorre particularmente em pacientes que se encontram no grupo de risco (SILVA, 2009). Sabendo que os casos desta infecção estão ligados a ingestão de alimentos contaminados. A prevenção está relacionada com a higienização das mãos e equipamentos que entram em contato com os alimentos. Além disso, quando possível indica-se realizar a cocção dos alimentos já que a Listeria não possui resistência a temperaturas elevadas (TRABULSI et al., 1999).

2.1.2.6 Epidemiologia

Este microrganismo é frequentemente transmitido pela ingestão de produtos alimentícios contaminados, porém existem outras formas como o contato direto com excrementos de animais e

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______________________________________________________________________________ Estudo sobre a utilização de saneantes na indústria alimentícia para controle de Listeria monocytogenes inalação de poeira. A transmissão também pode ocorrer através da placenta da gestante ou durante o parto (TRABULSI et al., 1999).

Esta bactéria é uma preocupação para os segmentos da indústria de alimentos, pois pode ser letal a indivíduos susceptíveis e possui habilidades para desenvolver-se em condições adversas (TRABULSI et al., 1999).

2.1.2.7 Histórico de estudo

Murray e colaboradores 1926, no Departamento de Patologia da Universidade de Cambridge, realizaram o primeiro isolamento de Listeria monocytogenes em sangue de coelhos e correlacionaram como a causa de doenças entre cobaias de laboratório e coelhos. Os autores nomearam o agente como Bacterium monocytogenes, devido à elevação característica nos valores sanguíneos dos leucócitos mononucleares. Três anos depois, foi isolado de fígado infectado de camundongo africano por Pirie, que o nomeou de Listerella hepatolytica pelo comprometimento hepático durante a infecção. Desse modo, a similaridade dos organismos descritos pelos diferentes pesquisadores levou, em consenso, ao nome de Listerella monocytogenes. O nome do gênero foi escolhido em honra ao cirurgião Lorde Lister e a partir de 1940 o gênero foi modificado para Listeria, pois já havia um gênero vegetal denominado Listerella, desta forma o agente passou a chamar-se Listeria monocytogenes. Cabe ressaltar que, tanto Murray quanto Pirie, atribuíram as infecções dos animais ao consumo de alimentos contaminados (ABRAHÃO, 2008; SILVA, 2009). Por muitos anos, o gênero Listeria spp. apresentou apenas a espécie L. monocytogenes. Posteriormente, foram incluídas outras espécies L. denitrificans (1948), L. grayi (1966), L. murrayi (1971), L. innocua (1981), L. welshimeri e L. seeligeri (1983) e L. ivanovii, em (1985). Pois, apesar das espécies de Listeria serem fenotipicamente similares, pode-se diferencia-las pela produção de hemolisina, análise de patogenicidade em ratos, pela produção de ácido a partir de D-xilose, L- ramnose e manitol (ABRAHÃO, 2008).

A listeriose foi relatada em humanos pela primeira vez em 1929, estabelecendo-se a partir de então a correlação entre Listeria monocytogenes e meningite em humanos. E em 1933, foi associada com doença peri-natal (ABRAHÃO, 2008). Os estudos relacionados aos perigos desta

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_____________________________________________________________________________________________ Fabiana Pieniz Didonet (fabididonet@hotmail.com). Trabalho de Conclusão de Curso. Ijuí. DCEENG/UNIJUÍ, 2018 infecção foram desencadeados durante a década de 80, quando ocorreram vários surtos na América do Norte e Europa e a L. monocytogenes foi responsabilizada por várias formas de listeriose humana. A partir de 1988, principalmente na Europa Central, pesquisadores passaram a investiga-la como doença originada por alimentos (SILVA, 2009).

No Brasil, assim como em outros países em desenvolvimento, há carência de informações sobre esse importante patógeno. Pois, mesmo havendo altos índices de doenças transmitidas por alimentos, suas causas são pouco estudadas (CRUZ, MARTINEZ E DESTRO, 2008).

Desta forma, é importante destacar necessidade de se tentar estabelecer a relação entre ocorrência deste microrganismo em amostras clínicas e o tipo de alimento consumido pelo paciente brasileiro, para buscar prevenir e controlar casos e surtos que possam vir a ocorrer (CRUZ, MARTINEZ E DESTRO, 2008).

2.1.3 Surtos de Listeria monocytogenes

Os surtos e casos de listeriose têm sido associados a diversos alimentos tanto de origem animal como vegetal. Cabe salientar que os alimentos contaminados que causaram maior número de casos são aqueles produtos que permitem a multiplicação da bactéria até populações elevadas antes do consumo (ABRAHÃO, 2008; SILVA, 2009).

O caso mais recente de surto desta infecção, ocorreu no ano de 2017, na África do Sul, ocasionando pelo menos 180 mortes e infectou aproximadamente 1.000 pessoas, possuindo como fonte de contaminação, produtos cárneos vendidos prontos para o consumo (SOUZA, 2018).

Vários casos de contaminação por esta bactéria, estão relacionados com a manifestação clínica de listeriose ocorreram pelo mundo, sendo alguns deles: Paris (2000), Japão (2001), França (1995), Suíça (1983-1987), Carolina do Norte (2000), e Massachusetts (2007). Estes casos estão atribuídos ao consumo de leite cru, leite pasteurizado, produtos de laticínio (em especial queijos de alta umidade), vegetais crus e produtos cárneos contaminados (ABRAHÃO, 2008; SILVA, 2009). No Brasil, os surtos e/ou casos de listeriose são subdiagnosticados e/ou subnotiﬁcados. Entretanto existem estudos de casos isolados, mostrando a incidência de meningite, abortos e partos prematuros, através da contaminação por L. monocytogenes (CRUZ, MARTINEZ e DESTRO, 2008).

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______________________________________________________________________________ Estudo sobre a utilização de saneantes na indústria alimentícia para controle de Listeria monocytogenes 2.2 L. MONOCYTOGENES NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS

Os alimentos relacionados com contaminação por L. monocytogenes são leite pasteurizado e não pasteurizado, produtos lácteos com alto teor de gordura, queijo não curado, crustáceos cozidos, marisco defumado, queijo fresco, queijo semi-suave (azul, tijolo, Monterey), queijos moles, sanduíches, frutas e verduras frescas e moluscos crus (U.S. DEPARTAMENT, 2017).

Com base nos dados obtidos nos surtos e casos esporádicos de listeriose ocorridos nas últimas décadas, são considerados alimentos de maior risco os prontos para consumo (que não requerem cocção antes do consumo), estocados sob refrigeração e/ou com vida de prateleira longa. Além disso, a maioria dos produtos prontos para consumo são tratados termicamente apresentando uma diminuição acentuada ou eliminação da microbiota acompanhante. Desta forma, devido à ausência de competidores, caso o produto venha ser contaminado posteriormente por L. monocytogenes, terá sua multiplicação facilitada durante a estocagem em temperaturas de refrigeração (ABRAHÃO, 2008).

2.2.1 Principais causas de contaminação

Sabe-se que a ocorrência de listeriose é relacionada a ingestão de alimentos contaminados, porém estes contaminam-se em praticamente toda a cadeia produtiva. O habitat primário de L. monocytogenes é o solo e a água, desta forma os vegetais podem contaminar-se pelo solo ou adubos usados como fertilizantes. Além disso, os animais podem carrear a bactéria sem apresentar doença, e contaminar os alimentos de origem animal como carne e leite (ABRAHÃO, 2008).

Durante a fabricação, processamento e embalagem dos alimentos a eliminação deste microrganismo dificultada, pois pode sobreviver por mais tempo sob condições ambientais adversas, ao contrário de outras bactérias vegetativas que apresentam uma preocupação de segurança alimentar como a Salmonella (U.S. DEPARTAMENT, 2017; ABRAHÃO, 2008). 2.2.2 Pontos de controle para evitar contaminação na indústria alimentícia

Cuidados com o projeto, construção e operação da planta de processamento de alimentos são fundamentais para reduzir o risco de contaminação. É necessário que as a estruturas sejam

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_____________________________________________________________________________________________ Fabiana Pieniz Didonet (fabididonet@hotmail.com). Trabalho de Conclusão de Curso. Ijuí. DCEENG/UNIJUÍ, 2018 adequadas em tamanho, construção e projeto para facilitar as operações de manutenção e sanitárias para fins de produção de alimentos (U.S. DEPARTAMENT, 2017). Ao realizar o projeto e construção da planta industrial deve-se realizar controle dos padrões de fluxo de tráfego para pessoal, matéria-prima, materiais de embalagem de alimentos e equipamentos, para minimizar o potencial de contaminação por L. monocytogenes (U.S. DEPARTAMENT, 2017). Além disso, a indústria deve ser construída de maneira a impedir a entrada de animais, poeira e insetos (SILVA, 2009).

Os equipamentos e os utensílios devem ser projetados e construídos para minimizar os locais onde a proliferação e a multiplicação microbiana podem ocorrer. Este cuidado também deve ser tomado quando ocorre a modificação/reforma de um equipamento existente (U.S. DEPARTAMENT, 2017).

A matéria-prima pode ser um risco de contaminação, para isso pode-se implementar controles para reduzir o potencial de um ingrediente ou insumo contaminar um produto acabado (U.S. DEPARTAMENT, 2017). Para entrar área de processamento de alimentos, deve-se ter cuidado com a limpeza e sanidade das roupas, dos calçados e das mãos (utilizar luvas quando houver contato direto com o produto). Cumprir com as normas de Boas Práticas de Fabricação é essencial (U.S. DEPARTAMENT, 2017; RODRÍGUEZ, 2017).

Ao executar a limpeza úmida de equipamento ou sala, os alimentos não podem estar expostos, pois gotículas contaminadas podem entrar em contato com o produto. Para a limpeza de ralos, indica-se períodos em que os alimentos não estejam sendo processados ou expostos, além de utilizar utensílios de limpeza específicos para este fim (baldes, vassouras, esfregão). Deve-se escolher com cuidado o modelo adequado para o ralo, sua disposição na fábrica e o sistema de sanitização. Estes cuidados permitem evitar a transferência da bactéria de uma superfície para outra (U.S. DEPARTAMENT, 2017; RODRÍGUEZ, 2017).

Os pisos devem ter inclinação para baixo em direção a um ralo, colocando-o no ponto mais baixo do seu piso. É importante manter os pisos da fábrica secos o tempo todo, pois a L. monocytogenes, como a maioria das bactérias, precisa de água para crescer e manter sua presença (RODRÍGUEZ, 2017). Sistemas de refrigeração e sistemas de tratamento de ar, podem

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______________________________________________________________________________ Estudo sobre a utilização de saneantes na indústria alimentícia para controle de Listeria monocytogenes gerar o acúmulo de água proporcionando um ambiente propício para o desenvolvimento da bactéria, para isso deve-se ter cronogramas de limpeza e sanitização (RODRÍGUEZ, 2017).

Cuidados também devem ser tomados nos centros de distribuição, que possuem uma grande responsabilidade para reduzir riscos de contaminação. Para isso, deve-se controlar a temperatura da mercadoria, possuir controle de estoque, datas de validade e análise microbiológicas dos produtos também são pontos muito importantes para o controle feito pelas equipes da qualidade (SILVA, 2009).

O emprego de procedimentos inadequados de limpeza e de sanitização dos equipamentos e a microbiota contaminante do ambiente de processamento, são consideradas as principais causas de contaminação dos produtos com microrganismos deterioradores e patogênicos (COSTA et al., 2016).

A eficácia do método para reduzir as populações bacterianas vai depender do método de sanitização empregado, tipo e fisiologia dos microrganismos, características da superfície, tempo de exposição ao saneante, concentração do produto, pH e temperatura. Os métodos químicos de limpeza e de sanitização, envolvem a aplicação de lavagem mecânica e o uso de saneantes. Já os métodos físicos, são eficazes na eliminação de microrganismos presentes nas superfícies dos equipamentos ou dos alimentos, utilizando forças de cisalhamento para remove-los (RODRÍGUEZ, 2017).

2.2.3 Regulamentação sobre L. monocytogenes em alimentos

Alguns países estabeleceram limites legais para o número de microrganismos permitido em alimentos, especialmente para os produtos prontos para o consumo, enquanto outros têm sugerido procedimentos ou critérios que não têm amparo legal (SILVA, 2009).

A diretiva da comunidade europeia sobre leite e derivados, estabeleceu tolerância zero para L. monocytogenes em queijos moles e ausência do microrganismo em 1 g para os demais produtos.

Já as apresentadas pela Grã-Bretanha, estabeleceram quatro grupos de qualidade para alimentos prontos para o consumo, de acordo com o número de bactérias: não detectado em 25 g é

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_____________________________________________________________________________________________ Fabiana Pieniz Didonet (fabididonet@hotmail.com). Trabalho de Conclusão de Curso. Ijuí. DCEENG/UNIJUÍ, 2018 satisfatório; 10²/25 g é razoavelmente satisfatório; 10² a 10³/25 g é insatisfatório, e 10³/25 g tornam o produto inaceitável (SILVA, 2009).

Na Alemanha, a presença do microrganismo também está dividida em níveis de risco semelhantes às diretivas estabelecidas pelo Canadá. Produtos que contém menos do que 104/g de produto são sujeitos ao recolhimento automático (SILVA, 2009). Austrália e França estabelecem a ausência de L. monocytogenes em cinco amostras de 25 g do alimento (SILVA, 2009).

O governo dos EUA tem a legislação mais rígida, na qual o microrganismo tem sido considerado como um “adulterante”. Sendo assim, qualquer alimento pronto para o consumo que o contenha pode ser considerado modificado e, dessa forma, está sujeito a recolhimento ou substituição. O requerimento dos EUA é a ausência do microrganismo em 25 g de amostra (JAY, 2005).

De acordo com a ANVISA (2001), no Brasil, os padrões microbiológicos em alimentos estabelecem ausência desse patógeno em 25 g de amostra (BRASIL, 2001). Já a Comissão Internacional em Especificações Microbiológicas para Alimentos (ICMSF) conclui que, se esse microrganismo não exceder 10²/g de alimento, este pode ser considerado aceitável para indivíduos que não estão sob risco (SILVA, 2009).

A dose mínima infectante para a listeriose ainda não foi estabelecida. Partindo dos dados de surtos que ocorreram no mundo, poder-se-ia dizer que doses de L. monocytogenes iguais ou maiores a 10² UFC/g de alimento poderiam causar quadro de toxinfecção alimentar. A contaminação de alimentos com níveis acima de 103 UFC/g é considerada alta para esta bactéria. Experimentos realizados com animais saudáveis indicaram que a ingestão de quantidades deste microrganismo entre 103 e 106 UFC/g seriam suficientes para causar danos à saúde (ABRAHÃO, 2008). Além disso, a dose infectante de patógeno de origem alimentar varia de acordo com as condições do hospedeiro, o nível de contaminação do alimento pelo patógeno, a quantidade ingerida de alimento e a virulência das cepas (ABRAHÃO, 2008).

2.3 CONTROLE DE MICRORGANISMOS ATRAVÉS DE SANEANTES

De acordo com a Vigilância Sanitária (2018) saneantes são substâncias ou preparações destinadas à higienização, desinfecção ou desinfestação de ambientes e no tratamento de água. Na

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______________________________________________________________________________ Estudo sobre a utilização de saneantes na indústria alimentícia para controle de Listeria monocytogenes indústria de alimentos o tipo de saneante a ser utilizado deve ser escolhido com base na sua atividade antimicrobiana, ação sobre equipamentos e superfícies, tratabilidade dos efluentes industriais gerados e, também, sobre os operadores. E, para a sua implementação, devem ser determinadas as condições de uso como concentração, tempo de contato e temperatura para melhor desempenho do produto (COSTA et al., 2016).

2.3.1 Regulamentação dos Saneantes

De acordo com a ANVISA (2007), os critérios técnicos para avaliação os produtos saneantes com ação antimicrobiana para indústria alimentícia e afins, se dão através de microrganismos empregados para avaliação da atividade antimicrobiana sendo eles Staphylococcus aureus, Salmonella choleraesuis e Eschericia coli (BELTRAME, 2009).

Porém para a L. monocytogenes não são realizados ensaios específicos, mesmo esta bactéria sendo reconhecida como uma das mais resistentes aos saneantes, principalmente por possuir a capacidade de produzir biofilmes. Desta forma, devido sua grande importância para a indústria alimentícia, o estudo da avaliação do comportamento desta bactéria em contato com estes produtos é relevante (BELTRAME, 2009).

A utilização de saneantes clandestinos também é uma das preocupações referentes ao controle de microrganismos, pois estes produtos não são regulamentados e não passam por nenhum tipo de avaliação quanto à eficácia e possíveis contaminações. Um estudo que testava a qualidade destes indicou que 50 % das amostras não foram eficazes contra microrganismos testados e não houve redução da carga microbiana nos tempos testados. Além disso, tais produtos podem apresentar cargas microbianas elevadas comprometendo a estabilidade, podendo causar a degradação do princípio ativo e alteração das propriedades físico-químicas como pH e viscosidade (OLIVEIRA, CAETANO e GOMES, 2012).

2.3.2 Utilização correta dos saneantes

Para uma limpeza eficiente, é imprescindível saber a concentração, temperatura, tempo de exposição e ação mecânica adequada. Para uma plena atividade do saneante, além do tempo de

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_____________________________________________________________________________________________ Fabiana Pieniz Didonet (fabididonet@hotmail.com). Trabalho de Conclusão de Curso. Ijuí. DCEENG/UNIJUÍ, 2018 contato nas superfícies a serem higienizadas (NASCIMENTO, DELGADO e BARBARIC, 2010). De acordo com Nascimento, Delgado e Barbaric (2010), “a concentração de saneante a ser utilizada, deve ser capaz de destruir o microrganismo mais resistente, no intervalo de tempo desejado”. Isso ocorre, pois, algumas bactérias, entre elas a L. monocytogenes, possuem a capacidade de aderirem e aglomerar-se à superfície dos equipamentos, resultando na formação de biofilmes. Este permite que as bactérias continuem se multiplicando, tornando-se assim uma fonte potencial de contaminação aos alimentos com maior resistência aos saneantes (CEZAR et al., 2013; NASCIMENTO, DELGADO E BARBARIC, 2010). Além disso, os biofilmes formados são causa da corrosão dos maquinários, gerando impacto negativo na qualidade dos produtos finais (NASCIMENTO, DELGADO E BARBARIC, 2010).

É importante ressaltar que o uso de desinfetantes não elimina a necessidade do uso das boas práticas de fabricação, sendo necessária limpeza prévia com detergentes apropriados para eliminação de matéria orgânica. Desta forma, a função dos desinfetantes será realizada de forma eficaz (CEZAR et al., 2013).

Durante a escolha dos saneantes também devem ser considerados outros fatores de interesse como: alteração das características sensoriais dos alimentos, segurança no manuseio, estabilidade da solução, corrosões nos equipamentos e desenvolvimento de compostos indesejáveis. Pois, cada situação possui condições específicas que podem influenciar no desempenho do produto (NASCIMENTO, DELGADO e BARBARIC, 2010).

2.3.3 Saneantes utilizados na indústria de alimentos

Existem várias opções de saneantes no mercado, sendo que os mais utilizados são compostos de cloro, ácido peracético e o quaternário de amônia. Recentemente estão surgindo no mercado produtos à base de ácidos orgânicos, que seriam produtos mais seguros com relação a resíduos em alimentos (BELTRAME, 2009).

Os compostos clorados, se caracterizam por ter amplo espectro e alta eficiência no controle da contaminação microbiológica, sua atividade antimicrobiana é proveniente da formação do ácido hipocloroso (HClO) ao reagir com a água. O HClO é um ácido fraco, não dissociado, altamente oxidante e que pode causar estresse oxidativo e gerar injurias ou até mesmo a morte dos

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______________________________________________________________________________ Estudo sobre a utilização de saneantes na indústria alimentícia para controle de Listeria monocytogenes microrganismos (RODRÍGUEZ, 2017). A atividade antimicrobiana ocorre através da destruição da cápsula bacteriana de proteção e oxidação do protoplasma celular, além de formar cloraminas tóxicas que alteram a permeabilidade celular e impedem a regeneração enzimática (NASCIMENTO, DELGADO e BARBARIC, 2010).

O fosfato trissódico (TSP) é eficaz na inativação de microrganismos como Salmonella e L. monocytogenes presentes nas superfícies de frutas e vegetais, porém as soluções que contêm mais do que 15 % de TSP podem afetar a qualidade sensorial do alimento (RODRÍGUEZ, 2017).

Os compostos de amônio quaternário, são surfactantes catiônicos capazes de interagir mais facilmente do que outros saneantes, com as superfícies de contato de equipamentos ou de alimentos e tem maior atividade antimicrobiana contra fungos e bactérias gram-positivas como L. monocytogenes (RODRÍGUEZ, 2017). Seu mecanismo de ação se dá pela inativação de enzimas responsáveis pelos processos de transformação de energia, desnaturação de proteínas celulares e ruptura da membrana celular (LIMA et al., 2017).

Os ácidos orgânicos como o ácido lático, cítrico, acético, ascórbico ou tartárico, são caracterizados como fortes agentes antimicrobianos devido à redução do pH do meio, alteração no transporte e, ou permeabilidade da membrana, acumulação de ânions, redução do pH intracelular (RODRÍGUEZ, 2017).

As bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos sintetizado nos ribossomos, produzido por bactérias que exercem ação antimicrobianas. Atualmente a única aprovada para utilização e alimentos é a nisina que atua como um componente bioativo, inibindo a adesão celular (RATTI, 2006).

O composto de ácido peracético, constituído de ácido peracético, ácido acético e peróxido de hidrogênio, é um forte agente oxidante e é usado nas etapas de lavagem e sanitização de frutas e hortaliças. O ácido peracético apresenta amplo espectro de ação, sendo esporicida em baixas concentrações (RODRÍGUEZ, 2017; LIMA et al., 2017). Este saneante atua na parede celular e no interior da célula microbiana o que danifica o sistema enzimático causando a destruição do microrganismo (NASCIMENTO, DELGADO E BARBARIC, 2010). Já os iodoforos possuem

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_____________________________________________________________________________________________ Fabiana Pieniz Didonet (fabididonet@hotmail.com). Trabalho de Conclusão de Curso. Ijuí. DCEENG/UNIJUÍ, 2018 ação através de seu alto poder de penetração na parede celular, levando a ruptura de proteínas (NASCIMENTO, DELGADO E BARBARIC, 2010).

A clorexidina é um agente catiônico do grupo das bi-guanidas que age alterando a permeabilidade da membrana citoplasmática, causando a lise devido ao desequilíbrio osmótico, possui espectro de ação contra bactérias gram-negativas e Gram-positivas (LIMA et al., 2017). Apresenta-se como um agente bactericida, fungicida e viricida (SILVA, DUTRA E CADIMA, 2010).

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3 MÉTODO DE PESQUISA

O método de pesquisa utilizado neste trabalho foi a pesquisa bibliográfica. 3.1 ESTRATÉGIA DE PESQUISA

De acordo com Gil (2002), a pesquisa bibliográfica é desenvolvida com base em material já elaborado, constituído principalmente de livros e artigos científicos. Desta forma, a pesquisa foi realizada através de artigos publicados em periódicos e revistas, além de trabalhos de conclusão de curso, dissertações e teses, com o objetivo de comparar os resultados encontrados nos diferentes estudos.

3.2 DELINEAMENTO

Para o desenvolvimento deste trabalho será realizada pesquisa bibliográfica e posteriormente tratamento dos dados, conforme apresentado na Figura 3.

Figura 3-Delineamento de pesquisa

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A pesquisa será realizada utilizando artigos, teses e dissertações que preferencialmente tragam dados experimentais do assunto abordado. Posteriormente os dados dos ensaios experimentais provenientes dos trabalhos estudados serão segregados e analisados, a fim de obter a informação de quais saneantes são mais apropriados para o controle de L. monocytogenes na indústria de alimentos.

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4 RESULTADOS

Através da análise dos dados obtidos na pesquisa foi possível observar o comportamento dos saneantes na inibição do crescimento de L. monocytogenes, além de apresentar as vantagens e desvantagens dos saneantes mais utilizados na indústria alimentícia.

4.1 INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE L. MONOCYTOGENES ATRAVÉS DE DIFERENTES SANEANTES

Durante a análise dos dados referentes aos resultados obtidos na sanitização de meios contaminados com L. monocytogenes é possível perceber que poucos autores se detêm à um estudo detalhado da formação de biofilmes, devido a utilização saneantes com concentrações insuficientes.

No estudo de Beltrame (2014), são realizados testes com quatro saneantes em superfícies lisa e com ranhuras, a fim de determinar a capacidade de contenção da formação de biofilme. Conforme apresentado no Gráfico 1, pode-se perceber que em superfície lisa, apenas o ácido orgânico não se mostrou eficaz no controle da bactéria, porém ao realizar o experimento com os mesmos parâmetros em superfície já usadas na indústria (com ranhuras e possivelmente presença de matéria orgânica), a eficiência dos saneantes diminui.

Nota-se que em todos os ensaios houve resistência bacteriana e formação de biofilme, porém destaca-se o ácido peracético como saneante com maior percentual de inibição de L. monocytogenes, eliminando 72 % das colônias.

A variação dos resultados para as diferentes superfícies ocorre através da maior fixação das células devido a presença de ranhuras nas superfícies usadas, explicando a queda de efetividade dos princípios ativos.

Druggan et al. (1993 apud Beltrame, 2014, p. 82), destaca que as células estão envolvidas em uma matriz polimérica e são diferentes fenotipicamente de quando crescem em suspensão,

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_____________________________________________________________________________________________ Fabiana Pieniz Didonet (fabididonet@hotmail.com). Trabalho de Conclusão de Curso. Ijuí. DCEENG/UNIJUÍ, 2018 sendo uma das maiores diferenças o aumento da resistência, na ordem de 10 vezes a 100 vezes, aos agentes antimicrobianos.

Gráfico 1-Análise experimental da capacidade de sanitização após 3 horas da aplicação dos saneantes (0,5%), em superfícies de polipropileno novas e utilizadas na indústria alimentícia contaminadas por cepas de L. monocytogenes

Fonte: Beltrame, 2014

Ratti (2006), realizou um estudo com L. monocytogenes avaliando a capacidade inibitória dos saneantes ácido peracético e nisina, conforme apresentado no Gráfico 2, onde a nisina apresentou resultados ineficazes e o ácido peracético inibiu 100 % das colônias.

Gráfico 2- Análise experimental da capacidade de sanitização do ácido peracético (0,07%) e nisina

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Já nos resultados de Carandina (2017), apresentados na Tabela 1, dos cinco saneantes testados apenas o ácido peracético, cloreto de benzalcônio e digluconato de clorixidina foram eficientes em relação a inibição das colônias bacterianas.

Tabela 1-Análise da formação de colônias de L. monocytogenes, após sanitização e incubação de 24 horas

Saneante Resultado

Hipoclorito de sódio (2%) negativo Ácido peracético (2%) positivo

Tintura de iodo (2%) negativo Cloreto de benzalcônio (2%) positivo Digluconato de clorixidina (2%) positivo

Fonte: Carandina, 2017

No estudo de Kamazawa, Chaves e San’Ana (2016) utilizando os saneantes quaternário de amônio, hipoclorito de sódio, ácido peracético e hipoclorito de sódio, foi possível perceber, que para L. monocytogenes os saneantes dióxido de cloro e ácido peracético apresentaram melhores resultados, erradicando o crescimento dos microrganismos.

Avaliando os dados supracitados, nota-se que o ácido peracético apresentou melhor performance na inibição de L. monocytogenes, em relação aos outros saneantes testados. Além disso, é possível perceber que embora o hipoclorito de sódio é amplamente utilizado na indústria alimentícia, pode não ser a melhor escolha de saneante no combate desta bactéria específica. 4.2 VANTAGENS DE DESVANTAGENS DOS PRINCIPAIS SANEANTES UTILIZADOS

NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS

Sabe-se que diante dos diferentes tipos de saneantes disponíveis, os mais utilizados na indústria de alimentos são compostos de cloro, ácido peracético e o quaternário de amônio. (BELTRAME, 2009). De acordo com Silva (2010) algumas características são ideais para determinar o saneante a ser utilizado são: o poder de eliminação ou redução dos microrganismos de interesse, reatividade com o material a ser sanitizado, não possuir efeito residual no alimento, ser lavável, não irritar a pele, ser atóxico, facilidade na dosagem, ser hidrossolúvel e possuir compatibilidade com outros agentes químicos envolvidos no processo.

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Tabela 2-Vantagens e desvantagens do uso de compostos clorados, compostos de quaternário de amônio e ácido peracético na indústria de alimentos

Fonte: Nascimento, Delgado e Barbaric (2010), Rodríguez (2017), Lima et al. (2017), Silva, Dutra e Cadima (2010)

Na Tabela 2, estão descritas as principais vantagens e desvantagens dos compostos de cloro, ácido peracético e compostos quaternários de amônio, com base nos estudos de Nascimento,

Saneante Vantagens Desvantagens

⁕ Eficaz a baixas temperaturas; ⁕ Baixa estabilidade durante a

estocagem; ⁕ Não é corrosivo ao alumínio e aço

inox, nas concentrações recomendadas;

⁕ É necessário muitos cuidados com o manuseio do produto;

⁕ Não requer enxague da superfície; ⁕ Irritante à pele;

⁕ Inodoro na forma diluída; ⁕ Possui forte odor;

⁕ Tem pouco efeito residual devido os produtos de decomposição serem acido acético, agua e peróxido de hidrogênio;

⁕ É incompatível com ácidos, álcalis concentrados, borrachas naturais e sintéticas, ferro, cobre e alumínio; ⁕ Não gera problemas ao tratamento de

efluentes;

⁕ São os sanitizantes mais baratos encontrados no mercado;

⁕ Danificam juntas de peças de borrachas e reagem com matéria orgânica;

⁕ São eficazes em diferentes diluições; ⁕ Altamente corrosivo;

⁕ Possuem fácil preparo e aplicação; ⁕ Não são indicados para baixos

valores de pH;

⁕ A quantidade de matéria orgânica interfere na eficiência;

⁕ Podem irritar a pele, mucosa e vias respiratórias dos manipuladores; ⁕ Diminuem a eficiência se submetidos a altas temperaturas;

⁕ Possuem fácil preparo e aplicação; ⁕ Possuem forte odor;

⁕ Neutralizam odores; ⁕ O custo é elevado;

⁕ Podem ser utilizados na sanitização por sistema de imersão, aspersão e manual;

⁕ Pouco eficientes em meio ácido e em contato com proteínas;

⁕ Pssuem boa estabilidade e solubilidade em água;

⁕ Não são eficientes para bactérias gram negativas;

⁕ A toxicidade é relativamente baixa; ⁕ São irritantes para a pele;

Ácido peracético

Compostos Clorados

Compostos Quaternários de

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______________________________________________________________________________ Estudo sobre a utilização de saneantes na indústria alimentícia para controle de Listeria monocytogenes Delgado e Barbaric (2010), Rodríguez (2017) Lima et al. (2017) e Silva, Dutra e Cadima (2010), onde é possível notar que cada saneante possui suas particularidades, desta forma a escolha do produto adequado depende das particularidades do processo de cada indústria.

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5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

A partir do estudo desenvolvido, conclui-se que o saneante ácido peracético se destaca no controle de L. monocytogenes e o tipo de superfície interfere na performance de cada saneante. Além disso, cabe destacar a importância do estudo das condições do ambiente, a fim de encontrar saneantes adequados para o processo.

Algumas sugestões para trabalhos futuros:

-Retomar o estudo experimental da capacidade bactericida e inibitória de saneantes sobre L. monocytogenes.

-Avaliar o desempenho dos saneantes em diferentes superfícies, utilizando as mesmas condições de concentração e temperatura.