Desenvolvimento e validação de metodologias empregando eletroforese capilar para determinação de precursores da serotonina em suplementos alimentares e polióis em chocolates dietéticos

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

ALINE GUADALUPE COELHO

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS EMPREGANDO ELETROFORESE CAPILAR PARA DETERMINAÇÃO DE PRECURSORES DA

SEROTONINA EM SUPLEMENTOS ALIMENTARES E POLIÓIS EM

CHOCOLATES DIETÉTICOS.

CAMPINAS 2016

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ALINE GUADALUPE COELHO

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS EMPREGANDO ELETROFORESE CAPILAR PARA DETERMINAÇÃO DE PRECURSORES DA

SEROTONINA EM SUPLEMENTOS ALIMENTARES E POLIÓIS EM

CHOCOLATES DIETÉTICOS.

Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências

Orientador: Prof. Dr. Dosil Pereira de Jesus

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA ALINE GUADALUPE COELHO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. DOSIL PEREIRA DE JESUS

CAMPINAS 2016

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Queira o melhor do melhor,

Se pensamos pequeno, coisas pequenas teremos, Mas se desejarmos fortemente o melhor.

E, principalmente, lutarmos pelo melhor... O melhor vai se instalar em nossa vida.

Porque sou do tamanho daquilo que vejo, e não do tamanho da minha altura. ”

(Carlos Drummond de Andrade)

Dedico esta tese à minha família. Ao meu esposo Augusto Fernandes Nalin; Aos meus pais: José Guadalupe Coelho e Emídia Joaquina Coelho; Aos meus irmãos Igor Guadalupe Coelho e Yane Guadalupe Coelho. Aos meus sobrinhos Henrique e Helena. Por todo apoio, incentivo, cumplicidade e amor.

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Agradecimentos

Embora essa caminhada tenha sido muitas vezes solitária, trabalhando quando todos já haviam ido embora e nos fins de semana, realmente tenho muito a agradecer pelo apoio de muitas pessoas que me acompanharam nessa caminhada.

Agradeço: A Deus que esteve sempre presente me guiando e protegendo. À minha família pelo apoio e por entender minha ausência. Ao meu esposo, Augusto, por estar sempre presente. A todos os amigos pela compreensão, torcida e paciência.

Ao meu querido orientador, Prof. Dosil, pelo apoio e por sempre enxergar muito além do que eu poderia. Obrigada pela paciência, apoio e pela oportunidade de trabalhar com você nesses projetos. Por ser um orientador pastor que sempre busca a orientada perdida, mostrando possibilidades e caminhos alternativos!

Aos amigos do GEM: Richard, Camila, Grazielle, Heloisa, Maria Augusta, Gabriela, Nádia, Amilton, Hugo, Jaqueline, todos sem exceções pelas discussões, ajuda e apoio. A todos os ex-membros do GEM que certamente contribuíram para a realização deste trabalho.

À Aline Mora e Fernanda Aguiar pela ajuda no começo do trabalho, pela companhia e amizade.

Aos amigos do GPQUAE, em especial a Acacia e o Willian que continuaram comigo e estiveram sempre presentes.

Aos colegas de trabalho que apoiaram quando necessário para que eu conseguisse alcançar meus objetivos. Aos funcionários do IQ pelo apoio e por toda a ajuda durante o tempo que estive por aqui.

Ao Prof. Fracassi por ceder gentilmente o uso do CE-C4D e pelas discussões valorosas sobre o trabalho.

Às Profas. Helena Godoy e Ana Valéria pelas contribuições no exame de qualificação.

Às Profas. Eva Lúcia e Taicia Fill, pelo tempo dedicado à leitura da qualificação e pelas valiosas discussões.

Agradeço a todos que contribuíram de alguma forma para que esse trabalho fosse realizado. Mesmo parecendo solitário, e tendo uma autora, um doutorado não é realizado sozinho. E foram várias as mãos e cabeças que transformaram esse

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Resumo

A preocupação crescente da população com a saúde e bem-estar trouxe consigo o aumento do consumo de suplementos alimentares e alimentos que possam trazer benefícios à saúde física e mental. Exemplo desses produtos são os suplementos alimentares, contendo 5-hidroxitriptofano (5-HTP), e chocolate dietético, que contém polióis na sua composição, substituindo a sacarose. Esses produtos são adequados para serem consumidos por indivíduos com síndromes metabólicas e restrições alimentares. Nesse contexto, foram desenvolvidos dois métodos, utilizando eletroforese capilar (CE), que podem ser empregadas no controle de qualidade desses produtos. Assim, foi desenvolvido e validado um método para determinação de 5-HTP em suplementos alimentares utilizando CE com detecção no ultravioleta-visível (UV-Vis). Para tanto uma solução 20 mmol L-1 em fosfato de sódio (pH 10), contendo 0,2 mmol L-1 em brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), como inversor de fluxo eletrosmótico, foi empregada como eletrólito de corrida (BGE). Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) obtidos foram de 3,1 e 10,1 µmol L-1, respectivamente. A linearidade foi avaliada para concentrações entre 10,1-500 µmol L-1 de 5-HTP e o coeficiente de correlação linear (R2) foi de 0,9997. A exatidão foi avaliada por comparação com outro método, por HPLC, e os resultados obtidos foram estatisticamente concordantes, considerando um nível de confiança de 95%. Para a determinação de polióis em chocolates dietéticos utilizou-se CE com detecção condutométrica sem contato capacitivamente acoplada (C4D). A estratégia de separação utilizou a interação entre borato (no BGE) e os polióis para formar ésteres borato negativamente carregados. A separação dos polióis foi alcançada em menos de 7 minutos. As curvas de calibração apresentaram R2 entre 0,9959-0,9984. Os LOQs foram 13, 17, 10 e 9,93 µg g-1 para eritritol, maltitol, xilitol e sorbitol, respectivamente. A exatidão do método foi avaliada por testes de recuperação e foram obtidos valores entre 87 a 115%, com desvios padrão variando de 0,6 a 18,4%, o que demonstra que o método CE-C4D apresenta exatidão adequada para análises quantitativas. O método proposto foi aplicado com sucesso para a determinação de polióis em amostras comerciais de chocolate dietético.

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Abstract

Nowadays there is a growing concern in society about health and well-being that have contributed to increase the consumption of dietary supplements and foodstuffs, which are able to provide physical and mental health benefits. Examples of these products are the dietary supplements containing 5-hydroxytryptophan (5-HTP) and sugar-free chocolates, that contain polyols in their composition, replacing sucrose. These products are suitable to be consumed by individuals with metabolic syndrome and dietary restrictions. In this work, two analytical methods were developed using capillary electrophoresis (CE) for determination of 5-HTP in dietary supplements and polyols in sugar-free chocolates. For determination of 5-HTP, CE with ultraviolet-visible (UV-Vis) detection was used. A 20 mmol L-1 sodium phosphate solution (pH 10) was used as background electrolyte (BGE) and 0.2 mmol L-1 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) was added for electroosmotic flow inversion. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were 3.1 and 10.1 μmol L-1

, respectively. Linearity was evaluated at concentrations of 5-HTP from 10.1 to 500 μmol L-1

, and a linear correlation coefficient (R2) of 0.9997 was achieved. Accuracy was assessed by comparison with a HPLC method, and no differences were found between the methods for a confidence level of 95%. For the determination of polyols in sugar-free chocolate, a CE system with capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D) was used. The separation was based on the interaction between borate ions (from BGE) and the polyols to form negatively charged borate esters. The separation of the polyols was achieved in less than 7 minutes. The calibration curves showed R2 that varied from 0.9959 to 0.9984. The LOQs were 13, 17, 10, and 9.93 µg g-1 for erythritol, maltitol, xylitol, and sorbitol, respectively. The accuracy of the method was evaluated by recovery tests, and the results varied from 87 to 115% with standard deviations ranging from 0.6 to 18.4%. These results demonstrated that the CE-C4D method has adequate accuracy for quantitative analysis. The method was successfully applied for the determination of polyols in commercial samples of sugar-free chocolate.

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Lista de ilustrações

Figura 1: Configuração básica de um sistema de CE.8 ... 21 Figura 2: Modelo para a interface capilar-solução. IHP indica o plano interno de Helmholtz e OHP o plano externo de Helmholtz.1 ... 27 Figura 3: Variação da mobilidade do fluxo eletrosmótico, em capilar de sílica fundida, em função da variação do pH.2... 28 Figura 4: Biossíntese da serotonina a partir do triptofano. ... 37 Figura 5: Eletroferograma de uma solução padrão de 5-HTP (100 µmol L-1) e TRP (250 µmol L-1). BGE: tampão borato de sódio 20 mmol L-1 (pH 9,2) e CTAB (0,2 mmol L-1); capilar de 60 cm (51,5 cm efetivo) de comprimento e 50 µm de diâmetro interno; potencial de separação de -20 kV. Injeção hidrodinâmica de amostra por 4 s a 50 mbar; detecção no comprimento de onda de 214 nm. Picos: (1) 5-HTP e (2) TRP. . 45 Figura 6: Eletroferograma para uma solução padrão de triptofano e 5-HTP (500 µmol L-1, cada). Tampão fosfato de sódio 20 mmol L-1 (pH 10,0 ajustado com NaOH) e CTAB (0,2 mmol L-1), capilar de 60 cm (51,5 cm efetivo) de comprimento e 50 µm de diâmetro interno; potencial de separação de -20 kV. Injeção hidrodinâmica de amostra por 4 s a 50 mbar; detecção no comprimento de onda de 214 nm. Picos: (1) 5-HTP e (2) TRP. ... 46 Figura 7: Eletroferograma de uma solução padrão de 5-HTP e triptofano (300 µmol L- 1, cada), além do padrão interno ftalato (100 µmol L-1). Tampão fosfato de sódio 20 mmol L-1 (pH 10,0 ajustado com NaOH) e CTAB (0,2 mmol L-1), capilar de 60 cm (51,5 cm efetivo) de comprimento e 50 µm de diâmetro interno; potencial de separação de -20 kV. Injeção hidrodinâmica de amostra por 4 s a 50 mbar; detecção no comprimento de onda de 214 nm. . Picos: (1) ftalato, (2) 5-HTP, (3) triptofano. .. 47 Figura 8: Curva analítica construída a partir da injeção de soluções padrão de 5-HTP no sistema CE-UV ... 49 Figura 9: Gráficos de resíduos para a curva analítica construída a partir da injeção de soluções padrão de 5-HTP no sistema CE-UV ... 49 Figura 10: Eletroferogramas de (A) uma solução padrão de 5-HTP (300 µmol L-1), (B) de uma amostra de suplemento alimentar e (C) da mesma amostra de suplemento alimentar fortificada com triptofano (300 µmol L-1). Ftalato (100 µmol L-1) foi adicionado às soluções como padrão interno. Tampão fosfato de sódio 20 mmol L-1 (pH 10,0 ajustado com NaOH) e CTAB (0,2 mmol L-1) Capilar de 60 cm (51,5 cm

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efetivo) de comprimento e 50 µm de diâmetro interno; potencial de separação de -20 kV. Injeção hidrodinâmica de amostra por 4 s a 50 mbar; detecção no comprimento de onda de 214 nm. Picos: (1) ftalato (padrão interno), (2) 5-HTP, (3) TRP. ... 51 Figura 11: Estrutura química de alguns polióis: A: Eritritol, B: Xilitol, C: Maltitol e D: Sorbitol, E: Lactitol, F: Isomalte e G: Manitol... 58 Figura 12:Equilíbrio entre ácido bórico, borato e dióis em meio aquoso. 138 ... 62 Figura 13: A: Representação artística da cela oscilométrica, onde e1 e e2 são os eletrodos. B:Circuito equivalente para C4D, em que Rs é a resistência da solução e Cw e Co são as capacitâncias da parede do capilar e inter-eletrodos, respectivamente.17 ... 64 Figura 14: Sistema CE-C4D utilizado no trabalho. Em destaque. A: Gerador de funções, B: Tela do software de aquisição de dados, C: Ajuste de linha de base, D: Detector e E: Reservatórios de BGE. ... 67 Figura 15: Eletroferograma de uma solução padrão contendo uma mistura de polióis (250 µmol L-1). Picos: (E): eritritol, (M): maltitol, (X): xilitol e (S): sorbitol. BGE: Borato de sódio 50 mmol L-1 (pH 9,15). Coluna capilar de sílica fundida com 50 µm de diâmetro interno e 50 cm de comprimento (42 cm efetivo). Injeção hidrodinâmica durante 10 s. ... 71 Figura 16: Gráfico dos tempos de migração dos polióis e do pico marcador de EOF (água) em função do potencial elétrico aplicado. ... 72 Figura 17: Eletroferograma de uma solução padrão contendo uma mistura de polióis (250 µmol L-1). BGE: Borato de sódio (A) 25 mmol L-1, (B) 33 mmol L-1 e (C) 50 mmol L-1 (pH 9,15 Coluna capilar de sílica fundida com 50 µm de diâmetro interno e 50 cm de comprimento (42 cm efetivo). Injeção hidrodinâmica durante 10 s. Picos: (E): eritritol, (M): maltitol, (X): xilitol e (S): sorbitol. ... 73 Figura 18: Eletroferograma de uma solução padrão contendo uma mistura de polióis (250 µmol L-1) para diferentes tempos de injeção hidrodinâmica: (A) 3 s, (B) 5 s e (C) 10s. BGE: Borato de sódio 25 mmol L-1 (pH 9,15). Coluna capilar de sílica fundida com 50 µm de diâmetro interno e 60 cm de comprimento (52 cm efetivo). Tensão de separação de 25 kV. Picos: (E): eritritol, (M): maltitol, (X): xilitol e (S): sorbitol. ... 74 Figura 19: Eletroferogramas de soluções padrão de polióis em diferentes valores de pH do BGE: Borato de sódio 25 mmol L-1 Coluna capilar de sílica fundida com 50 µm de diâmetro interno e 50 cm de comprimento (42 cm efetivo). Tensão de separação

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de 25 kV; injeção hidrodinâmica durante 5 s. Picos: (E): eritritol, (M): maltitol, (X): xilitol e (S): sorbitol. ... 75 Figura 20: Eletroferogramas de soluções padrão de polióis em pH 8,8 e 8,5 do. BGE: Borato de sódio 25 mmol L-1. Coluna capilar de sílica fundida com 50 µm de diâmetro interno e 50 cm de comprimento (42 cm efetivo). Tensão de separação de 25 kV; injeção hidrodinâmica durante 5 s. Picos: (E): eritritol, (M): maltitol, (X): xilitol, (S): sorbitol, (PI): lactato. ... 75 Figura 21: Eletroferograma de uma solução padrão dos póliois. BGE: Borato de sódio 25 mmol L-1 (pH 8,5). Coluna capilar de sílica fundida com 50 µm de diâmetro interno e 50 cm de comprimento (42 cm efetivo). Tensão de separação de 25 kV; injeção hidrodinâmica durante 5 s. Picos: (E): eritritol, (M): maltitol, (X): xilitol, (S): sorbitol. ... 76 Figura 22: Eletroferograma de uma solução padrão de polióis (250 µmolL-1). BGE: Borato de sódio 25 mmol L-1 (pH 8,5). Coluna capilar de sílica fundida com 50 µm de diâmetro interno e 70 cm de comprimento (62 cm efetivo). Tensão de separação de 25 kV; injeção hidrodinâmica durante 5 s. Picos: (E): eritritol, (M): maltitol, (X): xilitol, (S): sorbitol ... 77 Figura 23: Eletroferograma de uma solução padrão de uma mistura de polióis (250 mmo L-1), onde (E): eritritol, (M): maltitol, (PI): padrão interno, HEPES, (X): xilitol e (S): sorbitol. BGE: Borato de sódio 25 mmol L-1 (pH 8,5). Coluna capilar de sílica fundida com 50 µm de diâmetro interno e 70 cm de comprimento (62 cm efetivo). Tensão de separação de 25 kV; injeção hidrodinâmica durante 5 s. ... 78 Figura 24: Concentração de polióis extraídos de chocolate em função do tempo de extração. Sendo o tempo de extração de 2 min com agitação apenas manual e os tempos de 5,10 15 e 20 min com uso de ultrassom. ... 79 Figura 25: Curvas analíticas obtidas a partir de adições de soluções padrão de polióis no extrato aquoso (vermelho) e em BGE (preto). ... 80 Figura 26: Curvas analíticas construídas a partir da análise de soluções padrão de polióis por CE-C4D ... 82 Figura 27: Gráficos de resíduos decorrentes da análise de soluções padrões de polióis por CE- C4D ... 83 Figura 28: Eletroferogramas típicos para as amostras de chocolate, os números equivalem as amostras apresentados na Tabela 9. Onde (E): eritritol, (M): maltitol, (PI): padrão interno, HEPES, (X): xilitol e (S): sorbitol. BGE: Borato de sódio

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25 mmol L-1 (pH 8,5). Coluna capilar de sílica fundida com 50 µm de diâmetro interno e 70 cm de comprimento (62 cm efetivo). Tensão de separação de 25 kV; injeção hidrodinâmica durante 5 s. ... 87 Figura 29: Eletroferogramas de extratos da amostra “branco” (preto) e da mesma amostra fortificada com polióis (vermelho). Onde (E): eritritol, (M): maltitol, (PI): padrão interno, HEPES, (X): xilitol e (S): sorbitol. BGE: Borato de sódio 25 mmol L-1 (pH 8,5). Coluna capilar de sílica fundida com 50 µm de diâmetro interno e 70 cm de comprimento (62 cm efetivo). Tensão de separação de 25 kV; injeção hidrodinâmica durante 5 s. ... 88

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Lista de Tabelas

Tabela 1: Métodos de determinação de precursores da serotonina e de compostos

relacionados em diferentes matrizes. ... 41

Tabela 2: Mobilidades aparentes (µa) e efetiva (µef) do 5-HTP e TRP ... 47

Tabela 3: Parâmetros de adequação do sistema. ... 48

Tabela 4: Figuras de mérito do método proposto. ... 49

Tabela 5: Ingredientes contidos nos suplementos alimentares de 5-HTP analisados ... 50

Tabela 6: Média (± desvio padrão) para a quantificação de 5-HTP em suplementos alimentares pelos métodos por CE e HPLC. ... 52

Tabela 7: Métodos de determinação de polióis e compostos relacionados em diferentes matrizes. ... 60

Tabela 8: Mobilidades aparente (µa) e efetiva (µef) dos polióis. ... 78

Tabela 9: Resultados do estudo de efeito de matriz para amostra de chocolate dietético. ... 80

Tabela 10: Parâmetros de adequação do sistema para o método CE-C4D para determinação de polióis em chocolates dietéticos. ... 81

Tabela 11: Figuras de mérito do método CE-C4D para determinação de poliois em chocolates dieteticos. ... 81

Tabela 12: Determinação da porcentagem de recuperação (média ± SD) de polióis em amostras de chocolates fortificados em 3 níveis de concentração. ... 84

Tabela 13: Resultados das análises de polióis em chocolate dietético utilizando o método CE-C4D. ... 85

Tabela 14: Ingredientes e indicação do tipo de aditivo utilizados nas amostras de chocolate dietético analisadas. ... 86

Tabela 15: Porcentagem de recuperação (*média ± SD) de polióis em amostra “branco” fortificado analisadas pelo método CE-C4 D. ... 88

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Lista de Abreviaturas e Siglas

5-HT - 5-hidroxitriptamina (Serotonina) 5-HTP - 5-hidroxitriptofano

ABICAB - Associação Brasileira da Indústria de Chocolates, Cacau, Amendoim, Balas e Derivados

BGE - Eletrólito de corrida (do inglês, Background Electrolyte)

C4D - Detecção condutométrica sem contato capacitivamente acoplada (do inglês, Capacitively Coupled Contacless Conductivity Detection)

CE - Eletroforese Capilar (do inglês, Capillary Electrophoreis)

CGE - Eletroforese Capilar em Gel (do inglês, Capillary Gel Electrophoreis) CITP - Isotacoforese Capilar (do inglês, Capillary Isotachophoreris)

CTAB - Brometo de cetiltrimetil amônio (do inglês, Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)

EKC - Cromatografia Eletrocinética (do inglês, Electrokinectic Chromatography) EMS - Síndrome eosinofilia-mialgia (do inglês, Eosinophilia myalgia syndrome) EOF - Fluxo eletrosmótico (do inglês, Electroosmotic Flow)

FDA - United States Food and Drug Administration

FSCE - Eletroforese Capilar em Solução Livre (do inglês, Free Solution Capillary Electrophoresis)

HEPES - Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etano-sulfônico

IHP -Plano interno de Helmholtz (do inglês, inner Helmholtz plane)

MEKC - Cromatografia Eletrocinética Micelar (do inglês, Micellar Electrokinectic Chromatography)

MES -Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico

OHP - Plano externo de Helmoholtz (do inglês, outer Helmholtz plane) TRP - Triptofano

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Lista de Símbolos

α

_j - Fração molar ou função de distribuição

μ

_j - Mobilidade eletroforética de uma espécie

𝐿

_𝑑 - Comprimento efetivo do capilar

𝑡

_𝑖𝑛𝑗 - Tempo de injeção

𝜇

_𝑎 -Mobilidade eletroforética aparente

𝜐

_𝑒 - Velocidade eletroforética

L

- Comprimento total do capilar

𝑟 -

Raio iônico efetivo do íon

𝜂

- Viscosidade da solução

𝜇

_𝑒 - Mobilidade eletroforética

𝜇

_𝑒𝑜𝑓 – Mobilidade eletroforética do fluxo eletrosmótico

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Sumário

Capítulo I: Fundamentação teórica. Eletroforese capilar e validação de métodos

analíticos ... 19

I.1.1 Eletroforese ... 20

I.1.2. Eletroforese capilar ... 20

I.1.2.1 Instrumentação ... 21

I.1.2.2. Introdução da amostra ... 21

I.1.2.3. Detectores ... 23

I.1.2.4. Modos de separação eletroforética ... 24

I.1.2.5. Fundamentos teóricos e práticos ... 26

I.1.2.5.1 Fluxo eletrosmótico (EOF) ... 26

I.1.2.5.2 Mobilidades ... 28

I.1.2.6. Variáveis que influenciam os parâmetros de separação ... 30

I.2.2 Validação de métodos analíticos ... 32

I.2.2.1 Seletividade... 32

I.2.2.2 Limite de detecção e quantificação ... 32

I.2.2.3 Linearidade ... 33

I.2.2.4 Exatidão ... 33

I.2.2.5 Precisão ... 34

I.2.2.4 Robustez ... 34

Capítulo II: Desenvolvimento e validação de um método para determinação de precursores da serotonina em suplementos alimentares ... 35

II.2. Introdução ... 36

II.2.1. Suplementos alimentares e medicina alternativa ... 36

II.2.1.1 Serotonina e precursores da serotonina ... 36

II.2.1.2 Triptofano ... 37

II.2.1.3 Suplementos de 5-hidroxitriptofano ... 38

II.2.2. Objetivo ... 42

II.2.3. Parte experimental ... 42

II.2.3.1- Reagentes... 42

II.2.3.2- Preparo das soluções-padrão ... 42

II.2.3.3- Preparo do BGE ... 42

(17)

II.2.3.5- Preparo das amostras de suplemento alimentar ... 43

II.2.3.6 Validação ... 43

II.2.4.Resultados e discussões ... 45

II.2.4.1 Desenvolvimento do método de separação ... 45

II.2.4.2- Validação do método para determinação de 5-HTP em suplementos alimentares ... 48

II.2.4.3- Análises de suplementos alimentares ... 50

II.2.5 Conclusões ... 53

Capítulo III - Desenvolvimento e validação de um método para determinação de polióis em chocolate dietético por eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato capacitivamente acoplada (CE-C4D). ... 54

III. 3.Introdução ... 55

III.3.1.1 Chocolate ... 55

III.3.1.2 Chocolate dietético ... 56

III.3.1.3 Polióis ... 57

III.3.1.2 Ésteres borato ... 62

III.3.1.5 CE-C4D e determinação de polióis em chocolates dietéticos ... 63

III.3.2. Objetivos ... 66

III.3.3. Parte experimental ... 66

III.3.3.1. Reagentes e padrões analíticos ... 66

III.3.3.2- Preparo das soluções-padrão ... 66

III.3.3.3- Preparo do BGE ... 66

III.3.3.4 Instrumentação CE ... 67

III.3.3.4.1 Condicionamento do capilar ... 67

III.3.3.5 Desenvolvimento do método de separação ... 67

III.3.3.6 Preparo das amostras e extração dos polióis ... 68

III.3.3.7 Avaliação da extração dos polióis ... 68

III.3.3.8 Validação ... 69

III.3.3.9 Preparo e análise de amostra “branco” de chocolate fortificada com polióis ... 70

III.3.4. Resultados e discussões ... 71

III.3.4.1 Desenvolvimento e otimização da separação por CE-C4D ... 71

III.3.4.2 Extração dos polióis ... 79

(18)

III.3.4.4. Validação do método para determinação de polióis em chocolate dietético

... 81

III.3.4.5 Amostras de chocolates dietéticos ... 85

III.3.4.6 Amostra “branco” fortificada ... 87

III.3.5 Conclusões ... 89

4. Considerações gerais e perspectivas ... 90

(19)

Capítulo I: Fundamentação teórica. Eletroforese capilar e validação

de métodos analíticos

(20)

I.1.1 Eletroforese

Eletroforese é uma técnica de separação baseada na migração diferencial de compostos iônicos ou ionizáveis quando submetidos à aplicação de um campo elétrico.1,2 Arne Tiselius, na década de 1930, em um trabalho pioneiro, descreveu o uso da técnica de eletroforese para a separação de proteínas em soro sanguíneo, utilizando o método de fronteira móvel. Nesse método, a amostra é colocada em um tubo contendo uma solução tampão, um potencial elétrico é aplicado e os analitos migram de acordo com a mobilidade de cada um, entretanto a separação completa não é atingida.2

Os suportes comumente utilizados para eletroforese são: papel, géis de agarose, géis de acrilamida, dentre outros. Esses meios ou suportes apresentam a desvantagem de não dissiparem satisfatoriamente o calor produzido quando o potencial elétrico é aplicado. Além disso, como esses suportes apresentam grande área superficial para a adsorção dos analitos, podem ocorrer distorções das bandas dos solutos.1

O efeito Joule é o aumento da temperatura causado pela conversão de energia elétrica em calor, quando um potencial elétrico é aplicado através de um meio condutor.3 A dificuldade para dissipar o calor produzido pode levar a formação de gradientes de temperatura, fenômenos de convecção e distorção nas bandas, diminuindo a resolução das separações eletroforéticas. Um modo interessante de contornar esse efeito em eletroforese é o uso de capilares com pequenos diâmetros internos. Em 1979 Mikkers e colaboradores4 publicaram, pela primeira vez, um trabalho sobre eletroforese capilar utilizando tubos de Teflon com diâmetros interno de 0,2 mm e 0,35 mm. Os tubos capilares apresentam elevada área superficial interna relativa ao volume, o que facilita a dissipação do calor, além de permitir que campos elétricos elevados sejam aplicados.1

I.1.2. Eletroforese capilar

O uso de colunas capilares em eletroforese criaram novas perspectivas e, desde o início da década de 1980, o avanço dessa técnica analítica de separação foi bastante pronunciado.5 O uso de capilares, usualmente produzidos com sílica fundida, com diâmetros reduzidos (entre 15 e 100 µm), aliados a aplicação de altas

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voltagens, resultaram no aumento da eficiência e da resolução nas separações, além da diminuição dos tempos de análises.

A eletroforese capilar (CE) permite o uso de pequenas quantidades de amostras e reagentes. Adicionalmente, é uma técnica versátil, que possui vários modos de operação, o que permite sua aplicação em várias áreas da ciência, principalmente na determinação de diferentes analitos.1,2

I.1.2.1 Instrumentação

Uma característica marcante da técnica de CE é a simplicidade instrumental. Um instrumento típico possui um capilar de sílica fundida, uma fonte de alta voltagem, dois reservatórios de eletrólito de corrida (BGE, do inglês Background Electrolyte), um dispositivo de injeção de amostra, um detector e um sistema de aquisição de dados.6,7

A Figura 1 apresenta um esquema simplificado para um sistema de CE.

Figura 1: Configuração básica de um sistema de CE.8

I.1.2.2. Introdução da amostra

O modo de injeção da amostra tem influência direta na precisão das análises em CE, uma vez que, quantidades da ordem de nanolitros são injetadas. Os modos de injeção mais utilizados são a hidrodinâmica e a eletrocinética. Para a injeção

(22)

hidrodinâmica é estabelecida uma diferença de pressão entre os reservatórios. A pressão é aplicada ao reservatório de amostra, fazendo com que a amostra preencha uma pequena porção do capilar. A aplicação de vácuo no reservatório de eletrólito, do lado oposto ao reservatório de amostra (Fig. 1), também levará a injeção da amostra. Outra forma de realizar injeção hidrodinâmica é a injeção por gravidade, em que o reservatório de amostra é elevado em relação ao reservatório de eletrólito e, nesse caso, a introdução da amostra ocorre por sifonagem. O volume injetado hidrodinamicamente pode ser calculado através da Equação 1:

𝑉

_𝑖𝑛𝑗

=

∆𝑃𝑑4𝜋𝑡𝑖𝑛𝑗

128𝜂𝐿

Equação 1

Onde

∆𝑃

é a pressão aplicada no capilar,

𝑑

é o diâmetro interno do capilar,

𝑡

_𝑖𝑛𝑗 é o tempo em que a pressão é aplicada,

𝜂

é a viscosidade da amostra e

𝐿

é o comprimento total do capilar.2,9

Já na injeção eletrocinética, um potencial elétrico é aplicado e faz com que as espécies da amostra migrem para o capilar.1 Essa injeção é influenciada pelas velocidades eletroforéticas dos analitos e pelo fluxo eletrosmótico. É comum ocorrer discriminação de injeção dos analitos durante a injeção eletrocinética, devido a diferenças de mobilidade entre os analitos. Apesar disso, esse modo de injeção é simples, não requer equipamentos adicionais1–3 e a quantidade injetada pode ser calculada através da Equação 2:

𝑄 =

(𝜇𝑒+ 𝜇𝑒𝑜𝑓)𝑉𝜋𝑟2𝐶𝑡𝑖𝑛𝑗

𝐿

Equação 2

Onde,

𝜇𝑒

é a mobilidade eletroforética do analito,

𝜇𝑒𝑜𝑓

é a mobilidade do fluxo eletrosmótico,

V

é a voltagem usada na injeção,

r

é o raio interno do capilar,

C

é a concentração do analito,

𝑡

_𝑖𝑛𝑗 é o tempo de injeção e

L

é o comprimento total do capilar.2,9

(23)

Em comparação com a injeção eletrocinética, a injeção hidrodinâmica é mais robusta e precisa, uma vez que é pouco influenciada pela composição da amostra e a alíquota injetada é representativa da amostra, sem discriminação dos analitos.1–3

I.1.2.3. Detectores

Os detectores utilizados em CE podem ser seletivos ou universais. Os detectores seletivos medem uma determinada propriedade do soluto e os detectores universais medem uma propriedade do soluto em relação à solução.1 Os detectores mais empregados em CE são os detectores de absorbância no ultravioleta/visível (UV-Vis), de fluorescência, por espectrometria de massas e eletroquímicos.2,10,11

Os detectores de absorbância ou espectrofotométricos no UV-Vis são ainda os mais utilizados em CE.10 Nas detecções espectrofotométricas pelo método direto, os analitos devem ter absorção considerável na região do UV-Vis e os eletrólitos empregados são constituídos por espécies com baixa absortividade na mesma região. Para detecção indireta, eletrólitos contendo espécies que apresentam absorção no UV-Vis (cromóforos) são empregados e uma diminuição na absorbância é medida, quando os analitos chegam ao detector.2 Embora o detector UV-Vis seja o mais difundido em CE, ele apresenta limitações quanto à detectabilidade,12 devido ao reduzido caminho óptico do capilar, o que acaba limitando o uso desse detector, quando limites de detecção muito baixos são requeridos. Alguns artifícios, como a pré-concentração dos analitos dentro (online) do capilar ou antes da injeção (offline), derivatização de compostos com baixa absortividade e o uso de células de alta sensibilidade podem ser usados para contornar essa baixa detectabilidade.10

Detectores de fluorescência são os mais sensíveis e seletivos aplicados em CE, uma vez que a fluorescência é medida contra uma radiação de fundo (background) bastante baixa. Assim, pequenas quantidades de luz, emitidas pelos analitos, podem ser medidas, possibilitando uma elevada detectabilidade.11 A detecção por fluorescência pode ser realizada na coluna capilar (oncolumn) ou após a mesma (postcolumn). A fluorescência nativa de algumas moléculas pode ser utilizada para detecção ou etapas de derivatização podem ser realizadas para compostos não fluorescentes. Dependendo da técnica utilizada e da geometria do detector, limites de detecção da ordem de 10-13 mol L-1 podem ser alcançados.10

(24)

Os detectores eletroquímicos são divididos em três categorias, os potenciométricos, os condutométricos e os amperométricos. Os detectores potenciométricos são baseados na seletividade de microelétrodos que podem detectar pequenas quantidades de íons orgânicos e inorgânicos. A presença dos íons contidos na amostra causa uma diferença de potencial entre a solução que preenche o capilar (BGE) e o sensor. Essa diferença de potencial é medida e é diretamente proporcional à concentração do íon detectado. No caso dos detectores de condutividade, um potencial elétrico é aplicado em um par de eletrodos, os quais, dependendo da configuração do detector, podem estar com ou sem contato com a solução eletrolítica. Quando os analitos passam entre os eletrodos a mudança de condutividade é medida. Essa variação de condutividade tem relação direta com a concentração dos analitos iônicos. Já o princípio dos detectores amperométricos baseia-se na transferência de elétrons entre o analito de interesse e a superfície do eletrodo, no qual é aplicado um potencial. A transferência de elétrons, que ocorre no eletrodo, devido a reações de oxido-redução produz uma corrente que é proporcional a concentração do analito.10

O uso de espectrometria de massas (MS) para a detecção em CE tenta reunir as vantagens das duas técnicas, a alta eficiência e resolução da CE e a universalidade e detectabilidade da MS.13 Muitos avanços têm sido feitos para solucionar os problemas intrínsecos à hifenação dessas técnicas. A necessidade de fechamento do circuito elétrico, necessário para a separação eletroforética, bem como os fluxos reduzidos de solução, provenientes da CE, tornam a interface CE-MS menos direta do que nos métodos cromatográficos. O primeiro sistema que possibilitou o uso de CE-MS utilizou uma interface por electrospray (ESI).14 Atualmente outros métodos de injeção da amostra são utilizadas para o acoplamento CE e ESI-MS, tais como as interfaces sem líquido auxiliar (sheathless), com líquido auxiliar (sheath-liquid) e utilizando junção líquida (liquid junction). Essas configurações possibilitaram vários avanços na utilização de espectrometria de massas como detecção em CE.13,15

I.1.2.4. Modos de separação eletroforética

Vários modos de separação são possíveis em CE, dentre eles: Cromatografia Eletrocinética Micelar (MEKC, do inglês Micellar Electrokinectic Chromatography),

(25)

Eletroforese Capilar em Gel (CGE, do inglês Capillary Gel Electrophoreis), Eletrocromatografia capilar (CEC, do inglês Capillary Electrochromatography), Isotacoforese Capilar (CITP, do inglês Capillary Isotachophoreris) e Eletroforese Capilar em Solução Livre (FSCE, do inglês Free Solution Capillary Electrophoresis).5,16

Em MEKC, uma pseudo fase estacionária é composta por micelas formadas pela adição de tensoativos iônicos em concentrações acima da concentração micelar crítica.17 A separação é baseada na partição diferenciada dos solutos entre a fase móvel e a micelar. Essa versão é empregada principalmente para solutos neutros.2,18

CEC é uma técnica híbrida entre CE e cromatografia líquida, que emprega a partição das moléculas entre as fases estacionária e móvel. Os capilares são preenchidos com uma fase estacionária monolítica ou são empacotados com partículas usadas em colunas de HPLC. Entretanto na CEC o fluxo eletrosmótico é utilizado para mover a fase móvel pela coluna capilar. CEC emprega tipicamente soluções com alta concentração de solventes orgânicos e voláteis, o que favorece o uso acoplado a espectrometria de massas.19

CGE é usada para separar compostos com caráter iônico e alta massa molecular, como ácidos nucléicos e proteínas. A separação por peneiramento, ou seja, pela diferença de tamanho relativo, ocorre porque o capilar é preenchido com uma matriz polimérica.2 Eletroforese em gel, no formato capilar, utiliza polímeros lineares, como: poliacrilamida, metilcelulose e dextran, bem como, polímeros de ligações cruzadas como: bis-acrilamida e polímeros enovelados como óxido de polietileno.18

Em CITP a amostra é inserida no capilar entre dois eletrólitos, sendo o primeiro com mobilidade eletroforética maior que todos os componentes da amostra, chamado de eletrólito líder, e o segundo é o eletrólito terminador, que apresenta mobilidade menor que os demais componentes da amostra.2 Quando o potencial elétrico é aplicado, diferentes gradientes de potencial envolvem cada zona dos analitos, de acordo com as mobilidades dos mesmos. Assim, cada analito é focalizado em ordem decrescente de mobilidades eletroforéticas, em relação ao eletrólito líder, porém migram com a mesma velocidade (isotacoforese). A técnica pode ser aplicada à análise de peptídeos e proteínas, usualmente com detecção por espectrometria de massas.18,19

(26)

FSCE, também chamado de eletroforese capilar de zona, é o modo de separação por CE mais simples e utilizado. Nesse modo, a amostra é introduzida em um meio tamponado e quando o potencial elétrico é aplicado, cada zona da amostra migra de acordo com sua mobilidade eletroforética, permitindo a separação. Vários analitos podem ser separados nesta modalidade, desde íons inorgânicos e compostos orgânicos de baixa massa molecular a biomoléculas.18

Os diversos modos de separação por CE, aliados às diferentes técnicas de detecção possíveis, possibilitam diversas aplicações desta técnica de separação. Por exemplo, CE é muito útil na determinação de aminoácidos,20 peptídeos e proteínas. 21,22 Vários trabalhos demostram a aplicabilidade da técnica para a determinação de ácidos nucleicos, proteínas, lipídios, carboidratos,23,24 metabolitos e pequenas moléculas, bem como biopartículas e células únicas.25 A versatilidade da técnica também se confirma pelo uso de CE na análise de alimentos26–29 e pela determinação de diversos cátions e ânions inorgânicos.30,31

I.1.2.5. Fundamentos teóricos e práticos

I.1.2.5.1 Fluxo eletrosmótico (EOF)

A sílica fundida, uma forma amorfa de dióxido de silício, é o material mais utilizado para a produção dos capilares empregados em CE. Os capilares de sílica apresentam diversas vantagens quando comparados a outros materiais. Eles podem ser utilizados para detecção espectrofotométrica em comprimentos de onda entre 190 e 900 nm, apresentam resistência mecânica e química, baixa condutividade elétrica e alta constante dielétrica. Além disso, a sílica permite a produção de capilares com dimensões bem definidas.

Entretanto, um dos fatores mais interessantes, inerentes a esse material, é a formação do chamado fluxo eletrosmótico (EOF, do inglês Electroosmotic Flow). O capilar de sílica fundida apresenta grupos silanóis em sua superfície e esses grupos podem ser ionizados, tornando-se negativamente carregados, em meio aquoso com pH maiores que dois. Quando o capilar é preenchido por um eletrólito, as cargas negativas da parede do capilar atraem os íons positivos da solução, como pode ser observado na Figura 2. O centro desses íons define um plano chamado de plano interno de Helmholtz (IHP). Esses íons presentes na interface capilar-solução formam uma dupla camada elétrica, que é constituída por uma camada compacta e

(27)

outra difusa, sendo essa última atraída mais fracamente pelos grupos silanóis do capilar de sílica. O plano que delimita a camada compacta da dupla camada elétrica é chamado de plano externo de Helmholtz (OHP).

Quando um potencial elétrico é aplicado através do capilar, o campo elétrico atua nas cargas positivas (cátions), que formam a camada difusa da dupla camada elétrica, e esses cátions são atraídos para o eletrodo de carga oposta. Como esses íons se encontram solvatados, eles transportam também as moléculas de água, gerando um movimento como um todo da solução contida no capilar, conhecido como fluxo eletrosmótico. Delimitando a camada difusa da dupla camada elétrica, existe um plano de cisalhamento e nesse plano se desenvolve o potencial eletrocinético ou potencial zeta (ξ). Esse potencial tem implicações importantes no desenvolvimento do EOF.1 A Figura 2 apresenta um modelo para interface capilar-solução, indicando a camada compacta, a camada difusa, o plano de cisalhamento, IHP e o OHP.

Figura 2: Modelo para a interface capilar-solução. IHP indica o plano interno de Helmholtz e

OHP o plano externo de Helmholtz.1

A formação do EOF depende da ionização dos grupos silanóis, assim o pH tem influência direta na magnitude do EOF. A Figura 3 mostra a variação da mobilidade do EOF em função do pH. No intervalo de pH entre 2 a 10 o aumento do pH favorece o aumento da mobilidade do EOF.

(28)

Figura 3: Variação da mobilidade do fluxo eletrosmótico, em capilar de sílica fundida, em

função da variação do pH.2

Alguns modificadores podem ser utilizados para alterar a velocidade e o sentido do EOF e até mesmo para suprimi-lo. Eletrólitos com pH baixo, diminuem as cargas negativas na superfície do capilar e levam à redução da velocidade do EOF. A inversão do EOF pode ocorrer dinamicamente através do uso de aditivos no BGE, como tensoativos, por exemplo. Entretanto, alterações permanentes na parede do capilar, através de adsorção ou alterações químicas, também podem ser utilizadas para modular a intensidade e sentido do EOF.2

I.1.2.5.2 Mobilidades

Um parâmetro fundamental em CE é a mobilidade dos analitos ou mobilidade eletroforética (e), cuja unidade é cm2 V-1 s-1, e depende da carga do íon (

𝑞

), da

viscosidade da solução (

𝜂

) e do raio iônico efetivo do íon (

𝑟

).

A Equação 3 permite calcular a mobilidade eletroforética (

𝜇

_𝑒).

𝜇

_𝑒

=

𝑞

6𝜋𝜂𝑟

Equação 3

Outros termos fundamentais em CE são a velocidade eletroforética (cm s-1) e o campo elétrico (V cm-1). A velocidade é calculada pela divisão entre o comprimento efetivo do capilar (distância entre o ponto de injeção e o detector) e o tempo de migração (Eq. 4). Quanto ao tamanho do capilar, duas medidas são importantes em

(29)

CE, o comprimento efetivo, que mede a distância entre a entrada do capilar e o detector, e o comprimento total, que é a medida total do capilar. As equações 4 e 5 são expressões que relacionam esses termos.

𝜐

_𝑒

=

𝐿𝑑

𝑡_𝑚

_j a mobilidade de cada espécie individual j.

Para analitos considerados eletrólitos fracos, a

𝜇

_𝑒𝑓 é mais adequada que a



e, uma vez que esta última é atribuída à uma espécie totalmente ionizada.

I.1.2.6. Variáveis que influenciam os parâmetros de separação

Algumas variáveis são importantes em separações por CE e o ajuste adequado dessas condições tem papel determinante na eficiência das separações. Dentre essas condições destacam-se a concentração, composição e o pH do BGE, a temperatura, o diâmetro interno e o comprimento do capilar, o potencial elétrico de separação e o uso de aditivos no BGE.

A composição e a concentração do BGE podem influenciar a corrente elétrica produzida no sistema, a velocidade do EOF, a mobilidade dos analitos e a eficiência das separações. Outro fator importante para o eletrólito é o efeito tamponante, responsável por manter o pH do meio constante, minimizando os efeitos de adições de espécies básicas ou ácidas durante a injeção da amostra ou durante a separação eletroforética, devido a eletrólise nos eletrodos. Além disso, o pH afeta a carga dos analitos, o EOF, a corrente e, consequentemente, a produção de calor. O pH do eletrólito é determinante nas separações eletroforéticas, uma vez que a presença de carga elétrica, em determinados analitos, é função do pH, o qual irá determinar se o

(31)

analito irá migrar sob a influência do campo elétrico ou apenas será levado pelo fluxo eletrosmótico.19

As variações de temperatura também influenciam as separações eletroforéticas, uma vez que o aumento da temperatura do sistema de separação pode levar à degradação do BGE e das amostras.32 O aumento da temperatura também causa a diminuição da viscosidade do eletrólito e, consequentemente, o aumento da velocidade do EOF, que é influenciada pela viscosidade do eletrólito, como mostra a equação 6. Em menor extensão a temperatura também afeta o potencial zeta e a constante dielétrica.33

Capilares com diâmetro interno menores dissipam mais facilmente o calor gerado no sistema, uma vez que o gradiente de temperatura é proporcional ao quadrado do diâmetro interno do capilar.7 Adicionalmente, capilares com diâmetros internos reduzidos apresentam menores variações no gradiente interno de temperatura.

O potencial elétrico aplicado tem influência direta na velocidade de migração dos analitos, como indica a equação 5. Adicionalmente, o potencial tem efeito significativo na eficiência e no tempo de análise. O uso de potenciais elevados aumentam a eficiência e diminui o tempo de análises.7

Alguns aditivos podem ser adicionados ao BGE para promover alterações dinâmicas e alterar a mobilidade dos analitos. Alguns aditivos podem ser usados para suprimir o EOF e reduzir as interações dos analitos com a parede do capilar.18 Aditivos como éteres coroa e ciclodextrinas são utilizados para separações quirais e como complexante na separação de metais.34

As variáveis experimentais que influenciam as separações eletroforéticas estão intimamente relacionadas entre si e podem ser otimizadas para possibilitar separações eficientes em tempos de análises curtos.

(32)

I.2.2 Validação de métodos analíticos

A validação de métodos analíticos é um processo constituído por diversas etapas que visam assegurar a confiabilidade, comparabilidade e rastreabilidade de um método que se deseja validar.35 Vários órgãos nacionais e internacionais possuem documentos que direcionam a validação de métodos analíticos, como por exemplo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), o Ministério da Agricultura e Pecuária e Abastecimento (MAPA), o Eurachem Working Group e a Internacional Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC).

Segunda a ANVISA a validação dos métodos analíticos é realizada para garantir, por meio de estudos experimentais, que um método proposto atende às exigências analíticas, bem como, assegurar a confiabilidade dos resultados.36 Assim, a validação estabelece, através de estudos sistemáticos, se o método é adequado a sua finalidade, ou seja, se ele produz resultados que atendem a necessidade do problema analítico.37 Desta forma, segundo a ANVISA, os principais parâmetros de validação de um método analítico são: especificidade, seletividade, intervalo da curva de calibração, linearidade, curva de calibração, precisão, repetibilidade, reprodutibilidade, limites de detecção e quantificação, exatidão e robustez. A seguir, alguns destes parâmetros (mais importantes) são sucintamente descritos.

I.2.2.1 Seletividade

A seletividade corresponde à capacidade de um método em determinar um analito de maneira inequívoca, na presença de outras substâncias que podem interferir na determinação, tais como, impurezas, componentes da matriz e produtos de degradação.36,38

I.2.2.2 Limite de detecção e quantificação

O limite de detecção (LOD) corresponde à menor quantidade de um analito em uma amostra que pode ser detectada, porém não necessariamente quantificada como valor exato. Já o limite de quantificação (LOQ) corresponde a menor quantidade de um analito que pode ser quantificada com precisão e exatidão aceitáveis.35,36,38

O LOD pode ser calculado por três métodos: (1) visual, (2) relação sinal-ruído e (3) baseado em parâmetros da curva analítica. No método visual o LOD é

(33)

determinado através da adição de concentrações conhecidas da substância de interesse à matriz, de modo que seja possível distinguir entre o ruído e o sinal analítico. Já o método do sinal-ruído utiliza comparações de amostras com o analito de interesse em baixas concentrações e uma amostra “branco”. Assim, é estabelecido uma concentração mínima na qual a substância pode ser detectada. A relação sinal-ruído utilizada para determinar o LOD pode ser de 3:1 ou 2:1.35,39 O método baseado em parâmetros da curva analítica utiliza a equação 11.

LOD = 3,3 ×

𝑠_𝑆 Equação 11

Onde

s

é a estimativa do desvio padrão da resposta, da equação da linha de regressão ou do coeficiente linear da equação e

S

é a inclinação ou coeficiente angular da curva analítica.

Para o LOQ os mesmos critérios utilizados para o LOD são aplicados utilizando uma relação 10:1.39 A equação 12 também pode ser utilizada.

LOQ = 10 ×

𝑠

𝑆 Equação 12

I.2.2.3 Linearidade

A linearidade é a capacidade de um método analítico demonstrar que os resultados obtidos variam linearmente com a concentração do analito na amostra. A resposta analítica deve ser diretamente proporcional a concentração do analito, ou seja, função da concentração do analito, e deve ser estudada em um intervalo de concentração apropriado.36

Matematicamente, a avaliação da linearidade é feita usando o método da regressão linear. Além dos coeficientes linear e angular, é possível estimar o coeficiente de correlação (R2), que é uma estimativa da qualidade da curva obtida. Quanto mais próximo de 1,0 for o R2, menor é a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados. 35 Outros métodos para avaliação de linearidade são o método lack of fit e a avaliação dos resíduos da regressão linear da curva analítica.40

I.2.2.4 Exatidão

A exatidão expressa a concordância entre o valor encontrado e o valor aceito como verdadeiro ou aceito como referência. Usualmente, a exatidão é determinada

(34)

comparando-se os resultados obtidos pelo método a validar, com os obtidos de um método estabelecido como referência. Outros métodos para avaliar exatidão são a comparação com resultados de análise de materiais de referência, através de ensaios de recuperação ou pelo método de adição de padrão.35,38

I.2.2.5 Precisão

A Precisão é a expressão da concordância entre os vários resultados analíticos obtidos para uma mesma amostra e ela representa a dispersão dos resultados entre ensaios independentes, sendo avaliada pelo desvio padrão absoluto ou relativo.35 A precisão intra-dia é a estimativa realizada no mesmo dia, já a precisão inter-dia é a estimativa realizadas com análises em dias diferentes.41Em técnicas de separação, como cromatografia e eletroforese capilar, a precisão instrumental é medida pela injeção repetitiva e consecutiva da mesma amostra. A média das áreas é calculada e o desvio padrão relativo de todas as injeções é estimado.

I.2.2.4 Robustez

A robustez mede a capacidade de um método resistir a pequenas e deliberadas alterações dos parâmetros analíticos. Ela indica a confiança durante o uso normal do método.35,36 Essa avaliação deve demonstrar a estabilidade do procedimento sob diferentes condições, como tempo, temperatura, pH, diferentes fabricantes de insumos, entre outras variações.42

(35)

Capítulo II: Desenvolvimento e validação de um método para

determinação de precursores da serotonina em suplementos

alimentares

(36)

II.2. Introdução

II.2.1. Suplementos alimentares e medicina alternativa

Nas últimas décadas constata-se um aumento pronunciado na preocupação da população com assuntos relacionados à sua saúde e bem-estar. Essa preocupação trouxe consigo o aumento do consumo de suplementos alimentares e alimentos que eventualmente possam trazer benefícios a saúde física e mental.

O uso da medicina complementar e alternativa no tratamento de problemas de saúde física e mental tem aumentado na última década em todo o mundo. Medicamentos naturais para transtornos de humor, como depressão, ansiedade e insônia estão entre os mais populares. O consumo crescente de suplementos alimentares, que contêm 5-hidroxitriptofano (5-HTP), para minimizar sintomas de doenças como a depressão, fibromialgia, assim como, transtorno do sono, humor e ansiedade é um exemplo de como o uso da medicina complementar e suplementar vem ganhando espaço.43,44

Em outubro de 2014 o site Transparency Market Research publicou estimativas relacionadas ao mercado do 5-HTP. O estudo indicou que o mercado para o 5-HTP era estimado em 31,7 milhões de dólares em 2012, com um crescimento provável de 7,1% até 2019. A demanda mundial de 5-HTP em 2012 foi da ordem de 136 toneladas, sendo as aplicações relacionadas a alimentos, bebidas, suplementos alimentares e medicamentos. Os maiores consumidores de suplementos de 5-HTP são os Estados Unidos, Europa e a Ásia. 45

II.2.1.1 Serotonina e precursores da serotonina

A serotonina (5-hidroxitriptamina) é um neurotransmissor e vasoconstritor no sistema nervoso central. A serotonina (5-HT) controla diversas funções cerebrais, regula o sono, a agressividade, a temperatura corporal, o desejo sexual e a dor. Além disso, a 5-HT está diretamente relacionada com diversas condições patológicas, dentre elas a depressão. 46,47 Diversos estudos relacionam níveis baixos de serotonina, com o desenvolvimento da depressão.43,47–50 Usualmente, o objetivo dos tratamentos com antidepressivos é aumentar os níveis sinápticos de 5-HT. A maioria dos antidepressivos possuem inibidores seletivos da recaptação da 5-HT e outros aumentam a quantidade de 5-HT, inibindo sua rota catabólica.51

(37)

Triptofano (TRP) e 5-HTP são precursores na biossíntese da serotonina, como mostra a Figura 4. Como pode ser observado, nesta síntese o 5-HTP é um composto intermediário. Uma vez que TRP e 5-HTP são precursores da 5-HT, vários estudos sugerem que a ingestão desses precursores pode contribuir para o aumento das concentrações de 5-HT.43,48,51,52 A administração oral de 5-HTP resulta no transporte desse aminoácido através da barreira hematoencefálica e a descarboxilação em 5-HT ocorre no núcleo dorsal da rafe.53,54 Quanto ao TRP, estudos realizados com ratos indicam o aumento das concentrações de 5-HT no cérebro após a ingestão de TRP.55

N H OH NH2 O N H O OH NH2 O H N H NH2 O H Triptofano hidroxilase Triptofano descarboxilase

Triptofano 5-hidroxitriptofano _{5-hidroxitriptamina (Serotonina)}

pka = 4,9; 9,8

pKa = 2,46; 9,41 pka = 2,7; 9,6; 10,7

Figura 4: Biossíntese da serotonina a partir do triptofano.

II.2.1.2 Triptofano

O TRP é um aminoácido essencial que não é sintetizado no corpo humano e precisa ser obtido através de fontes alimentares, como carnes magras, peixes, leite, queijo, nozes e leguminosas.56 Esse aminoácido tem implicações diretas em mecanismos de regulação neural e funções cerebrais.57 Além disso, TRP é utilizado para aumentar os níveis de 5-HT, melhorar atividades cognitivas, tratar depressão, regular o sono, o apetite sexual e a temperatura corporal.56

A principal função do TRP no corpo humano é como constituinte na síntese de proteínas. Adicionalmente, este aminoácido é um precursor importante em duas rotas metabólicas, nas sínteses da quinurenina e da 5-HT. Depois da síntese proteica, a síntese da quinurenina é a segunda maior rota metabólica do TRP, correspondendo a aproximadamente 90% do catabolismo do TRP. Estima-se que 95% da 5-HT dos mamíferos é encontrada no trato gastrointestinal e apenas 3% do

(38)

TRP adquirido através da dieta alimentar é usado para a síntese de 5-HT no cérebro.58

Além do papel biológico, TRP é utilizado como material de partida para a síntese de vários produtos farmacêuticos, como medicamentos antidepressivos e para o tratamento de esquizofrenia.59

TRP foi artificialmente sintetizado pela primeira vez em 1949 e, então, passou a ser produzido em escala industrial. A partir do começo dos anos 80 o TRP passou a ser produzido através de fermentação, que possibilitava maiores rendimentos.59 Pouco tempo depois, entre os anos de 1988 e 1989 ocorreu nos Estados Unidos (EUA) um surto da síndrome eosinofilia-mialgia (EMS).58 A EMS é uma síndrome complexa e sistêmica com componentes autoimunes e inflamatórios que afetam a pele e músculos. Ela é caracterizada por fortes dores musculares e alterações respiratórias e nos eosinofilos.56 Esse surto afetou cerca de 1500 pessoas e causou 30 mortes. Os casos de EMS foram relacionados ao consumo de TRP sintético. Posteriormente, foi identificado que os lotes de TRP que causaram o surto eram oriundos de uma empresa japonesa chamada Showa Denka K.K. O uso de novas cepas de bactérias no processo de fermentação, entre outras alterações na produção do TRP realizada na empresa, culminaram com a síntese não apenas de TRP mas também de contaminantes tóxicos.60 Após a retirada dos suplementos produzidos pela empresa japonesa do mercado norte americano, houve uma diminuição dos casos.61

Após o ocorrido, todos os suplementos de TRP foram banidos dos EUA pela United States Food and Drug Administration (FDA) e outro precursor da serotonina passou a ser utilizado como suplemento alimentar, o 5-HTP.

II.2.1.3 Suplementos de 5-hidroxitriptofano

O 5-HTP é um aminoácido aromático produzido no corpo humano a partir do TRP. Ele vem sendo utilizado por mais de 30 anos para o tratamento de depressão, e várias outros doenças como obesidade, fibromialgia, insônia, dores de cabeça crônicas, além de ser um potente antioxidante.43,60,61 Extratos de 5-HTP são obtidos a partir de sementes da planta africana Griffonia simplicifolia. Nos EUA e Europa formulações que contêm 5-HTP, vitaminas e conservantes, podem ser comprados em lojas de produtos naturais e farmácias, sem necessidade de receita médica.51 No

(39)

Brasil o 5-HTP pode ser adquirido em farmácias de manipulação mediante apresentação de receita médica.

Para o tratamento da depressão, o 5-HTP tem algumas vantagens em relação ao TRP, uma vez que o 5-HTP é convertido mais rapidamente a 5-HT e atravessa facilmente a barreira hematoencefálica, enquanto o TRP precisa de uma molécula transportadora.43,62 Além disso, o TRP requer uma etapa adicional (conversão a 5-HTP) na via de síntese da 5-HT, sendo essa etapa limitada pela disponibilidade da enzima triptofano hidroxilase.43

Há uma tendência crescente para o uso de 5-HTP como medicação alternativa e natural no tratamento de transtornos de humor e de obesidade, de modo que o desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação deste aminoácido em suplementos alimentares, fluídos biológicos e outras matrizes vem ganhando destaque na literatura.49,62–64 A Tabela 1 apresenta uma lista de trabalhos em que foi realizada a determinação de 5-HTP e compostos relacionados.

Sakaguchi e colaboradores65 propuseram um método para determinação de 5-hidroxindoles em plasma humano por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), utilizando derivatização e detecção por fluorescência. Chen et al66 desenvolveram um método para a determinação eletroquímica de 5-HTP utilizando um eletrodo modificado de nano folhas de carbono e o método foi aplicado para determinação em amostras de tecido de cérebro de rato. HPLC tem sido utilizada para determinação de 5-HTP e outras indolaminas, tais como o triptofano e a serotonina, em tecido de cérebro de rato,67 café,62 soro sanguíneo humano,68 cogumelos comestíveis,69 chocolate,70 ingredientes à base de leite e suplementos esportivos.57 Métodos eletroquímicos63,71,72 e de espectroscopia de absorção no UV-Vis71 também têm sido utilizados para a determinação de 5-HTP.

A eletroforese capilar pode ser uma ferramenta analítica vantajosa para a determinação de 5-HTP, uma vez que esta técnica pode fornecer elevada eficiência de separação e análises em curto período de tempo, com o consumo de pequenos volumes de amostras e reagentes.72 Na literatura são encontrados trabalhos que relatam o uso de CE para determinação de 5-HTP, em soluções padrão,73,74 urina,75 soro, extratos neuronais,76 xaropes77 e plasma sanguíneo humano.78 No entanto, nesses trabalhos foram utilizadas detecções amperométrica, por fluorescência e espectrometria de massas, ao invés de detecção no UV-Vis, que é o mais comumente utilizado em sistemas comerciais de CE.

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Nesse trabalho foi proposta uma metodologia rápida, inédita e com preparo de amostra simplificado para a determinação de 5-HTP em suplementos alimentares.

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Matriz Analitos Extração

(Solvente) Técnica Analítica LOQ Bibliografia

Café TRP; 5-HTP Metanol: água 50% HLPC com detecção fluorimétrica 0,2 e 0,3 µg L-1

62

Padrões. HT; 5-HTP; 5-HIAA CE-MPE (Detecção de florescência

multifoton) 70 zmol 73 Urina TRP; HTP; HT; 5-HIAA Metanol: água (90 % v/v) MALDI-TOF MS 5 µmol L-1 79

Solução padrão 5-HTP Amperometria em fluxo. 17 nmol L-1 80

Plasma humano 5-HT HFBA e K3[Fe(CN)6]

Cromatografia líquida com detecção de

fluorescência 1,2-1,4 fmol

65

Suplemento alimentar 5-HTP KCl 1 mol/L Voltametria cíclica e espectroscopia no

UV-vis 12 mg/25mL

71

Solução padrão 5-HT; 5-HTP; 5-HIAA Análise por injeção em fluxo com detecção

de quimiluminescência 2 nmol L

-1 81

Tecido de cérebro de ratos 5-HTP HClO4 e EDTA Voltametria 0,3 nmol L-1 66 Tecido de cérebro de

ratos. 5-HT; TRP; 5-HTP HClO4 e EDTA HPLC com detecção por fluorescência pmol

67

Soro de rato e extratos de

sementes 5-HTP Acetonitrila: água 7%(v/v) LC-MS 2 ng

52

Chocolate 5-HT; 5-HTP; TRP Ácido fórmico LC-MS 0,11 ug/g 82

Solução padrão 5-HTP; TRP Voltametria

30 nmol L-1 6 nmol L-1

72

HFBA- (4-(3’,3’,4’,4’,5’,5’,6’,6’,7’,7’,8’,8’,9’,9’,10’,10’,10’- Heptadecafluorodecil)benzilamina) TRP-Triptofano, 5-HTP- 5-hidroxitrptofano,5-HT- serotonina,5-HIAA- ácido indoleacético

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II.2.2. Objetivo

Desenvolver e validar um método simples e rápido para determinar 5-HTP em suplementos alimentares, utilizando eletroforese capilar com detecção UV-Vis.

II.2.3. Parte experimental

II.2.3.1- Reagentes

Hidróxido de sódio, fosfato de sódio e ácido fosfórico foram adquiridos da Labsynth, (Diadema, SP, Brasil) e hidrogenoftalato de potássio foi obtido da Vetec (Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) e L-triptofano foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Steinheim, Nord Westfalen, Alemanha) e L-5-hidroxitriptofano (5-HTP) foi obtido da Acros (New Jersey, NJ, EUA). Metanol Grau HPLC foi fornecido pela Tedia (Fairfield, OH, EUA) e a água ultra-pura foi obtida de um sistema de purificação Direct- Q3 UV (Millipore, Molsheim, Alsácia, França).

II.2.3.2- Preparo das soluções-padrão

As soluções-padrão estoque individuais, na concentração 10 mmol L-1, de 5-HTP, TRP e biftalato de potássio foram preparadas pela solubilização de cada padrão analítico em água ultra-pura. As demais soluções foram preparadas a partir da diluição das soluções-padrão estoque, com o mesmo solvente ou com BGE.

II.2.3.3- Preparo do BGE

Para o desenvolvimento do método de separação por CE foram avaliados dois eletrólitos de corrida: (1) borato de sódio 20 mmol L-1 (pH 9,2); (2) fosfato de sódio 20 mmolL-1 com pH 10,0 (ajustado com solução de NaOH). Em ambos os eletrólitos foi adicionado CTAB (0,2 mmol L-1) como inversor de fluxo eletrosmótico.

II.2.3.4- Instrumentação CE e procedimento

As análises por CE foram realizadas em um sistema Agilent 7100 (Agilent, Waldbronn, Baden Wiirttemberg, Alemanha) equipado com um detector de arranjo de diodos. No desenvolvimento do método por CE empregou-se um capilar de sílica