UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MATHEUS TONETTI GALENI
ETIOLOGIA DA PERDA AUDITIVA EM INDIVÍDUOS HETEROZIGOTOS PARA O locus DFNB1
CAMPINAS 2020
ETIOLOGIA DA PERDA AUDITIVA EM INDIVÍDUOS HETEROZIGOTOS PARA O locus DFNB1
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área de Concentração em Genética Médica.
ORIENTADOR: PROFª. DRA. EDI LÚCIA SARTORATO
CAMPINAS 2020
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO/TESE DEFENDIDA PELO ALUNO MATHEUS TONETTI GALENI, E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. EDI LÚCIA SARTORATO
MATHEUS TONETTI GALENI
ORIENTADOR (A): EDI LÚCIA SARTORATO
MEMBROS TITULARES:
1. PROF (A). DR (A). EDI LÚCIA SARTORATO
2. PROF (A). DR (A). ANDRÉA TREVAS MACIEL GUERRA
3. PROF (A). DR (A). CAMILA ANDRÉA DE OLIVEIRA
Programa de Pós-Graduação em (Ciências Médicas) da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
Dedico esse trabalho aos meus pais, minhas irmãs, meus tios, meus avós, meus primos meu namorado, meus amigos e a todos que estiveram presente nessa minha jornada.
meu caminho até aqui e ter me possibilitado chegar até aonde eu cheguei.
Gostaria de agradecer a minha orientadora Edi Lúcia Sartorato, por ter me aceitado e me orientado desde o começo, além de me proporcionar toda a base e estrutura necessária para o desenvolvimento desse projeto, muito obrigado por todo o conhecimento e paciência nesses anos todos.
Agradeço do fundo do meu coração meus amados pais Elaine e Ricardo que sem eles eu nada seria. Vocês foram essenciais por todo o meu desenvolvimento pessoal, me deram todo o suporte e ajuda possível e nunca me abandonaram. São as pessoas que eu mais amo no mundo, muito obrigado por tudo.
Agradeço as minhas irmãs Mayra e Beatriz. A Mayra com todo o seu jeito calmo e meigo sempre me ajudou no que foi preciso, além de estar se tornando uma bancária incrível. A Bia com seu jeito direto sempre me falou o que precisava escutar, mesmo eu sendo o irmão mais velho, além de estar se tornando uma fisioterapeuta apaixonada pela profissão me deu o meu sobrinho Felipe que foi o melhor presente na nossa família. Eu amo muito vocês e tenho muito orgulho de vocês, muito obrigado por tudo.
Agradeço aos meus avós paternos Arlindo e Maria por toda a paciência e aprendizado de vida e por nunca terem desistido de mim. Minha avó materna Maria Ignês por ter me ensinado a trabalhar desde cedo e a dar valor nas pequenas coisas, mesmo sendo brava as vezes eu aprendi muito com você. Gostaria também de agradecer ao meu avô Natalino que faleceu a alguns anos, você faz muita falta até hoje, mas muito obrigado por tudo.
Agradeço a todos os meus tios e tias por todo o ensinamento de vida, vocês sempre foram muito presentes em minha vida e me ensinaram o verdadeiro significado de família unida, são pessoas que eu amo de paixão, muito obrigado a todos vocês.
Agradeço as minhas primas e meus primos que se tornaram meus melhores amigos de infância, crescemos juntos e aprendemos juntos, eu amo demais vocês, e fico imensamente feliz por sermos primos, gostaria de agradecer em especial a minha prima Bruna, que além de ser minha prima é a minha irmã do coração, minha confidente e a minha companheira, te amo, e gostaria de agradecer por ter você em minha vida
momentos. Muito obrigado por tudo e muito obrigado por ser você, eu te amo demais.
E por último, não menos importante gostaria de agradecer a todos os meus amigos do laboratório Nadya, Marcela, Gisele, Helena e Mara que me ensinaram muito nesses anos, obrigado por todos os momentos maravilhosos que passamos juntos e também os que não foram tão maravilhosos assim, eu aprendi muito com vocês. Gostaria também de agradecer aos meus amigos da vida Thiago e Natalia por todos os momentos que passamos juntos e por toda a força que me deram nesses anos de mestrado, vocês me ajudaram muito. Eu amo cada um de vocês e não sei o que seria da minha vida sem ter amigos como vocês.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
desenvolvidos possui frequência de 1 em cada 1000 nascidos vivos. No Brasil, possui uma frequência estimada de 4 para cada 1000 nascimentos a variar dependendo da região. Até o momento foram identificados cerca de 75 genes relacionados a perda auditiva não sindrômica autossômica recessiva. Em muitas populações ocidentais, variantes apenas no gene GJB2, localizado no locus DFNB1, que codifica a conexina 26, são responsáveis por 50% da perda auditiva não sindrômica autossômica recessiva, sendo que a variante mais comum é a c.35delG, presente em 70% dos casos, e com uma frequência de portadores de 2 a 4% em algumas populações. Variantes no GJB6, localizado no locus DFNB1, também são uma causa comum de perda auditiva, muitas vezes associada a variantes no gene GJB2. Por sua vez, variantes em outro gene de conexina, o gene GJB3, já foram associadas a perda auditiva e doenças de pele. Estudos prévios também apontaram uma deleção no de PATJ em um paciente com perda auditiva. Esse gene não havia sido foi associado à perda auditiva anteriormente. Esse trabalho teve por objetivo estabelecer a prevalência e variantes nos genes GJB6, GJB3 e PATJ em pacientes com perda auditiva que permanecem com diagnóstico molecular inconclusivo e verificar se essas variantes estão associadas a alterações em outros genes de conexinas. A casuística incluiu 38 indivíduos não aparentados com perda auditiva pré-lingual não sindrômica que são heterozigotos para variantes no locus DFNB1. Para a busca de novas variantes no exon codificante dos genes GJB6 e GJB3 foi utilizado o sequenciamento de Sanger. Utilizou-se também da técnica de RFLP-PCR para o rastreio da variante R32W no gene GJB3. A técnica de PCR em tempo real foi realizada para se validar a presença de uma deleção no gene PATJ previamente identificada em um estudo anterior. Não foram encontradas alterações no exon codificante dos genes GJB6 e GJB3 que pudessem estar relacionadas à etiologia da perda auditiva nos pacientes estudados, e a deleção no gene PATJ não estava presente diante do resultado obtido pela técnica de PCR em tempo real. A associação de novas alterações em genes conexinas em indivíduos heterozigotos para o locus DFNB1 não foi observada pelas técnicas utilizadas nesse trabalho. Nesses casos, portanto, para um diagnóstico preciso recomenda-se o sequenciamento completo do genoma desses indivíduos.
it has a frequency of 1 in every 1000 live births. In Brazil, it has an estimated frequency of 4 for every 1000 births to vary depending on the region. To date, about 75 genes related to autosomal recessive non-syndromic hearing loss have been identified. In many western populations, variants only in the GJB2 gene, located in the DFNB1 locus, which codes for connexin 26, are responsible for 50% of autosomal recessive non-syndromic hearing loss, the most common variant being c.35delG, present in 70 % of cases, and with a carrier frequency of 2 to 4% in some populations. Variants in GJB6, located at the DFNB1 locus, are also a common cause of hearing loss, often associated with variants in the GJB2 gene. In turn, variants in another connexin gene, the GJB3 gene, have already been linked to hearing loss and skin diseases. Previous studies have also pointed out a deletion in PATJ in a patient with hearing loss. This gene had not been previously associated with hearing loss. This work aimed to establish the prevalence and variants in the GJB6, GJB3 and PATJ genes in patients with hearing loss who remain with an inconclusive molecular diagnosis and to verify whether these variants are associated with changes in other connexin genes. The sample included 38 unrelated individuals with non-syndromic pre-lingual hearing loss who are heterozygous for variants in the DFNB1 locus. To search for new variants in the exon encoding the GJB6 and GJB3 genes, Sanger sequencing was used. The RFLP-PCR technique was also used to screen for the R32W variant in the GJB3 gene. The real-time PCR technique was performed to validate the presence of a deletion in the PATJ gene previously identified in a previous study. There were no changes in the exon coding for the GJB6 and GJB3 genes that could be related to the hearing loss etiology in the studied patients, and the deletion in the PATJ gene was not present in view of the result obtained by the real-time PCR technique. The association of new alterations in connexin genes in heterozygous individuals for the DFNB1 locus was not observed by the techniques used in this work. In such cases, therefore, for an accurate diagnosis, complete sequencing of the genome of these individuals is recommended.
Figura 2. Ilustração representando a cóclea com visualização frontal e em secção transversal. Figura 3. Representação de uma herança digênica na qual em um alelo possui a variante c.35delG e o outro possui uma deleção no gene GJB6.
Figura 4. Esquema representando as deleções descritas no locus DFNB1.
Figura 5 – Imagem representando a conexina e a canal juncional que é formado nas Gap Junctions.
Figura 6. Representação das junções ocludentes. Em vermelho está a localização do gene PATJ e sua possível correlação com as junções ocludentes (tight junction).
Figura 7 – Fluxograma da metodologia utilizada para a triagem das variantes nos genes GJB6, GJB3 e PATJ
Figura 8 – Esquema representando a estratégia utilizada para o desenhos dos primes utilizados para a confirmação da deleção envolvento o gene PATJ.
Figura 9 – Ciclo utilizado para amplificação dos primers para o rastreio da deleção no gene PATJ.
Figura 10 – Ciclo utilizado no PCR em tempo real.
Figura 11 - Ciclo utilizado na amplificação do gene GJB3 para rastreio da variante R32W. Figura 12 – Ciclo utilizado na amplificação do gene GJB3
Figura 13 - Ciclos de amplificação para posterior sequenciamento do gene GJB3. Figura 14 – Ciclo utilizado na amplificação do gene GJB6.
Figura 15 - Ciclos de amplificação para posterior sequenciamento do gene GJB3. Figura 16- Eletroferograma com a variante p. F191S encontrada no gene GJB6.
Figura 17 - Modelagem do gene GJB6. Em A encontra-se o gene normal (wt) e em B o gene GJB6 com a variante p.F191S.
Figura 18 – Imagem mostrando a deleção de 18 kb do gene PATJ identificada pela técnica de CytoScan, gerada pelo programa ChAS. Seta em vermelho apontando a deleção.
Figura 19 – Resultado da PCR Multiplex mostrando que somente região interna da deleção (600 pb) foi amplificada.
Figura 20 - Imagem mostrando o resultado dos ensaios gerado pelo software CopyCaller v2.0, a amostra 3 corresponde ao paciente 396 OT que possui a deleção no gene PATJ segundo os resultados do CytoScan.
Tabela 2. Principais síndromes com perda auditiva
Tabela 3. Loci e genes relacionados à perda auditiva não-sindrômica autossômica dominante (DFNA).
Tabela 4. Loci e genes relacionados à perda auditiva não-sindrômica autossômica recessiva (DFNB)
Tabela 5. Tabela resumida com as variantes selecionadas de acordo com nosso banco de dados Tabela 7. Sequências dos primers utilizados para amplificação do gene GJB3 com a variante R32W e o tamanho do fragmento gerado
Tabela 8. Sequências dos primers utilizados para amplificação do gene GJB3 e o tamanho do fragmento gerado
Tabela 9. Sequências dos primers utilizados para amplificação do gene GJB6 e o tamanho do fragmento gerado
Tabela 10. Pacientes que foram utilizados no estudo, com as respectivas variantes Tabela 11. Variantes encontradas no sequenciamento do gene GJB3
Tabela 12. Tabela resumida com todas as alterações encontradas no gene GJB3. Destaca-se em vermelho a variante ainda não descrita.
Cx conexina dB Decibel
DFN locus de surdez não-sindrômica
DFNA locus de surdez não-sindrômica autossômica dominante DFNB locus de surdez não-sindrômica autossômica recessiva DGV DNA Ácido desoxirribonucleico
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético GJ Gap junction
Hz Hertz kb Kilobases ng Nanograma
OMS Organização Mundial de Saúde pb Par de base
PCR Polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase) pH Potencial de hidrogênio iônico
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição)
rpm Rotações por minuto
SNSAR Surdez sensorioneural não sindrômica autossômica recessiva V Voltagem
μL Microlitro μg Micrograma
1.1 Sistema auditivo ...15
1.2 Perda auditiva ...17
1.2.1 Classificação da perda auditiva ...18
1.2.2 Etiologia da perda auditiva ...19
1.2.3 Genética das perdas auditivas ...20
1.2.3.1 Perda auditiva não-sindrômica ...21
1.2.3.2 Perda auditiva não-sindrômica autossômica dominante (DFNA)...21
1.2.3.3 Perda auditiva não-sindrômica autossômica recessiva (DFNB) ...23
1.2.3.4 Gene GJB2 ...26
1.2.3.5 Indivíduos monoalélicos para o locus DFNB1 ...27
1.2.3.6 Gene GJB6 ...28 1.2.3.7 Gene GJB3 ...30 1.2.3.8 Conexinas ...31 1.2.4 Gene PATJ ...32 1.3 Justificativa ...35 2. OBJETIVOS ...36 2.1 Objetivo geral ...36 2.2 Objetivos específicos ...36 3. MÉTODOS ...37 3.1 Casuística ...37 3.2 Estudo molecular ...39 3.2.1 Extração de DNA ...39
3.3 Análise da deleção de 18kb no locus DFNA2B ...40
3.3.1 Estudo da deleção envolvendo o gene PATJ por PCR multiplex ...40
3.3.2 Confirmação da deleção no locus DFNA2B pela técnica de PCR em tempo real ...43
3.4 Gene GJB3 ...44
3.4.1 Rastreamento da variante R32W no gene GJB3 ...44
3.4.2 Sequenciamento do éxon codificante do gene GJB3 ...45
3.5 Gene GJB6 ...48
3.5.1 Sequenciamento do éxon codificante do gene GJB6 ...48
4. RESULTADOS...51
4.1 Estratégia de estudo utilizada: ...52
4.2 Rastreamento de variantes no gene GJB3 ...52
4.3 Gene GJB6 ...55
5.2 Gene GJB6 ...60 5.3 Gene PATJ ...60 6. CONCLUSÃO ...61 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...62 8. ANEXOS ...81
1. INTRODUÇÃO 1.1 Sistema auditivo
O sistema auditivo é um dos mais intrincado e sofisticado do corpo humano, tendo a responsabilidade de detectar as diferentes ondas sonoras presentes no ambiente e iniciar o processo de percepção e interpretação do som. Os detectores que estão presentes nesse sistema são capazes de transduzir fielmente vibrações tão pequenas quanto o diâmetro de um átomo, e podem responder mil vezes mais rápido que fotorreceptores visuais, permitindo assim, com uma maior facilidade a orientação inicial da cabeça e do corpo devido a resposta rápida a estímulos acústicos (Purves et al., 2004).
Em nossos ouvidos chegam uma grande variedade de ondas sonoras que são geradas no ambiente. Os diferentes sons produzidos possuem um amplo espectro de tons baixos e altos com uma variedade de intensidades. A orelha é o órgão sensorial que possui a capacidade de decifrar as diferentes frequências e intensidades sonoras geradas no ambiente e ao mesmo tempo transferir essa informação para o cérebro, permitindo assim, identificar sua direção e distância e reconhecer cada som gerado (Dror & Avhraham, 2009). O sistema auditivo é constituído pela orelha externa, média e interna, representados na figura 1, e cada segmento possui sua característica e função. A orelha externa é composta pelo pavilhão e canal auditivo externo (meato acústico), sendo que o pavilhão possui a função de captar a energia sonora gerada no ambiente e concentra-la no canal auditivo. A função do canal auditivo externo é proteger a orelha média e interna, transmitir os sons gerados para a membrana timpânica e ampliar algumas frequências de sons como uma câmara de ressonância.
.
Os ossículos martelo, bigorna e estribo compõem a orelha média; Estes são articulados e servem como uma conexão entre o tímpano e a janela oval da orelha interna. Esses ossículos servem como alavancas que aumentam as vibrações mecânicas, amplificando as vibrações das ondas sonoras. A orelha interna é composta pelos vestíbulos e canais semicirculares, que controlam a orientação espacial e o equilíbrio e pela cóclea que é responsável pela audição. Na orelha interna, ocorre a transformação das vibrações sonoras em sinais elétricos que chegam ao cérebro (Moussalle et al., 1997; Dror & Avrahan, 2009).
A cóclea (figura 2), que está presente na orelha interna, é o principal órgão responsável pela audição possuindo um formato de tubo helicoide com cerca de duas voltas e meia. Sua base localiza-se sobre a extremidade lateral do meato acústico interno (Moussalle et al. 1997). Esse órgão é dividido em três compartimentos que são preenchidos por fluídos. São eles: a escala média, vestibular e timpânica. A escala média é uma cavidade preenchida por endolinfa, situada entre a escala vestibular e timpânica, que são cavidades preenchidas por perilinfa, apresentando baixa concentração de potássio e alta concentração de sódio, enquanto que a endolinfa apresenta alta concentração de potássio e baixa concentração de sódio, assemelhando-se a fluidos intracelulares (Moller, 2006). Na escala média localiza-se o órgão de Corti, ou órgão Espiral, que é a região sensorial do sistema auditivo. Esse órgão, localizado na membrana basilar, é constituído por células sensoriais especializadas e células de suporte, denominadas células ciliadas. Estas, possuem uma distribuição altamente organizada: uma fila composta por células ciliadas internas e três filas compostas por células ciliadas externas. A porção apical das células ciliadas possui projeções especializadas ricas em actina, que são denominadas estereocílios. As células ciliadas internas possuem a capacidade de transformar a energia mecânica em um sinal elétrico (Dror & Avraham, 2009).
O princípio básico da audição consiste na transformação das ondas sonoras que são geradas no ambiente em impulsos nervosos que chegam ao cérebro. As ondas sonoras geradas são captadas pelo pavilhão auditivo e canalizadas para o tímpano. Ao atingir a membrana timpânica as ondas de descompressão e compressão alternadas do ar provocam o movimento do tímpano para frente e para trás. Logo, o tímpano passa a vibrar com a mesma frequência que a onda. Desse modo o tímpano transverte as vibrações sonoras em vibrações mecânicas que são propagadas para os ossículos (martelo, bigorna e estribo). As vibrações atingem primeiramente o martelo, que ao entrar em vibração aciona a bigorna e por último faz o estribo vibrar. Após serem ampliadas, as vibrações chegam a orelha interna, e os movimentos que acontecem na janela oval são propagados para a rampa timpânica e em seguida para a membrana de Reissner,
sendo então traduzidos em movimentos da endolinfa e consequentemente, da membrana tectórica sobre as células sensoriais do órgão espiral, também denominado órgão de Corti. Simultaneamente, a membrana basilar vibra e faz com que as células ciliares do órgão de Corti se agitem para trás e para frente; esse movimento flexiona os cílios nos pontos de contato com a membrana tectória. A flexão dos cílios excita as células sensoriais gerando impulsos nas terminações nervosas filamentares da cóclea que enlaçam essas células. Os impulsos gerados são então transmitidos através do nervo coclear até os centros auditivos do tronco encefálico e córtex cerebral, onde são interpretados. (Alberts et al. 1989; Casanova, 1997).
1.2 Perda auditiva
A perda auditiva é a doença sensorial mais comum em todo o mundo, afetando a integração social, a qualidade de vida e o desenvolvimento infantil dos pacientes, com grande impacto na saúde pública. Aproximadamente 466 milhões de pessoas (432 milhões de adultos
Secção transversal da cóclea
e 34 milhões de crianças) do mundo inteiro apresentam perda auditiva bilateral de grau moderado à profundo, o que corresponde a cerca de 6,3% da população mundial, aumentando ainda mais na população idosa. Cerca de 33% das pessoas acima de 65 anos de idade possuem algum tipo de deficiência auditiva. Estima-se que até 2050 mais de 900 milhões de pessoas (1 em 10) terão deficiência auditiva incapacitante (OMS, 2019).
Em países desenvolvidos, 1 a cada 1000 crianças nascem com algum grau de perda da audição, e na pulação acima de 60 anos cerca de 60% apresentam uma diminuição da capacidade auditiva conhecida como presbiacusia (Dror & Avraham, 2009). A frequência estimada no Brasil é de 4 a cada 1000 nascimentos (Piatto & Maniglia, 2004); entretanto, dependendo da região essa frequência pode variar de 2 a 7 para cada 1000 recém-nascidos (Russo et al., 2000). Na maioria dos casos, o diagnóstico da perda auditiva ocorre muito tarde, em torno de dois ou três anos de idade, o que pode impedir a percepção da fala, o desenvolvimento cognitivo e linguístico da criança (Buttross SL, 1995). Sabe-se que quanto mais cedo for realizado o diagnóstico, seguido da (re) habilitação auditiva e da adaptação de dispositivos de amplificação sonora, os resultados do desenvolvimento da linguagem e audição destas crianças serão melhores, uma vez que o sistema nervoso central apresenta uma maior flexibilidade no primeiro ano de vida (Santos et al., 2011).
No Brasil, cerca de 80 a 90% dos alunos que possuem algum grau de perda auditiva não conseguem completar o ensino fundamental e somente 5% dos que possuem perda auditiva profunda conseguem atingir níveis educacionais que se assemelham a pessoas sem nenhuma perda (Santos et al., 2011).
Simultaneamente ao diagnóstico precoce da perda auditiva e às estratégias de (re) habilitação, é de grande importância a busca da etiologia da perda auditiva, uma vez que conhecer a causa é essencial para avaliação do prognóstico, identificação de riscos associados, direcionamento na conduta a ser empregada na (re) habilitação, e para um aconselhamento genético efetivo (Santos et al., 2011).
1.2.1 Classificação da perda auditiva
Diferentes formas da perda auditiva podem ser classificadas, variando desde o grau de perda até a região afetada. Em relação a região afetada, pode-se classificar em condutiva, neurossensorial ou mista. Quando a causa for devido a problemas na orelha externo e/ou médio
a perda é classificada como condutiva; quando estiver associada a problemas no nervo coclear e/ou na orelha interna classifica-se em neurossensorial; e quando for devido à combinação de ambos os componentes, neurossensorial e condutivo, a mesma é classificada como mista (Ito et al., 2010).
A perda auditiva pode também ser classificada em pós-lingual ou pré-lingual. É definida como pós-lingual quando ocorre após o desenvolvimento da fala normal e pré-lingual quando a mesma está presente ao nascimento ou começa antes do desenvolvimento da fala. Além disso, pode ser bi ou unilateral, quando ocorre em ambas orelhas ou apenas em uma, respectivamente. (Angeli; Lin; Liu, 2012; Dror; Avraham, 2010; Hilgert; Smith; Van Camp, 2009; Kochhar; Hildebrand, 2007).
Em relação ao grau, a perda auditiva é classificada de acordo com a frequência em Hertz (Hz), podendo variar entre leve (de 26 a 40 dB), moderada (de 41 a 70 dB), severa (de 71 a 90 dB) e profunda (acima de 90 dB). (Silman; Silverman, 1997).
1.2.2 Etiologia da perda auditiva
A perda auditiva pode ser devido a fatores genéticos ou ambientais (tabela 1). Dentre estes, os fatores ambientais compreendem cerca de 40-50% dos casos, devido ao o uso de fármacos ototóxicas, infecções, frequente exposição a ruídos de grande intensidade, entre outros. Em relação aos fatores genéticos (50-60%), variantes em elementos regulatórios ou em genes que estão envolvidos na estrutura, na função ou no desenvolvimento adequado da orelha levam a perda auditiva em diferentes graus (Dror & Avraham, 2009).
Nos países desenvolvidos as frequências variam, 60% dos casos correspondem a perda auditiva de origem genética, 30% adquirida e 10% etiologia idiopática (causa desconhecida) (Bitner-Glindzicz M et al., 2002). Nos países em desenvolvimento, devido as condições precárias em relação a saúde e saneamento básico da população, a etiologia da perda auditiva de causa ambiental ainda é muito frequente, além disso, um grande número de casos, cerca de 32%, é de causa idiopática (Pupo et al., 2008).
Estudos relacionando a prevalência da perda auditiva na população brasileira ainda são escassos; no entanto, em um estudo realizado em 1992 identificou-se que 67% dos casos eram devidos a fatores ambientais, 15% devido a fatores genéticos e 18,5 % permaneciam idiopáticos (Simões e Maciel-Guerra, 1992).
Tabela 1. Descrição das principais causas da perda auditiva.
(Bitner-Glindzicz, 2002)
1.2.3 Genética das perdas auditivas
A utilização de técnicas avançadas em genômica e biologia molecular, permitiu o desenvolvimento de pesquisas associadas à perda auditiva genética, ajudando a esclarecer a grande e complexa rede de genes e os mecanismos moleculares que comandam a função, a resposta ao trauma, o desenvolvimento e o envelhecimento da orelha interna. Esses esclarecimentos são de grande importância para um diagnóstico mais preciso, para a implementação de uma terapia de maior eficiência no tratamento da perda auditiva e principalmente para o aconselhamento genético adequado para as famílias.
Devido à grande quantidade de genes que são expressos na cóclea fica evidente a complexidade existente nos mecanismos moleculares que estão envolvidos nesse órgão (Heller et al., 1998). Até o presente momento, cerca de 170 loci e 118 genes já foram descritos e relacionados a perda auditiva. Entretanto, as estimativas sugerem que este número atinja cerca de 300 genes (correspondendo a 1% do genoma humano), uma vez que muitos loci foram Pré-Natal Utilização de medicamentos ototóxicos durante a gestação
Exposição a radiação durante a gestação Icterícia grave
Perinatal Trauma no parto
Ambiental Anóxia Meningite Sarampo Pós-Natal Otite Caxumba Traumatismo
Exposição contínua a sons de alta intensidade Autossômico Dominante
Autossômico Recessivo Sindrômico Ligado ao X
Genético Mitocondrial
Autossômico Dominante Não sindrômico Autossômico Recessivo
Ligado ao X Mitocondrial
Infecções congênitas(sífilis, toxoplasmose, rubéola, citomegalovirus, herpes)
mapeados, mas os genes correspondentes ainda permanecem sem identificação (Van Camp & Smith RJH, 2018).
1.2.3.1 Perda auditiva não-sindrômica
Cerca de 70% dos casos de perda auditiva não-sindrômica de origem genética são monogênicos, sendo observado, todos os tipos de herança. Devido a sua grande heterogeneidade, o diagnóstico etiológico é difícil de ser estabelecido.
Para facilitar a representação dos loci e genes relacionados a perda auditiva uma nomenclatura padronizada e uma classificação comum têm sido usadas (HUGO Gene Nomenclature Committee, http://www.genenames.org/). Os loci relacionados a perda auditiva não-sindrômica são nomeados pelo radical DFN, derivado do inglês deafness, e são acrescido das letras A ou B conforme a forma de transmissão. DFNA significa que a perda auditiva é autossômica dominante e DFNB que é autossômica recessiva. Quando há apenas o radical DFN isso significa que a transmissão da perda auditiva é ligada ao cromossomo X. O número que acompanha cada uma dessas nomenclaturas é sequencialmente colocado de acordo com a ordem cronológica de descoberta do locus.
Em relação aos padrões de herança, cerca de 75 a 80% dos casos de perda auditiva genética não-sindrômica são de herança autossômica recessiva, 20 a 25% autossômica dominante e cerca de 1 a 2% ligada ao cromossomo X. Além disso, estima-se que 1% seja de herança mitocondrial (Kokotas et al., 2007; Hilgert et al., 2009).
1.2.3.2 Perda auditiva não-sindrômica autossômica dominante (DFNA)
A perda auditiva não-sindrômica autossômica dominante (DFNA) corresponde a 20% dos casos, geralmente apresentando as formas neurossensorial, pós-lingual e progressiva (Hilgert et al., 2009a; Smith et al., 2014). Até o presente momento já foram mapeados 44 genes distribuídos em 41 loci que estão relacionados a herança autossômica dominante (van Camp & Smith. Hereditary Hearing Loss Homepage. <Http://hereditaryhearingloss.org>) (tabela 3).
Tabela 3. Loci e genes relacionados à perda auditiva não-sindrômica autossômica dominante (DFNA).
Locus Gene Referência
DFNA1
DFNA2A KCNQ4 (KUBISCH et al., 1999) DFNA2B GJB3 (XIA et al., 1998) DFNA2C IFNLR1 (GAO et al., 2017) DFNA3A GJB2 (KELSELL et al., 1997) DFNA3B GJB6 (GRIFA et al., 1999) DFNA4A MYH14 (DONAUDY et al., 2004) DFNA4B CEACAM16 (ZHENG et al., 2011) DFNA5 GSDME/DFNA5 (VAN LAER et al., 1998) DFNA6/14/38 WFS1 (BESPALOVA et al., 2001)
(YOUNG et al., 2001) DFNA7 LMX1A (WESDORP et al., 2018) DFNA8/12 TECTA (VERHOEVEN et al., 1998) DFNA9 COCH (ROBERTSON et al., 1998) DFNA10 EYA4 (WAYNE et al., 2001) DFNA11 MYO7A (LIU et al. 1997) DFNA13 COL11A2 (MCGUIRT et al., 1999) DFNA15 POU4F3 (VAHAVA et al., 1998) DFNA17 MYH9 (LALWANI et al., 2000) DFNA20/26 ACTG1 (ZHU et al., 2003)
(VAN WIJK et al., 2003) DFNA22 MYO6 (MELCHIONDA et al., 2001) DFNA23 SIX1 (MOSRATI et al., 2011) DFNA25 SLC17A8 (RUEL et al., 2008) DFNA27 REST (NAKANO et al., 2018) DFNA28 GRHL2/TFCP2L3 (PETERS et al., 2002) DFNA34 NLRP3 (NAKANISHI et al., 2017) DFNA36 TMC1 (KURIMA et al., 2002) DFNA37 COL11A1 (BOOTH et al., 2018)
(Modificado de Van Camp; Smith, 2019)
Os genes predominantes associados a DFNA são: GJB2, COCH, TETCA, KCNQ4e WFS1. Os genes GJB2 e TECTA estão associados tanto ao padrão autossômico recessivo quanto dominante. Entretanto, ainda são escassos na população brasileira estudos envolvendo os genes associados à perda auditiva autossômica dominante.
1.2.3.3 Perda auditiva não-sindrômica autossômica recessiva (DFNB)
A perda auditiva não-sindrômica autossômica recessiva ocorre em 80% dos casos e é tipicamente pré-lingual, neurossensorial bilateral de grau severo/profunda e atingindo geralmente todas as frequências (Hilgert et al., 2009; Morton,1991; Van Laer et al., 2003).
Até o momento já se tem cerca de 73 genes distribuídos em 69 loci numerados de forma crescente em relação à ordem de descoberta (Tabela 4).
DFNA40 CRYM (ABE et al., 2003) DFNA41 P2RX2 (YAN et al., 2013A)
DFNA44 CCDC50 (MODAMIO-HØYBJØR et al., 2007) DFNA50 MIRN96 (MENCÍA et al., 2009)
DFNA51 TJP2 (WALSH et al., 2010A) DFNA56 TNC (ZHAO et al., 2013) DFNA64 SMAC/DIABLO (CHENG et al., 2011) DFNA65 TBC1D24 (AZAIEZ et al., 2014) (ZHANG et al., 2014) DFNA66 CD164 (NYEGAARD et al., 2015) DFNA67 OSBPL2 (XING et al., 2015)
(THOENES et al., 2015) DFNA68 HOMER2 (AZAIEZ et al., 2015) DFNA69 KITLG (SECO et al., 2015) DFNA70 MCM2 (GAO et al., 2015)
DFNA73 PTPRQ (EISENBERGER et al., 2017)
− DMXL2 (CHEN et al., 2016)
− MYO3A (GRATI et al., 2016)
Tabela 4. Loci e genes relacionados à perda auditiva não-sindrômica autossômica recessiva (DFNB).
Locus Gene Referência
DFNB1A GJB2 (KELSELL et al., 1997) DFNB1B GJB6 (DEL CASTILLO et al., 2002)
DFNB3 MYO15A (WANG et al., 1998) DFNB4 SLC26A4 (LI et al., 1998) DFNB6 TMIE (NAZ et al., 2002) DFNB7/11 TMC1 (KURIMA et al., 2002) DFNB8/10 TMPRSS3 (SCOTT et al., 2001) DFNB9 OTOF (YASUNAGA et al., 1999) DFNB12 CDH23 (BORK et al., 2001)
DFNB16 STRC (VERPY et al., 2001)
DFNB18B OTOG (SCHRADERS et al., 2012) DFNB21 TECTA (MUSTAPHA et al., 1999) DFNB22 OTOA (ZWAENEPOEL et al., 2002) DFNB23 PCDH15 (AHMED et al., 2003A) DFNB24 RDX (KHAN et al., 2007)
DFNB25 GRXCR1 (SCHRADERS et al., 2010A) DFNB26 GAB1 (YOUSAF et al., 2018) DFNB28 TRIOBP (SHAHIN et al., 2006)
(RIAZUDDIN et al., 2006A) DFNB29 CLDN14 (WILCOX et al., 2001) DFNB30 MYO3A (WALSH et al., 2002) DFNB31 WHRN (MBURU et al., 2003)
DFNB35 ESRRB (COLLIN et al., 2008) DFNB36 ESPN (NAZ et al., 2004) DFNB37 MYO6 (AHMED et al., 2003B) DFNB39 HGF (SCHULTZ et al., 2009) DFNB42 ILDR1 (BORCK et al., 2011)
DFNB44 ADCY1 (SANTOS-CORTEZ et al., 2014) DFNB48 CIB2 (RIAZUDDIN et al., 2012) DFNB49 MARVELD2 (RIAZUDDIN et al. 2006) DFNB49 BDP1 (GIROTTO et al., 2013) DFNB32/105 CDC14A (DELMAGHANI et al., 2016)
(IMTIAZ et al., 2017) (LIU et al. 1997) (WEIL et al., 1997) DFNB15/72/95 GIPC3 (AIN et al., 2007) (CHARIZOPOULOU et al., 2011) (REHMAN et al., 2011)
DFNB18 USH1C (AHMED et al., 2002) (OUYANG et al., 2002)
(Modificado de Van Camp; Smith, 2019)
DFNB53 COL11A2 (CHEN et al., 2005) DFNB57 PDZD7 (BOOTH et al, 2015) DFNB59 PJVK (DELMAGHANI et al., 2006) DFNB60 SLC22A4 (BEN SAID et al., 2016) DFNB61 SLC26A5 (LIU et al., 2003)
DFNB63 LRTOMT/COMT2 (AHMED et al., 2008)(DU et al., 2008) DFNB66 DCDC2 (GRATI et al., 2015) DFNB66/67 LHFPL5 (TLILI et al., 2005) (SHABBIR et al., 2006) (KALAY et al., 2006) DFNB68 S1PR2 (SANTOS-CORTEZ et al., 2016) DFNB70 PNPT1 (VON AMELN et al., 2012) DFNB73 BSND (RIAZUDDIN et al., 2009) DFNB74 MSRB3 (WARYAH et al., 2009)
(AHMED et al., 2011) DFNB76 SYNE4 (HORN et al., 2013) DFNB77 LOXHD1 (GRILLET et al., 2009) DFNB79 TPRN (REHMAN et al., 2010)
(LI et al., 2010 DFNB82 GPSM2 (WALSH et al. 2010) DFNB84A PTPRQ (SCHRADERS et al. 2010) DFNB84B OTOGL (YARIZ et al., 2012) DFNB86 TBC1D24 (REHMAN et al., 2014) DFNB88 ELMOD3 (JAWOREK et al., 2013) DFNB88 KARS (SANTOS-CORTEZ et al., 2013) DFNB91 SERPINB6 (SIRMACI et al., 2010)
DFNB93 CABP2 (SCHRAUWEN et al., 2012) DFNB94 NARS2 (SIMON et al., 2015) DFNB97 MET (MUJTABA et al., 2015) DFNB98 TSPEAR (DELMAGHANI et al., 2012) DFNB99 TMEM132E (LI et al., 2015)
DFNB100 PPIP5K2 (YOUSAF et al., 2018)
DFNB101 GRXCR2 (IMTIAZ; KOHRMAN; NAZ, 2014) DFNB102 EPS8 (BEHLOULI et al., 2014)
DFNB103 CLIC5 (SECO et al., 2015)
DFNB104 FAM65B (DIAZ-HORTA et al., 2014) DFNB105 CDC14A (DELMAGHANI et al., 2016) DFNB106 EPS8L2 (DAHMANI et al., 2015) DFNB108 ROR1 (DIAZ-HORTA et al., 2016) − WBP2 (BUNIELLO et al., 2016) − ESRP1 (ROHACEK et al., 2017) − MPZL2 (WESDORP et al., 2018) − GRAP (LI et al., 2019)
Em ordem decrescente de frequência, os genes que estão mais envolvidos na perda auditiva não sindrômica autossômica recessiva são GJB2, SLC26A4, MYO15A, OTOF, CDH23 e TMC1 (Hilgert, Smith, Van Camp, 2009).
1.2.3.4 Gene GJB2
O gene GJB2 localizado no cromossomo 13q11-q12, no locus DFNB1, codifica a proteína conexina 26 (Cx26) com 226 aminoácidos, que está associada à comunicação celular por meio de gap junctions (GJ), sendo o primeiro gene a ser relacionado à perda auditiva sensorioneural não-sindrômica com padrão autossômico recessivo (Kelsell et al.,1997). Nesse gene já foram descritas cerca de 310 variantes, algumas bastante frequentes e outras raras (Krawczak & Cooper, 2011). A associação entre conexinas formam hexâmeros denominados conéxons, que estão presentes na membrana celular e formam canais que possibilitam a passagem de íons e pequenas moléculas entre membranas celulares. Esse fluxo é um processo fundamental para o funcionamento da audição, pois permite a reciclagem de íons potássio nos fluidos cocleares. Alterações na Cx26 interferem na homeostase iônica da orelha interna, o que leva ao acúmulo extracelular de potássio, resultando em morte celular.
Variantes no gene GJB2 são responsáveis por aproximadamente 50% de todas as perdas auditivas não-sindrômicas (Chen K et al., 2014; Dai P et al., 2009; Rabionet et al., 2000). A c.35delG é a variante mais comum associada a esse gene, correspondendo a cerca de 70% dos casos de perda auditiva de origem genética e apresentando um padrão de herança autossômico recessivo (Snoeckx et al., 2005). Essa variante leva a um stop códon prematuro devido a uma deleção de uma guanina (G) em uma série de seis guaninas que se estende da posição 30 à 35 desse mesmo gene; com isso, é gerado um polipeptídeo truncado com 12 aminoácidos ao invés do polipeptídio normal, com 226 aminoácidos (Denoyelle et al., 1997). Essa variante é muito frequente em heterozigose, podendo ser encontrada em até 4% dos indivíduos, dependendo da população estudada (Gasparini et al., 2000). Em 2007, foi realizado um estudo por Oliveira e colaboradores em 10 cidades brasileiras de diferentes regiões. Esses autores rastrearam a variante c.35delG em recém-nascidos e encontraram uma frequência média para essa variante em heterozigoze de 1:74.
Pacientes que são homozigotos para c.35delG geralmente apresentam uma perda auditiva não progressiva, pré-lingual, prevalentemente de grau severo a profundo. Entretanto,
o grau de perda pode variar dentro de famílias afetadas e até mesmo entre os grupos estudados (Denoyelle et al., 1999; Santos et al., 2005). Tal variabilidade sugere que variações em outros genes codificadores de conexina poderiam compensar a inatividade da conexina 26 na cóclea, modificando assim os efeitos dessa variante (Steel, 1999). Essas modificações poderiam também explicar o fato de indivíduos que são monoalélicos para variantes no gene GJB2 apresentarem perda auditiva mesmo que essa variante esteja associada a um padrão de herança autossômico recessivo.
1.2.3.5 Indivíduos monoalélicos para o locus DFNB1
Variantes no locus DFNB1 compreendem cerca de 50% dos casos de perda auditiva não sindrômica autossômica recessiva. Nesse locus estão localizados os genes GJB2, que codifica a proteína conexina 26, e o gene GJB6, que codifica a conexina 30 (Chen et al., 2014; Dai et al., 2009; Rabionet et al., 2000).
Cerca de 10 a 40% dos indivíduos com perda auditiva apresentam variantes recessivas no gene GJB2 detectadas em apenas um dos alelos, o que dificulta o correto aconselhamento genético e o diagnóstico molecular desses pacientes (Wilcox et al., 2000).
Algumas hipóteses foram desenvolvidas para explicar a perda auditiva associada a variantes em somente um alelo: (1) existência de variantes na região não codificante do gene GJB2, o que afetaria a sua expressão; (2) variantes em outros genes que interagem com o alelo normal do gene GJB2, resultando no fenótipo deficiente; (3) relação casual e não causal de variantes no gene GJB2, que não estariam, portanto, relacionada à perda auditiva nesses casos. Em 2002, Del Castillo e colaboradores puderam explicar o fenótipo de perda auditiva em alguns de seus pacientes após detectarem grandes deleções no gene GJB6, próximo ao gene GJB2, segregando com a perda auditiva em diversas famílias (Figura 3).
Figura 3. Representação de uma herança digênica na qual em um alelo possui a variante c.35delG e o outro possui uma deleção no gene GJB6.
1.2.3.6 Gene GJB6
O gene GJB6 codifica a proteína conexina 30 (Cx30) e está localizado no locus DFNB1, a 35 kb do gene GJB2 em direção ao telômero. Possui 261 aminoácidos e apresenta 77% de similaridade quando comparado à conexina 26. Assim como a conexina 26 a conexina 30 também está associada à comunicação celular (gap junctions) através do fluxo de pequenas moléculas, incluindo íons, metabólitos e moléculas de sinalização celular controlando a homeostase da cóclea (Ahmad et al., 2003; Marlin et al., 2005).
Ao analisar indivíduos com perda auditiva, portadores de variantes no gene GJB2 em heterozigose, Del Castillo e colaboradores (2002) encontraram duas grandes deleções no cromossomo 13 que se estendiam da região proximal do gene GJB2 até a o gene GJB6. Eles denominaram essas deleções del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854), com 342 kb e 232 kb deletados, respectivamente (Del Castillo et al., 2002; Del Castillo et al., 2005). Na população espanhola, 50% dos indivíduos com perda auditiva heterozigotos para o gene GJB2 apresentam a variante del(GJB6-D13S1830) e 25% apresentam a del(GJB6-D13S1854), o que pode justificar a perda auditiva nesses pacientes. Um estudo multicêntrico realizado no Brasil em colaboração com um grupo espanhol revelou que 25,5% dos pacientes heterozigotos para variantes no gene GJB2 apresentavam a del(GJB6-D13S1830) e 6,3% apresentavam a del(GJB6-D13S1854) (Del Castillo et al., 2005).
Na tentativa de esclarecer a interação entre os genes GJB2 e GJB6, vários estudos foram realizados e algumas hipóteses foram desenvolvidas. Uma das hipóteses sugere que a interação entre esses dois genes é um padrão complexo de herança digênica, já que tanto a Cx26 quanto a Cx30 são expressos nas mesmas estruturas da orelha interna (Lautermann et al., 1998). Supõe-se que a perda da Cx26 ou da Cx30 possa alterar os hemicanais e a formação dos canais juncionais (Xia et al., 2001; Forge et al., 2002). Esses canais, compostos por conexinas 26 e 30, apresentam sinalização intercelular catiônica duas vezes mais rápida que a efetuada por canais homotípicos (Sun et al., 2005). Outra hipótese seria a inativação do gene GJB2 pela deleção de elementos regulatórios desse gene presentes nas regiões eliminadas do gene GJB6. Trabalhos envolvendo ensaios imuno-histoquímicos e análises de bioinformática de possíveis elementos regulatórios corroboram com essa teoria (Common et al., 2005; Snoeckx et al., 2005).
Mais recentemente, em estudos realizados por Wilch e colaboradores (2006, 2010) foi encontrado uma terceira deleção nessa mesma região que foi denominada del (CHR13:19,837,344-19,968698). Esta segregava com a perda auditiva sensorioneural não-sindrômica, em quatro membros de uma família alemã que eram heterozigotos para a c.35delG e apresentavam perda auditiva profunda e bilateral. Essa deleção, de 131,4 kb, tem pontos de quebra localizado a mais de 100 kb upstream do sítio de início da transcrição dos genes GJB2 e GJB6. Os pesquisadores observaram que ela reduzia a expressão de ambos os genes, e sugeriram que isso fosse devido à perda de um elemento cis regulador ainda não conhecido que controlaria a co-expressão dos genes GJB6 e GJB2.
Em um estudo realizado por Feldmann e colaboradores (2009) foi identificado uma deleção de aproximadamente 920 kb que removia tanto o gene GJB2 como o gene GJB6. Essa deleção foi observada em um indivíduo que apresentava perda auditiva profunda pré-lingual e era heterozigoto para a variante V84M no gene GJB2.
Para explicar a alta frequência de deleções nessa região, surgiu a hipótese de que a sequência Alu presente no íntron 2 do gene GJB6 pudesse contribuir para a ocorrência das deleções devido a recombinação homóloga com outras repetições ao longo do locus DFNB1. Algumas pesquisas sugerem que recombinações Alu/Alu causam deleções e são comuns nos organismos (Deininger et al., 1999). A figura 4 abaixo representa a localização das deleções já descritas na região DFNB1.
Figura 4. Esquema representando as deleções descritas no locus DFNB1.
1.2.3.7 Gene GJB3
O gene GJB3 codifica a proteína conexina 31 (Cx31) e está localizado no cromossomo 1p35.1. Variantes nesse gene estão associadas a perda auditiva e doenças de pele (eritrokeratodermia variabilis). Variantes relacionadas a perda auditiva não sindrômica foram originariamente reportadas com um padrão autossômico dominante (DFNA2) na população chinesa (Xia et al. 1998). Entretanto, Liu e colaboradores (2000) relataram um padrão de herança autossômica recessiva de perda auditiva não-sindrômica para essa mesma população. Foram também detectados portadores de variantes no gene GJB3 em heterozigoze com audição normal, em contraste com outros heterozigotos que apresentaram perda auditiva progressiva, como é o caso da variante p.R32W, em que ocorre a troca de uma arginina por um triptofano. Assim, até o momento, não se sabe ao certo a relação dessa variante com a perda auditiva e a sua frequência em outras populações (Rouan et al., 2003).
Variantes no gene GJB3 foram também associadas a doenças de pele com padrão de herança dominante e recessivo (Plantard et al.. 2003; Richard et al. 1997; 1998; 2000). Portanto, parece que variantes nesse gene podem resultar diferentes fenótipos, com diferentes formas de perda auditiva transmitidas de modo recessivo ou dominante.
1.2.3.8 Conexinas
No genoma humano foram encontrados até o momento 21 genes de conexinas (Söhl & Willecke, 2004). As conexinas (Cx) são proteínas que formam os canais das junções gap (junções comunicantes do tipo fenda). Esses canais estão responsáveis pela comunicação direta entre células adjacentes possibilitando a trocas de eletrólitos, mensageiros secundários e metabólitos do citoplasma de uma célula para outra (Pfeilsticker et al., 2004).
Para diferenciar os componentes da família das conexinas, utilizou-se como um dos parâmetros os pesos moleculares, em kDa, advindos das sequências de cDNA (Bennett et al., 1995; Dhein, 1998; Sosinsky & Nicholson, 2005). Foi utilizado também outro sistema de nomenclatura que divide as proteínas das junções gap em duas categorias, alfa e beta, de acordo com semelhanças na sequência de nucleotídeos e de aminoácidos (Gimlich et al., 1990; Willecke et al., 2001; Segretain & Falk, 2004). Por exemplo, Cx26, proteína de 26 kD, é designada proteína beta-2 (B2) das junções fenda (GJ, do inglês gap junction), ou seja, GJB2 (NCBI, MIM *121011).
As conexinas estão organizadas na membrana plasmática sob a forma de hexâmeros, constituindo o hemicanal juncional, comumente chamado de conexon (Makovski et al., 1977; Dermietzel & Spray, 1993). Doze conexinas interagem para formar um canal juncional completo (gap junction), seis conexinas na membrana plasmática de uma célula se encaixar com hexâmetros compatíveis em uma célula adjacente (figura). (Koval et al., 2014). Os conexons são denominados segundo sua composição de conexinas como canais homotípicos ou heterotípicos e como canais homoméricos ou hetereméricos (Kelsell et al., 2001).
Pode-se classificar o canal juncional das seguintes formas: (1) homomérico – homotípico, onde o canal é formado por dois hemicanais idênticos e formados pela mesma conexina; (2) homomérico– heterotípico, o canal é formado por dois conexons diferentes, sendo que os conexons em si são formados pela mesma conexina, por exemplo um conexon e formado pela conexina 26 e o outro e constituído pela conexina 31; (3) heteromérico – homotípico, onde o canal e formado por dois conexons iguais, sendo que estes são formados por conexinas diferentes, estando as conexinas de um conexon alinhadas com conexinas de mesmo tipo no outro conexon, por exemplo Cx26 com Cx26, Cx31 com Cx31; (4) heteromérico – heterotípico ou biheteromérico, onde o canal e formado por dois conexons diferentes, e estes também são
formados por conexinas diferentes, estando as conexinas de um conexon alinhadas com conexinas diferentes no outro conexon (Kumar & Gilula, 1996).
Figura 5 – Imagem representando a conexina e a canal juncional que é formado nas Gap Junctions.
1.2.4 Gene PATJ
Em um estudo anterior sugeriu-se a possibilidade de uma deleção no gene PATJ em um paciente heterozigoto para a variante 35delG no gene da Cx26. A relação desse gene com a perda auditiva ainda não foi reportada na literatura (Jacob, 2016).
O gene PATJ, localizado no cromossomo 1 p31.3, codifica uma proteína com múltiplos domínios PDZ, que interage com outras proteínas que estão envolvidas na cascata de sinalização das junções ocludentes (Tight junction) (Figura 5).
Os domínios PDZ são domínios estruturais que ajudam na ancoragem de proteínas transmenbrana ao citoesqueleto e são os responsáveis por mediar as interações que ocorrem entre proteína-proteína e proteínas com múltiplos domínios PDZ organizando-se frequentemente como complexos multiméricos na membrana plasmática. Essa proteína está localizada a partir das junções ocludentes até a membrana apical das células epiteliais (Philipp et al., 1997).
Figura 6. Representação das junções ocludentes. Em vermelho está a localização do gene PATJ e sua possível correlação com as junções ocludentes (tight junction).
As regiões onde ocorrem as interações entre células ou entre células e substrato são especializações da membrana plasmática formada por um complexo de proteínas associadas à membrana plasmática, a moléculas do citoesqueleto e a matriz extracelular. Estes complexos incluem as junções de ancoramento (junções aderentes, desmossomas e hemidesmossomas), as junções tipo fenda e as junções ocludentes (tight junction), (Duffy et al., 2002).
As junções ocludentes (tight junction) são compostas por pelo menos três tipos de proteínas transmembrana, ocludina, claudina e moléculas de adesão juncional, além da “placa”
INADL PARD
citoplasmática, composta de muitas proteínas diferentes que formam grandes complexos (Figura 3). As proteínas transmembranares medeiam a adesão celular e constituem as barreiras de difusão intramembranar (espaço entre a membrana externa e da membrana interna de uma célula) e paracelular (espaço entre duas células). A “placa” citoplasmática é constituída por três principais complexos multiproteicos: o complexo proteína ZO, o complexo CRB3-Pals1-PATJ e o complexo PAR-3-aPKC-PAR-6. O complexo de proteínas ZO organiza as proteínas transmembranares pela associação a outras proteínas citoplasmáticas e microfilamentos de actina. Por sua vez, os complexos CRB3 e PAR, proteínas evolutivamente conservadas, estão envolvidos no estabelecimento e manutenção de polaridade celular epitelial. Além dos três complexos multiproteicos que fazem parte da placa citoplasmática e que estão associadas constitutivamente as junções ocludentes, outras proteínas com funções diferentes já foram identificadas, como por exemplo, as proteínas de andaime, MUPP1 e MAGI-1, proteínas adaptadoras, reguladores de transcrição e fatores de processamento de RNA, proteínas reguladoras, GTPases e proteínas G, cinases e fosfatases e proteínas de choque térmico. Todas essas proteínas estão envolvidas em processos de união da junção, regulação de barreira, transcrição de genes, e outros caminhos ainda não compreendidos (Schneeberger, et al., 2004). As conexinas são proteínas estruturais constituintes dos canais de junções do tipo fenda, que desempenham uma importante função na regulação da homeostasia tecidual por meio de concentrações iônicas e da manutenção do pH (Alberts, et al., 2007; Dbouk et al., 2009). As conexinas interagem nas placas juncionais com diversos componentes celulares (elementos do citoesqueleto, fosfatases e enzimas cinases), moléculas de adesão e moléculas sinalizadoras. Sabe-se que o gene CLDN14, que está localizado no cromossomo 21 (21q22), codifica a proteína claudina (239 aminoácidos), um dos componentes das junções intercelulares de oclusão ou zônulas de oclusão (tight junctions). As junções de oclusão limitam a difusão passiva de íons e pequenas moléculas através do espaço intercelular, além de manter a polaridade celular juntamente com o citoesqueleto e com as junções de adesão (proteína caderina-23). Na cóclea, o gene é expresso nas células ciliadas e nas células de sustentação. Variantes nesse gene são responsáveis por perda auditiva autossômica recessiva (DFNB29) (Ahmed et al., 2002).
1.3 Justificativa
A grande heterogeneidade genética adicionada ao fato de que a maioria dos genes envolvidos na perda auditiva hereditária levam a um quadro clínico indistinguível entre diferentes genes, tornam o diagnóstico molecular das perdas auditivas complexo e difícil. Nesse sentido, novas tecnologias classificadas como “high-throughput” (alto rendimento) vêm sendo desenvolvidas oferecendo uma importante contribuição no esclarecimento da etiologia de várias perdas auditivas, assim como também, de outras patologias de origem genética. É importante diminuir o número de indivíduos com etiologia da perda auditiva não esclarecida por meio de estudos que permitam o diagnóstico molecular das perdas auditivas, principalmente nos heterozigotos para o locus DFNB1.
2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral
Determinar a etiologia genética da perda auditiva em indivíduos que permanecem com o diagnóstico inconclusivo.
2.2 Objetivos específicos
Investigar a presença de variantes nos genes GJB3 e GJB6 em indivíduos monoalélicos o locus DFNB1 e também com diagnóstico molecular indefinido;
Confirmar a presença da deleção do gene PATJ em um indivíduo com perda auditiva sensorioneural não sindrômica autossômica recessiva (SNSAR) monoalélicos para variantes no locus DFNB1.
3. MÉTODOS 3.1 Casuística
Foram selecionados 46 indivíduos previamente rastreados quanto à presença de variantes mais frequentemente encontradas em indivíduos com perda auditiva neurossensorial não-sindrômica, sendo elas: a variante c.35delG, a variante intrônica IVS1+1G>A e outras variantes na região codificante do gene GJB2 (conexina 26); as deleções del(GJB6- D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene GJB6 (conexina 30); e a variante mitocondrial m.A1555G no gene MT-RNR1. Desses, 38 eram heterozigotos para o locus DFNB1 e compreendiam o grupo 1 de pacientes nesse estudo, e em 8 pacientes nenhuma alteração havia sido observada, os quais compreendiam o grupo 2 (tabela 5). Esses 8 pacientes com diagnóstico molecular indefinido foram incluídos com o intuito de se verificar a relação do gene PATJ com a SNSAR.
Foi realizado o rastreamento da variante R32W no gene GJB3 em 38 pacientes do grupo 1 e em 21 pacientes desse mesmo grupo foi sequenciado todo o éxon codificante dos genes GJB3 e GJB6. No paciente 396 OT do grupo 1 (heterozigoto para o locus DFNB1 – 35delG/N), no qual foi previamente identificado uma deleção de aproximadamente 18 kb no locus DFNA2B pela técnica de análise cromossômica em microarrays (CytoScan™ HD Array (Affymetrix), assim, foi incluída na casuística e realizada a técnica de PCR em tempo real e PCR Multiplex para análise dessa região envolvendo o gene PATJ. No grupo 2, foram sequenciados os 8 pacientes para os genes GJB3 e GJB6 (figura 6).
Tabela 5 – Tabela resumida com as variantes selecionadas de acordo com o banco de dados disponível no laboratório de genética humana no CBMEG/UNICAMP.
Grupo Gene Nº paciente(s) Variantes
33 35delG/N 1 35delG/N + del 18kb 1 35delG/V153I 1 35delG/R127H 1 K168R/N GJB6 1 del(GJB6 - D13S1854/N Grupo 2 _ 8 N/N 34 GJB2 Grupo 1
Os pacientes foram selecionados a partir do banco de dados do laboratório de Genética Humana do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) da UNICAMP. Todos possuem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido assinado, pois tratam-se de pacientes que já participaram de um estudo anterior aprovado pelo Comitê de Ética (Parecer CEP: 196/2006), não necessitando de novas coletas. Entretanto, no caso dos parentes que foram utilizados para análise de segregação, serão realizadas coletas de sangue, mediante assinatura do TCLE. Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, sob. No 3.402.625 (anexo 1).
Os pacientes já possuíam avaliação audiológica (emissões otoacústicas e potenciais evocados auditivos de tronco encefálico, audiometria tonal e/ou vocal, impedanciometria), para comprovar a perda auditiva sensorioneural. Assim como dados sobre a história clínica dos pacientes.
3.2 Estudo molecular
3.2.1 Extração de DNA
Foi realizada a extração de DNA genômico a partir de leucócitos que foram obtidos em 10 a 15 mL de sangue periférico coletados em tubos do tipo Vacutainer com anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético dissódico 2H2O 0,5 M pH 8,0). Para a realização do mesmo seguiu-se o método de extração com fenol e clorofórmio, de acordo com o protocolo do Laboratório de Genética Molecular Humana do CBMEG.
Inicialmente adicionou-se 35 mL de Solução A (Tris-HCl 10 mM pH 8,0;Triton-X 100 a 1%; Sacarose 0,32 M; MgCl2 5 mM) em um tubo Falcon de 50 mL, junto com o sangue, para que ocorresse a lise das hemácias. Após ser homogeneizado, o tubo foi mantido no gelo por 30 minutos.
Posteriormente, os tubos passaram por um processo de centrifugação a 2.000 rpm, por 15 min, a uma temperatura de 4°C. O sobrenadante resultante foi descartado e o precipitado (pellet) ressuspenso em 35 mL de Solução A. Este último procedimento foi repetido até que se obtivesse um pellet de coloração clara e livre de hemácias.
Após esse passo, adicionou-se 1 mL da solução B 1X (EDTA 20 mM;Tris-HCl 20 mM pH 8,0; NaCl 20 mM) e 250 μL de solução C (para 1 mL de solução C: 0,5 mL de SDS 10% e 0,5 mL de solução B 1X, 1 mg de Proteinase K [Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemanha] ). O material foi incubado em banho-maria a 56°C por 2 horas, ou, em alguns casos, a 37°C por 18 horas.
Após a incubação, foi realizado a purificação do DNA genômico com fenol-clorofórmio. Adicionou-se 2 mL de TE 1X (EDTA 1 mM;Tris-HCl 10 mM, pH 8,0) e uma quantidade suficiente de fenol (Merck, Darmstadt, Alemanha) saturado com Tris-HCl 10 mM pH 8,0 até que o volume da amostra fosse dobrado. Então realizou-se a homogeneização por inversão lenta dos tubos por 5 minutos.
Para separação e recuperação da fase aquosa (sobrenadante), centrifugou-se os tubos a 2.500 rpm, por 15 minutos, em temperatura ambiente. Descartou-se o precipitado e o sobrenadante foi passado para um tubo tipo Falcon de 15 mL. Repetiu-se esse procedimento duas vezes, primeiro substituindo o fenol por solução de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1; v:v:v) e por último com solução de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1; v:v) (Merck, Darmstadt, Alemanha).
Para que o DNA fosse precipitado, acrescentou-se 0,1 ml do volume da amostra de acetato de sódio 3 M pH 5,5 e 2,5 volumes de etanol absoluto (Merck, Darmstadt, Alemanha) gelado. Capturou-se o DNA com auxílio de uma haste plástica esterilizada e foram adicionadas algumas gotas de etanol 70% para a retirada do excesso de sal. Esperou-se 30 minutos para a secagem, após esse período, as hastes foram colocadas em tubos tipo Eppendorf de 1,5 mL e as amostras foram ressuspensas em um volume de 200 μL de TE 1X.
3.3 Análise da deleção de 18kb no locus DFNA2B
3.3.1 Estudo da deleção envolvendo o gene PATJ por PCR multiplex
Para o rastreamento da deleção envolvendo do gene PATJ pela técnica de PCR multiplex, foram sintetizados dois pares de primers. O primeiro par se encontrava na extremidade da deleção, enquanto que o segundo par se encontrava no meio (figura 7). Partimos do pressuposto que mesmo que os pares externos estivessem a 18kb de distância, com a deleção
eles ficariam mais próximos que seria possível amplificar a região. As sequências dos primers e o tamanho dos fragmentos resultantes são mostrados na tabela 6.
Figura 8 – Esquema representando a estratégia utilizada para o desenhos dos primes utilizados para a confirmação da deleção envolvento o gene PATJ.
Tabela 6- Tabela com as sequências dos primers utilizados para o rastreio da deleção no gene PATJ.
Para a reação de PCR utilizou-se cerca de 200 a 500 ng de DNA genômico, 20 pmol de cada primer (direto e reverso), 2,5 μL da enzima Taq DNA polimerase em Tampão de PCR 10X (Tris-HCl 10mM pH 8,8), 25 mM de MgCl2 e 200μM de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) completando com água ultrapura até o volume final de 50μL.
Realizou-se as amplificações no aparelho termociclador Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems), com 30 ciclos de aquecimento a 95°C para a desnaturação do DNA, seguido do anelamento dos primers com temperatura de 58°C, e por último a fase de extensão das fitas com uma temperatura de 72°C. As condições da PCR estão resumidas na figura 7. Após a amplificação as amostras foram coradas com brometo de etídio (Sigma) e a visualização foi realizada em gel de agarose a 1%.
Figura 9 – Ciclo utilizado para amplificação dos primers para o rastreio da deleção no gene PATJ. Par Primers 5' 3' Tamanho (pb)
1 PATJ_1(new)_F GAAAATTGCCAGCTCCTTTG
PATJ_1(new)_R TCCATCTTCTGTCTCACTTTGC 472 2 PATJ_2(new)_F CCAAAGAAGTAAATAGCCATGGAG
3.3.2 Confirmação da deleção no locus DFNA2B pela técnica de PCR em tempo real
Para a reação de PCR em Tempo real (qPCR) foram adicionados 4μL de DNA genômico diluído a 5 ng/μL em uma placa de 96 poços específica (MicroAmp - Fast 96-Well Reaction Plate 0,1mL - Applied BiosystemsTM), foi feito um mix contendo 10μL de 2X TaqMan® Genotyping Master Mix, 1μL do TaqMan® Copy Number Assay em solução estoque de 20X, 1μL da TaqMan® Copy Number Reference Assay 20X e por último 4μL da Nuclease-free water totalizando um volume final de 20μL.
Após misturar o mix junto ao DNA a placa foi selada com um filme óptico adesivo e em seguida centrifugada para a retirada das bolhas. As amplificações de Real-Time foram realizadas no equipamento Applied Biosystems® 7500 fast, sendo realizado 40 ciclos de aquecimento a 95ºC para a desnaturação do DNA, seguido da temperatura de 60ºC para o anelamento e extensão. As condições da qPCR estão resumidas na figura 8. Após a amplificação os resultados foram analisados pelos programas 7500 Fast Software v2.3 e CopyCaller v2.1.
3.4 Gene GJB3
3.4.1 Rastreamento da variante R32W no gene GJB3
Para o rastreio da variante, foi realizado a técnica de RFLP-PCR. A sequência dos primers e o tamanho do fragmento são mostrados na tabela a seguir (tabela 7).
Tabela 7 - Sequências dos primers utilizados para amplificação do gene GJB3 com a variante R32W e o tamanho do fragmento gerado.
Para a reação de PCR utilizou-se cerca de 200 a 500 ng de DNA genômico, 20 pmol de cada primer (direto e reverso), 2,5 μL da enzima Taq DNA polimerase em Tampão de PCR 10X (Tris-HCl 10mM pH 8,8), 25 mM de MgCl2 e 200μM de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) completando com água ultrapura até o volume final de 40μL.
Realizou-se as amplificações no aparelho termociclador Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems), com 30 ciclos de aquecimento a 95°C para a desnaturação do DNA, seguido do anelamento dos primers com temperatura de 62°C, e por último a fase de extensão das fitas com uma temperatura de 72°C. As condições da PCR estão resumidas na figura 7. Após a amplificação as amostras foram coradas com brometo de etídio (Sigma) e a visualização foi realizada em gel de agarose a 1% para posterior digestão.
Par Primers 5' - 3' Tamanho (pb)
1 CX31_ 1F TTCCTCTAATTCTCTCAGGTAGGC
Figura 11 - Ciclo utilizado na amplificação do gene GJB3 para rastreio da variante R32W.
Após a visualização das bandas em gel de agarose 1%, as amostras foram digeridas utilizando-se a enzima Hpa II. Na presença da variante R32W a enzima cliva, gerando 2 fragmentos de tamanhos diferentes, em contrapartida, sem a variante somente 1 fragmento é gerado. Foram adicionados 10 μL do produto da PCR, 7 μL de H2O ultrapura, 2 μL do tampão React 8 e 1 μL da enzima Hpa II totalizando um volume final de 20 μL.
A digestão foi realizada no aparelho termociclador Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) a uma temperatura de 37°C overnight. Posteriormente foi realizada a inativação da enzima a 65°C por 20 minutos, que ocorreu no mesmo aparelho. Os produtos digeridos foram corados com brometo de etídio (Sigma) e visualizados em gel de agarose 1,5%.
3.4.2 Sequenciamento do éxon codificante do gene GJB3
O éxon codificante do gene GJB3, que possui 813 pb, foi dividido em dois para amplificação pela técnica de PCR e posterior sequenciamento de Sanger para rastreio de novas variantes. As sequências dos primers e o tamanho dos fragmentos resultantes são mostrados na Tabela 8.
Tabela 8 -Sequências dos primers utilizados para amplificação do gene GJB3 e o tamanho do fragmento gerado.
Par Primers 5' - 3' Tamanho (pb)
2 CX31_all_2F CTGCAGCTCATCTTCGTCAC
CX31_all_2R TCACTCAGCCCCTGTAGGAC 660
Para a reação de PCR utilizou-se cerca de 200 a 500 ng de DNA genômico, 20 pmol de cada primer (direto e reverso), 2,5 μL da enzima Taq DNA polimerase em Tampão de PCR 10X (Tris-HCl 10mM pH 8,8), 25 mM de MgCl2 e 200μM de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) completando com água ultrapura até o volume final de 40μL.
Realizou-se as amplificações no aparelho termociclador Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems), com 30 ciclos de aquecimento a 95°C para a desnaturação do DNA, seguido do anelamento dos primers com temperatura de 62°C, e por último a fase de extensão das fitas com uma temperatura de 72°C. As condições da PCR estão resumidas na figura 7. Após a amplificação as amostras foram coradas com brometo de etídio (Sigma) e a visualização foi realizada em gel de agarose a 1%
Figura 12 – Ciclo utilizado na amplificação do gene GJB3.
Purificou-se os fragmentos amplificados pela técnica de PCR utilizando-se o kit Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System (Promega Corporation, EUA). Após esse processo a pureza e a quantidade das amostras de DNA foram determinadas por densidade óptica em espectrofotômetro NanoDrop® ND-8000 (Thermo Scientific).
Realizou-se o sequenciamento das amostras no sequenciador automático ABI PRISM® 3700 DNA Analyzer utilizando-se o BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem, EUA), seguindo-se o protocolo recomendado pelo fabricante. Para o preparo das reações foram utilizados:
40-80ng de DNA
