Capítulo II: Desenvolvimento e validação de um método para determinação de
II. 2.3.5 Preparo das amostras de suplemento alimentar
Quatro amostras diferentes de suplementos alimentares comerciais, contendo 5-HTP, foram adquiridos a partir de farmácias nos EUA. As amostras em drágeas (10 unidades) foram maceradas e homogeneizadas, enquanto as cápsulas (10 unidades) foram abertas e homogeneizadas. A seguir, 0,0400 g das amostras em pó foram dissolvidas em 250 mL de água ultra-pura, com o auxílio de ultrassom (30 min). As amostras de cada suplemento alimentar foram diluídas em BGE e o padrão interno (biftalato de potássio) foi adicionado (100 µmol L-1). As amostras foram filtradas em filtro de membrana de fluoreto de polivinidileno (PVDF, 0,22 µm) antes da injeção no sistema de CE.
II.2.3.6 Validação
O método proposto foi validado tendo como referencial o guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos da Anvisa.36 Parâmetros como seletividade, faixa linear, linearidade, precisão, exatidão e limites de detecção e quantificação foram avaliados.
Soluções padrão foram diluídas em BGE a partir das soluções estoque, com concentrações de 25 a 500 µmol L-1, e curvas analíticas foram obtidas injetando três soluções independentes. Biftalato de potássio, na concentração de 100 µmol L-1, foi adicionado a todas soluções, como padrão interno. As curvas analíticas foram construídas utilizando a razão entre as áreas do pico do 5-HTP e a área do pico do padrão interno. As equações da regressão linear das curvas analíticas, obtidas pelo método dos mínimos quadrados, foram utilizadas para estimar as concentrações de 5-HTP nas amostras de suplementos alimentares analisadas.
A exatidão do método por CE foi avaliada por comparação com o método oficial da AOAC (988.15) para a determinação de triptofano em alimentos, empregando HPLC.83 As análises por HPLC foram realizadas com um sistema Agilent HPLC 1200 Series (Agilent, Waldbronn, Baden Wiirttemberg, Alemanha). A coluna analítica utilizada foi a C18 Zorbax Eclipse Agilent (5 µm, 4,6 mm x 250 mm). A fase móvel utilizada foi uma mistura de solução aquosa de acetato de sódio/metanol (95:5, v/v). O pH da solução aquosa de acetato de sódio com concentração de 8,5 mmol L-1 foi ajustado para 4,0 com solução de ácido acético. A vazão da fase móvel empregada foi de 1,5 mL min-1. A detecção UV-Vis foi realizada a 280 nm. As amostras foram diluídas com água ultra-pura e filtradas em filtro de membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF, 0,22 µm) antes da injeção no sistema de HPLC.
II.2.4.Resultados e discussões
II.2.4.1 Desenvolvimento do método de separação
O 5-HTP possui um grupo carboxílico (pKa= 2,7), um grupo amino (pKa = 9,6) e uma hidroxila (pKa = 10,7) no anel indólico, que possibilitam, em determinadas faixas de pH, a ionização do 5-HTP. Entretanto, foi necessária a escolha de um BGE que possibilitasse uma separação adequada do 5-HTP na presença de TRP, uma vez que o TRP poderia estar contido em suplementos alimentares de 5-HTP.
Para os testes realizados com tampão borato de sódio foi alcançada uma separação parcial entre o 5-HTP (100 µmol L-1) e o TRP (250 µmol L-1), como pode ser observado na Figura 5. Assim, o tampão borato mostrou-se interessante apenas para a determinação do 5-HTP na ausência de TRP.
0 2 4 6 8 10 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 mAU Tempo(min) 1 2
Figura 5: Eletroferograma de uma solução padrão de 5-HTP (100 µmol L-1) e TRP (250 µmol L-1). BGE: tampão borato de sódio 20 mmol L-1 (pH 9,2) e CTAB (0,2 mmol L-1); capilar de 60 cm (51,5 cm efetivo) de comprimento e 50 µm de diâmetro interno; potencial de separação de -20 kV. Injeção hidrodinâmica de amostra por 4 s a 50 mbar; detecção no comprimento de onda de 214 nm. Picos: (1) 5-HTP e (2) TRP.
Diante da ineficiência da separação dos aminoácidos com o tampão borato de sódio, a solução de fosfato de sódio 20 mmol L-1 em pH 10,0 e com adição de CTAB (0,2 mmol L-1), como inversor de fluxo eletrosmótico, foi testado e possibilitou uma separação eficiente, como pode ser observado na Figura 6. Desta forma, esse BGE foi o escolhido para o desenvolvimento da metodologia analítica.
0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 m AU Tempo(min) 1 2
Figura 6: Eletroferograma para uma solução padrão de triptofano e 5-HTP (500 µmol L-1, cada). Tampão fosfato de sódio 20 mmol L-1 (pH 10,0 ajustado com NaOH) e CTAB (0,2 mmol L-1), capilar de 60 cm (51,5 cm efetivo) de comprimento e 50 µm de diâmetro interno; potencial de separação de -20 kV. Injeção hidrodinâmica de amostra por 4 s a 50 mbar; detecção no comprimento de onda de 214 nm. Picos: (1) 5-HTP e (2) TRP.
Em pH 10,0 o 5-HTP tem carga líquida negativa resultante da ionização completa do seu grupo carboxílico (pKa= 2,7) e da ionização parcial da hidroxila (pKa = 10,7) do anel indólico. Como mostra a Figura 6 ambos os aminoácidos podem ser separados com resolução de linha de base. O 5-HTP apresentou uma maior mobilidade eletroforética (menor tempo de migração) que o TRP. Esta diferença pode ser explicada pela presença do grupo hidroxila no 5-HTP, que é parcialmente ionizado no pH do BGE
A mobilidade do fluxo eletrosmótico (eof), calculada utilizando o tempo de
migração da acetofenona como marcador do EOF, foi de 3,75·10-4 cm2 V-1 s-1 e a Tabela 2 traz os valores das mobilidades aparentes (a) e eletroforéticas (e) para o
Tabela 2:Mobilidades aparentes (µa) e efetiva (µef) do 5-HTP e TRP
Mobilidades (cm2 V-1 s-1) 5-HTP TRP
µa 5,4 · 10-4 4,6 · 10-4
µe 1,6 · 10-4 9,2 · 10-5
Para corrigir os efeitos de eventuais variações nas injeções de amostra e, assim, melhorar a precisão instrumental, foi utilizado um composto como padrão interno. Vários compostos foram avaliados com base em simulações de separação, empregando o software PeakMaster 5.1.84 No entanto, experimentalmente o ftalato, adicionado na forma de sal de potássio e na concentração de 100 µmol L-1, foi o que apresentou melhor separação em relação aos picos dos analitos, como mostra a Figura 7. Além disso, nas amostras analisadas o ftalato não foi detectado, o que também contribuiu para que este composto fosse escolhido como padrão interno.
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 12 m A U Time (min) 1 2 3
Figura 7: Eletroferograma de uma solução padrão de 5-HTP e triptofano (300 µmol L- 1, cada), além do padrão interno ftalato (100 µmol L-1). Tampão fosfato de sódio 20 mmol L-1 (pH 10,0 ajustado com NaOH) e CTAB (0,2 mmol L-1), capilar de 60 cm (51,5 cm efetivo) de comprimento e 50 µm de diâmetro interno; potencial de separação de -20 kV. Injeção hidrodinâmica de amostra por 4 s a 50 mbar; detecção no comprimento de onda de 214 nm. . Picos: (1) ftalato, (2) 5-HTP, (3) triptofano.