Cryptosporidium parvum: estabelecimento de modelo experimental em camundongo imunossuprimido com dexametasona

Texto

(1). UNIVERSIDADE DE SÃ9 PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de Pós-GradUação em Farmácia · 'Área de Análises Clínicas. Cryptosporidium 'parv~m: es~abe.leci~ento .de modelo experimental em . camuridongo ir'nunossuprímido com dexametasona. Matheus Diniz Gonçalves Coêlho. Dissertação para obtenção do grau de MESTRE. Orientadora: Profª Di<!Hermínia Yohko Kanamura. São Paulo. 2004 (Nota da BCQ: Não foi possível ca pturar fie lmente a im agem das fig uras desta dissertação).

(2) Fi llYIOi út de Ciencias Farmacêutieq$. Universidade de São Paulo. 1. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS - Programa de Pós-Graduação em' Farmácia Área de Análises Clínicas. . r. '. Cryptosporidium parvum:__estabetecimento de modelo experimental em. camundongo ímunossuprimido com dexametasona. /. Matheus Diniz- Gonçalves C~lho ·. Dissertãção para obtenção do grau de . · MESTRE. . Orientadora:. '. ·:. lPror- brªHermínia Yohko Kanamura :. -' São Paulo. 2004.

(3) DEDALUS - Acervo - CQ. '. 11111111111111. ,j. ,,. 30100006172. (. Fi cha Cata hrgráfi ca Elabo rJ,!J pda Divisão de Biblioteca e Docurrientação do Conjunto das Químicas da USP.. C(i 72c. Coêlho , Matheus Diniz Gonçalves Cryptosporidium parvum : estabelec i mento de modelo expe r imental em camundongo imunossuprimido com dexametasona / Matheus D i niz Gonçalves ·Coê l ho. São Pau lo, 200 4. 57p. Disse rtação (mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Uni'versidade de São Paulo. Departam ento de Análises Clínicas e Toxicológicas. Orientad or: Kan a mura, Hermínia Yohko 1. Parasitologia. 4 . Anti inflamatório. 2. Imunologia 3. Protozoa: Zoo l ogia J. T. II. Kanamu ra ,, Hermínia Yohko,. orientador.. 616.96. CDD.

(4) Matheus Diniz Gonçalvês Coêlho. Cryptosporidium parvum: estabelecimento de modelo experimental em camundongo imunossuprimido é:om dexametasona. Comissão Julgadora. da Dissertação para obtenção do grau de Mestre. ProfªDrª Herminia Yohko Kanamura ·orientador/Presidente. Profª Drª Irene da Silva Soares 1Q examinador .. Profª Drª Solange Maria Gennari ' 2• eiraminador. São Paulo, 27 de Agosto de 2004..

(5) .. l. L ~s < i & ~ ~ < V ~ $ ã . o -. ól--"P~. ~(U/q~~ól-'. ~ ~ n ã & ~\~ ~ --. ~ _ q t.U!I~~~~~. '. ~ se, -n ã&~oi,. ~~~ ~q~~i.anll~. ~~C0114t°YUÇÕEWl&nâo--{(me,. . . . ~t'yolc-Lá;c.ólccadc: ... _ ~~~p~em.,cultwar ~~. ~. \l~qae,, por menor. q~~Q./, ~~ar~~~. ~ores <V frtA:'c,fi-ca,-.. '\.

(6) !'. •. ,. Dedico este trabalho. a meu pai, Heitor Gonçalves Coélho, porque . f0i mais do que um pai para mim, me incentivando a caminhar sempre à frente e a seguir seu exemplo à minha mãe Eunice Diniz Coêlho, "in memoriamnpor ter sido um exemplo incomparável de máe e ter me doutrinado da , maneira que o fez. a meu irmão Thiago Diniz Gonçalves Coêlho. por ter me incentivado a enxergar o caminho da ciência à Iara Bezerra Rodrigues Coelho por ter me incenUvado a ter paciência. à minha amada esposa Francine Alves-da Silva Coélho, por ter me apoiado de todas as maneiras possíveis, sendo minha fiel companheira de todos os momentos e ter me ajudado em tantas ocasíôes, durante a execução do mestrado.

(7) .. ). ,. /. \ '-. •. 1. Trabalho realizado no Laboratório de Parasitologia da . Universidade de Taubaté e na Seção de Ent~roparasitoses _do Serviço de Parasitologia da Divisão de-Biologia Médica.do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, SP.. , Apoio Financeiro: ·Fundação de Amparo a Pesquisa dó Estado de São· .. Paulo (FAPESP)..

(8) AGRADECIMENTOS. À .Prof- Dr2 Herminia Yohko Kanamura, por ter se disposto.a me orientar em um difícil momento do Mestrado e ter compartilhado dos seus conhecimentos e · experiência.de vida; À Prof- Drª- )\na. Júlia Urias dos ·santos pela amizade .e apreço que sei que tem por mirn, por ter praticamente me co-orientado durante_todo este· período e pelo inquestionável apoio científico, emocional e profissional; Ao professor Heitor Gonçalves Coelho, por ter me apoiado e incentivado desde o início do Mestrado; · · ·. Á bióloga Francine Alves da Silva Coêlho, por ·todo o seu apoio fundamental .no decorrer de todas as etapas do Mestrado; .. · Ao Prof. Dr. Pedro Luís da Silva Pinto, pelas ~µgestões apresentadas no exame de qualificação e por ter compartilhado dos seus conhecimentos teóricos e práticos sobre vários aspectos que foram abordados nos experimentos . que ~~;. .. À Prof- Drª- Mana Helena de Arruda Leme, pelo auxílio na realização do~ testes estàtísticos; À Prof- Drª- Irene da Sil~a Soares pelas sugestões apresentadas no exame de qualificação; ~ ·. À Prof- Drª- Raquel dos Anjos Fazioli, pela paciência de algumas etapas. do projeto; .. e. auxílio na realização ' .. À Prof! Drª- E!izabeth Na~I de. Gaspari, por ter indiretamente me ajudado a encontrar o caminho certo para minha realização acadêmica, posto que pude passar a desfrutar do prazer de · estudar · . Parasitologia, em particular - . /. Cryptosporídium, parvum;. ·. Ao Mestre José Márcio Cardoso, pela grande assistência quando da · -obtenção do tão. esperado bezerro infectado par~ isolamento do inóculo inicial - o começo de tudo; · Aos funcionários da Secretaria de Pós Graduação da Facuidade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, Jorge Alves Lima e Elaine Midori Ychico; por todo o auxílio apoio prestados no decorrer do mestrado;. e. Ao. meu amigo Otávio Ricardo de Oliveira, pelo incentivo constante e compartilhamento da indignação, como o pão de cada dia; Aos meus colegas d~ Pós-graduação: Angélica, Sílvio, Edward e Claudinho, por terem compartilhado experiências e conhecimentos durante todo este período; /.

(9) '. Aos estagiários, alunos de pós-graduação ·e funcionáríos (;ias seções de Imunologia (Teresinha, Ana Patrícia, Lígia, Elza e Aline) e Parasitologia do Instituto Adolfo Lutz (lvete, Jefferson, Otávio e Fá_ bio) pelo constante incentivo; Aos estagiários do Laboratório de Parasitologia da UNITAU, em especial à Priscila Figueira Miranda, Wilsa Renata Soares. Eliane de Carvalho Lopes e Juliana Guimarães_ Cardoso pelo auxílio prestados na realização de alguns experimentos; Aos funcionários da UNITAU que me incentivaram a- seguir em frente na realização desse mestrado e a todos os técnicos, funcionários, alunos, estagiários, enfim, ·a todas as pessoas que direta ou indiretamente me ajudaram na realização · d~e trabalho; · · · · · \ ·. ../.

(10) ÍNDICE. Lista de abreviaturas ,. Lista de Tabelas e Figu-ras. 11. Resumo. IV. Abstract. V. , . 1. INTRODUÇÃO . .. 01. .. · 1.1. Aspectos gerais da criptosporidiose '. 01. .. :1.2. Ciclo biológico de Cryptosporídíum parvum·. 02. 1.3. Aspectos clínicos da criptosporidiose .. 03. 1.4. Aspectos epidemiolé>9icos da criptosporidiose. 03. 1.5. Tratamento da criptosporidíose. 05 \. \.. 1.6. Resposta imune ao Cryptosporídíum ·1.6.1 . Participação dos linfócitos TCD4+. 06. na resposta imune a Cryptosporidium spp. ~I~~. .. /. ITT. 1.6.2. Participação de outras citocinas na resposta imune a Ciyptosporidium. 08. 1.7. Módelos experimentais. 11. .. '. 1.7.1. Cultivó"in vitro". 11. 1.7.2. Modelos "in vivo". 12. 1:7.2.1. Modelo bovino: bezerros recém-nascidos. 12. 1.7.2.2. Modeto·primata. 12. 1.7 .2.3. Modelo suíno. 13. 1.7.2.4. Modelo murino. .13. 1.8. Modelo murino imunossuprimido com gliCÓCOrticóides. 15. 2. JUSTIFICATNA. 19. 3. OBJETIVOS. 20 r. 4. MÀTERIAL E MÉTODOS. . 4.1. lmunossupressão dos camundongos /. 21. 21.

(11) r.. 4.1.1. Avaliação da imunossupressão. 22. ~.1.2. Manutenção de camundongos imunossuprimidos. 23. \. 4 .2. Obtençã9 de Cryptosporidium parvum a partir de bezerro. 23. 4.2.1. Purificação de oocistos e preparação dÓ ínocuk> para infecção . ... i4. dos camundongos 4.3. Infecção de camundongos e coleta dos oocistos. 24. 4.3.1. Acompanhamento da infecção dos camundongos. 26. 4 .3.2. Recuperação de oocist9s das ·fezes dos camundongos infectados. 26. \. ·-. 4.3.3. Quantificação dos oocistos de C. parvum recuperados âas fezes 27 .. dos camundongos infectados .. .. 27 -'. 4.3.4. ManutençãQ da cepa de C: parvum isolada ).. 4.4. Análise estatística. 28. 5. RESULTADOS. 29. 5.1. Avaliação da imunossupressão dos camundongos. 29. .. 5.2. Quantificação dos oocistos recuperados de camundongos infectados. 35. '. 5.3. Manutenção da cepa de C. parvum em camundongo. 38 /. 6 . DISCUSSÃO. ·40. 7 . CONCl,.USÕES. 44. 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 45. ANEXOS '·. 58 ,/.

(12) 1 LISTA DE ABREVIATURAS. '. -AIDS·- Acquired·lmmunodefieiency-5yndrome · HIV - Human ··lmmunodeficiency--Virus. -·tFN-v·...:. interferon. ~. ·IL ..:: interreucina ·1EL ..:. linfócitos intra epiteliais. IClf - ·receptor de célula, ,TNF-a - fâtor de .necrose tumoral alpha. -células NK -células Natural Ki1ler SN·- Simians -tmmunodeficiency Virus A:I. :_ Antes da imunossupressão VA - Valor Absoluto. VR - Valor Relativo. rn_g - miligrama . ml - . mililitr:o · -~ - microlitro. ··M..; Molaridade ,'.

(13) n USTADE TABELAS.E.FIGURAS , ··Figura ·1. -Número ·-.de · leucócitos/,mm3 ·.·de ·--sangue ·de ·camundongos, ·expres~~- ·em ·medianas:· ·Grupo ·A ·-. 20 ·camundongos ---BAtB/c. imunossuprimídos com -1s>mg, de dexametasona; ·Grupo · s 1 .. -. -10. camundongos· BALB/c imu~ssuprimídos com U,"5mg de dexametasona e. ·e -. .1 0 camundongos ~C57BU6 imunossuprimidos com·. -o:smg. dexametasona. de. 30 .. ,.,. Tabela ·1. · Resultados ·do -·teucograma ·do --sangue · periférico ·de 20. '. .. '.. (. -ca-mundongos ··BAl::.B/c· fêmeas (grupo A) ·submetidas· à:·imanossupressão • .. ,. com dose diária de -1 mG de· dexametasona, antes (A.I:) e após · a. primeira, segunda e terceira semana da imunossupressão I. •. Tabela · -2. . Resultados .do . leucograma do .sangue ..periférico ·.de .W. -camundongos-BALB/c -fê~eas -(grupo-B) submetidas -à -imunossupressão com dose ·diária ·de ·0,5 mG' ·de ·de~me~sona, -antes ·{A.I:) -e -após -a. primeira,' segunda e terceira- semanada imunossupressão-. .33. 1abela '"3. . Resultados'1 ·de ieucograma do sangue pe'riférico de ·1u '. '. camundongos C57BU6 machos .(grupo C) submetidos ·à imunossupressão. ..com .dose .diária .de .0.,5 .mG .d e .dexametasona, .antes .(A.l..) .e .após .a .pr:imeira:e segunda semana .da .imunossupressão. .34. -Figura 2. ·Número ·totaJ ·de ·ooeistos, -expressos ·em ·média -aritmética,. recuperados. 1. a. partir. das. ··fezes. de. camundongos. ·C57BL16. · imunoss~primidos com dose 'diária de 0;5m__g de dexametasona _(grupo 3), até ·o 1712. dia da infec:ção. 35 ,'. Quadro .1. ·-Resumo .dos .procedimentos .de .imunossupressão .e .infecção · -realizados-e:do dia-de-ébito:dos animais. · ,. '. 36.

(14) Ill. Tabela 4 . .Número .de .oocístos .de .e..parvum .recuperados .das .fezes .de . ' .camundongos .05.78L/6 .imunossuprimidos .com .dose .diária de .0,5 .mg .de •. .dexametasona,.do -12. ao 2~ dia-do.experimento. 1. ·. 3-7. Figura 3. Número total de oocistos inoculados e número total de oocistos recuperadÓs do ,_.grupo 3 (10 camundongos C57BU6 imunossuprimidos. com 0,5mg de dexametasona e inoculados com -2x104 oocistos de I. .çryp_ tp~P,f>_rf.Pf'!mp~r.v,u_,m. 38. . Figur:a. 4. Nú~ro, total, qe ooçistos inoculados _:e núm_ ero .total ~e oocistos . recuperados .do grupo 11 (-5 camundongos , C57BU6 imunossuprimidos 4. coi:n 0,5mg de dexametasona e inoculados com 2x10. oocistos de. -.-Cryptosporidíum parvum récuperados dos camundongos do grupo·3) · -39. '.

(15) IV RESUMO. Estudou-se no presente trabalho a susceptibilidad~ de camundongos das I. linhagens C57BU6 e BALB/c à infecção por . Cryptosporidíum parvum, com o. intuito de se estabelecer mode~o animal para obtenção de massa de oocist~. Para isto os_camundongos foram submetidos.a procedimento de imunossupressão· com o corticosteróide dex~metasona. em diferentes doses, pela via subcutânea e, 4. após estabelecida a imunossupressão, · infectados com 2x10 oocistos de C.. parvum pela via intragástríc.a. Apenas os camundongos da linhagem C57BL/6, que 'foram imunossuprimidos 'com 0,5mg de dexametasona por, animal, liberaram uma .. .. apreciávef quantidade de oocistos nas fezes, sendo deste modo considerados .. .. \. .,.- '. como um modelo 'si!llples e prático para ampfificação deste parasito.. .\.

(16) V. ABSTRACT ". BALB/c. and. C57BU6N. mice. were. evaluated. for. susceptibilíty. to. Cryptosporidium parvum infection wrth the purpose of establishing an animal._!nodel. for obtaining large amount Qf oocysts. For this, mice were imunossupressec:l by subcutaneous. application,. witt1. different. doses. of. the. corticosterrnd. dexamethasone, and after establishfJ1ent of the imunossupression, they were 4. inocutated, by intra-gastric route, with 2x10 C. parvum oocysts. Only -C57BUS. mice, which w,ere imunossupressed wíth 0;5 mg of dexamethasone, relej:ised a '. .. substantial amount of oocysts in teces, showing that this can constitute..a ~imple and feasible model for amplification of this parasite.. \. . ... •'. ... .\. .\·. I. '\.

(17)

(18) \. l. 1. INTRODUÇÃO 1.1. As~os gerais da criptosPQ__ridiose I. Em 1907, Tnzer fez a. primeira referência ~o .gênero· Cryptosporidíum para um -~protozoário parasito que comumente observava nas glândulas gástricas de camundongos. , Em 1912, o mesmo . pesquisador _sugeriu uma nova espécie,. Cryptosporidium ~rvum, para u~. organismó semelhante,que passou a observ,ar . no intestino de camundongos. Este protozoário parecia ser raro; permanecendo . sem importância médico-veterinária por cerca de 40 anos, até que foi .. '. .. responsábiliz~do por surtos de diarréias em beierros e, com o advento da AIDS, •. e. reconhecido ~mo importante patógeno oportunista (SLAVI~, 1955; _ PANCIERA et ai., 1971 ; PETERSEN, 1992)_. .. Cryptosporidii.Jm spp são protozoários coccideos que infectam as células .. .. \. .. .. epiteliais dos ~atos digestivo-e respiratório de ur.na grande variedade .de animais .. \. vertebrados,. .. .. sendo · .par«1sitos' intracelulares. Várias espécies. obrigatórios. '. morfologicamente ~~milar:es f9ram de~ita~ e riorneadas segundo o hospedeiro. se. 1. em que foram encontradas, no identificar e nomear espécies,,. faz. . entant~ pàra . se necessária uma combinação de métodos_morfológicos, biológicos e genéticos (ZU et ai., 1992; FAYER et ~/., 2000; EGYEQ et a/.;'2003). Com rela~o a. e. pa_rvum, aná_lises genotipicas de isolados,'- de humanos e,. de animais, revel~ram a existência de dois diferentes subgrupos genéticos '. '. '. (AWAD-EkKARIEM et ai., 1995; WIDME_ R et ai., · 1998). Este·. fato foi . ) . . . primeiramente comprovado por PEN~· et ai. (1997) que, ao estudarem 39 isolados '. de. e.. parvum de· humanos e ' bovinos, demonstraram a existência de um. poi;morfismo genético, pela análise moieculàr . de ~ma região. de 369 pares de base do gene que · codifica para uma proteína de adesão relacionada a •. I. tromoospondina (TRAP-C2), definindo deste modo dois genótipos distintos: o . . genótipo 1, e_ncontrado exclusiv~me11te em infecções humanas, e o genótipo 2, presente tanto em hospedeiros humanos quanto em animais. Ao realizarem testes de infeçção experime'ntal, os autores observaram que os isolados do genótipo -1 não foram capazes rde infectar camundongos recém nascidos das linhagens.

(19) ·2 BALB/c 1e SCID ou bezerros neonatos, ao_contrário dos·isolados do genótipo 2; · 1. -. •. 1. devido a diferençàs genotipicas, fenotfpicas, epidemiológicas e patqgênicas entre. . ) esses dois genótipós, MORGAN ai. (2002) propuseram a denominação_. et. Cryptosporidium hominis ao genótipo 1, ~nsiderando-o assim uma nova espécie... Revisões bibliográficas recentes réconhecem 13 espécies, a saber_ : . C. andei'soni, C.baiteyi, '. e.. cannis, C. felis, . e. galli, . ,.. e.. homfnis,· e. meleagridis,. mo/nari, C. muris, C. parvum, C. saurophilum, C. serpentis e. e.. .. e. wrairi, previamente. diferenciadas com o uso de critérios in~rfoÍógicos, moleculares e especificida<;fe de hospedeiros (MONIS & THOMPSON, 2003; XIAO et ai., 2004). I. 1.2. Ciéto biológico de Cryptosporidíum parvum ' .. \. .. Nos mamíferos, quando oocistos de Cryptosporidíum- spp ,são ingeridos, a excistação ·ocorre no intestino delgado coi;n liberação de quatro esporozoítos que · penetram as ' vilosidades dos enterócitos, e se desenvolvem no vacúolo '. '. .. t. citoplas!Jlático; um compartimento extracitoplasmático que permite que o parasito . .. se localize numa ·região intracelular. e_ extracitoplasmática: · No vacúolo,, os · ..esporozoít95. se desenvolvem em ·trÓfozóítos e ~ste~ origi~am o. meronte. tipo 1,. que são -formas com seis a oito, núcleos, que por, sua vez produzem seis a oito merozoí~~s que invadem as células epite~iais adjacentes .e se de~nvolvem em novos merontes tipo : 1, que são ~ma fonte. interna de auto-infecção com . ampli~caÇão do parasitç. Uma população de merozoítos origina o merpnte tipo· li que se dese~volve _· em microgamonte' ou macrogamonte com liberação dos microgametas e . macrogametas. A .re~rodução. sexuada inicia-se quando. microgametas maduros se fundem com macrogametas, · OriQinando · após fertilização bo zigoto que ~e se desenvolver em dua~ populações de oocistos: os de parede delgada (aproximadamente_2Ó% dos oocistos formados), que são 1. uma -segunda fonte .de' auto-infecção ihterna, ou oocistos de parede espessa . {aproximadam~nte 80% dos oocistos formados), que podem ser excretados no meio ambiente (KO_ SEC et ai., 2001 ).. ··/.

(20) .3 .. 1.3. Aspectos clínicós da criptosporidiose. . Os sint?rnas clínicos da criptosporidiose são amplamente dependentes do hospedeiro. Três populações de hospedeiros têm sid9 desc~s: indivíduos em. ,-·. surtos de áreas"industrializadas, crianças de áreas tropicais em dese~volvirnento e · pacientes irçiunocomprometidos. Dados de surtos nos Estados Unidos descrevem um . · período de latência 'de . uma semana após infecção e · uma doença .. caracterizada por_ diarréia aquosa, ocasionalmente com dores abdominais, . náuse~s. vômito, perda de peso ou febre moderada, podendo durar até nove dias. Este mesmo quadro clínico é observado em crianças com criptosporidiose nas d~nvolvimento.. áreas . em. Já. em. pacientes. imunoco.mprometidos,. a. criptosporidiose pode se manifestar de quatro maneiras: a) infecção·autolimitada .,. com dores abdominais, náuseas, .vômito, perda de peso ou febre moderada; b) . síndrome da desidrataçao diarréica aguda, com 20 ou mais evacuações diarréicas por dja; c) _síndrome da diarréia crônica e d) diarréia com envolvimento sintomático dos ,. duetos biliares e pancreáticos (TAGHI-KILANI et ai., 1990; MORGAN et ai.,.. 1995; LAURENT etal., 1997; FRANZEN & MULLER; 1999; KOSEC eta/., 2001). 1. '. ~. •. '. •. •. 1. . . . 1.4. As~os epidemiológicos da criptosporidiose " Apesar do gênero Cryptosporidium ter sido descoberto em. 1907, . . a maioria. ' ' ·- das informações sobre sua biologia, infecções em humanos e epidemiologia foi acurri~lada apenas na última década. Nesse período, qryptosporidium"' parvum passou a· ser reconhecido como uma ·causa comum de diarréia tanto em humar:ios f. •. •. '. -. como em outros animais (TZ_ IPORI & WARD, 2002b; PENG" et ai.;· 2003).. j " '. Fatores determinantes da epidemiologia e da ocorrência de infecções ·por. Cryptosporidium parvuf"(I. relacionam-se ao seu pequeno tamanho, que d_ ificulta o seu diagnóstico, à baixa .dose infectante, à resistência aos procedimentos de . cloretação utilizados no. tra~mento convencional de água e ao potencial zoonótico. (KOS~C et ai., 2001). A transmissão da criptosporidiose pode ocorrer ~r contato direto entre 1. humanos e destes com animais infectados e por consumo de água potável ou. 1.

(21) 4 •. •. 1. I. _. contato com água recreacionaf contaminada; no entanto, a transmissão também pode se dar pelo consumo de alimentos contaminé;ldos e possivelmente pelo ar, sendo considerados.grupos de risco: c::rianças, pessoas mal-nutridas e indivíduos_ imtmocomprometidos, ihciuii:tdo pacientes com AIDS (AcquÍred lm~unodeficiency ' . Syndrome), transplantados, pacientes -submetidos à quimioterapia ·para câncer, '. pacientes. •. I. institucionalizados · e . pacientes · com. doenças. infecciosas. imúnossupressoras (AWAD-EL-KARIEM et ai., 1995; FAYER et ai., 2000). Em 1976, os primeiros . dois ~casos ~e criptÓsporidiose hum~na foram atado o primeiro caso rel~~dos por dois grup~s:·indepe~dentes e ~m 1981 , foi rel_ de criptosporidiose em paciente com AIDS, (FRANZEN & MULLER, 1999). Um ano depois a epidemia de AIDS deu à criptosporidióse humana um 'novo significado, quando, nos El)A, o CDC (Centers for°Disease Contrai and Prevention do Ncltional •. .. 1. '. '. '. '. Center for lnfectious Disea_ses) relatou que de ~m total de 21 r;>acientes com Aios,. _ 14 desenvolveram um quadro diarréico fulminante e evoluíram ao óbito (PETERSEN, 1992). Desde então, úm grande número de pesquisadores vem investigando a prevalência. e. epidemiologia. dessa · infecção. em. pacientes. com. AIDS,. . apresentando resultados estimativos que djferem marcadamente de acordo com a populaçã~ estudada, com uma freqüência média- de 32%; porém sabe-se que pacientes · com imunod_e pr~o mais severa têm uma. maior predisposição a adqui_ rir cript9spo~idiose (HUNTER & NICHOLS, 2002). O primeiro surto de· infecção por parasito . do gênero Cryptosporidium, identificado na · época como · C. parvum, , através de métodos sorológico~ e .. 1. '. .. ,. •. .. parasitológicos, se deu no verão de 1984 _em Braun -Station, um subúrbio com .. -. .. '. /. cerca . de 5900 pessoas a 32 Km de Santo Antônio,· Te.xas. Porém, o surto de ,. ,. . .. . .. ,. .. . r. maior repercussão ocorreu em 1993 na cidade de Milwaukee, W!_sconsin, Estados. '. '. Unidos, no q~al 403.000 pesso~s, de um total de 1:610.000! desenvolveram criptosporidiose devído ao consumo de, água contaminada do reservatório da cidade (ERÁNZE~ & MULLER, 1999; DILLINGHAM et ai., 2002). Em estudos conduzidos em desenvolvimento como, por exemplo, . . . em países . . Nigéria, Méx~. Peru, Guiné-Bissau e Uganda, foi demonstrada a importância de parasitos do gênero Cryptosporidium como freqüente causador de diarréia,. \. ( ,_. (.

(22) relacionando a elevada ocorrência a fatores clínicos, ambientais, higiênicos e nutricionais (OKAFOR & OKUNJI, 1996; ENRIQUEZ,. et ai., 1997; CHECKLEY et. ai., 1997; PERCH etal., 2001;.TUMWINE etal., 2003). HOJLYING et ai. (1986) r~alizaram um estudo com 374 crianças !iberianas, . . com idades de 6 a . 59 meses, com o intuito de · investigar o papel de. Cryptosporidium spp como agente .etiológico de diarréia, e verificaram uma \. ocorrência de 8,4% em crianças com diarréia no ambiente doméstico e 14,6% em crianças hospitalizadas; a aglomeração populacional e a alimentação de recém-. •. \. nascidos. com leite não materno for~m considerados os principais fatores de risco para contrair criptosporidiose nessa comunidade. Em estudo epidemiológico reali~do em um .hospital próximo a ·cidade de \. Jerusalém; Israel, SALLON et ai. (1988), ao realizarem ~xame parasitológico de_ 1. .,.. '. '. fe~es ·,de 221 crianças com diarréia, demon.strararil a presenp de oocistos de. CryptoSporidium spp eni 13% das amostras analisadas; a maioria das crianças •. 1. com criptosporidiose desnutrjdas do que as crianças . . eram significativamente mais , que. não liberavam oócistÓs nas ·fezes. Sendo assim, os autores conduíram que, .. '. .. .. nos países em desenvolvimento, a elevada prevalência de criptosJ>?ridiose em . crianças com diarréia estaria associada com a desnutrição. No Brasil, Mangini et ai. (1992) demonstraram uma incidência de 17,43% de criptosporidiose em .crianças de .. o à.. ~ anos de idade com quadró. de diarréia e '. \. internadas no Hospital das Clínicas em São Paulo. Surtos de criptosporidiose em outros estados do .Brasil, com incidências variando também foram ·observados . d.e 72%, em criança~ çom diarréia, na cidade de_Fo~leza - Ceará (Agnew et ai., 1998), até ·1,1% em crianças, com men~s . de 5 anos de _idade, na cidade de Càmpo Grande - Mato Grosso do Suf' {Oshiro et ai., 2000).. 1.5 ..Tratamento da criptosporidiose ,. I 1. A falta ·de tra~mento efetivo na infecção causada por _parasitas do gênero. Cryptosporidum freqüentemente contribui para a morte de pacientes com AIDS ou •. \. '. 1. •. com imunodeficiência"s de outras etiologias (WOODS et ai., 1996). Observa-se -.

(23) .. \. 6. pouco a.vanço n~ste sentidd, em parte devido à.falta de um modelo de. infecção · in ' vivo" e ·in v.itró" bem definido (BJORNEBY et ai., 1991 ; MEAD, 2002). Têm-se estudado vários esquemas de terapia para criptosporidiose ta.i s '. como: imunoterapia com anticorpos policlonais ou monoclonais (ARROWOOD et /. ai., 1989; DOYLE ef ai., 19~3; RIGGS et ai., 2002), terapia com agentes .. 1. -antimicrobianos (HEA~EY et a,I., 1995; WOODS _et ai., 1996, BLAGBURN et al, '. .. 1998), uso de microorganismos da m~croflora intestinal {WATERS et ai., 199~). e. terapia com colostro imune bovino (PERRYMAN et ai., 1999), algumas delas se moslrando · eficazes no controle <:ia criptosporidiose, mas não no estabelecimento da cura definiüva. ,. O uso de · terapia anti-retroviral tem resultado em um decréscimo de. infecções oportunistas em pacientes com AJDS nos últimos anos; IVES et . (2001)-demoostraràm qÚe a incidência de criptosporidiose diminuiu .. ,1.. cerca de 60% '. em pacientes inf~ados pelo HIV (Human lmmunodeficiency Virus) durante o uso .. dos coquet~is de drogas anti-retrovirais. No entanto, seg~ndo MEAD (2002), não se sabe ao certo até que ponto este tratamento será ·· efetiv?, devido a P,9S5ibilid~de . de · recombinação virai, o que anularia o efeito da .terapia anti-. ... retroviral, resultando· numa maior pré-d_ isposição dos pacientes às infecções oportuni$tas.. 1~6. Resposta imune ao Cryptospondium Tanto em estudos realizados em humanos.quanto em estudos com modelos. é re~ltada a importância da resposta imune humoral e -celular .. experimentais . , . para atenuar ou resolver infecção . causada_ por Cryptosporidium parvum.. .ª. . Atualmente existe ~rto :cons(!nso de que os dois component~ fundamentais para preyenção ou ·resoluç:ãq da criptosporidiose são a dtocina interferon gamma (IFN-. y). e os linfócitos T CD4+ (HAYWARO· ~t ai., 2000; HUNTER & NIÇHOLS, 2002; , .LACR.ÓIX-LAMANDÉ, 2002). ~. 1.6.1. , Participação. dos. Cryptosporidium spp, via IFN--y _-. linfócitos. T. CD4+. na. resposta· imune. à.

(24) 7 ., 1. BLANSHARD et ai. (1992), ao analisarem a contagem de linfócitos T ·c04+ em ~cientes com -AIDS e cciptosporidiose, dem~rí~~~m qÜe~só ~ -pacien~ 1. · com contagem -de linfócitos TCD4+ inferior a 50 célutas/mm3 de sangue apr~sentar~m doença fulminante; segundo CHEN ·e~ ai. (1993) esta pequena quantidade de linfócitos T CD4+ provavelmente leva a uma diminuição na .. .. .~. hábilidade destes pacientes de resistirem ou se curarem de. -uma infecção por \ Cryptosporidium spp. Da rnes~ mâneira, estudos com camundongos comprovam (. a hipótese · de que ··os linfócitos T CD4+ são de g·rande ·importância no estabelecimento de resistência a crip~osporidíose neste modelo experimental (B~NSHARO et ~/.,.1992; HAYWARD et ai., 2000; LAURENT et ai., 2002). 1. · Para delinear ~ : importância das células T CD4+ e da citocina- !FN-y na .. '. · imunidade protetora em camundongos, UNGAR et ai. (1986) iniciaram uma série < -. de experimentos nos quais anticorpos monodonais (Mab) anti-CD4 e anti-lFN-y foram. .. administrados. a. camundongos. BALB/c. recém-nàscidos. e. imunocompetentes infectados co~ C. pàrvum. Neste.estudo demonstrou-se que a co-administração d~ Mab anti-CD4+ e ariti-lFN-y resultaram numa infecção crônica por C. parvum,. corn .grande número de oocistos liberados nas fezes. A '. .. remoção '. · do Mab anti-lFN-y em qualquer ponto do experimento levou a redução do número de oocistos liberados. Por outro làdo, para que se mantivesse uma liberação crônica de oocistos houve a necessidade de se manter o tratamento com. Mab. anti-CD4+. Parti.n do destes resultados os .·autores concluíram ·qoe IFN-y limita a . ' " ' severi<jade da inJecção. mas não é ·-responsável .pêla resolução final, sugerindo .. \. haver outros mecanismos dependentes das células T C04+ .. na cura definitiva da. J. criptosporidíose. · AGUIRRE et ai. (1994) ao analisarem a susceptibilipade de camúndongos. .. deficientes de moléculas MHC-classe I e MHC-classe li, .demonstraram qu~ só os camundongos de~cíentes de MHC-classe li são susceptív~s à -infecção por. é. _,. parvum, já que desenvolveram infecção crônica ·pelo parasito. Estes camundongos. possqiam quantidades. pe linfócitos B e linfócitos T coa+ normais, e a _. ctiptosporidiose persistente observada foi atribuída a deficiência d~ linfootos T CD4+ funcionais no ·tim9, baço e Iinfonodos dos anímais. .--..

(25) 8. Co~ o intuito de determinar a' competência de camundongos de se curarem de criµtosporidiose na total ausência de IFN-y, THEODOS et ai. (1997) realizaram estudo ~ülizando _camundongos da linhagem C57BU6, com uma disfunção ·no gene do IFN-y (camundongos nocauteados de IFN-y). Neste estudo também · foram analisados camundongos C57BU6 com urría neutralização temporária da ·atividade do IFN-y, obtida pelo uso de anticorpos anti-lFN- y. Esses pesquisadores demonstraram ,que, enquanto a neutralização temporária da atividade . do IFN-v induzju uma _criptesporidiose apenas "temporária, na sua completa ausêncià os camundongos não foram capazes de se curar... MEAO & YOU ·(1998) demo.nstr-aram haver uma. marcante diferença de susceptibilidade entre as linhagens de ~mundongos C57BU6 e -BALB/c, quando /\. nocauteados de iFN-y. Ao inocularem camundongos adultos .(com a a 10 semanas de idade), fêmeas, das· duas linhagens, com _ 105 oocistos de C. parvum demonstraram que a in!ensidade âe infecção nos camundongos_C57BU6 foi bem '. /. maior do que nos camundongos BALB/c. Enquan~ os camundongos da primeira linhagem liberaram. uma grand~ quantidade de oocistos. nas fezes, que auméntou marcan~emente no quarto dia e contin~ou a aumentar nos dias consecutivos, os ,. '. 1. camundongos da 'linhagem BALB/c desenvolveram uma infecção moderada, com. -. \. -. -. liberação, de oocistos 100 vezes menor que os da outra linhagem, evoluindo para '. '. cura. TZIPORI et ai. (2002), ·ao estudare111. a ·infectividade de um isolado de .. /. '. '. C. parvum obtido de um bezerro de cervo vermelho (Cervus elaphus). observaram '. •'. .. que ca'mundongos da linhagem C57BU6 nocauteados de IFN-v, após inoculação com 300 oocistos, desenvolveram sintomas de criptosporidiose como letargia, , anorexia e reduzido ganho.de peso e liberaram grandes quantidades de oocistos .. nas fezes, apesar de não haverem desenvolvido d.iarréia. .. '. 1.6.2. Participação de outras citocinas na resposta imune a Cryptosporidium. Para explicar a acentuada diferença de susceptibilidade à infecção por. e. parvum. de camundongos das linhagens C57BU~ ~ BALB/c, nocauteados de.

(26) 9 .,.. IFN-y, SMITH et ai. _ (2000) avaliaram o padrão de liberação de citocinas de célulàs do baço desses animais, previamen1e infectados com 2x106 oocistos de C. parvum, após eStífnulação "in vitro" com antígenos de esporozoítos. Os. esplen~itos dos_ camundongos BALB/c produziram -maior quantidade de interleucinas 12, 4 e 5 (IL-12, IL-4, IL-5) e do fator _d e necrose tumoral, e os camundongos.da linhagem C57BU6 produziram apenas maior quantidáde de IL-5; '. deste modo, os autores concluíram que na ausência ~e IFN-y, a resolução da l. I. •. .. .. •. . criptosporidiose -é dependente em parte da expressão de citocinas Th2. ,•. Em tontraste ao observado nos camundongos nocauteados de IFN-y, o~ camundongos da linhagem C57Bl16 atimizados são resistentes.à infecção por' C. parvum, e os ~m~ndongos da iinhagem BALB/c são susceptíveis (ADJEI et ai.,. 1997). Com o intuito de esclarec~r a diferença d~ susceptibilidade das duas linhagens de camundongos atimizados, ADJEI ' .. et-..._ ai.. (2000) inocularam. 6. camundongos fêmeas, adultas, com 10 oocistos de C. parvum e analisaram a porcentagem de linfócitos T CD4+,. -. -. ,. '. CD8+, a.~+ e yô+ do baço e do epitélio. '. intestinal. Esses pesqui~dores observaram que não houve diferença entre as linhagens, com relação - aos linfócitos do baço, ·no entanto, com relação aos . .. .. '. linfócitos intra-epiteliais_{IEL), os camundongos da linhagem C57Bl16 tiveram_uma maiç,r porcentagem de _linfócitos --CD4+, .. CD8+yô~e. TCRyô+. Sendo assim, os. .. autores -·concluíram que na ausência de resposta imune celular sistêmica, os linfócit~s_intra-epiteiiais CD4+, _. CD8+yô e TCRyô+ parecem ter uma importante função regulatória na resposta imune ao C. parvum, com produção de citocinas do tipo Th-1 e Th-2. A impo_ rtância do fator de necrose tumoral alpha (TNF-a.) nà resposta imune ao C. ·parvum, foi. ,analisada ·primeiramente em estudo realizado por' CHEN et ai. (1993b); neste estudo se observou que a, administração de uma preparação de .. '. anticorpos policlonais anti-TNF=a., antes e· durante o experimento de infecção, não induziu maior susceptibilidade ao C. parvum. ~esultados semelhantes_fo"ram observados· por MACDONALD & BRANCOFT (1.994), contudo administrando um anticorpo monoêlonal que' neutraliza o . TN_F-a. (Mab TN3-1R12). Esses d_ados ' ·• sugerem que o TNF-a. não é um' ir:r,portahte ·mediador na resi~tência inata ao C. parvum, apesar de ser uma c!tocina. capaz de induzir a produção de IFN-y..

(27) 10 ·.A. IL-12. é. considerada. principalmente porque. ta!. importante. no. combate. à. cHptosporidiose,. componente pode induzir a produção dê tFN-y pelas. células . NK (Natural Killer) e pelos linfócitos T e é um importante mediador de '. \. resistência. inata. dependente. de. IFN-y · para. um. grande número de ' microorganismos, incluindo outros protozoários do , Filo Apicomplexa como Toxoplasmq_gondíí (HÚNTER etal., 1994; KHAN et ai., 1994).. ·. Para verificar a ação da IL-12 como modelador da susceptibilidade de camundongos imunocompetentes e imunodeprimidos à infecção por , URBAN et ai.. (1996). camundongos . BALB/c. e. parvum.. administraram anticorpos policlonais anti I. recém-na$cidos. e. camundongos. IL-12 a. C.817. SCID. (camundongos com imunod.eficiênci~ severa combinad~). antes e após infecção( e · observara_ m .que houve aumento significativo da infecção nas mucosas intestinais dç1s duas linhag~ns ,,e_studadas. Com esses resu~dos, os pesquisadores sugeriram que a ·1L-12 _participa da resistência inata ao. 'e.. parvum tanto em .. Gamundongos imunocompetentes quanto em camundongos imunodeprimidos. · '. '. '. A . capacidade er9.tetora da IL-12 foi confirmada em ~utro experimento realizado.no mesmo trabalho, no Ql:Jal se administrou ll-12 recombinante nas duas linhagens de camundongos estudadas, um dia antes da inoculação com oocistos, demonstrando-se que n~nhum dos camundongos das d_uas linhagens adquiriu criptospori~iose. Os _autores concluíram que a cura da criptosporidiose nestes mopelos experimentais talvez .esteja associada a uma resposta i_ m une.do tipo Th2. •,. No_entanto, AGUIRRE et ai. (19~8) demonstraram que camundongos da linhagem C57BU6, nocauteados de IL-4, desenvolveram infecçã~ prolongada por. e. parvum, sugerindo qtie a cura da çriptosporidio~ está ligada a resposta imune dQ tipo .Th-1; contudo, alguns camundongos ·eventualmente se curaram da infecção com ou sem a presença de IFN-y. Para determinar o efeito da adição ou · de uma citocina Th-1 ou de uma . citocina Th-2 na' infecção por C. parvum, ,SMITH ·et ai. (2001) infectaram - camundongos C57BU6 nocaute,a dos de IFN-y, com oocistos de C. parvum e . adminisv,aram IL-12 ou IL-4 recombinantes por via intraperitoneal e, durante o período da infecção, demonstraram que tais camundongôS não se curaram da .. \. ériptosporidiose es~t,elecida; .pelo contr~rio, ·apresentaram uma exacerba~o da. ' À. '. 1. '. -·.

(28) 11 doença. Com estes -resultados os pesquisadores concluíram que a resistência e recuperação de infecções causadas por C. parvum dependem de um balanço. -. /. refinado na quantidade e sincronizáção de citocinas Th1 e Th2.. 1.7. Modelos experimentais. Para estudo dos aspectos· bioquí(!liCOs, imunológicos e da biologia celular e . . molecular de qualquer microorganismo, é essencial que se obtenha um grande. .. ,..... .. .. estoque do m~smo e no caso do C. parvum, alguns fatores precisam ser melhor estudados tais como: o estabelecimentq de. uma. fonte de. oocistos de fácil obten~o;. a padronização de métodos reprodutíveis de purificação de oocistos e a. otimização das condições- de crescimento "in vitro" (MORGAN. et ai.,. 19.95;. MELONI & THOMPSON, 1996).. ' 1.7 .1. Cultivo ªin vitro·. No. que d~ res~ito. ª? cultivo de .e. parvum "in vitro·, vários· pesquisadores. et al.1 1991 ; GUT et ·a1., 1991 ·; HEALEY et ai., 1993; UPTON et ai., UPTON et ai. , 1995; LAWTON et ai., 1997_; DENG & -CLIVER, 1998). (FLANI.GAN 1994;. -·. •. <. •. ... tentaram produzir infecções em monocamadas de células com este parasito, tanto. .. .. com, isolados humanos como de bezerro, observando-se resultados pouco •. •. -. •. i. •. satisfatórios com as várias linhagens celulares, entre elas. MDBK. MDCK, caco-2 , eHCT-8. De' acordo com WIDMER. et ai.. (2000). a falha em perpetuar a infecção ·in. vitro" é atribuída à apoptose, que em· diferentes sistemas de cultura celular, afeta _a maioria das células infectadas, sendo um fenômeno responsável por uma drástica . redução no número ~e parasitas in~celula~es.. dessas dificuldades, HIJAWI ., et ai. (2001) descreveram o . , desenvolvimento completo e manutenção em longo prazo de C. parvum "in vitro· Apesar :. em cultura de células -da linhagem HCT-8. O ciclo completo do parasito foi mantido durante 25 . dias, por subcultivo; :todavia, apesar dos resultados promissores é!Presentados,. a pouca reprodutibilidade da técnica utilizada' e_o alto investimento - BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Fa,mac~ t·1cas , Universidade de Sào Pauto· •.

(29) 12. necessário para manutenção de culturas celulares constituem séria limitação para a implantação desta metodologia na rotina.. 1.7 .2 . ~odeios "in vivo" Para es~belecimento de uma fo~te ·de oocistos, ~e Cryptosporidium parvum, . pesquisas têm sido conduzidas inicialmente com algumas espécies de mamíferos como primatás, suínos ·e camundongos, infectados experimentalmente com · oocistos obtidos de bezerros naturalmente· infectados,· no entanto a maioria das espécies de mamíferos)á ~studadas adquire resistência natural ao C. parv_u_r;n, nas semanas iniciais de vida (SHERWOOD et ai., 1982).. 1.7.2.1. Modelo bovino: bezerros recém-nascidos. ,, Para se ,obter parasitos em massa . em condições experimentais, vários. pesquisadores infectam bezerr:os recém-;-nascidos, utilizando como fonte de ' inóculo, oocistos isolados de bezerros e cordeiros naturalmente infect~dos. Os .. '. bezerros são infectados imediatamente após o. nascimento, preferencialmente. .. -. '. .. . antes de terem · sido alimentados com colostro. Estes devem ser alojados em completo isolamento a fim de se ~vitar a exposição a outros patógenos, incluindo. Cryptosporidium spp de outras fontes, bem como para impedir contaminação do meio (MELONI & THOMPSON, 1996; BAKER et ai. , 1998). 1. Vale salientar que esse ,modelo animal requer recursos de instalação e supervis~o ·por pessoas capacitadas-ao atendimento de animais de grand~ porte e que o risco de infecção para humanos é bastante elevado, em função da grande quantidade de qocistos liberados· pelo~ bezerros infectados. Exist~rn vários relatos .. .. de manipuladores de_ ~zerros e estudantes de veterinária que adquiriram criptosporidiose pelo contato com bovinos infectados _(BAKER et ai., 1998).. . 1.7.2.2. Modelo primata.

(30) 13. •. O modelo básico que simula muitos dos aspectos da criptosporidiose observada em humanos com AIDS é o do primata com AIDS; enquanto primatas imunocompet~ntes desenvolvem diarréia aguda auto-limitada, que pode ser duradoura ·nos . - _prima~s jovens, macacos infectados com SIV (Simious. -. '. '. lmmunodeficiency Vírus) desenvolvem criptosporidiose de prognóstico progressivo .. .. .. e fatal, envolvendo os tratos ~igestivo, biliar -e respiratório (RIGGS, 1990; BASKERVILLE et ai., 1991). . ·. Apesar de existirem alguns aspectos da criptosporidiose que só podem ser 1. bem estudados em _primatas, tais como o delineamento dos vários defeitos imunológicos na mucosa do trato gastrintesfinal, associados à progressão da infecção pelo SIV, que contribui para a persistência da infecção e ao dano de mucosa observad...o na criptosporidiose, esse modelo experimental é_ de custo elevado, de pouca acessibilidade, e outros fatores, incluindo as considerações éticas, limitam a praticidade 9e se usá-lo (RIGGS, 1990). r. · 1.7.2.3~Modelo suíno. Porcos recém-nascidos são altamente susceptíveis · à criptosporidiose, podendo. desenvolver. diarréia. aquosa,. desidratação, · má. e. absorção. freqüentemente, morte súbita (TZIPORI et ai. , 1994). Já suínos adultos raramente .. .. ....__. .. .. desenvolvem diarréia, mas ·pddem excretar oocistos intermitentemente por longos . períodos de tempo (SCOTT et ~I., 1995). As limitações -desse modelo incluem o fato de que a susceptibilidade dos porcos é variável, podendo a criptosporidiose durar curtos períodos de tempo,. ter. uma longa duração ou resultar em morte súbita .e o fato da manutenção desses o porte. animais ser tão dispendiosa quanto à de outros animais de grande e médi_. 1-.7.2.4. Modelo murino. Diferentes linhagel)s de camundongos têm sido utilizadas para realização de experimentos com C. parvum, tais como: o estabelecimento de c,riptosporidiose crônica e obtenção de· massa de oocistos (HEINE et ai., 1984; UNGAR et ai.,.

(31) 14. 1_990; RASMUSSEN . & HEALEY, 1992; PETRY et ai,, 1995; MELONI & THOMPSON, 1996; YANG et ai., 2000); estudo da-·susceptibilidade de diferentes linhagens de camundongos à infecção por C. parvum (AGUIRRE et ai. . 1994; MEAD & YOU, 1998); estudo da viabilidade e infectividade de isolados de C. ~. 1. .. '. '. '. '. parvum (AYDIN & ôZKUL, 1996; • VE~GARA-CASTIBLANCO et ai., 2000; I NEUMANN et ai.; 2000; DELAUNAY et al, 2000; OKHUYSEN et _ ai., 2002); avaJiação de ~gentes qúimioterápicos para combate à cliptosporidiose (HEALEY .. .. et ai., 1995; BLAGBURN et ai., 1998) e estudos do mecanismo imune envolvido. na susceptibilidade ou não. ao C. -p~rvum· (UNGAR et ai., 1986; B~NSHARD _et. a/., 1992; CHEN et ai.,· 1993b; AGUIRRE et ai., 1994; MACDONALO & '. .. .. BRANCOFT, 1994; URBAN et.al., -1996; THEOOOS et ai., 1997; AGUIRRÊ et I. ai.,. 1998; ~AKER et ai.; 1998;. HAY_WARD et ai., 2000; SMITH ~t ai., 2001; LACROIX-. LAMANDÉ et ai., 2002; LA~RENT et aL, 2002~-TZIPORI et ai., 2002). Quanto à obtenção de oocistos em massa, experimentos utilizando ·~m!,Jndongos , recém-nascidos das linhagens '?57BU6, ARC/Swiss, ~ALB/c '. .. demonstrara~m resulta~os s·atisfatórios na indução de infecção por C. pawum (SHERWOOD et ai:, 1982; PETRY ef ai., 1995; MELONI e THOMPSON, 1996), mas dific1.;1ldades de manuseio pelo reduzido tamanho dos animais, baixo número de oocistos recuper~dos e .auto-limitação da infecção tornam esse modelo pouco prático para obtenção de· ~stos em massa, embora apropriado para estu~os de infectividade de cepas de. e.. parvum (NEUMANN et ai., 2000; VERGARA-. CASTIBLANCO etal., 2000). HEINE et a/., (1984) inocu·larani camundáng~s da linhagem BALB/c, recém -. nascidos e congenitamente atimizados (nude), que são deficientes de 'células T, com 105 oocistos de C. parvum e, apesar de.não haverem quantificado o número . . \. de oocisto~ recuperados, estabeleceram infecção persistente em .todos os \. camundongos utilizados_no experimento; todavia, falharam em induzir infecção em camundo9gos BALB/c núde adultos (40 dias). Com o intuito de estabelecer infecções por C. parvum em camundongos nude adultos. UNGAR et ai. (1990) inocularam .14 camundongos da 'linhagem BALB/c com 30 dias de idade, com 107 oocistos e observaram três padrões diferentes de , , infecção: quatro camundongos morreram no quarto dia após a infecção; três ).

(32) /. 15. desenvolveram um declínio gradual e morreram após quatro. semanas e ·três adquiriram criptosporidiose e· liberaram ?OCistos nas fezes durante 16 semanas. Os outros quatro camundongos morreram de causas não relacionadas ao C. paNum. No mesmo trabalho os putores a~ministrar'am anticorpo monoclonal imunocoirlpetentes e recémanti-CD4 a, um .outro grupo de camundongos BALB/c , ' I. .. nascidos, e, durante o período que durou a imunossupressão, todos os •. 1. ,. ... •. •. camundongos do grupo liberaram oocistos nas fezes; dessa forma os autores, apesar de não haverem quantificado o número de oocistos recuperados nas fezes. dos camundongos, assinalaram a praticidade dos dois modelos estabelecidos,. '. .. '. para obtençao de · o~éistos de C. paivum, porém, os autores ·não · conseguirám .. •. ,1. estabelecer infecção por C. parvum após administrarem o anticorpo monoclonal anti-CD4 a camundongos BALB/c imunocompetentes.adultos. Vários. experimentos. foram. realizados. com. camundongo~. adultos. geneticàment,e imunodepri~idos, como camundongos SCID (camundongos com imudeficiêr:1cia co~binada ·severa), camundongos congenitamente atimizados ou camundongos. nocauteados P8ira determinadas citocinas, contudo, a maioria deles ·,. -. direcionados ao estudo de aspectos referentes à resposta imune e à biologia de. C. paNum, não sendo direcionados à obtenção de massa de oocístos. O uso de linhagens susceptíveis de.. . _camundongos parece ser promissor, principalmente devido à faéilid~de de manuseio d~ste modelo e a possibilidade de. ·se desenvolver ·um quadro clínico · bastante semelhante ao observado na criptosporidiose humana (YANG et ai..! 2000).. 1.7.3. Modelo murino imunossuprimido com glicocorticóides. Já . para se obter produção em- massa de oocistos, vários pesquisadores ' empregaram_ camundongos adultos · da ~inhagem C57BU6, por serem mais susceptíveis do que camundongos de outras li_nhagens, subr:netidos à terapia c(?m o corticosteróide dexametasona, em diferentes dosagens e vias de administração •. j. •. .(RASMUSSEN & HEALEY, 1992; PETRY et ai., 1995; YANG et ai., 2000) .. •.

(33) 16. O córtex d.a supra-renal sintetiza duas élasse~ de hormônios esteróides, a saber, os androgên!os. e os corticosteróides. Os corticosteróidés são divididos, de acordo com-- seu mecanismo de ação, em glicocorticóides, · reguladÓres do metabolismo de car,b oidratos, e · mineralocorticóides, reguladores do equilíbrio . eletrolítico. Os efeitos farmacológicos ·dos ~rticosteróides . são amplos, incluindo alterações no metàbolismo dos carboidratos, lipídios e proteínas, manutenção do equilíbrio eletrolítico, preservação da função normal do sistema cardiovascular, do . sistema imunológico,, dos rins, da muscul~tura esquelética, do sistema endócrino ' . ' . do sistem~ nervoso, sendo bem ~nhecida a ação · imunossupressora. e. dos. /. glicocorti~ides.· Os glicocorticóides podem evitar ou suprimir a inflamação em . . resposta a vários eventos estimulantes dentre os quais estímulos radiantes,. -. \. /. .. mecamcos,. .. químicos, ·· infeccio59s .. e. i'!'unológicos,. estando. as. ~ções_. antiinflamatória e. imunossupressora indissoluvelmente ligadas, já que ambas resultam, em . sua · maioria, d~ inibição de · funções_ específicas dos leucócitos (CHROUSOS., .1995). Os efeitos imunossupressores dos glicocorticóides estão relacionados com a indução de linfopenia e 'd. iminuição da função linfocitária Cóm perda da _capacidade . .. _,. prolíferativà das células frente a mitógenos específicos (PINTO, 1991). Além disso, J. -. ~. •. 1. os glicocorticóides apresentam efeitos s~bré a resposta imunológica específica do hospedeiro, _pelos efeitos · sobre a produção de citocirias dentre as quais o IFN-y, fator.estimulador d~ colônia de.granulócitos e monócitos, interteucinas (IL-1 , IL-2, '. •. 1. •. IL-3, tl-6) e TNF-a. (GQODMAN & GILMAN, 1996). . · . A indução de lir)fopenia foi inicialmente observada por FAUCI & DALE (1974). ao ad.ministrarem o_ glicbcorticóide h1drocortisona a . humanos normais por via intraven_osa, verificando · que os valores absolutos de linfócitos e monócitos da circulação sanguínea diminúem após um período de 4 a 6 !'oras da administração . . da droga, retom~ndo ao normal após 24 horas, ocasionando uma depleção seletiva no número de linfócitos. .. -... .,..-. FAUCI (1975) aiQda investigou o efeito do glicocorticóide acetato de cortisona. quando ad~inistrapo em cobaias, demonstrando que esta droga causa profunda, mas transitória linfoper,ia, . que atingia um pico após 4 horas, retomando a. B I BLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêuticas Universidade de São Paulo. '.

(34) 1. •. 17. contagens normais em 24 horas. Verificou ainda que havia uma diminuição proporcional do número de linfócitos T totais, quand9 comparados aos linfócitos·T _ circulantes e que a -linfopenia sanguínea era resultante da redistribuição ' dos. .. ,. linfócitos cirpulantes para a medula óssea. Com relação ao uso de ·glicocórtícóide como droga imunossupressorà, parà . posterior. indução de criptosporidiose em modelo murino, RASMUSSEN & v. '. \. HEALEY (1992) determi.naram a sus~ptipilidade de camundongos fêm~as, . adultos, de cinco diferentes linhagens (C57BL/6, C3H/t:ieN, BALB/nAnN, DBA/2N ~ CBA) imunossuprimidos com o glicocortícóide dexametasona, empregando . ' .. · vários regimes de administração da droga. .. un:1 Qrupq de camundongos adultos {10 (. por linhagem} recebeu dexametasona na água potável, numa concentração equi\ralente ~ Sµg/dia, que, segundo REHG et ai. (1988), seria efetiva para indução de imu_nossupressão em ratos; contudo os autores não observaram liberação de grande~ quantida_d es de oocist0s neste gr.upo. Um segundo grupo de .. !. ~. camundongos adultos (20 por linhagem) foi dividid,o em quatro subgrupos e cada ·um_ dos subgrupos recebeu d~xametasona por via intraperitoneal nas dose~ de. .. .. . 62,5; 125; 250 ou 500µg/dia. A droga {oi administrada durante 83 dias, e, neste '. ,. período, observ(?U-se que apenas os camundongo~ da linha~ern C57BL/6, quandp '. .. .. imun_ossuprimid~s ·com. 1.25µg/día por via intraperi~oneal, demonstraram-se. susceptíveis a infecção por C,yptosporidium parvum, já que liberararn uma grande quantidade ·de oocistos nas fezes, ·até o fi_nal do período no qual foi realizado o -experimento. Os animais de tódas as cinco · linhagens estudadas, quando Joràm . . . . imunossuprimidos com doses superiores a 125µ9/dia chegaram a óbito. Neste mesmo sentido, PETRY et ai. (1995) induziram imunossupressão em '. camundongos adultos, fêmeas da linhagem C57BL/6, injetando dexametasona durante quatro dias alternados, por via subcutânea, nas doses de 250, 500 ou 6. 1000µg por: animal. Após infecção com 10 oocistos de C. parvum ·por animal, os autores· constataram que os camundongos , imunossuprimidos com 1OOOµg de dexametasoná liberaram maior quantidade de oocistos quando comparado aos outros grupos. \. /.

(35) 18. /. YANG . e( .ai.. /. (2000). demonstraram. 1. que. •. camundongos. C57BU6. •. imunossuprimidos com 16µg/ml de dexàmetasona, administrados na água potá~el, e infectados com apenas um oocisto, desenvolveram infecção patente: porém sem li~ração de oocistos nas fezes; ·a infecção só foi constatada em cortes histológicos de íleo terminal (2cm 'distais) corados com hematoxilina e eosina. Ao se examinarem as lâminas, v~~cou-~ C. parvum produzindo atrofia e ·fusão das '. .. \. vilosidades e dilatação das ·crip~s· intestinais. Apesar disso, em trabalho anterior,. ,, YANG & HEALEY (1993) demonstraram que a 'administração de dexametasona na água potável a camundongos C57BU6 induziu uma maior mortalidade, com sinais .. .. '. de toxicidade ~ais evidentes, em relação à administração por via intraperitoneal.. .. (. /. j. '.

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(37) J. 19. 2. ,JUSTIFICATNA. Dificuldades na realização de estudos que requerem oocistos de. Cryptosporidium_ pa,vum em massa justificam,· a necessidade d~ se desenvolver modelo experimental ~dequado para manutenção do parasito,. já que a maioria dos modelos animais não é susceptivel à infecção por este I. •. prot(?zoário: Exi~te·m estratég_ i as descritas na literatura para a obtenção de oocístos. ' ' . de C. parvum a partir da infecção de bezerros neonatos, todavia, o .. estabelecimento de um esquema para indução de imunossup~o com corticosteróide, em camundongos adultos, em nível adequádo para se .estabelecer. um. modelo experimental de . infecção, parece ser uma. alternativa ·de grande interesse para aprofl,Jndar aspectos referentes à. biologiá dest~ parasito; e, princi~lmente, obter massa de oocistos a sere;., •. '. 1. •. ~. •. empregados em f{Jturos esludos bioquímicos, moleculares .. êomo fonte d~ antígeno~ na produção de imunoreagentes.. ' r,. \. /. <. •. ~. imunológi~s e. .. ..

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(39) 3. OBJETIVOS Geral. Esta~lecer modelo .animal para obtenção de ooci~os dé Cryptospbrid[um parvum .infectando ~mundongos adultos das linhagens BAl,.B/c .e C57BLJ6,. imunossuprimidos com _glicocorticóide.. Específicos ~. Verificar as condições adequadas para a indução de imunossupressão em camundongos das· linhagens C57BLJ6 e BALB/c, com e~prego do glicocorticóide. .. dexametasona, comparando a contagem global e diferencial de leucócitos no . sangue perifériÇ9; - ·. Acompanhar a ·infecção em camundongos das linhagens C57BLJ6 e BAl,..B/c:· •. .. ". 1. .. ~. .. ) munossuprimidos con:i dexametasona e submetidos à inoculação intragástri~ com oocistos obtidos de bezerro experimentalmente infectado com C. parvum; '. Avaliár · a viabilidade · do mod~lo'. experimental murino para obtenção de opdstos· em massa; quantificando -os oocistos liberados . nas ~zes dos .. .. -. camu_ndongos das -linhagens C57BLJ6 e BAlB/c infectados com C. parvum, para análise de rendimento..

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(41) 21 \. 4. MATERIAL E MÉTODOS r. ',.. ,. 4._ 1. lmunossupressão de camundongos I. Camandongqs fêmeas da linhagem BALB/c com idade entre 2 e 3 meses e peso ·variando de.·20 a 25 gramas e ma~hos da linhag~m C57BU6, com a mesma. idad.e e o n:,esmo· ~so. for~_ m obtido~ nos biotério da Facu.ldade de Ciência~ Farmacêuticas e do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São . .. .Paulo, respeétivàmente. Os camL.i~dongçs da linhage~ BALB/c foram ~scolhidos por pertencerem. a. uma-linhagem d~ maior acessib'il.idade,· com .grande dispo~ibiÍidade nos biotérios; além disso, para estabelecer e verificar as condições dó efeito imunossupresSQr. dó corticóid. e· dexametasona. A escolh~ dos camµndongós da linhagem C57BU6 ' : .. . . _baseou-se em- dadQs da _liter.a~ra indicando· grande susceptibilidade desses ao desérwolvimento de.. criptosporidiose :após-imunossupressão com dexametasona e . .. . ~. '. infecção com cocistos de C. parvum. Embora costume ·_ . .a maioria- das pesquisas . utilizar ,camundongos fêmeas, frente. às dificuldades encontradas para adquirir ,. .. \. , camundÓng0$ Ç57BU6 _ fêmeas, optou-~ -pélo uso de camundongos . machos. dessa linhagem. . " Como droga imunossupc essora utilizou-se dexametasona injetável -adquirida . -·. ~. en:, frasco ampola de 2,_51111, na concentração de 4mg/ mi, com o nome C?Omercial · Decadron. (Merck). A via de.. administração utilizada foi ~ subcutânea, devido à .. ,. .. · facilidade de padroniza~o d~ dosagem d~ imünossupressor admi~istrada para 'V. -. cada camun.dongo e a m~nor toxicidade.. o. corti~sterôide fpi administrado diariamente, nas dosagens de 0,5mg e ' .. .1mg; J)Qr um período de 21 ,dias, nos camundongos BALBlc e na dose de 0,5 mg, por um:período de 14 dias, n<;>s camundongos C57BU6.. 'os .'. camundong~ ~tilizados na ~se . de padronização do esquema de '. .. \. imunossupressão. (experimento 1) tc;>ram separados em grupos, da seguinte. .. .. maneira:. ~. \. - grnpo A.: 20 can:,u~dongqs BALB/c fêmeas, im·unossuprimidos com 1mg de dexametaS9na por a~imal, di~riam~nte~ . .•. L.

(42) 22 - grupo B: 10 camàndongos BALB/c fêmeas, imunossuprimidos com 0,5mg de dexametasona por animal, diariamente; '. /~. '. - grupo C: 10,camundongos ·C57BU6 machos, im~nossuprimídos com 0,5mg de .. dexametasona pot a11imal,.diàriamente. As.dosagens de· 0,5mg e 1mg de dexametasona foram. éscolhidas após, uma • • . • 1. por. análise CUidê!CÍOsa _ das . dosager:is . utilizadas. o,175,:ng até 1,ng· por animal,· e apesar. variaram a dose de imunossu.pressão de. no esquema. das variaçõe~. -Outros pesquisadó~es,' que. de inJUOOSSUpressão e nos resultados de cada . um. dele"s, preferif!19S realizar o~ experi~entos utiliza~qo estas duas doses. ,.. •. •. ·. #. ·Vale salientar qu~. tendo em vista a di~culdade de obtenção de . ,., ' . camundongos da linhagem C57BU6; a imunossupressão desses camundongos foi. · realizada a_ penas ·na do~ge_m' de,0,5mg de d_exametasona, para n~o correr o risco de perder animais.utilizando uma dose.sabidamente elevada de corticóide. ~·. ,. ' 0. ~. 1. '. •. ,. ,. 1. :. •. 4.1 .1. Avaliação ,d~ _ imunossupressão '. '. •. · '. Para .anàlisãr a imunossupressão, f,oi .realizado leucograma, que permite a . .. .. '. .. ~. contagem do riümero relativo .e absoluto de leucócitos. Tal técnica foi realizada a •. 1'. cada sei~ dias, até se observ,a r uma consiqer_ada diminuição do número absoluto .. :. .. .. ... j. de· leucócitos (50% em médi~) e inversão _do número relativo d_e linfócitos no. d~ .linfócitos eni torno de ·25%, em um total de 100. sangue perifé~i~ ·(contage)ll células).. ·A ,Qua,ntidade de ··leucócitos tot~is ,por m~3 de sangue foi ~stimada pç,r intermédio da contagem do ·número absoluto, e através da ,contagem diferencial . J. -. •. •. '. • .,. pode-se acomp'a!1har o cÔmJ?Ortamento·des linfócitos após a~~ihistração da droga imunossupreSSQra.. ó. leu~rama foi realizàdo somente até o dia da infecção, .. .. para evitar que um soma!-9.Jio de procedimentos viesse a provocar o óbito dos animais.. ·Amostras. de 25µ1- de sangue dos. animais . submetidos à imunossupressão ,. .. .. .. foram diluídas na-propor~o 1:20 êm líquido de TüÍ1< e contada~ em câmara de Neubauer, sendo a leitura da · contagem diferencial realizada em microscópio 1. •.

(43) 23 óptico, através de esfregaço sangüíneo, corado pelo Leishman (Merck S. A.; Indústria Quimica,,R. J.).. 4.1 .2. Manutenção-de camundongos ·imunóssuprimidos /. Os a,nimais: imunossuprim,idos fqrai:n mantidos em condições rigorosas de qualidade sanitária,. sendo. todo o material utilizado autoclavado e esterilizado. (gaiolas, bebedouro!i: m~r_ava;lha), ·COf!! o intuito de evitar a infecção dos · camundongos co~ outr~s patóg~nos: Para manutenção diária dos· camundon.g os, os equipamentos de proteção individual incluíram · avental descartável, máscara .•. ~. •. ~. J. luvas e óculos de proteção.. ·4.2. Obtenção de Cryptosporidium parvum a p~rtir de bezerro. .Para ·obtenção de oocistos de C. __ parvum, um bezerro .da_raça holandesa · recebi_d o por'. doação de uma ~àzenda do Município de_Caçapava, Vale do Paraíba, SP, .~m ·cinco dias de idade, sem te~ mamado colostro da sua progenitora! foi infectado por yia oral. com 2,5x10. 7. oocistos. Estes foram obtidos a parti~ ·de um. outro bezerro natur~lmente infectado, .proveniente da mesma fazenda que o . ·, . primeiro. O animal -permaneceu ' no biotério ~o Laboratório de Parasitologia da . '. Universidade de 1aut,até (UNITAU), recebendo os devidos cuidados até cessar a liberação dos;~istos. Para diminuir a _tjupntidade de gordura presente nas fezes, foi alimentado diariamente com dois durànte todo -~:>' períodq da in~o·o . bezerro . litros de leite desnatado. Após ter. cessado a· diarréia e com o término da liberação '. '•. · dos oocistos, o animá! passou a receber diariamente dois litros de leite integral e 1. '/. I. _. água. Com ~ início do_processo diarréico, as fezes passaram a ser armazenadas em saco coletor , sem conservantes, sendo ' diariamente transferidas para recipientes contendo sqluçã~ de dicromato de potássio a 5%, na proporção 1:2.. Para verificàção da pr~sença ou ausência·de oocistos de C. parvum nas fezes, as amostras foram analisadas pela técnfca de ~utuação em solução .de sacarose. _,. 1.

(44) 24. ·(SHEATE~. 1923). Este procedimento foi realizado até consta~ção da ausência. de oocistos nas fezes.do animal. 1 I. 4.2.1. Purificaçã<? de oocistos e preparação do inóculo para infecção ~os ,. cam~ndongos. ~. •. .. --. 1 •. '. Os oocistos excretados nas fezes dos bezerros foram isolados pe_la técnica de purificação em ·grai!iente .. '. de. -. '. sacarose. (Bl,.JKl1ARI & SMITH, 1995). Cer:ca de . ... 2ml de. fez~ preservadas .~m dicroníato de potássio a 5% foram homogeneizados 1 '. ern ~bos de fundo cônico . de 151:ril -conte.ndó 10ml de solução de Sheater. (sacarose: densidade \~Og/ml); a '.su_spen~o 'obtida foi ~ntrifugada á 1500rpm. .. .. por 1o minutos. Após centrifugação. foram. .. ~. removidos cerca de 2ml da camadá. . superior, contendo.os oocistos, e cotocados ·em outro tubo cônico contendô~3ml .. ~. ·de ág.oa destilada; sendo que a/suspensão ol)tida foi "centrifugadaa 3000rpm por. . 1 o· mint:1tos, para-.remoç~o da sacarose. Este· _procedimento · foi , repetido até '.. '. 1. •. ~. •. •. '. ••. completa remoção da sacarose. -Ao pr~ipitado.obtido foi adicionado hipoclorito de · .. .. ..:... '. sódio, para ·remoção de contaminantes e a suspensão resultanté foi novamente · .. '. '. ·.. .. .. cenfrifugada ~ 3000rpm por 10 ·minutos .e posteriormente ·1avada três vezes com , (igua bidestilada para remoção do hlpo_ciorito: -Os ·oocisto~. presentes foram ressuspensos ern ~oluçã·o salina .ta~~nada com fo~fàtqs (PBS), 0,01M, pH 7,2. '. ". '. para um volume.final de 1,5ml.. -. '. .. '. Para a prep~ração do inóculo ·uti!izado na . infecção dos camundongos, ·procedeu-se a qua~tificaçã~ dos oocis~s obtidos no procedimento de purificação, ' .. ... confeccionando-se e.sfregaço~ com 1Oµ! da solu.ção de PBS contendo os oocistos. ~. '. '. · Os .esfregaços foram corados pela técnica .de Kinyoun modjticada (metodo_ logia descrita no ~nexo 1) e o núméro de .oocistqs quantificado foi convertido para o volume final de 1,5ml. ~osteriorrnente realizou-se diluição ·dessa suspensão de. oocistos, prepar~ndo-se_os inóculos empregados,nas infecções. ./. 4.3. Infecção de camundongos e coleta dos oocísto_s. · .. ·1. \. ·--- · B IBLIOT ECA Faculdad_e de Ciências Farmacêoticas. Univetsidade de São Paulo.