UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E AMBIENTAIS ENGENHARIA AMBIENTAL
JADY RANI MATOS ALVES
EFEITO DE BORDA SOBRE OS MICRORGANISMOS DO SOLO EM
FRAGMENTO FLORESTAL DO PARQUE NACIONAL DO IGUAÇU
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
MEDIANEIRA 2017
JADY RANI MATOS ALVES
EFEITO DE BORDA SOBRE OS MICRORGANISMOS DO SOLO EM
FRAGMENTO FLORESTAL DO PARQUE NACIONAL DO IGUAÇU
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito parcial à obtenção do título de Engenheiro Ambiental, do Departamento Acadêmico de Ciências Biológicas e Ambientais da Universidade Tecnológica Federal do Paraná.
Orientadora: Prof.ª Dra. Marcia Antonia
Bartolomeu Agustini
Co-orientadora: Prof.ª Dra. Cristhiane Rohde
MEDIANEIRA 2017
TERMO DE APROVAÇÃO
EFEITO DE BORDA SOBRE OS MICRORGANISMOS DO SOLO EM FRAGMENTO FLORESTAL DO PARQUE NACIONAL DO IGUAÇU
por
JADY RANI MATOS ALVES
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi apresentado em 30 de novembro de 2017 como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Engenharia Ambiental. A candidata foi arguida pela Banca Examinadora composta pelos professores abaixo assinados. Após deliberação, a Banca Examinadora considerou o trabalho aprovado.
__________________________________ Marcia Antonia Bartolomeu Agustini
Prof.ª. Orientadora ___________________________________ Cristhiane Rohde Prof.ª. Co-Orientadora ___________________________________ Leandro Finger Membro titular ___________________________________ Fabio Palczewski Pacheco
Membro titular
Ministério da Educação
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Campus Medianeira
Diretoria de Graduação e Educação Profissional Departamento Acadêmico de Ciências Biológicas e Ambientais
Engenharia Ambiental
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente aos meus amados pais, pelo incentivo e apoio. Obrigada pelos ensinamentos, pela dedicação, pelo companheirismo, pelos conselhos e especialmente pelos exemplos.
A toda minha família, por todo amor e dedicação, e por sempre estarem presentes na minha vida, principalmente nos momentos mais importantes para mim.
Agradeço a Prof. Dra. Marcia Antonia Bartolomeu Agustini, por sua orientação, ensinamento e paciência, pois sem seu conhecimento, não seria capaz de realizar esse trabalho.
A Prof. Dra. Cristhiane Rohde, por sua co-orientação, pela confiança depositada, pelas colaborações no desenvolvimento deste trabalho e por acrescentar parte do seu conhecimento.
A todos os professores que colaboraram para minha formação, e em especial, ao Prof. Dr. Anderson Sandro da Rocha, Prof. Dr. Laercio Mantovani Frare e Prof. Thiago Edwiges, por transmitir parte do conhecimento para a realização deste trabalho.
A toda equipe do Laboratório de Microbiologia UTFPR-MD, e especialmente ao Ademir e a Gabriela, que colaboraram com as análises.
A Leandro Finger pela colaboração durante as coletas e a Francielle Fernandes por toda a ajuda durante as análises.
A Bruna Ataíde, pela amizade, pela confiança depositada, por todo o apoio ao longo do desenvolvimento deste trabalho e por toda ajuda para a realização do mesmo.
Aos meus amigos, pela preocupação, pelo carinho, pela paciência, pelos cuidados, pelo companheirismo e principalmente por me ajudarem a acreditar que eu era capaz.
De modo em geral agradeço a todas as pessoas que participaram em algum momento dessa caminhada, que de alguma forma me incentivaram e acreditaram em mim e que estiveram presentes no meu cotidiano, nos bons e maus momentos.
Há homens que lutam um dia e são bons, há outros que lutam um ano e são melhores, há os que lutam muitos anos e são muito bons. Mas há os que lutam toda a vida e estes são imprescindíveis. (BRECHT, Bertolt, 1939)
RESUMO
ALVES, JADY R. M. Efeito de Borda sobre os Microrganismos do Solo em Fragmento Florestal do Parque Nacional do Iguaçu. 2017. 57 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Engenharia Ambiental) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Medianeira, 2017.
Quando o assunto é sustentabilidade, a conservação da biodiversidade é vista como um dos maiores desafios da sociedade deste final de século. Como consequência do alto índice de ações antrópicas no meio ambiente, alguns ecossistemas tiveram sua estrutura parcialmente ou completamente alterada. Um dos principais efeitos causados por essas ações é a fragmentação de ecossistemas e, como resultado, a formação de bordas, sendo responsável por causar alterações nos meios físicos, químicos e biológicos, tornando essa área limítrofe diferente do restante do fragmento. Dentre as principais espécies afetadas pelo efeito de borda, estão os microrganismos edáficos, por apresentarem grande sensibilidade a alterações físicas e químicas no ambiente. Como a fragmentação florestal e, consequentemente, o efeito de borda afetam diretamente os microrganismos edáficos, o estudo da composição microbiana do solo do fragmento é considerado eficaz para a análise de efeito de borda. Amostras foram coletadas em duas áreas do Parque Nacional do Iguaçu, uma com sucessão ecológica avançada e outra com sucessão ecológica intermediária (antiga Estrada do Colono) e foram realizadas análises químicas do solo para índice de matéria orgânica, pH, fósforo e nitrogênio, e análises das populações microbianas presentes para actinobactérias, bactérias celulolíticas, bactérias solubilizadoras de fosfato e fungos. As populações de actinobactérias apresentaram grande sensibilidade ao efeito de borda em ambas ás áreas de estudo, variando 66% na primeira área, desde o ponto inicial ao ponto final, no interior do fragmento, e a segunda área apresentou 58% de variação no desenvolvimento. As populações de fungos apresentaram maior influência das atividades antrópicas e variaram em 58% na primeira área de estudo, desde o ponto com maior atividade antrópica para o de menor atividade, e 63% na segunda área. A matéria orgânica apresentou baixa diferença entre os pontos, com exceção do ponto de maior atividade antrópica na segunda área de estudo, que variou em 28% dos demais pontos. Os índices de fósforo apresentaram grandes diferenças apenas nos pontos localizados na área de sucessão ecológica intermediária, devido ao processo de regeneração do solo, atingindo variação de 35%. Os valores de pH se apresentaram sem grandes variações e ambas as áreas estudadas. O número de plantas rasteiras apresentou grandes diferenças entre os pontos de maior atividade antrópica em ambas as áreas, com variação de 46% na primeira área e 87% na segunda área.
ABSTRACT
ALVES, JADY R. M. Edge Effect on Soil Microorganisms on Forest Fragment of Iguaçu National. 2017. 57 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Engenharia Ambiental) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Medianeira, 2017.
When it comes to sustainability, biodiversity conservation is seen as one of society's greatest challenges at the turn of the century. As a consequence of the high index of anthropogenic actions in the environment, some ecosystems had their structure partially or completely altered. One of the main effects caused by these actions is the fragmentation of ecosystems and, as a result, the formation of edges, being responsible for causing changes in the physical, chemical and biological means, making this area bordering different from the rest of the fragment. Among the main species affected by the formation of borders are edaphic microorganisms, because they have great sensitivity to physical and chemical changes in the environment. As forest fragmentation and consequently edge effect directly affect edaphic microorganisms, the study of soil microbial composition of the fragment is considered to be effective for edge effect analysis. Samples were collected in two areas of the Iguaçu National Park, one with advanced ecological succession and another with intermediate ecological succession (former Estrada do Colono), and soil chemical analyzes were performed for organic matter index, pH, phosphorus and nitrogen, and analyzes of the microbial populations present for actinobacteria, cellulolytic bacteria, phosphate solubilizing bacteria and fungi. Actinobacteria populations showed great sensitivity to edge effect in both study areas, ranging from 66% in the first area, from the initial point to the final point, within the fragment, and the second area showed a 58% developmental variation. Fungi populations showed greater influence of anthropic activities and varied in 58% in the first area of study, from the point with greater anthropic activity to the one with less activity, and 63% in the second area. The organic matter showed a low difference between the points, except for the point of greatest anthropic activity in the second area of study, which varied in 28% of the other points. The phosphorus indices presented great differences only in the points located in the area of intermediate ecological succession, due to the process of soil regeneration, reaching variation of 35%. The pH values were presented without great variations and both areas studied. The number of undergrowth plants showed great differences between the points of greatest anthropic activity in both areas, with a variation of 46% in the first area and 87% in the second area.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Localização do Parque Nacional do Iguaçu no Estado do Paraná ... 18
Figura 2 - Localização do Parque Nacional do Iguaçu com destaque para a antiga Estrada do Colono, sendo um dos pontos de análises dos microrganismos do solo 29
Figura 3 - Localização dos pontos de coleta das amostras de solo para análise de microrganismos nas duas extensões selecionadas do Parque Nacional do Iguaçu . 30
Figura 4 - Esquema da localização dos pontos de coleta das amostras de solo para análise de plantas rasteiras nas duas extensões selecionadas do Parque Nacional do Iguaçu ... 37
Fotografia 1 - Demarcação da área de 30 x 100 cm e preparação do solo para coleta da amostra no Parque Nacional do Iguaçu, Serranópolis do Iguaçu, Paraná, outubro de 2017 ... 30
Fotografia 2 - Colônias de actinobactérias isoladas em Placas de Petri correspondentes as amostras de solo da “ÁREA 1” do Parque nacional do Iguaçu e seus respectivos pontos de coleta (Pontos 0, 200 e 400) ... 32
Fotografia 3 - Colônias de actinobactérias isoladas em Placas de Petri correspondentes as amostras de solo da “ÁREA 2” do Parque nacional do Iguaçu e seus respectivos pontos de coleta (Pontos 0, 200 e 400) ... 33
Fotografia 4 - Colônias de fungos isoladas em Placas de Petri correspondentes as amostras de solo da “ÁREA 1” do Parque nacional do Iguaçu e seus respectivos pontos de coleta (Pontos 0, 200 e 400) ... 36
Fotografia 5 - Colônias de fungos isoladas em Placas de Petri correspondentes as amostras de solo da “ÁREA 2” do Parque nacional do Iguaçu e seus respectivos pontos de coleta (Pontos 0, 200 e 400) ... 36
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Composição por litro do meio de cultura Ágar Caseína Amido ... 32
Tabela 2 – Composição por litro do meio de cultura Ágar Carboximetilcelulose ... 33
Tabela 3 – Composição por litro do meio de cultura para isolamento de Bactérias Solubilizadoras de Fosfato ... 34
Tabela 4 - Análise química do solo ao longo do gradiente borda-interior em duas áreas no Parque Nacional do Iguaçu, Serranópolis, PR ... 38
Tabela 5 - Levantamento de plantas rasteiras ao longo do gradiente borda-interior em duas áreas no Parque Nacional do Iguaçu, Serranópolis, PR ... 40
Tabela 6 - Levantamento de Actinobactérias na diluição 10-1 ao longo do gradiente borda-interior em duas áreas no Parque Nacional do Iguaçu, Serranópolis, PR ... 41
Tabela 7 - Levantamento de Fungos na diluição 10-1 ao longo do gradiente borda-interior em duas áreas no Parque Nacional do Iguaçu, Serranópolis, PR ... 43
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 12 1.1 OBJETIVOS ... 14 1.1.1 Objetivo Geral ... 14 1.1.2 Objetivos Específicos ... 14 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 15
2.1 FRAGMENTAÇÃO DE ECOSSISTEMAS E HABITATS NATURAIS ... 15
2.1.1 Fragmentação Natural ... 15
2.1.2 Fragmentação Antrópica ... 15
2.1.3 Efeito de Borda ... 16
2.2 PARQUE NACIONAL DO IGUAÇU ... 17
2.2.1. Estrada do Colono ... 18
2.3 IMPORTÂNCIA DOS MICRORGANISMOS NO SOLO ... 20
2.3.1 Bactérias ... 21
2.3.1.1 Actinobactérias ... 22
2.3.1.2 Bactérias celulolíticas ... 23
2.3.1.3 Bactérias solubilizadoras de fosfato ... 24
2.3.2 Fungos ... 25 2.4 CONTAGEM DE MICRORGANISMOS ... 26 2.4.1 Técnica Spread-Plate ... 27 3 METODOLOGIA ... 28 3.1 ÁREA DE ESTUDO ... 28 3.2 AMOSTRAGEM ... 28
3.3 ANÁLISE QUÍMICA DO SOLO ... 31
3.4 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA ... 31
3.4.1 Contagem de Microrganismos ... 31
3.4.1.1 Actinobactérias ... 31
3.4.1.2 Bactérias celulolíticas ... 33
3.4.1.3 Bactérias solubilizadoras de fosfato ... 34
3.4.1.4 Fungos ... 35
3.5 ANÁLISE DE PLANTAS RASTEIRAS ... 37
4.1 ANÁLISE QUÍMICA DO SOLO ... 38
4.2 ANÁLISE DE PLANTAS RASTEIRAS ... 40
4.3 CONTAGEM DE MICRORGANISMOS ... 41
4.3.1 Actinobactérias ... 41
4.3.2 Bactérias celulolíticas ... 42
4.3.3 Bactérias Solubilizadoras de Fosfato ... 42
4.3.4 Fungos ... 43
5 CONCLUSÃO ... 45
1 INTRODUÇÃO
Quando se trata de sustentabilidade, um dos maiores desafios encontrados pela sociedade deste final de século é a conservação da biodiversidade, já que, devido ao alto índice de ações antrópicas no meio ambiente, alguns ecossistemas tiveram sua estrutura parcialmente ou completamente alterada, e muitos destes não poderão ser restaurados (VIANA; TABANEZ, 1996).
Um dos principais efeitos causados por essas ações é a fragmentação de ecossistemas (VIANA; TABANEZ, 1996), que ocorre quando há a subdivisão de uma determinada região. Essa fragmentação pode ocorrer de forma natural, porém, são poucos os casos, sendo mais frequentes àquelas ocasionadas por um conjunto de ações antrópicas (DALE; PEARSON, 1997).
A formação de bordas é uma das principais consequências da fragmentação, sendo responsável por causar alterações nos meios físicos, químicos e biológicos, tornando essa área limítrofe diferente do restante do fragmento. Diversos estudos realizados em fragmentos florestais indicam que fatores como incidência de luz, temperatura, umidade, taxa de decomposição, riqueza de espécies e interações bióticas podem sofrer alterações conforme varia o gradiente borda-interior (MURCIA, 1995; DAVIES-COLLEY; PAYNE; VAN ELSWIJK, 2000; BONASSA, 2004).
A formação das bordas origina um efeito conhecido como efeito de borda, que ocorre quando dois ecossistemas adjacentes estão separados por brusca transição. Estes ecossistemas adjacentes ainda interagem entre si (MURCIA, 1995), porém, há alteração significativa na biodiversidade na extensão limítrofe do fragmento (FORMAN; GODRON, 1986), causada principalmente pela ação do meio externo sobre essa extensão (TABANEZ; VIANA; DIAS, 1997). Segundo Laurance; Bierregaard (1997), o efeito de borda é o agente principal na alteração da biodiversidade em habitats fragmentados.
O Parque Nacional do Iguaçu é uma Unidade de Conservação Brasileira localizada no estado do Paraná. Foi transformado em Parque Nacional em 1939 e pertence a “lista de Patrimônios Naturais da Humanidade” pela UNESCO desde 1986 (IBAMA, 1999; GOVERNO DO BRASIL, 2014). O parque tem como objetivo básico preservar ecossistemas naturais de grande relevância para região e,
principalmente, a amostra do Bioma Mata Atlântica (Floresta Estacional Semidecidual) remanescente no estado (IBAMA, 1999).
Em 1950 foi aberto um trecho de 17,6 quilômetros da Rodovia PR-495, denominado Estrada do Colono, que corta ao meio o Parque Nacional do Iguaçu (JUSTIÇA FEDERAL, 2001; BONASSA, 2004). Em 2003, a Justiça Federal tornou legal o pedido do IBAMA para reintegração de posse deste trecho e a liminar de interdição da Estrada vem sendo cumprida desde então (BONASSA, 2004).
A Estrada do Colono acentuou intensamente o efeito de borda, já que cortava ao meio o Parque Nacional do Iguaçu, fazendo com que os dois fragmentos formados sofressem com esse efeito. Apesar da faixa de estrada ser pequena quando comparada a área total de ocupação do Parque, a sua abertura é capaz de diminuir de forma extrema a efetividade do mesmo em proteger o ecossistema que contém (FERREIRA, 1998).
Dentre as espécies afetadas pelo efeito de borda, estão os microrganismos presentes no solo, responsáveis pela degradação da matéria orgânica e ciclagem de nutrientes, em especial pela conversão do nitrogênio atmosférico em compostos nitrogenados (BIDONE; POVINELLI, 1999), tornando-os acessíveis à vegetação local e acarretando no aumento da fertilidade do solo (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
Na degradação da matéria orgânica, algas, protozoários, insetos e suas larvas possuem participação efetiva (EMBRAPA, 2005), porém, segundo Bidone; Povinelli (1999) as bactérias, os actinomicetos (actinobactérias) e os fungos são considerados os principais grupos envolvidos nesse processo. Esses microrganismos, por serem comuns em diferentes tipos de solo, e sensíveis a alterações no ecossistema são vistos como indicadores biológicos de qualidade do solo.
O presente trabalho tem como objetivo estudar os efeitos de borda biológicos diretos sobre a composição microbiana do solo em uma extensão do Parque Nacional do Iguaçu, localizada no município de Serranópolis do Iguaçu, na região Oeste do estado do Paraná, a fim de determinar a abundância geral de actinobactérias, bactérias celulolíticas, bactérias solubilizadoras de fosfato e fungos e comparar a composição e concentração de microrganismos do solo.
1.1 OBJETIVOS
1.1.1 Objetivo Geral
Avaliar o gradiente de efeito-borda sobre a composição microbiana do solo em fragmento florestal no Parque Nacional do Iguaçu.
1.1.2 Objetivos Específicos
• Determinar e comparar a abundância geral de actinobactérias, bactérias celulolíticas, bactérias solubilizadoras de fosfato e fungos no solo em diferentes extensões ao longo do gradiente borda-interior Parque Nacional do Iguaçu;
• Determinar e comparar a composição química do solo para os parâmetros pH, índice de fósforo e quantidade de matéria orgânica em diferentes extensões ao longo do gradiente borda-interior Parque Nacional do Iguaçu;
• Determinar e comparar o número de plantas rasteiras em diferentes extensões do Parque Nacional do Iguaçu;
• Comparar o efeito de borda sobre os parâmetros avaliados em uma área em intermediário de sucessão ecológica (antiga Estrada do Colono), com uma área em estágio avançado se sucessão ecológica no Parque Nacional do Iguaçu.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 FRAGMENTAÇÃO DE ECOSSISTEMAS E HABITATS NATURAIS
A fragmentação é o termo que define alterações de um ecossistema original, seja ele terrestre ou aquático, que ocorre quando há a subdivisão de um determinado habitat contínuo em diversos fragmentos, podendo estes estarem muito isolados do habitat original (DALE e PEARSON, 1997), fazendo com que haja uma diferença nas condições ambientais do entorno (SHAFER, 1990). Essa fragmentação pode ocorrer de forma natural, porém, são poucos os casos e, na maioria das vezes, são ocasionadas por um conjunto de ações antrópicas (DALE; PEARSON, 1997).
2.1.1 Fragmentação Natural
É denominada fragmentação natural a formação de um ecossistema isolado naturalmente por processos como flutuações climáticas, heterogeneidade do solo, formação de ilhas, sedimentação e processos hidrogeológicos, que favorecem apenas algumas espécies selecionadas (CONSTANTINO et. al, 2003).
Esses fragmentos possuem, normalmente, espécies endêmicas, justamente pelo fato de haver um longo período de isolamento, e acarretando numa maior diferenciação genética e especiação. Deste modo, tornam-se prioridades na conservação de ecossistemas e significativos para o estudo dos efeitos a longo prazo da fragmentação antrópica (VIANA; PINHEIRO, 1998).
2.1.2 Fragmentação Antrópica
A fragmentação causada pela intervenção das atividades antrópicas ainda apresenta déficit nos dados em relação ao quanto essas atividades influenciam nesse processo, devido à falta de monitoramento regular nesses habitats. No Brasil,
as práticas que mais influenciam na formação de fragmentos isolados são: extração de madeira, queimadas, reflorestamento com espécies exóticas, atividade agropecuária, urbanização e a precariedade de leis específicas que protejam os ecossistemas de forma mais eficaz e não ocasionem mais impactos negativos nos remanescentes (CAMARGO; KAPOS, 1995).
As diferenças nas condições ambientais e os problemas que possam ser causadas terão influência direta com o tamanho e a forma do fragmento, o tipo de ecossistema que está no entorno (matriz circundante) e o efeito de borda (BIERREGAARD et al., 1992).
Para Harris (1984), a fragmentação é um dos processos antrópicos que mais alteram o meio ambiente. Intensas fragmentações têm se tornado cada vez mais frequentes em diversas regiões e diversos ecossistemas que se encontravam quase contínuos, hoje são formados por manchas isoladas do ecossistema original. Esse processo acarreta em três principais modificações: diminuição da área total, mudança da estrutura do ecossistema e a gradativa fragmentação de remanescentes (HARRIS, 1984).
Uma vez que a fragmentação é definida como a modificação de um ecossistema, esta é capaz de alterar os mesohabitats e microhabitats acessíveis a diversas espécies e resulta na formação de habitats desfavoráveis. Mesmo sabendo que uma condição desfavorável para uma espécie pode ser favorável a outra, todas são afetadas com a alteração daquele habitat já que esta fragmentação pode intervir nas interações entre essas espécies (DAVIES; GASCON; MARGULES, 2001).
2.1.3 Efeito de Borda
Além da influência da fragmentação no ecossistema e nos habitats originais, a formação de bordas cria novos habitats ao redor do fragmento devido ao contato com a matriz circundante (DAVIES; GASCON; MARGULES, 2001) e origina um efeito conhecido como efeito de borda, que ocorre quando dois ecossistemas adjacentes estão separados por brusca transição. Estes ecossistemas adjacentes ainda interagem entre si (MURCIA, 1995), porém há alteração significativa na biodiversidade na extensão limítrofe do fragmento (FORMAN; GODRON, 1986),
causada principalmente pela ação do meio externo sobre essa extensão (TABANEZ; VIANA; DIAS, 1997)
Fragmentos cercados por áreas abertas possuem uma incidência de luz solar maior nas bordas, ocasionando alterações em seu microclima e, consequentemente, um aumento na temperatura do solo e diminuição da umidade relativa do ar. A vegetação localizada na borda está mais vulnerável a ação dos ventos e mais suscetível a quedas, já que no interior do fragmento, a velocidade do vento é menor. Uma vez que ocorre a queda da vegetação externa ao fragmento, este fica cada vez menor, e quanto menor a sua área, maior são os impactos desse efeito (OOSTERHOORN; KAPELLE, 2000). Segundo Laurence; Bierregaard (1997) o efeito de borda é o agente principal na alteração da biodiversidade em habitats fragmentados.
O efeito de borda é distribuído em três categorias distintas, de acordo com o tipo de alteração que causam ao fragmento. Este efeito é chamado abiótico, quando altera fatores microclimáticos como, por exemplo, a variação na temperatura e incidência na luz solar (DAVIES; GASCON; MARGULES, 2001; REDDING et al., 2003). Os efeitos biológicos diretos são considerados aqueles em que há influência da borda na distribuição e abundância de espécies (MacDOUGALL; KELLMAN, 1992; DIDHAN; LAWTON, 1999). Já os efeitos biológicos indiretos se referem a influência nas interações entre as espécies presentes nos fragmentos (BIERREGAARD et al., 1992; KOLLMANN; BUSCHOR, 2003).
2.2 PARQUE NACIONAL DO IGUAÇU
O Parque Nacional do Iguaçu é uma Unidade de Conservação de Proteção Integral Brasileira localizada na região Extremo Oeste do estado do Paraná (Figura 1). Foi transformado em Parque em 10 janeiro de 1939 pelo Decreto n° 1.035, de 10 de janeiro de 1939 e incluído na “lista de Patrimônios Naturais da Humanidade” pela UNESCO em 28 novembro de 1986. O parque conta com uma área total 185 mil hectares e 420 quilômetros de extensão, abrangendo 14 municípios e é considerado o parque melhor manejado do país (IBAMA, 1999; GOVERNO DO BRASIL, 2014).
Figura 1 - Localização do Parque Nacional do Iguaçu no Estado do Paraná Fonte: Adaptado de Schobbenhaus et al. (2002)
O parque tem como objetivo básico preservar ecossistemas naturais de grande relevância para região e, principalmente, a amostra do Bioma Mata Atlântica (Floresta Estacional Semidecidual) remanescente no estado (IBAMA, 1999).
Até a década de 1950, a região Oeste do estado do Paraná se manteve ambientalmente preservada, porém, em consequência da forte expansão agrícola e processos mais intensos de devastação durante o fim século XIX, a região de Floresta Atlântica do estado foi reduzida a menos de 5% da sua área original e se encontra praticamente isolada. O Parque Nacional do Iguaçu, sozinho, conserva um dos maiores trechos da vegetação original, correspondendo a mais de um terço das áreas de proteção integral existentes no estado e 59% do remanescente de floresta Estacional Semidecidual, abrigando assim, o maior remanescente do Bioma Mata Atlântica da região Sul do Brasil (IBAMA, 1999).
Atualmente, é dirigido pelo Instituto Chico Mendes da Conservação da Biodiversidade (ICMBio), órgão federal responsável por gerenciar as Unidades de Conservação (IBAMA, 1999).
2.2.1. Estrada do Colono
A Estrada do Colono corresponde a um trecho de 17,6 quilômetros da Rodovia PR-495, construída pelo Departamento de Estradas de Rodagem do
Paraná (DER-PR) e corta ao meio o Parque Nacional do Iguaçu, uma Área de Preservação Permanente (APP). Este trecho foi transformado em estrada em 1950, após a criação do Parque. Tem início no município de Serranópolis do Iguaçu, localizado na região Oeste do Estado do Paraná, e término no município de Capanema, localizado na região Sudoeste do Estado (JUSTIÇA FEDERAL, 2001; BONASSA, 2004).
Devido ao aumento desenfreado dos índices de desmatamento no Estado e à construção de inúmeras cidades e rodovias, grupos ambientalistas passaram a pressionar autoridades e iniciaram uma Ação Civil Pública pedindo o fechamento dessa estrada, tendo como base o Plano de Manejo do Parque Nacional do Iguaçu de 1981 e, em 10 de setembro de 1986, o Ministério Público Federal autorizou a interdição deste trecho. Porém, em 1997, após o incentivo de líderes políticos da região e mobilização da comunidade, a Estrada do Colono foi reaberta ilegalmente, e em alguns dias, o que era apenas uma trilha simples, se tornou uma rodovia aberta com 12 metros de largura, tráfego sem fiscalização e com cobrança de pedágio (JUSTIÇA FEDERAL, 2001; BONASSA, 2004).
No ano 2000, o Supremo Tribunal Federal tornou legal a reabertura da Estrada do Colono até que fosse realizado um novo julgamento. O funcionamento da Estrada se estendeu até o ano de 2001, quando o Exército Brasileiro, em ação conjunta com o Comando de Operações Táticas (COT) da Polícia Federal e da Polícia Florestal e o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) cumpriram a ordem judicial para fechamento definitivo da Estrada (JUSTIÇA FEDERAL, 2001; BONASSA, 2004).
A Estrada do Colono foi novamente invadida, em 2003, por moradores do município de Serranópolis do Iguaçu, fortemente apoiados por líderes políticos, porém, a Justiça Federal tornou legal o pedido do IBAMA para reintegração de posse deste trecho e a liminar de interdição da Estrada vem sendo cumprida desde então (BONASSA, 2004).
O fechamento da Estrada do Colono resultou no aumento de 112 quilômetros na distância rodoviária entre os municípios de Serranópolis do Iguaçu e Capanema, obrigando o governo local a fornecer outras alternativas de desenvolvimento à região. Em contrapartida, essa ação tem sido de extrema importância para o desenvolvimento do ecossistema do Parque Nacional do Iguaçu e, por essa razão, em 2001, a Organização das Nações Unidas para a Educação, a Ciência e a Cultura
(UNESCO), retirou o Parque Nacional do Iguaçu da lista de patrimônios mundiais em perigo. O Parque tinha sido inscrito nessa lista em 1999, devido a reabertura ilegal da Estrada do Colono e a dificuldade que as autoridades brasileiras tinham em cumprir a ordem judicial para fechá-la (JUSTIÇA FEDERAL, 2001; UNESCO, 2001).
Em janeiro de 1999, foi emitido o relatório final "Avaliação Ecológica Rápida para o Diagnóstico Ambiental do Parque Nacional do Iguaçu" apontando a existência da Estrada do Colono como o maior problema ambiental do Parque. Os responsáveis técnicos pela elaboração do relatório listaram os principais problemas ambientais que a utilização da Estrada poderia causar a biodiversidade do Parque, recomendando assim, por ordem técnica, seu fechamento imediato. Para os responsáveis pelo estudo, sua utilização faz do Parque uma área completamente suscetível a degradação ambiental devido à intensidade de tráfego local. Além disso, a vegetação do Parque sofre grande modificação em ambas às margens da estrada, resultando no efeito de borda e provocando uma mudança radical no ecossistema da floresta nas margens da estrada (AGUDELO, 1998; ANTONELLI, 1999).
A Estrada do Colono acentua intensamente o efeito de borda, já que corta ao meio o Parque, fazendo com que os dois fragmentos que passam a existir sofram com esse efeito, e sua ação negativa é ampliada. Segundo Ferreira, 1998, apesar da faixa de estrada ser pequena se comparada a área total de ocupação do Parque, a sua abertura é capaz de diminuir de forma extrema a efetividade do mesmo em proteger o ecossistema que contém (FERREIRA, 1998).
2.3 IMPORTÂNCIA DOS MICRORGANISMOS NO SOLO
Qualquer estudo que venha a ser feito a respeito de ambientes terrestres se remete ao solo, visto que, nele acontecem diversos processos-chave para o funcionamento de um ecossistema, consequentes do seu processo de desenvolvimento que abrange interações entre o material parental e os organismos vivos presentes (GRANT; LONG, 1989).
A constituição do solo tem a fração biológica, composta por pequenos animais (mesofauna) e por uma grande diversidade de microrganismos (microfauna) (ARAÚJO; HUNGRIA, 1994), que atuam sobre a matéria orgânica, a fim de
desenvolver processos de síntese de compostos orgânicos, de forma contínua (ALEXANDER, 1961). São considerados indispensáveis para a formação do solo e sua manutenção, por serem responsáveis pelos processos de decomposição de resíduos orgânicos, ciclagem de nutrientes e produção de ácidos para dissolução (GRANT; LONG, 1989; MENDES; REIS JÚNIOR, 2010).
Esses microrganismos também são responsáveis por tornar os compostos inorgânicos pertinentes à vegetação local, já que estes compostos são percussores no processo de síntese de proteínas realizado pelas plantas, acarretando no aumento da fertilidade do solo (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
Na degradação da matéria orgânica, algas, protozoários, insetos e suas larvas possuem participação efetiva (EMBRAPA, 2005), porém, segundo Bidone; Povinelli (1999) as bactérias, os actinomicetos (actinobactérias) e os fungos são considerados os principais microrganismos responsáveis pela transformação biológica da matéria orgânica biodegradável em compostos inorgânicos.
A degradação da matéria orgânica se inicia na fase mesófila, onde há predominância de bactérias mesófilas e fungos. Na degradação aeróbia, as enzimas proteolíticas produzidas por estes microrganismos quebram as cadeias de proteínas e geram, sobretudo, polipeptídeos e aminoácidos que poderão ser aproveitados por outros microrganismos. O nitrogênio orgânico logo é convertido para nitrogênio amoniacal, em quantidade proporcional ao teor de proteína e carbono utilizados pelos microrganismos (KIEHL, 1985).
Durante este processo, há o aumento da temperatura para a fase termófila devido a disponibilidade de oxigênio e a população de microrganismos prevalecente passa a ser de actinobactérias, bactérias e fungos termófilos. Rapidamente a temperatura retorna a faixa mesófila ocasionando ausência de açúcares e amidos, assim, as bactérias e fungos mesófilos retomam o processo (KIEHL, 1985).
2.3.1 Bactérias
As bactérias são microrganismos procariotos e unicelulares, que se reproduzem por divisão binária e podem formar associações com células similares. São divididas em dois grandes grupos, de acordo com suas atividades e o meio em que vivem (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
No primeiro grupo estão as eubactérias, encontradas principalmente nas formas esféricas, bastonetes e espirilos, variando de 0,5 a 5,0 micrometros. Apesar de serem unicelulares, se apresentam na maioria das vezes aos pares ou em grupo de quatro indivíduos. Algumas delas podem possuir flagelos, o que facilita a locomoção em meios líquidos. São essenciais na degradação da matéria orgânica e na produção de antibióticos, principalmente a estreptomicina (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
As arqueobactérias constituem o segundo grupo e são notórias pela capacidade de sobreviverem em ambientes considerados inóspitos para muitos microrganismos, como, por exemplo, em altas temperaturas, ambientes muito ácidos e/ou que apresentem altas concentrações salinas. Algumas arqueobactérias são capazes de produzir gás metano a partir do dióxido de carbono e hidrogênio, dependendo das condições do ambiente em que vivem (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
Para se desenvolverem, as bactérias necessitam de disponibilidade de nutrientes como o nitrogênio, que pode ser retirado da atmosfera, fósforo, manganês, ferro, zinco, cobre e outros compostos provenientes de substâncias orgânicas. Essas exigências nutritivas e as condições fundamentais para o crescimento e reprodução das bactérias são os fatores que as tornam um dos principais microrganismos no processo de degradação da matéria orgânica (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
2.3.1.1 Actinobactérias
As actinobactérias, também conhecidas como actinomicetos, representam um filo de bactérias gram-positivas com alto conteúdo de G+C (guanina e citosina) no seu DNA (GAO; PARAMANATHAN; GUPTA, 2006; MIAO; DAVIES, 2010) e organização filamentosa. Foram, por muito tempo, classificadas como fungos por também produzirem hifas e cadeias de esporos, porém, as actinobactérias possuem um flagelo tipicamente bacteriano e sensibilidade a fagos e antibióticos antibacterianos. Diferentemente dos fungos, elas não apresentam esteróis em sua parede celular, são procariontes e, na maioria das vezes, aeróbias, características essas, que ligadas a outra série de fatores, fizeram com que pesquisadores as
classificassem como microrganismos pertencentes ao domínio Bactéria (SUPUT; LECHEVALIER; LECHEVALIER, 1967).
Esses microrganismos possuem uma alta variedade morfológica, podendo se apresentar na forma de cocos, cocos-bacilos, hifas e micélios e algumas actinobactérias específicas apresentam a capacidade de formar esporos resistentes à dessecação (GOODFELLOW; WILLIAMS, 1983).
Se dispersam no ambiente através de esporos hidrofóbicos adaptados para dispersão no ar ou esporos hidrofílicos para dispersão pela água, através do solo (MCCARTHY; WILLIANS, 1992). Servin et al. (2008) classificou as actinobactérias, quanto a sua respiração em aeróbias estritas, anaeróbias facultativas, microaerófilas ou anaeróbias estritas. Kennedy, Lowry, Conlan (1999) classificou-as de acordo com o metabolismo, em autotróficas, heterotróficas, quimiotróficas ou fototróficas.
O solo apresenta uma grande ocorrência de actinobactérias, podendo chegar a um milhão de células por grama de solo, já que estes microrganismos desempenham um papel indispensável na mineralização da matéria orgânica devido a capacidade de degradação de uma grande variedade de compostos, principalmente o subgrupo de Estreptomicetos, que são muito comuns no solo. Os microrganismos que compõem o gênero Frankia convivem em simbiose com raízes de algumas plantas superiores formando alguns nódulos onde ocorrerá a fixação do nitrogênio em seu interior, como é o caso da Casuarina spp. (GOODFELLOW; WILLIAMS, 1983, MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 1997).
2.3.1.2 Bactérias celulolíticas
As Bactérias Celulolíticas, também conhecidas como Bactérias Fermentadoras de Carboidratos Estruturais, são bactérias capazes produzir, bioquimicamente, a enzima extracelular celulase, a partir da hidrólise da celulose e se incorporam às fibras dos alimentos, degradando os componentes presentes na parede celular (CHENG; COSTERTON, 1986). Essa espécie de bactérias produzem principalmente, acetato, propionato, butirato, succinato, gás carbônico e gás hidrogênio. São liberados também etanol e lactato (HUNGATE, 1966).
No solo, essas bactérias auxiliam um maior enraizamento da vegetação local em maior área de solo, ocasionando um aumento na absorção dos nutrientes pelas
plantas. Para que isso ocorra, são necessárias condições favoráveis para o desenvolvimento dessas bactérias, principalmente em relação ao pH, que deve estar entre 5 e 6, para que sua enzimas estejam ativas. Se o pH não estiver nessa faixa, as enzimas não são capazes de realizar o processo de degradação na velocidade necessária para manterem o metabolismo das bactérias funcionando normalmente, ocasionando, muitas vezes, até a morte das bactérias (CHENG; COSTERTON, 1986).
2.3.1.3 Bactérias solubilizadoras de fosfato
O fósforo é um nutriente de extrema importância para o metabolismo de plantas e microrganismos, porém, pouco disponível no solo em regiões tropicais, apesar do solo nestas regiões apresentarem grande capacidade para fixar esse nutriente. A quantidade fósforo no solo, seja na forma orgânica ou inorgânica, depende principalmente do teor de matéria orgânica presente e do pH deste solo, já que nem todas as formas em que o fosfato pode se apresentar ocorre na faixa normal de pH dos solos (MELLO; PEREZ, 2009).
Essa baixa disponibilidade de fósforo no solo se dá devido ao fato de que o fósforo é adsorvido pelas partículas do solo e se estabiliza na forma de fosfato inorgânico insolúvel (CHANG; JACKSON, 1957), entretanto, diversos microrganismos presentes no solo são capazes de solubilizar esse fosfato (MARRA et al., 2012) e esta é uma das principais possibilidades para que haja um amento na disponibilidade de fósforo para promover o crescimento das plantas (ZENG et al., 2012).
Um dos mecanismos de solubilização de fosfato é a produção de ácidos orgânicos. Os microrganismos edáficos solubilizam os fosfatos inorgânicos insolúveis a partir da produção de ácidos orgânicos, como o cítrico, oxálico, málico, entre outros, que são capazes de diminuir o pH do solo, facilitando o processo e atuando como quelantes e complexantes para os elementos que acompanham o íon fosfato (geralmente cálcio, ferro e alumínio) (BOLAN, et al., 1994; NAHAS, 1999). Esse processo acidifica o entorno da célula e torna o microrganismo eficiente na solubilização, principalmente as bactérias Gram negativas, que solubilizam o fosfato
a partir da produção de ácido glicônico (RODRIGUEZ; FRAGA, 1999; SONG et al., 2008).
O acúmulo de ácidos orgânicos no solo é decorrente da interrupção do ciclo de Krebs. Quando há baixo teor de fósforo, as bactérias produzem os ácidos, solubilizando os fosfatos inorgânicos insolúveis e aumentando a disponibilidade de fósforo no solo (MÜLLER; FROSCH, 1975).
O solo que apresenta baixas concentrações de íons ferrosos são ambientes mais propícios para a liberação de ácidos orgânicos pelas bactérias, uma vez que o ferro inibe a ação de enzimas essenciais para o processo (MARSCHNER, 1995).
2.3.2 Fungos
Os fungos representam um grupo de organismos eucariotas que compreende as leveduras, os bolores e os cogumelos. Estes organismos são classificados no reino Fungi, separados de plantas, animais ou bactérias devido ao fato de suas células possuírem parede celular formada por quitina e glucanos (ALEXOPOULOS; 1996).
O reino Fungi possui uma diversidade muito grande e táxons, com ecologias, estratégias e ciclos de vida diferentes entre si, abrangendo desde microrganismos aquáticos unicelulares até grandes cogumelos e são classificados de acordo com suas características morfológicas fisiológicas (ALEXOPOULOS; 1996).
Os fungos estão presentes de forma abundante em todo o planeta, porém de forma discreta devido as suas pequenas estruturas. Vivem no solo, na matéria morta e em plantas, animais, e até outros fungos, em simbiose ou parasitismo (AINSWORTH; KINDELERER, 1976).
Esses organismos possuem um papel essencial na maioria dos ecossistemas, por atuarem na decomposição da matéria orgânica, nas trocas e ciclo de nutrientes e em muitas cadeias tróficas, além da sua utilização na produção de antibióticos e agentes biológicos na agricultura contra ervas daninhas e pragas (ALEXOPOULOS; 1996).
Os fungos possuem relações de simbiose com organismos pertencentes a todos os reinos, sendo estas relações mutualistas ou antagonísticas. A relação de simbiose entre fungos e plantas é denominada simbiose micorrízica e é de extrema
importância para o crescimento de plantas em diversos ecossistemas (AINSWORTH; KINDELERER, 1976). Segundo Bonfante (2003), mais de 90% das plantas necessitam do estabelecimento da simbiose micorrízica para sua sobrevivência, já que esta relação tem influência direta na absorção de nitrato e fosfato pelas plantas em solos que possuem baixas concentrações destes nutrientes essenciais.
Os fungos também podem estabelecer uma relação simbiótica com algas e cianobactérias formando os líquens, que podem estar presentes em todos os ecossistemas do planeta e possuem extrema importância na iniciação da sucessão biológica e na formação do solo (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2005).
A alimentação se dá de forma heterotrófica a partir da degradação da matéria orgânica inanimada ou pelo parasitismo. Podem também agir na decomposição dos resíduos de plantas e animais, tornando-os compostos simples que podem ser utilizados por outros microrganismos presentes no solo (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997). De acordo com Pelczar, Chan, Krieg (1980), os fungos possuem a capacidade de se adaptar em muitos ambientes considerados inóspitos para diversos outros microrganismos, incluindo bactérias, por serem mais resistentes às pressões osmóticas e suportarem grandes variações de pH, na faixa entre 2 e 9, apesar do ótimo de sobrevivência ser 5.
Geralmente encontram-se em locais com umidade considerável, para que possam captar a água da atmosfera, porém, possuem a capacidade de sobrevivência caso haja desidratação do ambiente em que estão, produzindo esporos ou estrando em estado latente (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
2.4 CONTAGEM DE MICRORGANISMOS
Em condições consideradas naturais, diversos microrganismos, como bactérias, leveduras, bolores, protozoários, vírus, entre outros, compõem uma população microbiana. Constantemente há a necessidade de constatar a quantidade e a composição microbiana de um ambiente em particular, definindo espécies e o número total de microrganismos que ali vivem e como interagem entre si. Por este motivo, é necessário que existam técnicas e meios de cultura para que se possa
isolar, enumerar e identificar microrganismos em uma determinada amostra (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
2.4.1 Técnica Spread-Plate
Algumas práticas são frequentemente utilizadas em laboratórios para a contagem de microrganismos presentes em uma determinada amostra. Umas dessas práticas é a de Espalhamento em Superfície, também conhecida por
Spread-Plate ou Método das Diluições Seriadas, em que são realizadas diluições
consecutivas da amostra e cada diluição é espalhada em duas placas de Petri por cima do meio de cultura a ser utilizado. Este método pode ser utilizado tanto para isolamento quanto para contagem de microrganismos, já que, após concluído o plaqueamento e a incubação, por tempo e temperatura consideradas adequados ao processo, as células crescerão de forma isolada, formando colônias a serem contadas na diluição adequada e, portanto, são denominadas Unidades Formadoras de Colônias (UFC) (SEELEY; VANDEMARK; LEE, 1991).
Nos tubos em que as amostras estiverem mais diluídas, não haverão células suficientes, diferentemente daqueles em que as amostras estiverem mais concentradas, onde haverá um excesso na formação de células, logo a contagem ideal não poderá ser realizada corretamente nas placas extremas de diluição (SEELEY; VANDEMARK; LEE, 1991).
Para que a contagem seja realizada de forma ideal é necessário que a placa selecionada contenha um número considerável de colônias, o que, para bactérias de um modo geral, representa a faixa de 25 a 250 colônias. Abaixo de 25 colônias, o valor não é considerado confiável já que possíveis contaminantes presentes podem ocasionar pelo menos 4% de erro. Acima de 250 colônias, a contagem manual se torna mais difícil, podendo ocasionar erros metodológicos (COLLEE; MACKIE; MCCARTNEY, 1996).
As contagens devem ser realizadas em duplicata ou triplicata para proporcionar resultados estatisticamente válidos. Com os dados de diluição e volume das amostras são realizados cálculos para determinação da quantidade de microrganismos existentes em certo peso ou volume do material inicial da amostra (COLLEE; MACKIE; MCCARTNEY, 1996).
3 METODOLOGIA
3.1 ÁREA DE ESTUDO
O trabalho foi desenvolvido na Unidade de Conservação de Proteção Integral do Parque Nacional do Iguaçu, localizado na região Oeste do Estado do Paraná, no município de Serranópolis do Iguaçu, entre as coordenadas 25º27’18” e 25º27’16” de Latitude Sul e 54º03’55” de Longitude Oeste.
O clima da região é subtropical úmido, sem estação seca definida (WONS, 1994), com temperatura média máxima de 22ºC e média mínima de 18ºC (PARANÁ – GOVERNO DO ESTADO). A vegetação predominante é Floresta Estacional Semidecidual (WONS, 1994).
3.2 AMOSTRAGEM
Ao longo do trecho foram selecionadas duas áreas. A primeira, denominada “ÁREA 1”, é uma área em estágio de sucessão ecológica avançada e a segunda, denominada “ÁREA 2”, corresponde à antiga Estrada do Colono (Figura 2), uma área em estágio de sucessão ecológica intermediária dentro do Parque Nacional do Iguaçu.
Figura 2 - Localização do Parque Nacional do Iguaçu com destaque para a antiga Estrada do Colono, sendo um dos pontos de análises dos microrganismos do solo
Fonte: O Eco (2016)
As áreas 1 e 2 estão distanciadas entre si em 500 metros. Em cada área, foram feitas amostragens em três pontos ao longo do gradiente borda-interior, entrando até 400 metros no Parque. O primeiro ponto foi na divisa entre a matriz e o fragmento (Ponto 0), o segundo e o terceiro ponto foram demarcados a cada 200 metros, perpendiculares a borda (Figura 3).
Figura 3 - Localização dos pontos de coleta das amostras de solo para análise de microrganismos nas duas extensões selecionadas do Parque Nacional do Iguaçu Fonte: Google Earth (2017)
As amostras de solo foram coletadas durante o mês de outubro, com média de temperatura de 22ºC no município (CLIMATE-DATA.ORG). Em cada ponto foi demarcada uma área de 30 cm x 100 cm e retirada uma amostra, numa profundidade de 0-10 cm da camada superior do solo, com auxílio de uma pá de jardinagem, conforme Fotografia 1. As amostras foram acondicionadas em sacos plásticos etiquetados, conservadas em caixa de isopor com gelo (LIMA et al., 2014).
Fotografia 1 - Demarcação da área de 30 x 100 cm e preparação do solo para coleta da amostra no Parque Nacional do Iguaçu, Serranópolis do Iguaçu, Paraná, outubro de 2017 Fonte: Autoria Própria (2017)
Em cada ponto foram coletadas duas amostras do solo, uma foi encaminhada para análise química em laboratório particular e a outra foi levada para análise microbiológica no Laboratório de Microbiologia da UTFPR.
3.3 ANÁLISE QUÍMICA DO SOLO
As amostras de solo correspondentes para cada ponto foram enviadas para o Laboratório LAB AGRO Análises Agronômicas Ltda. Os fatores avaliados foram quantidade de matéria orgânica, a partir do método WalkeyBalck, pH em água e concentração de fósforo, pelo método Mehlich, devido a influência desses fatores no desenvolvimento dos microrganismos presentes no solo e na qualidade do mesmo.
3.4 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
As amostras de solo, após três horas da coleta, foram homogeneizadas e 15 gramas de cada foram adicionadas a 135 mL de solução salina a 0,85%. Os frascos com as amostras foram mantidos em mesa agitadora orbital com velocidade de 145 rpm por 30 minutos (diluição 10-1), a partir da qual foram preparadas soluções decimais seriadas até 10-6 (LIMA et al., 2014).
3.4.1 Contagem de Microrganismos
3.4.1.1 Actinobactérias
Para a contagem de actinobactérias utilizou-se a técnica spread-plate em meio de cultura Ágar Amido Caseína com composição conforme Tabela 1. Após a preparação, o pH foi ajustado para 7, o meio foi distribuído em placas de Petri estéreis e 100 µL das diluições 10-1 até 10-6 foram espalhados sobre a superfície das
Tabela 1 – Composição por litro do meio de cultura Ágar Caseína Amido
Componente Quantidade (gramas)
Ágar 15 Amido solúvel 10 Caseína 0,3 Cloreto de sódio 2 Fosfato dipotássico 2 Nitrato de potássio 2
Sulfato de magnésio heptahidratado 0,05
Fonte: Adaptado de Arifuzzaman; Khatun; Rahman (2010)
Depois deste período de incubação, foram selecionadas e quantificadas as diluições para contagem das unidades formadoras de colônias com características típicas de actinobactérias, de acordo com cada um dos pontos de coleta para a “ÁREA 1” (Fotografia 2) e “ÁREA 2” (Fotografia 3). O ensaio foi realizado em duplicata. Os resultados foram expressos em Unidades Formadoras de Colônia por grama de solo (UFC.g-1).
Fotografia 2 - Colônias de actinobactérias isoladas em Placas de Petri correspondentes as amostras de solo da “ÁREA 1” do Parque nacional do Iguaçu e seus respectivos pontos de coleta (Pontos 0, 200 e 400)
Fotografia 3 - Colônias de actinobactérias isoladas em Placas de Petri correspondentes as amostras de solo da “ÁREA 2” do Parque nacional do Iguaçu e seus respectivos pontos de coleta (Pontos 0, 200 e 400)
Fonte: Autoria Própria (2017)
3.4.1.2 Bactérias celulolíticas
A população de bactérias celulolíticas foi determinada após plaqueamento das diluições 10-1 a 10-4 em meio Ágar Carboximetilcelulose com composição
conforme Tabela 2; e pH ajustado para 7 (RAY et al., 2007, BEHERA et al., 2014).
Tabela 2 – Composição por litro do meio de cultura Ágar Carboximetilcelulose
Componente Quantidade (gramas)
Triptona 2
Sulfato ferroso heptahidratado 0,004
Sulfato de magnésio heptahidratado 0,2
Fosfato dissódico 4
Fosfato dipotássico 4
Cloreto de cálcio dihidratado 0,001
Carboximetilcelulose (CMC) 10
Ágar 15
As placas foram incubadas a 30°C por 5 dias. Para diferenciar as colônias celulolíticas as placas foram cobertas com solução Lugol 1%, por 3 a 5 minutos (Kasana et al., 2008) e após esse tempo o meio apresentou uma coloração escura. As colônias com zona clara ao redor foram computadas como celulolíticas e o seu diâmetro e o das colônias foram aferidos com o auxílio de uma régua milimetrada. Foi realizada a contagem de unidades formadoras de colônias, todas em triplicatas. Os resultados foram expressos em Unidades Formadoras de Colônia por grama de solo (UFC.g-1).
3.4.1.3 Bactérias solubilizadoras de fosfato
As bactérias solubilizadoras de fosfato foram cultivadas em meio de cultura, constituído de sais minerais com glicose e sais de fosfatos insolúveis. A partir das diluições 10-1 a 10-4 foram transferidas alíquotas de 100 µL para placas de Petri contendo o meio de cultura com composição conforme Tabela 3 (OLIVEIRA et al., 2009).
Tabela 3 – Composição por litro do meio de cultura para isolamento de Bactérias Solubilizadoras de Fosfato
Componente Quantidade (gramas)
Ágar 15 Cloreto de potássio 0,2 Cloreto de sódio 0,2 Extrato de levedura 0,5 Glicose 10 Ortofosfato de cálcio 5 Sulfato de amônio 0,5
Sulfato de magnésio heptahidratado 0,1
Fonte: Adaptado de Oliveira et al. (2009)
Neste meio foram adicionadas uma solução contendo 0,25 g.L-1 de fosfato
dipotássico e outra contendo 1 g.L-1 de cloreto de cálcio, e o pH foi ajustado para 6,5 (HARA; OLIVEIRA, 2004, CHAGAS JÚNIOR et al, 2010). Após a incubação das placas por sete dias, a 28ºC, as bactérias solubilizadoras de fosfato foram
identificadas a partir da formação de um halo transparente ao redor da colônia, facilmente visível em contraste com o meio opaco, de acordo com Kang et al. (2002). O halo indica a solubilização do precipitado de monohidrogeno fosfato de cálcio no meio. Foram contabilizadas as unidades formadoras de colônias, todas em triplicatas. Os resultados foram expressos em Unidades Formadoras de Colônia por grama de solo (UFC.g-1).
3.4.1.4 Fungos
Para a contagem de fungos também foi utilizada a técnica de spread-plate no meio Agar Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol Base (Agar DRBC). A partir das diluições 10-1 a 10-5 foram transferidas alíquotas de 100 µL para placas de Petri
contendo o meio de cultura. Para cada diluição foram feitas duas repetições por placa. As placas foram incubadas a 25ºC por sete dias. Após esse período foi realizada a contagem das colônias (SANTOS-GONZÁLEZ; FINLAY; TEHLER, 2007) “ÁREA 1” (Fotografia 4) e “ÁREA 2” (Fotografia 5). Os resultados foram expressos em Unidades Formadoras de Colônia por grama de solo (UFC.g-1).
Fotografia 4 - Colônias de fungos isoladas em Placas de Petri correspondentes as amostras de solo da “ÁREA 1” do Parque nacional do Iguaçu e seus respectivos pontos de coleta (Pontos 0, 200 e 400)
Fonte: Autoria Própria (2017)
Fotografia 5 - Colônias de fungos isoladas em Placas de Petri correspondentes as amostras de solo da “ÁREA 2” do Parque nacional do Iguaçu e seus respectivos pontos de coleta (Pontos 0, 200 e 400)
3.5 ANÁLISE DE PLANTAS RASTEIRAS
Para a avaliação da vegetação rasteira, em cada ponto do transecto foi feita uma amostragem, com o auxílio de coletor de madeira de 0,5 m × 0,5 m e foram contadas todas as plantas presentes na área do coletor. As análises foram realizadas em triplicata, de modo que as amostras de solo foram coletadas em pontos com 10 metros de distância entre si (Figura 4).
Figura 4 - Esquema da localização dos pontos de coleta das amostras de solo para análise de plantas rasteiras nas duas extensões selecionadas do Parque Nacional do Iguaçu
Fonte: Autoria Própria (2017)
O número de plantas rasteiras foi avaliado devido a influência desse fator no grau de sucessão ecológica de um ambiente, e consequentemente, no desenvolvimento dos microrganismos presentes no solo e na qualidade do mesmo.
10 m 10 m 200 m 200 m 500 m
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 ANÁLISE QUÍMICA DO SOLO
Os dados da análise química do solo para cada ponto de coleta estão listados na Tabela 44.
Tabela 4 - Análise química do solo ao longo do gradiente borda-interior em duas áreas no Parque Nacional do Iguaçu, Serranópolis, PR
Área de Coleta Ponto de Coleta Matéria Orgânica (g.kg-1) pH em Água Fósforo (mg.dm-3) ÁREA 1 0 32,24 5,34 6,20 200 32,91 6,48 9,60 400 32,91 6,04 11,10 ÁREA 2 0 33,58 6,14 30,00 200 34,93 5,72 33,40 400 24,19 5,58 11,90
Fonte: Autoria Própria (2017)
A análise química do solo revelou que, de maneira geral, não houve diferenças expressivas no acúmulo de matéria orgânica entre os diferentes pontos dentro de uma mesma área e entre as duas áreas estudadas, exceto para o pronto 400 da “ÁREA 2”.
No ponto 400 da “ÁREA 2” o teor de matéria orgânica foi menor, provavelmente devido ao fato de que a partir dos 300 metros nesta área, a mata ainda se apresenta aberta, em estágios iniciais de sucessão ecológica e com indícios de atividades antrópicas no local.
A baixa variação apresentada entre os pontos (exceto o ponto 400) indica que a produção da matéria orgânica e sua incorporação ao solo não vem sofrendo influência do efeito de borda em ambas as áreas. Isso se deve ao fato que em todos os pontos há a presença de plantas de médio e grande porte, além de cobertura vegetal e serapilheira, as quais atuam como fonte matéria orgânica para o solo.
Entre as duas áreas, não houve grandes alterações no teor de matéria orgânica, porém, a “ÁREA 2” apresentou maiores valores de concentração. Isso ocorre pelo fato de essa extensão corresponder a uma área de sucessão ecológica intermediária, que vem sendo regenerada ao longo do tempo. Esse processo de regeneração faz com que o solo alcance picos nas concentrações de matéria orgânica, até que se recupere por completo e estabilize esse teor (BUSTAMANT et al., 2004).
A quantidade de matéria orgânica disponível no solo resulta das taxas de produção e incorporação, sofrendo variações de acordo com as condições do ambiente e uso do solo (NASCIMENTO et al., 2010).
Os valores de pH encontrados para o solo em todos os pontos de coleta se apresentam sem grandes variações ao longo das extensões ou entre as diferentes áreas (variando na faixa de 5,34 a 6,48), não evidenciando, assim, a influência do efeito de borda sobre esse parâmetro. Segundo Brady; Nyle (1989), o pH ideal do solo varia entre 5,5 e 7, indicando assim que as amostras apresentaram valores de pH considerados ideias para a qualidade do solo.
Por outro lado, a concentração do fósforo foi influenciada pelo efeito de borda nas duas áreas avaliadas. Na “ÁREA 1”, que corresponde a uma área de sucessão ecológica avançada, a concentração fósforo aumentou gradativamente ao longo de sua extensão, nos três pontos estudados.
Já na “ÁREA 2”, houve um aumento nos dois primeiros pontos, seguido de uma queda no ponto 400. Esse mesmo comportamento foi observado para matéria orgânica, e se deve ao fato da área estar aberta com sinais de ação antrópica.
A “ÁREA 2”, apesar de estar em estágios mais iniciais de sucessão ecológica, quando comparada com a “ÁREA 1”, apresentou teores mais elevados de fósforo. Isso se dá, devido ao fato dessa área estar em processo de regeneração, apresentando uma ciclagem de nutrientes mais acelerada (BUSTAMANT et al., 2004). Esse mesmo comportamento foi observado para os teores de matéria orgânica, porém com variações menos expressivas entre áreas.
4.2 ANÁLISE DE PLANTAS RASTEIRAS
Os dados de plantas rasteiras ao longo dos pontos para cada área estão listados na Tabela 55.
Tabela 5 - Levantamento de plantas rasteiras ao longo do gradiente borda-interior em duas áreas no Parque Nacional do Iguaçu, Serranópolis, PR
Área de Coleta Ponto de Coleta
(m)
Número médio de plantas
rasteiras Desvio Padrão
ÁREA 1 0 5,00 4,08 200 2,33 2,05 400 3,00 2,16 ÁREA 2 0 29,33 19,36 200 3,67 0,94 400 9,33 3,68
Fonte: Autoria Própria (2017)
Verificou-se um maior número de plantas rasteiras no primeiro ponto de ambas as áreas estudadas. Na “ÁREA 1”, os dois últimos pontos apresentaram valores muito próximos. Já na “ÁREA 2” houve uma redução muito grande no segundo ponto, seguido de um aumento do último ponto. Esse aumento ocorreu em função da área estar aberta nessa localidade.
Os resultados encontrados indicam que o efeito de borda, para esse parâmetro, está ocorrendo em distâncias inferiores a 200 metros, devido ao maior número de plantas rasteiras encontradas nos pontos iniciais de ambas as áreas. Essa influência é evidenciada devido ao fato das plantas rasteiras serem fortemente influenciadas pelo estágio de sucessão ecológica do ambiente e se apresentarem em maior quantidade em estágios iniciais. De maneira geral, plantas rasteiras são caracterizadas por habitar solos com condições extremas, preparando o local para a chegada de outras espécies mais exigentes (PAULA, 2002).
A “ÁREA 2” apresentou maiores valores de plantas rasteiras em relação a “ÁREA 1” também pela influência do grau de sucessão ecológica nessas áreas, que é maior na “ÁREA 1”.
4.3 CONTAGEM DE MICRORGANISMOS
4.3.1 Actinobactérias
Após realizadas as análises foram contabilizadas as colônias de microrganismos. As populações de actinobactérias foram encontradas em ambas as áreas com quantidades de colônias significativas, de acordo com a metodologia utilizada, apenas na diluição 10-1 (Tabela 66).
Tabela 6 - Levantamento de Actinobactérias na diluição 10-1 ao longo do gradiente borda-interior em duas áreas no Parque Nacional do Iguaçu, Serranópolis, PR
Área de Coleta Ponto de
Coleta (m)
Unidades Formadoras de Colônias por Grama de Solo
(x104 UFC.g-1)
Desvio Padrão entre as Amostras ÁREA 1 0 17,55 3,5 200 29,25 3,5 400 51,30 18 ÁREA 2 0 22,05 0,5 200 30,15 3,5 400 53,10 9
Fonte: Autoria Própria (2017)
A concentração de actinobactérias aumentou de acordo com o gradiente borda-interior, revelando que esses microrganismos foram afetados pelo efeito de borda.
A “ÁREA 2” apresentou uma concentração maior em relação a “ÁREA 1”. A “ÁREA 2” também apresentou uma concentração de matéria orgânica ligeiramente maior que a “ÁREA 1”, fato esse que pode ter contribuído para a maior população de actinobactérias encontradas nesse local.
As actinobactérias desempenham um papel indispensável na mineralização da matéria orgânica e seu desenvolvimento em diversos ambientes é comumente associada a disponibilidade da matéria orgânica no local (GOODFELLOW; WILLIAMS, 1983, MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 1997).
Outro fator que pode afetar a população desses microrganismos é a grande sensibilidade às alterações físicas no ambiente (GOODFELLOW; WILLIAMS, 1983, MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 1997). Apesar de não ter sido avaliado, é sabido que a região limítrofe apresenta maior radiação luminosa e temperatura, além de menor umidade, podendo ser esses os fatores que causaram uma redução das actinobactérias no ponto 0 (MURCIA, 1995; GOODFELLOW; WILLIAMS, 1983, MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 1997).
4.3.2 Bactérias celulolíticas
Não houve resultados significativos para as populações de bactérias celulolíticas em todos os pontos analisados. As bactérias celulolíticas são identificadas em Placas de Petri a partir de um halo de atividade celulolítica, indicando a degradação da celulose. De acordo com Bagga; Shandu; Sharma (1990) e Kaur et al. (2007), o pH tem forte influência na atividades das enzimas produzidas pelos microrganismos para degradação desse polissacarídeo, sendo a faixa ótima entre 3,6 e 5, o que difere da faixa de pH apresentada em ambas as áreas, que variou entre 5,34 e 6,48.
Além do pH, a temperatura também tem forte influência na atividade das celulases produzidas pelas bactérias (BAGGA; SHANDU; SHARMA, 1990; KAUR et al., 2007). As placas com meio de cultura ágar carboximetilcelulose para identificação da atividade celulolítica foram incubadas a 30ºC. Estudos realizados com bactérias para avaliar a atividade da enzima celulase produzida e sua atuação na degradação da celulose indicou que muitas dessas enzimas eram mais eficientes de atuantes na faixa termofílica, com temperatura ótima de 95ºC a 106ºC (NIEHAUS et al., 1999) .
4.3.3 Bactérias Solubilizadoras de Fosfato
Não foram identificadas bactérias solubilizadoras de fosfato nos pontos analisados, apesar do índice de fósforo de ambas as áreas estarem dentro dos padrões de qualidade do solo (BRADY; WEIL 1989). Para a identificação desses
