PRISCILA AMANDA FRANCISCO
DETECÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS E DE SEUS FATORES DE
VIRULÊNCIA NA SALIVA, CÂMARA PULPAR E CANAL
RADICULAR DE DENTES ASSOCIADOS AO INSUCESSO
ENDODÔNTICO
Piracicaba 2017
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
PRISCILA AMANDA FRANCISCO
DETECÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS E DE SEUS FATORES DE VIRULÊNCIA NA SALIVA, CÂMARA PULPAR E CANAL RADICULAR DE DENTES
ASSOCIADOS AO INSUCESSO ENDODÔNTICO
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Clínica Odontológica, na Área de Endodontia.
Orientadora: Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna Priscila Amanda Francisco e orientada pela Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes
Piracicaba 2017
DEDICATÓRIA
À minha família, Katia, César, Patrícia e Bruna, que não mediram esforços para me apoiar durante toda essa jornada. A possibilidade de dividir cada conquista com vocês é a minha maior felicidade.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Agradeço à toda minha minha família pelo carinho e pelo esforço que fizeram para que eu pudesse prosseguir com meus sonhos. Espero sempre poder retribuir na mesma medida da minha gratidão, todo o amor e cuidado que têm por mim.
À minha orientadora, profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes, agradeço por me escolher como orientada, por confiar a mim pesquisas tão sérias e desafiadoras e por todas as oportunidades incríveis que constantemente me proporciona. Fazer parte da equipe da senhora é um privilégio.
Aos professores, Dr. Carlos Augusto de Morais Souto Pantoja, Dr. Marlos Barbosa Ribeiro e Dr. Rafael Nóbrega Stipp, pelas correções e contribuições para a melhoria deste trabalho, durante o exame de qualificação.
Aos professores que compõem a minha banca de defesa do Mestrado, Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes, Dr. Francisco Montagner e Dr. José Flávio Affonso de Almeida, por terem aceitado prontamente meu convite. As arguições dos senhores com certeza serão fundamentais para o enriquecimento desse trabalho. Será um prazer e uma honra tê-los nesse momento tão especial.
Aos meus amigos de Piracicaba, Andréa Cardoso Pereira, Ana Carolina Correia Laurindo de Cerqueira Neto, Ana Carolina Pimental Corrêa, Aniele Carvalho Lacerda, Augusto Rodrigues Lima, Bruna Alves Taveira Ueno, Bruna Milaré Angelieri, Daniela Cristina Miyagaki, Diogo Henrique da Silva, Eloá Cristina Bícego Pereira, Felipe Nogueira Anacleto, Flávia Medeiros Saavedra de Paula, Jaqueline Mafra Lazarri, Maicon Ricardo Zieberg Passini, Marlos Barbosa Ribeiro, Rafaela Casadei Chapola, Rodrigo Arruda Vasconcelos. Agradeço à vocês por dividirem seus conhecimentos, por estarem presentes tanto nos momentos difíceis como nos de descontração, e por acrescentarem alegria aos meus dias. Considero valiosa a amizade de cada um e torço pelo sucesso de todos.
Aos amigos Augusto Rodrigues Lima e Diogo Henrique da Silva, por me receberem de forma tão gentil e atenciosa. Vocês sempre são positivos e estão dispostos a ajudar. Em apenas dois anos já dividimos muitas histórias e nos tornamos grandes amigos. Espero tê-los pra sempre em minha vida.
Ao amigo Marlos Barbosa Ribeiro, por me ajudar a evoluir desde o início do mestrado, tanto na vida acadêmica e profissional, como também na pessoal. Foi muito bom ter te conhecido e criado essa amizade tão especial. Tenho um carinho grande por você e fico muito feliz por tudo que tem conquistado.
Às amigas Flávia Medeiros Saavedra de Paula, Jaqueline Mafra Lazarri e Rodrigo Arruda Vasconcelos pela companhia de todos os dias, pelo carinho e pela amizade sincera. Sempre quando precisei vocês estavam presentes para me escutar e ajudar. Espero poder sempre retribuí-los e tê-los como amigos.
Aos amigos Andréa Cardoso Pereira, Ana Carolina Correia Laurindo de Cerqueira Neto e Aniele Carvalho Lacerda e Felipe Nogueira Anacleto, pelas conversas agradáveis, pela gentiliza e também pelos “momentos científicos”. Vocês são muito inteligentes e competentes, com certeza terão isso refletido em suas vidas profissionais.
Ao amigo Maicon Ricardo Zieberg Passini, pela paciência em ensinar as técnicas do laboratório e principalmente pela amizade. Sem nossas conversas diárias eu não entenderia metade do que sei hoje, te agradeço de coração.
Ao Prof. Dr. Walter Luiz Siqueira por ter me aceitado para um estágio na University of Western Ontario, London, Ontário, Canadá.
Ao Prof. Dr. Mario Zuolo e à Profa. Me. Maria Cristina Coelho Carvalho, pelo convite ao brilhante curso “Intensivo em Microscopia” ministrado.
À Profa. Dr. Magda Feres e à técnica Izilvânia Barreto, por me receberem em seu laboratório para a realização de uma metodologia do meu projeto de Mestrado.
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de mestrado no país, processo nº 2015/19215-2 e pela bolsa de estágio no exterior, processo 2016/19743-1.
À direção da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de Campinas, na pessoa do seu diretor, o prof Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques.
À profa Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, coordenadora do Programa de Pós-Graduação da FOP/UNICAMP e à profa Dra. Karina Gonzales Silvério Ruiz, coordenadora do curso de Pós-Graduação em Clínica Odontológica.
À Ana Paula Carone, Claudinéia Prata Pradela, Érica A. Pinho Sinhoreti, Lucas de Almeida Cruz e Raquel Q. Marcondes Cesar, profissionais da secretaria da Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas.
Aos professores da área de Endodontia, profa. Dra. Adriana de Jesus Soares, prof. Dr. Alexandre Augusto Zaia, profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes, prof. Dr. Caio Cezar Randi Ferraz e prof. Dr. José Flávio Affonso de Almeida.
Aos funcionários Adriano Luis Martins, Ana Cristina Godoy, Elisângela Barbosa Vendemiatti, Janaina de Oliveira Leite, Maria Helídia Neves Pereira e Maicon Ricardo Zieberg Passini.
Aos colegas de mestrado Augusto Rodrigues Lima, Bruna Alves Taveira Ueno, Bruna Milaré Angelieri, Diogo Henrique da Silva, Eloá Cristina Bicego Pereira, Flávia Medeiros Saavedra de Paula, Jaqueline Mafra Lazarri, e Rafaela Casadei Chapola.
Aos colegas de doutorado Aline Cristina Gomes, Ana Carolina Correia Laurindo de Cerqueira Neto, Ana Carolina Pimental Corrêa, Andréa Cardoso Pereira, Aniele Carvalho Lacerda, Ariane Cássia Salustiano Marinho, Cimara Barroso Braga Brum, Claudia Leal Sampaio Suzuki, Elilton Cavalcante Pinheiro Júnior, Érika Manuela Asteria Clavijo, Fabrício Rutz da Silva, Felipe Nogueira Anacleto, Julio Vargas Neto, Marcelle Louise Sposito Bourreau, Maria Cristina Coelho de Carvalho, Mário Luis Zuolo, Thaís Mageste Duque e Tiago Pereira da Rosa.
Aos colegas de pós-doutorado: Daniel Rodrigo Herreira Morante e Maria Rachel Figueiredo Penalva Monteiro.
A todos os pacientes que participaram da minha pesquisa.
A todos que participaram de forma direta e indireta, contribuindo para a realização deste trabalho.
RESUMO
Na microbiota de infecções secundárias/persistentes predominam micro-organismos resistentes aos procedimentos endodônticos, destacando-se entre eles Enterococcus faecalis. A microinfiltração coronária é um agente etiológico do insucesso do tratamento endodôntico, promovendo uma fonte constante de contaminação da saliva para os canais radiculares. Os objetivos do presente estudo foram: a) estudar a composição da microbiota da saliva (S), câmara pulpar (CP) e canal radicular (CR) de dentes com insucesso endodôntico, por meio da técnica de checkerboard, de maneira a verificar a simultaneidade entre as espécies bacterianas presentes nestes três sítios; b) quantificar a carga bacteriana total, de Enterococcus faecalis e de Streptococcus spp. na saliva, câmara pulpar e canais radiculares, por meio de real-time PCR; c) quantificar os níveis de lipopolissacarídeos (LPS) e ácido lipoteicóico (LTA) presentes na S, CP e CR investigados; d) correlacionar as bactérias encontradas entre os sítios, dentro dos sítios e com o LPS/LTA; e) correlacionar os micro-organismos e o LPS/LTA com os aspectos clínicos dos pacientes. Foram selecionados 20 dentes com presença de lesão periapical e necessidade de retratamento endodôntico. Amostras foram coletadas da saliva, câmara pulpar e canal radicular. O DNA destas foi extraído e submetido ao método do checkerboard utilizando sondas para 40 espécies diferentes. Para a quantificação, por real-time PCR, de bactérias totais, E. faecalis e Streptococcus spp. foram utilizados primers universais e específicos. As amostras de LPS e LTA foram quantificadas pelos métodos Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) e Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), respectivamente.Pelo checkerboard, bactérias foram detectadas em todas as amostras, tanto Gram-positivas quando Gram-negativas, anaeróbias facultativas e estritas, com média do número de espécies de 35, 20, e 29, para S, CP e CR, respectivamente. As bactérias mais prevalentes, encontradas simultanemanete nos 3 sítios estudados foram: E. faecium, P. micra, F. nucleatum sp. nucleatum, E. faecalis, E. saburreum e C. ochracea. Pelo real-time PCR, foram encontrada médias de bactérias totais de 1,45 x 106; 6,78 x 105 e; 2,02 x 104, na S, CP e CR. A proporção média de E. faecalis e Streptococcus spp. nesses mesmos sítios foram de 0,6% e 10,7% (S); 17,4% e 9% (CP); 9,17% e 1% (CR). O LPS e o LTA estiveram presentes em 95% e 100% das amostras do CR, com média de 3,26 EU/mL e 578,67 pg/mL. Associações altamente significativas positivas e negativas (p<0,01) foram encontradas entre espécies dentro de cada sítio, sendo 2 positivas na S; 66 positivas e 44 negativas na CP; e 7 positivas e 11 negativas no CR, todas com valores de ODDS > 2 ou < 0,5. Uma associação estatística positiva
(p<0,05) entre os sítios dos dentes que apresentavam sinais de microinfiltração (11/20) foi encontrada entre S. oralis da S e S. oralis do CR (p=0,015 e ODDS=7). Nos dentes que não apresentavam sinais de microinfiltração (9/20) uma associação negativa foi encontrada, entre C. showae da CP e C. showae do CR (p=0,048 e ODDS=0,250). Entre a concentração de bactérias Gram-negativas e o LPS, houve quatro associações positivas (V. parvula-CP/LPS-S; C. showae-CP/LPS-S; N. mucosa-CP/LPS-S e C. ochracea-CP/LPS-CR); e duas negativas (F. nucleatum sp. nucleatum-CP/LPS-CP; e D. pneumosintes-CR/LPS-CR) (p<0,01). Entre a concentração de bactérias Gram-positivas e o LTA, houve uma associação positiva (E. hirae-CR/LTA-CP) e três negativas (todas na CP, entre o LTA e E. nodatum, S. mitis e E. nodatum) (p<0,01). Com relação as correlações com aspectos clínicos, três associações negativas significantes (p<0,05) foram encontradas entre dor à percussão e D. pneumosintes, F. periodonticum e E. corrodens. O LPS da S apresentou uma correlação moderada positiva com a presença de fístula (p=0,02). A dor à percussão e o LTA da CP apresentaram uma correlação regular positiva (p=0,035). Concluiu-se que a microbiota do canal radicular associado à infecção secundária/persistente é heterogênea, existindo uma similaridade entre as microbiotas das 3 regiões estudadas, com maior detecção de LTA do que LPS. Associações entre micro-organismos presentes na saliva, câmara pulpar e canal radicular sugerem possível comunicação entre os sítios.
Palavras–chave: Periodontite apical, micro-organismos, fatores de virulência, endotoxinas,
ABSTRACT
In the microbiota of secondary/persistent infections, microorganisms resistant to endodontic procedures predominate, especially Enterococcus faecalis. Coronary microleakage is an etiologic agent of endodontic treatment failure, promoting a constant source of saliva contamination to the root canals. The aims of the present study were: a) to study the microbiota composition of saliva (S), pulp chamber (PC) and root canals (RC) of teeth with endodontic failure, by means of the checkerboard technique, in order to investigate the simultaneity among the bacterial species present in these three sites; b) to quantify the total bacterial load, Enterococcus faecalis and Streptococcus spp. in saliva, pulp chamber and root canal, by real-time PCR; c) to quantify the levels of lipopolysaccharides (LPS) and lipoteichoic acid (LTA) existing in the S, PC and RC investigated; d) to correlate the bacteria found between the sites, within the sites and with the LPS/LTA; e) to correlate the microorganisms and the LPS/LTA with the patient clinical aspects. Twenty teeth with presence of periapical lesion and need for endodontic retreatment, were selected. Samples were collected from saliva, pulp chamber and root canal. The extracted DNA was subjected to the checkerboard method using probes for 40 different species. For the quantification, by real-time PCR, of total bacteria, E. faecalis and Streptococcus spp., universal and specific primers were used. The LPS and LTA samples were quantified by the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods, respectively. By checkerboard, bacteria were detected in all samples, both Gram-positive and Gram-negative, facultative and strict anaerobes, with an average number of species of 35, 20, and 29, for S, PC and RC, respectively. Simultaneous bacteria most found, at the 3 studied sites, were: E. faecium, P. micra, F. nucleatum sp. nucleatum, E. faecalis, E. saburreum and C. ochracea.By real-time PCR, the mean of total bacteria was 1.45 x 106; 6.78 x 105 e; 2.02 x 104, in S, PC and RC. The mean proportion of E. faecalis and Streptococcus spp. at these same sites was 0.6% and 10.7% (S); 17.4% and 9% (PC); 9.17% and 1% (RC). LPS and LTA were found in 95% and 100% of the RC, with a mean of 3.26 EU/mL and 578.67 pg/mL. Highly significant positive and negative associations (p <0.01) were found between species for each site, being 2 positives in S; 66 positive and 44 negatives in PC; and 7 positive and 11 negative in RC, all with ODDS values> 2 or <0.5. A positive statistical association (p <0.05) between the sites of the teeth showing signs of microleakage (11/20) was found between S. oralis from S and S. oralis from RC (p = 0.015 and ODDS = 7). In the teeth that did not show signs of microleakage (9/20) a negative association was found between C.
showae of PC and C. showae from RC (p = 0.048 and ODDS = 0.250). There were four positive associations between the Gram-negative bacteria concentration and the LPS (V. parvula-PC/LPS-S, C. showae-PC/LPS-S and C. ochracea-PC/LPS-RC), and two negatives (F. nucleatum sp. nucleatum-PC/LPS-PC and D. pneumosintes-RC/LPS-RC) (p <0.01). Between the Gram-positive bacteria concentration and the LTA, there were one positive association (E. hirae-RC/LTA-PC) and three negatives (all at PC between LTA and E. nodatum, S. mitis and E. nodatum) (p <0.01). With regard to correlations with the clinical aspects of patients, three significant negative associations (p <0.05) were found between pain to percussion and D. pneumosintes, F. periodonticum and E. corrodens. LPS of S presented a moderate positive correlation with the fistula presence (p = 0.02). The pain to percussion and LTA of the PC had a positive positive correlation (p = 0.035). It was concluded that the microbiota of root canal associated with secondary/persistent infection is heterogeneous, with a similarity among the microbiotas in the 3 sites, with greater detection of LTA than LPS. Associations between the microorganisms present in the saliva, pulp chamber and root canal suggest a possible communication among the sites.
Keywords: Periapical periodontitis, microorganisms, virulence factors, endotoxins,
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Frequência de bactérias detectadas e seus níveis de DNA (1 = <105, 2 = 105, 3 = 105-106, 4 = 106, 5 = >106 [indicados pela legenda]) na saliva de pacientes com insucesso endodôntico e presença de lesão periapical, por meio da técnica de
checkerboard. 60
Figura 2. Frequência de bactérias detectadas e seus níveis de DNA (1 = <105, 2 = 105, 3 = 105-106, 4 = 106, 5 = >106 [indicados pela legenda]) na câmara pulpar do dente de pacientes com insucesso endodôntico e presença de lesão periapical, por
meio da técnica de checkerboard. 61
Figura 3. Frequência de bactérias detectadas e seus níveis de DNA (1 = <105, 2 = 105, 3 = 105-106, 4 = 106, 5 = >106 [indicados pela legenda]) no canal radicular do dente de pacientes com insucesso endodôntico e presença de lesão periapical, por
meio da técnica de checkerboard. 62
Figura 4. Número de espécies por caso de insucesso coletado nos 3 sítios
estudados (saliva, câmara pulpar e canal radicular), investigado pelo checkerboard. 64
Figura 5. Média e desvio-padrão da concentração de LPS em EU/mL das amostras
de saliva, câmara pulpar e canal radicular. 67
Figura 6. Média e desvio-padrão da concentração de LTA em pg/mL das amostras
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Relação das cepas empregadas para o desenvolvimento das sondas de
DNA bacteriano. 48
Tabela 2.Pares de primers reportado na literatura, que foram utilizados na reação
de real-time PCR 50
Tabela 3. Diluição da solução de endotoxina de E. coli para a determinação da
curva padrão 52
Tabela 4. Características clínicas dos pacientes com insucesso do tratamento
endodôntico e presença de lesão periapical. 57
Tabela 5. Quantificação e prevalência de bactérias totais, E. faecalis e
Streptococcus spp., na saliva, câmara pulpar e canais radiculares de dentes com
insucesso do tratamento endodôntico e presença de lesão periapical. 66
Tabela 6. Associações positivas significantes (p<0,05) entre as espécies bacterianas
Gram-negativas e o LPS. 70
Tabela 7. Associações negativas significantes (p<0,05) entre as espécies
bacterianas Gram-negativas e o LPS. 70
Tabela 8. Associações positivas significantes (p<0,05) entre as espécies bacterianas
Gram-positivas e o LTA. 71
Tabela 9. Associações negativas significantes (p<0,05) entre as espécies bacterianas
Gram-positivas e o LTA. 71
Tabela 10. Associações negativas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 19
2 REVISÃO DA LITERATURA 22
2.1 Insucesso endodôntico 22
2.2 Papel da microinfiltração coronária 24
2.3 Microbiota do insucesso endodôntico 27
2.3.1 Enterococcus faecalis 29
2.4 Métodos moleculares de identificação bacteriana 31
2.4.1 Checkerboard DNA-DNA hybridization 32
2.4.2 Real-time PCR 34
2.5 Fatores de virulência 35
2.5.1 Lipopolissacarídeo (LPS) 36
2.5.2 Ácido lipoteicóico (LTA) 38
3 PROPOSIÇÃO 40
4 MATERIAL E MÉTODOS 41
4.1 Autorização para realização da pesquisa 41
4.2 Local da pesquisa 41
4.3 Seleção dos sujeitos da pesquisa 41
4.4 Exame clínico, aspectos clínicos e radiográficos 42
4.5 Procedimentos clínicos 43
4.5.1 Coleta das amostras da saliva 43
4.5.2 Coleta das amostras da câmara pulpar 43
4.5.3 Coleta das amostras do canal radicular 44
4.5.4 Armazenamento das amostras 45
4.5.5 Retratamento endodôntico 45
4.6 Procedimentos laboratoriais 46
4.6.1 Checkerboard DNA-DNA hibridization 46
4.6.1.1 Extração do DNA microbiano 46
4.6.1.2 Aplicação das amostras na membrana de nylon 46
4.6.1.3 Hibridização da membrana com as sondas de DNA 47
4.6.2 Quantificação por meio do real-time PCR 50
4.6.2.1 Primers utilizados 50
4.6.2.2 Extração do DNA 51
4.6.2.3 Reação de real-time PCR 51
4.6.3 Endotoxinas (LPS) - Pyrogent-5000 Kinetic Turbidimetric Teste
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (Lonza, Walkersville, MD, EUA) 51
4.6.3.1 Materiais apirogênicos 51
4.6.3.2 LAL Pyrogent-5000 (Lonza, Walkersville, MD, EUA) 52
4.6.3.3 Procedimentos para execução do teste 53
4.6.3.4 Cálculo da concentração de endotoxinas 53
4.6.4 Ácido Lipoteicóico (LTA) - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 54
4.7 Análise estatística 54
5 RESULTADOS 56
5.1 Perfil dos casos coletados 56
5.2 Composição da microbiota 58
5.2.1 Micro-organismos identificados pelo checkerboard 58
5.2.2 Distribuição da microbiota 63
5.2.3 Quantificação dos micro-organismos pelo real-time PCR 65
5.3 Lipopolissacarídeos e ácido lipoteicóico 67
5.4 Associações da microbiota, LTA, LPS e aspectos clínicos e radiográfico 68 5.4.1 Associações entre a microbiota identificada nos 3 sítos 68 5.4.2 Associações dentro da microbiota identificada em cada sítio 69
5.4.3 Associações entre bactérias Gram-negativas e LPS 69
5.4.4 Associações entre bactérias Gram-positivas e LTA 70
5.4.5 Associações entre os micro-organismos e aspectos clínicos e radiográficos 71 5.4.6 Associações entre o LPS e aspectos clínicos e radiográficos 72 5.4.7 Associações entre o LTA e aspectos clínicos e radiográficos 72
6 DISCUSSÃO 73
6.1 Composição da microbiota da saliva, câmara pulpar e canal radicular 73
6.2 Níveis de lipopolissacarídeos e ácido lipoteicóico 80
6.3 Associações da microbiota, LTA, LPS e aspectos clínicos e radiográficos 81
7 CONCLUSÃO 85
REFERÊNCIAS 87
Apêndice 1 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 103 Apêndice 2 – Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies
bacterianas encontradas na saliva. 106
Apêndice 3 – Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies
bacterianas encontradas na câmara pulpar. 107
Apêndice 4 – Associações negativas significantes (p<0,01) entre as espécies
bacterianas encontradas na câmara pulpar. 110
Apêndice 5 – Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies
bacterianas encontradas no canal radicular. 112
Apêndice 6 – Associações negativas significantes (p<0,01) entre as espécies
bacterianas encontradas no canal radicular. 113
Apêndice 7 – Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado, nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal radicular),
investigadas pelo checkerboard 114
1 INTRODUÇÃO
É reconhecido que os micro-organismos encontrados nos canais radiculares podem ser oriundos da cavidade oral (Gomes et al., 2004; Sedgley et al., 2006). A existência desses micro-organismos e seus produtos no interior dos canais são fatores cruciais no desenvolvimento e manutenção das doenças endodônticas (Kakehashi et al., 1965). Assim, o objetivo de uma terapia endodôntica bem sucedida consiste em alcançar a drástica redução do conteúdo bacteriano intracanal. Todavia, alguns casos podem evidenciar o ressurgimento ou persistência de lesões perirradiculares, o que revela a falha do tratamento anterior (Subramanian e Mickel, 2009).
Embora estudos, como o de Nair (1999), mostrem que fatores não microbianos, como as reações de corpo estranho à substâncias endógenas (cristais de colesterol) e exogênas (extrusão do material obturador), possam estar envolvidos na patologia periapical, inúmeros trabalhos na literatura reportam que a principal causa do insucesso do tratamento endodôntico é a persistência da comunidade bacteriana (Sundqvist et al., 1998; Molander et al., 1998; Pinheiro et al., 2003a; Gomes et al., 2004; Rôças et at., 2004; Gomes et al., 2006; Endo et al., 2013; Barbosa-Ribeiro et al., 2016; Delboni et al., 2017).
Os fatores etiológicos mais comuns que podem levar a infecção endodôntica associada ao insucesso são: controle asséptico inadequado, acesso coronário mal executado, canais radiculares não encontrados, anatomia radicular complexa, instrumentação imprópria, e infiltração da obturação ou da restauração coronária (Ray e Trope 1995; Sundqvist et al., 1998). A microinfiltração por falta do selamento coronário satisfatório promove uma fonte constante de agentes infecciosos da saliva, que podem iniciar e manter a infecção periapical, levando ao insucesso do tratamento endodôntico (Dos Santos et al., 2014; Delboni et al., 2017).
A penetração dos micro-organismos no interior dos canais radiculares devido à microinfiltração coronária poderá trazer como consequência o desenvolvimento ou perpetuação da periodontite apical crônica, sem quaisquer sintomas, ou com sintomas persistentes e exsudação (Siqueira, 1997). Além disso, certos componentes da estrutura bacteriana, conhecidos como fatores de virulência, poderão agir estimulando as respostas inflamatórias e imunológicas (Amersfoort et al., 2003).
A composição da microbiota associada com infecção secundária/persistente é diferente em número e em diversidade de espécies quando comparada à infecção primária.
Bactérias anaeróbias facultativas Gram-positivas são predominantes nesse meio ambiente (Molander et al., 1998; Pinheiro et al, 2003a; Gomes et al., 2005), dentre elas, Enterococcus spp tem sido a mais frequentemente detectada (Hancock et al., 2001; Gomes et al., 2006b; Ozbek et al., 2009a; Wang et al., 2012), assim como Streptococcus spp. (Rôças et al.,2008 e Antunes et al, 2015). Essas espécies possuem maior capacidade de sobreviver ao preparo químico-mecânico, à medicação intracanal e à obturação dos canais radiculares, ou seja, a um meio nutricional restrito, no qual as inter-relações são mínimas (Sundqvist et al., 1998).
Para um melhor entendimento da microbiota presente nos canais radiculares e de seu papel nas infecções periapicais, métodos moleculares de identificação microbiana têm sido amplamente utilizados em pesquisas na área de microbiologia aplicada à odontologia (Munson et al., 2002; Sedgley et al., 2005; Siqueira e Rôças, 2005ab; Gomes et al., 2006ab; Sakamoto et al., 2006; Vianna et al., 2008; Subramanian e Mickel, 2009; Endo et al., 2013). A biologia molecular cultura-independente, apresenta vantagens em relação aos procedimentos de identificação bacteriana baseados em características fenotípicas, em aspectos como: maior sensibilidade e especificidade, e a capacidade de identificar bactérias incultiváveis (Munson et al., 2002; Siqueira e Rôças, 2005ab), gerando resultados relevantes em relação ao conteúdo microbiano.
O checkerboard DNA-DNA hybridization é um tipo de método independente de cultura, proposto por Socransky et al. (1994) que trabalha com a identificação de múltiplas espécies em amostras clínicas a partir do DNA total, levando a maior compreensão do perfil da microbiota associada a infecções endodônticas, de forma rápida e com sensibilidade adequada (Sakamoto et al., 2006). O método é capaz de revelar o número e composição microbiana, fator importante para o entendimento do desenvolvimento e manutenção da doença (Vianna et al., 2008). Outro método molecular é o real-time PCR, uma variação da reação da cadeia de polimerase (PCR). A maior parte dos ensaios de PCR são qualitativos ou semi-quantitativos, com exceção do real-time PCR, que é capaz de identificar microrganismos específicos (Shelburne et al., 2000; Antunes et al., 2015). Tal método envolve a análise dos padrões de amplificação ao longo de um número de ciclos de PCR, utilizando sondas fluorogênicas espectralmente distintas para detectar e quantificar os genes de interesse. Durante os repetitivos ciclos de amplificação, ocorre o aumento da fluorescência que é monitorado e medido pelo aparelho de real-time, sendo proporcional a quantidade do DNA amplificado (Sedgley et al., 2005).
Em relação aos fatores de virulência, o ácido lipoteicóico (LTA) é um componente importante da parede e membrana de bactérias Gram-positivas, grupo mais prevalente dentro da infecção secundária/persistente. O LTA pode ativar e permanecer dentro dos macrófagos por longo tempo, induzir a liberação de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6, e TNF-α (Amersfoort et al., 2003), ativar o sistema complemento (Ginsburg, 2002), e estar envolvido na formação do biofilme e adesão ao dente devido sua ação adsortiva a hidroxiapatita (Fabretti et al., 2006). Todas essas atividades do LTA poderão afetar indiretamente na indução da lesão periapical. Outro fator de virulência intimamente ligado a doença periapical são as endotoxinas (lipopolissacarideos, LPS) presentes na parede celular das bactérias Gram-negativas. Embora a literatura relate a predominância de bactérias Gram-positivas nos insucessos, Gomes et al. (2008) demonstraram que bactérias Gram-negativas também estão presentes na infecção persistente. O LPS tem-se mostrado presente em todos os canais radiculares com infecção endodôntica (Martinho et al., 2014; Marinho et al., 2015). Mesmo em pequena concentração (1 à 50 µg/ml), este pode agir na estimulação da resposta imunológica, com a liberação de citocinas pró-inflamatórias por neutrófilos e monócitos/macrófagos, podendo gerar dor e sintomatologia clínica (Hanazawa et al., 1985; Wilson et al., 1996; Martinho et al., 2010; Gomes et al., 2012).
Dessa forma, este estudo clínico foi conduzido para elucidar a composição da microbiota e os níveis de endotoxinas e ácido lipoteicóico presentes na saliva, câmara pulpar e canal radicular de dentes com infecção secundária/persistente. O trabalho também correlacionou nos três sítios estudados: a comunidade microbiana; o LPS; o LTA; além dos aspectos clínicos e radiográficos, propondo rotas de associação entre a microbiota da cavidade bucal e aquela associada ao insucesso do tratamento endodôntico.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 INSUCESSO ENDODÔNTICO
O objetivo do tratamento endodôntico é prevenir ou tratar a periodontite apical para que o dente possa continuar em função na cavidade oral. A periodontite apical é caracterizada como uma resposta inflamatória à infecção intra ou extra-radicular, representando uma tentativa de defesa do hospedeiro contra a disseminação de bactérias e seus sub-produtos para o osso alveolar e outras partes do organismo (Sundqvist, 1994; Stashenko et al. 1998; Nair, 2004; Siqueira et al., 2014).
A presença de micro-organismos dentro dos canais radiculares foi demonstrada pela primeira vez por Miller em 1890. Kakehashi (1965), em seu afamado trabalho, demonstrou que a periodontite apical apenas desenvolve-se na presença de bactérias.
Desta forma, a eliminação ou redução de bactérias no interior dos canais radiculares é mandatória, visto que a principal causa da lesão periapical pós-tratamento, ou seja, do insucesso do tratamento endodôntico, é a permanência de micro-organismos ou a recontaminação do sistema de canais radiculares. (Siqueira e Rôças, 2008; Endo et al., 2013; Siqueira et al., 2014).
Espera-se que o insucesso seja resultado de uma terapia anterior mal conduzida. Problemas comuns que podem levar ao insucesso endodôntico incluem: controle asséptico inadequado, abertura coronária mal delineada, canais não encontrados, anatomia radicular complexa, instrumentação inadequada, e infiltração das restaurações temporárias e permanentes (Sundqvist e Figdor, 1998). Contudo, Siqueira e colaboradores (2014) em uma revisão da literatura que teve como um de seus objetivos estudar as causas do insucesso, verificou que a periodontite pós-tratamento também pode ser observada em alguns casos de dentes aparentemente bem tratados, isto devido a questões da complexa anatomia radicular, ocorrendo em 5-15% dos casos com lesão periapical pré-operatória. Ainda, Sundqvist e Figdor (1998) afirmam que dois fatores possuem influência negativa no prognóstico do tratamento endodôntico: a presença de infecção no interior dos canais no momento da obturação e o tamanho da lesão periapical.
O insucesso endodôntico pode ser caracterizado como emergente (se desenvolvido após o tratamento), persistente (se persistiu apesar do tratamento) e secundária (se desenvolvido após a cura da patologia inicial). Quanto a sua localização, a infecção usualmente se encontra dentro dos canais radiculares (Möller, 1966; Sundqvist et al., 1998; Molander et al., 1998; Hancock et al., 2001), mas em alguns casos essa pode estender-se externamente aos tecidos radiculares (Tronstad et al., 1990; Siqueira et al., 2014). Fatores não microbianos também foram sugeridos como potencial causa da patologia pós-tratamento, mas as evidências científicas desses casos são pouco relatadas na literatura (Nair et al., 1990; Nair, 1999).
A infecção persistente é composta por bactérias provenientes do primeiro tratamento que não foram eliminadas ou suficientemente controladas. Essas bactérias estão normalmente localizadas em regiões das paredes dos canais radiculares não tocadas pela instrumentação e pelas substâncias químicas auxiliares, ou em áreas de difícil acesso como canais laterais, ramificações apicais, túbulos dentinários e istmos (Fukushima et al. 1990, Ida e Gutmann 1995; Sjögren et al. 1997; Nair et al., 2005; Ricucci et al., 2009; Vera et al., 2012).
A infecção secundária é causada por bactérias que não estavam presentes no canal antes do primeiro tratamento, mas foram introduzidas durante o mesmo devido a falta de atenção às condições assépticas durante os procedimentos (Siren et al.1997), ou devido à falha no selamento coronário após a conclusão do tratamento (Torabinejad et al., 1990; Magura et al., 1991; Ray e Trope, 1995; Cheung 1996; Vieira et al., 2012).
Ainda, para Nair (2004), existem 5 fatores biológicos que contribuem para a persistência da radioluscência periapical após o tratamento dos canais radiculares: 1) a infecção intra-radicular na porção apical do sistema de canais radiculares; 2) infecção extra-radicular, na forma de actinomicose periapical; 3) cistos; 4) reações de corpo estranho à substâncias cristalinas de origem endógena (cristais de colesterol), extrusão do material obturador ou qualquer outro material exógeno; e 5) tecido de cicatrização da lesão. Entretanto, enfatiza que de todos esses fatores, a infecção persistente na porção apical radicular é a principal causa do insucesso endodôntico prevista na literatura (Nair et al., 1990a; Sjögren, 1996; Figdor, 2002). O diagnóstico clínico do insucesso endodôntico é frequentemente caracterizado pela presença de sinais e/ou sintomas de periodontite apical, que pode ter persistido ou surgido pós-tratamento (European Society of Endodontology, 2006; Roças et al., 2008). A decisão sobre o retratamento ou não depende da avaliação da lesão periapical, ou seja, se esta está curando ou não. Quando imagens radiográficas do tratamento prévio estão disponíveis para
comparação, o julgamento pode ser facilitado. Algumas situações em que retratamento é indicado são: 1) presença de obturação incompleta ou defeituosa associada ao desenvolvimento de uma lesão periapical; 2) necessidade de uma nova restauração e a qualidade da obturação anterior não é satisfatória; e 3) dentes que no momento do tratamento anterior não apresentavam lesão e algum tempo depois a exibem. Para dentes com radioluscência apical pré-operatória, o tempo de proservação é um fator importante para a cura. Um acompanhamento de 4 anos é considerado favorável (Sjögren et al., 1998).
Na tentativa de preservar-se o elemento dentário sempre que possível, várias estratégias são sugeridas, entre elas: o retratamento não cirúrgico com ou sem o uso de medicação intracanal, cirurgia parendodôntica ou a extração do elemento dental e substituição por implante. Geralmente o retratamento não cirúrgico é a primeira escolha, visto ser a abordagem menos invasiva (Sjögren et al., 1997; Siqueira, 2001). Os procedimentos clínicos dessa técnica incluem a remoção da obturação original, seguida por nova instrumentação, desinfecção e obturação (Salehrabi e Rotstein, 2010).
2.2 PAPEL DA MICROINFILTRAÇÃO CORONÁRIA
Estudos transversais apontam que os melhores resultados de tratamentos endodônticos são obtidos em dentes com adequadas obturações associado a adequadas restaurações coronárias (Tronstad et al., 2000; Siqueira et al., 2005; Moreno et al., 2013). Sendo assim, o tratamento do dente afetado deve ser considerado como um todo e a adaptação da restauração coronária permanente deve ser feita o quanto antes após o término do tratamento dos canais radiculares (Siqueira et al., 2014).
Pinheiro et al. (2003a) notaram em seu trabalho que a infiltração coronária (por restaurações defeituosas, materiais temporários antigos ou dentes sem selamento) foi detectada em 45 dos 60 dentes retratados e pode ter influenciado os achados microbiológicos. Gomes et al., em 2006, analisando que a maior parte dos dentes incluídos em sua pesquisa apresentavam cáries ou restaurações defeituosas, também relacionaram a infiltração coronária (durante ou após o tratamento) à presença de determinados micro-organismos dentro do sistema de canais.
Tais resultados corroboram com os de Ray e Trope de 1995, que indicaram que a obturação dos canais não é uma barreira adequada contra a infiltração, devendo ser então, o adequado selamento coronário um fator crítico para o sucesso.
Ng et al. (2008), da mesma forma, afirmam que dentes com restaurações satisfatórias tem maior taxa de sucesso e cura significativamente melhor dos tecidos periapicais (10–18%; OR = 1.82), quando comparados a dentes com restaurações de baixa qualidade. Além disso, postulam que quatro fatores são identificados como fortes influenciadores do prognóstico do tratamento endodôntico: a) presença de lesão periapical, b) extensão apical da obturação, c) qualidade da obturação, e d) estado restaurador pós-tratamento. Com base nesses resultados, concluíram que a restauração coronária deve ser considerada a parte final do tratamento de canais radiculares juntamente a obturação, com o intuito de prevenir a reinfecção pós-operatória.
Em 2000, Tronstad e colaboradores observaram que dentes diagnosticados com boa endodontia e boa restauração coronária apresentavam taxas de sucesso de 81%. Já em dentes diagnosticados com boa endodontia e restauração coronária ruim a taxa de sucesso diminuia de 10% à 71%. Essa diferença foi estatisticamente significante e a importância do bom selamento coronário foi também evidenciada nesse estudo.
Uma revisão de 33 trabalhos anteriores à 1994, realizada por Sanders e Sanders, relacionando a falha do tratamento endodôntico à microinfiltração, concluiu que a infiltração deve ser considerada como uma importante causa da falha do tratamento dos canais radiculares.
Por outro lado, em outra revisão da literatura, Siqueira et al. (2014) contrariando o pressuposto de que a infiltração coronária desempenha um papel importante na falha do tratamento, encontraram evidências de que a doença pós-tratamento é causada principalmente por bactérias que persistiram no sistema de canais radiculares após o tratamento inicial. A afirmativa é baseada nas seguintes constatações:
a) Biópsia de espécimes de dentes com doença pós-tratamento geralmente revelam uma infecção bacteriana localizada no terço apical do canal, mas não se estendendo ao longo de todo o comprimento das paredes do canal (Ricucci et al., 2009);
b) Culturas positivas de amostras de canais radiculares tomadas no momento da obturação indicando um problema infeccioso persistente (Sjögren et al., 1997);
c) A incidência de doença pós-tratamento é maior em dentes com periodontite apical pré-operatória do que nos dentes sem lesão. As taxas de falha no tratamento de dentes vitais e necróticos não são iguais (Strindberg, 1956; Chugal et al., 2003; Østavik et al., 2004; Ricucci et al., 2011)
A prevalência de alguns micro-organismos, como Enterococcus faecalis e fungos, foram observadas em diferentes sítios, como a cavidade oral e os canais radiculares, ambientes estreitamente conectados, especialmente na presença de infiltração coronária. Assim, é possível que espécies do canal radicular provenham da cavidade oral, bem como espécies do canal radicular migrem para a cavidade oral (Al-Ahmad et al., 2009, Zhu et al., 2010; Delboni et al., 2017).
A fonte provável de E. faecalis em canais radiculares com insucesso do tratamento endodôntico é a cavidade oral. Wang et al. (2012) notaram que a maior parte das amostras dos canais radiculares que eram positivas para E. faecalis correspondiam a amostras de saliva que também eram positivas para essa bactéria, indicando uma correlação com a presença de espécie nos dois sítios.
Notoriamente, segundo a literatura, E. faecalis não é um colonizador oral comum em cavidades bucais com dentição saudável. Usualmente, enterococos não são detectados na saliva de pessoas dentadas que nunca receberam tratamento endodôntico (Sedgley et al., 2004; Ravazi et al., 2007). Em contraste, um estudo reportou que 75% dos pacientes com tratamento endodôntico, possuíam espécies de enterococos detectáveis na saliva (Gold et al., 1975). Também foi sugerido que pode existir uma associação positiva entre a ocorrência de E. faecalis e o número de visitas clínicas, devido à microinfiltração coronária através da restauração temporária entre sessões do tratamento endodôntico (Siren et al., 1997). A fase de reabilitação do elemento dental tratado é igualmente crítica para recontaminação, pois o uso do material selador temporário por longos períodos pode levar a desadaptação e infiltração do mesmo. Assim, a qualidade da restauração temporária pode ser importante na prevalência da infecção por E. faecalis em canais radiculares (Zehnder et al., 2009).
Zhu et al. (2010), estudando a prevalência, fenótipo e genótipo de E. faecalis, revelaram que não houve diferenças significativas entre a sua prevalência na saliva e nos canais radiculares. Contudo, as cepas encontradas dessa espécie eram diferentes, o que sugere que um único paciente pode ter diferentes cepas de E. faecalis em diferentes nichos da cavidade oral.
Delboni et al. (2017) investigaram a diversidade e similaridade entre os genótipos de E. faecalis isolados de múltiplos sítios orais (saliva, câmara pulpar e canal radicular) associados ao insucesso endodôntico, por meio de duas técnicas de reação em cadeia de polimerase. Em seus resultados, os autores observaram a presença de 7 diferentes genótipos de E. faecalis nas cepas isoladas. Notaram igualmente que em 80% dos pacientes esses mesmos genótipos isolados do canal radicular, também estavam presentes na saliva ou na câmara pulpar.
Dessa forma, concluíram que as cepas de E. faecalis dos 3 sítios estudados são similares pelos métodos aplicados e que a comunicação entre os ambientes orais pela microinfiltração coronária é uma possível causa do insucesso endodôntico.
Em relação aos fungos em casos de insucesso, a associação encontrada por Egan et al. (2001), foi altamente significante (P = 0,021), com uma probabilidade de 13,8 vezes de haver fungos no canais, quando estes também estavam presentes na saliva. Os autores sugerem que tais fungos podem ter invadido os canais radiculares durante o tratamento inicial por infiltração coronária ou pela colonização dos túbulos dentinários.
2.3 MICROBIOTA DO INSUCESSO ENDODÔNTICO
Os micro-organismos capazes de sobreviver no interior de canais já tratados devem ser resistentes às medidas antibacterianas administradas durante a limpeza e medicação e devem sobreviver em um ambiente escasso de nutrientes, onde as relações com outras bactérias são mínimas (Sundqvist et al., 1998).
Com o objetivo de caracterizar-se o perfil microbiológico da infecção secundária/persistente muitos trabalhos foram conduzidos. Pode-se notar que o com o avanço das técnicas de identificação, um número maior de espécies foi relacionado a essa condição patológica. Por muito tempo predominou a utililização de técnicas de cultura para identificação bacteriana, por meio delas acreditava-se que o insucesso era composto por monoinfecções, ou então por uma diversidade bem reduzida de espécies. Em 1998, Sundqvist et al., por meio da coleta microbiológica de 54 dentes previamente tratados e com presença de lesão periapical, revelaram que a microbiota desses dentes era composta por espécies únicas predominantemente Gram-positivas, e que E. faecalis era a bactéria mais comumente isolada. Apenas em um caso, em que a qualidade de tratamento anterior foi considerada ruim por análise radiográfica, a flora foi similar àquela encontrada em canais nunca tratados, contendo um grande número de espécies.
Hancok et al. (2001), encontraram resultados semelhantes ao de Sundqvist et al. (1998), em que mais de um terço de seus casos eram de monoinfecções, com uma média de 1,7 espécies por canal radicular. Ademais, observaram que quando a obturação do tratamento prévio estava a mais de 2 mm do ápice radiográfico, havia um aumento estatisticamente significativo nas chances de se encontrar bactérias intracanal (P<0,5). Canais com uma
qualidade da obturação considerada ruim apresentaram uma carga microbiana maior, provavelmente devido a um ambiente similar ao da necrose pulpar.
Pinheiro e colaboradores, em 2003, recuperaram micro-organismos de 51 dentes com infecção secundária/persistente. Na maioria dos casos, uma ou duas cepas por canal foram encontradas. Das espécies microbianas isoladas, 57,4% eram anaeróbias facultativas e 83,3% Gram-positivas. Enterococcus faecalis foi a espécie mais prevalente. Os anaeróbios obrigatórios representaram 42,6% das espécies e os gêneros mais frequentemente isolados foram Peptostreptococcus, que foi associado a sintomas clínicos (P <0,01). Também foram observadas associações significantes entre: dor ou história de dor e infecções polimicrobianas ou anaeróbias (P <0,05); sensibilidade à percussão e Prevotella intermedia / P. Nigrescens (P <0,05); fístula e Streptococcus spp. (P <0,001) ou Actinomyces spp. (P <0,01); e dentes sem selagem coronária e Streptococcus spp. ou Candida spp. (ambos com P <0,01).
Siqueira e Rôças (2004) utilizaram a técnica de PCR para investigar a ocorrência de várias espécies microbianas em canais radiculares previamente tratados associados a lesões perirradiculares recalcitrantes de pacientes brasileiros e encontraram bactérias anaeróbias fastidiosas, como Pseudoramibacter alactolyticus; Propionibacterium propionicus; Filifactor alocis e Dialister pneumosintes, em valores de prevalência relativamente elevados, independentemente da qualidade da obturação dos canais.
Em um estudo, em que todos os casos examinados estavam mal obturados, as espécies mais freqüentemente detectadas foram Enterococcus faecalis (64%), seguido por Streptococcus spp. (21%) e Tannerella forsythensis (14%) (Rôças et al., 2004).
Quando Rôças e colaboradores (2008) estudaram a composição microbiológica do insucesso endodôntico de 17 dentes em uma população alemã, pela técnica molecular Reverse-capture Checkerboard, identificaram uma microbiota diversificada, contendo: Streptococcus species (47% do casos), Lactobacillus species (35%), Dialister invisus (29%), Eubacterium infirmum (29%), Prevotella intermedia (29%), Selenomonas sputigena (29%), Synergistes oral clone BA121 (29%), e Treponema denticola (29%). E. faecalis (47%) e C. albicans (6%) também foram identificados por PCR espécie-especifico. Contrariando as pesquisas anteriores, a maior parte dos casos tiveram uma infecção mista, e E. faecalis, quando presente, não foi a espécie mais dominante.
Com o objetivo de caracterizar e determinar a frequência da colonização bacteriana em lesões periapicais e porções apicais de raízes submetidas a apicectomia,
Subramanian e Mickel (2009) coletaram, durante cirurgias parendodônticas, amostras do tecido perirradicular e da porção radicular ressectada e encontraram diversos gêneros como, Lactobacillus, Propionibacterium, Neisseria, Selenomonas, Abiotrophia e Bifidobacterium que apresentavam uma associação significativa maior com a porção apical da raiz do que com a lesão. Estas bactérias podem ter estado presentes como um biofilme na superfície externa da raiz ou encontradas na porção apical do canal radicular.
A análise do conteúdo bacteriano dos canais radiculares provenientes do insucesso, por métodos moleculares como o PCR, tem permitido a detecção de algumas espécies bacterianas Gram-negativas de difícil cultivo, como Fusobacterium spp., Porphyromonas spp., Prevotella spp., Tannerella spp. e Treponema spp, além de revelar um perfil heterogêneo da infecção polimicrobiana (Endo et al., 2013).
Outro estudo, utilizando análises moleculares, em consonância com os anteriores mostra que comunidades bacterianas mistas ocorreram na maioria das amostras, onde as espécies de Streptococcus, membros do filo Actinobacteria e P. alactolyticus foram mais prevalentes e dominavam as comunidades bacterianas apicais em muitos casos (Antunes et al., 2015).
2.3.1 Enterococcus faecalis
Independente da técnica de identificação utilizada (dependentes ou independentes de cultura), E. faecalis, uma espécie Gram-positiva facultativa anaeróbia, é um dos micro-organismos mais detectados em casos de retratamento (Sundqvist et al., 1998;; Rôças et al., 2004; Siqueira e Roças, 2004; Willians et al., 2006; Ozbek et al., 2009a; Subramanian e Mickel, 2009; Barbosa-Ribeiro et al., 2016), sendo capazes de suportar condições severas de sobrevida no canal radicular com grande variação de pH, temperatura e tensão de O2 (Gomes et al., 2008; Baik et al., 2011; Lee e Baek 2012). Quando expostas ao estresse ambiental, algumas cepas podem adotar um estado viável mas não cultivável e ressuscitar quando as condições normais são restabelecidas (Lleò et al., 2001). E. faecalis pode sobreviver à prolongados períodos com quantidades ínfimas de nutrientes (Figdor et al., 2003). Ademais ele pode crescer em mono-cultura em canais radiculares já preenchidos na ausência de suporte sinérgico de outra bactéria (Fabricius et al., 1982).
Antunes e colaboradores (2015), notaram que a prevalência de E. faecalis, em suas coletas de casos de insucesso, não foram tão pronunciadas (14%). Isso pode estar diretamente relacionado com a qualidade do tratamento endodôntico e do selamento coronário, que foram considerados adequados. Outro motivo pode ser as condições bacteriológicas do canal radicular como um todo, já que este estudo foi restrito apenas a porção apical do sistema de canais. Em dois casos em que E. faecalis foi detectado, ele era altamente dominante, correspondendo a mais de 98% da população total de bactérias. Kaufman et al., (2005); Zoletti et al., (2006) e Roças et al., (2008), também encontraram uma baixa prevalência dessa bactéria em canais radiculares previamente tratados, o que questiona a acepção corrente de que E. faecalis é a espécie mais importante envolvida em insucessos do tratamento endodôntico
Já nas infecções primárias, a prevalência de E. faecalis é baixa, o que pode ser explicado pelas interações negativas ocorrendo na microbiota no canal radicular, isto é, outras espécies podem inibir o seu crescimento (Sundqvist, 1992). Ainda, existe a possibilidade de que, durante a preparação químico-mecânica, as espécies bacterianas anaeróbias mais prevalentes sejam mais susceptíveis a serem eliminadas do que E. faecalis, demonstrando ser resistente aos procedimentos e também aos medicamentos antimicrobianos intracanais, incluindo o hidróxido de cálcio (Byström et al., 1958; Gomes et al., 1996). Várias maneiras pelas quais E. faecalis sobrevive a ambientes extremamente alcalinos, foram reportadas, como: a) à sua capacidade de regular o pH interno com uma eficiente bomba de prótons (Evans et al., 2002); b) pelo efeito tampão da dentina, fazendo com que o alto pH não consiga alcançar os túbulos dentinários (Haapasalo et al., 2000); e c) pela síntese de genes de transcrição e proteínas de resposta ao estresse alcalino (Flahaut et al., 1997; Appelbe e Sedgley et al., 2007).
Vários mecanismos de sobrevivência de E. faecalis estão descritos na literatura, como sua capacidade de: aderir e infiltrar células epiteliais (Guzman et al., 1989; Mohamed et al., 2004) e formar biofilmes persistentes associados a infecção refratária (Kishen et al., 2006). Subramanian e Mickel (2009) reforçaram tais achados, afirmando que E. faecalis pode contribuir na persistência das infecções periapicais tanto pela formação de biofilmes, assim como pela adesão e invasão de tecidos moles como a lesão periapical.
Para Rôças et al. (2004), a ocorrência frequente de E. faecalis em casos de insucesso do tratamento endodôntico prévio, sugere que essa espécie pode ter um papel relevante na etiologia das lesões periapicais persistentes. Contudo, também questionam se esse micro-organismo é o principal patógeno associado ao insucesso ou apenas um sobrevivente,
que apresenta vantagem por sua habilidade de resistir às condições adversas dentro dos canais radiculares obturados.
Estudos mostram que o papel como agente patogênico de E. faecalis deve ser considerado, uma vez que esse possui diversos fatores de virulência, como: substâncias de agregação, proteínas de superfície enterocócica, gelatinase, hialuronidade, citolisina tóxica, produção de superóxido extracelular, ácido lipoteicóico e determinante de resistência a antibióticos (Schleifer e Klipper-Balz, 1984; Portenier et al., 2003). Cada um deles pode estar associado com vários estádios da infecção endodôntica, bem como da inflamação periapical. Enquanto alguns produtos de E. faecalis podem estar diretamente ligados à danos nos tecidos perirradiculares, uma grande parte destes é provavelmente mediada pela resposta do hospedeiro à bactéria e aos seus produtos (Kayaoglu et al., 2004). Entre os fatores de virulência, o LTA, localizado na parede celular de bactérias Gram-positivas, é o primeiro a ter contato com as células hospedeiras e iniciar uma resposta inflamatória (Baik et al., 2008).
Além possuir esses fatores de virulência, E. faecalis também é capaz de dividi-los com outras espécies para posterior contribuição em sua sobrevivência e capacidade de causar infecção (Jett et al., 1994). Roças et al., (2004b) afirmam que sua capacidade de sobreviver e persistir como um patógeno nos canais radiculares faz deste seu principal fator de virulência.
2.4 MÉTODOS MOLECULARES DE IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
Técnicas dependentes de cultura têm sido tradicionalmente utilizadas na identificação da microbiota associada a infecções endodônticas (Sundqvist et al., 1998; Molander et al., 1998; Hancock et al., 2001; Pinheiro et al., 2003; Gomes et al., 2004; Salehrabi e Rotstein, 2010). Contudo, procedimentos baseados na identificação fenotípica têm algumas desvantagens que podem resultar na subestimação dos micro-organismos que vivem em determinado sistema (Siqueira e Rôças; 2003). Além disso, é difícil simular as condições ambientais necessárias para o cultivo de micro-organismos fastidiosos.
Subramanian et al., em 2009, notaram, através da análise de suas amostras pela clonagem e sequenciamento do gene 16S, que a maior parte das espécies detectadas foram organismos ainda não cultivados, sugerindo que além dos patógenos previamente conhecidos, várias bactérias ainda desconhecidas e não cultivadas podem ter um papel na patogênese da doença perirradicular.
Os métodos moleculares, utilizados para diagnóstico, permitiram a detecção de algumas espécies cultiváveis em dentes com insucesso do tratamento endodôntico em valores de prevalência maiores do que nunca relatado por estudos de cultura. A detecção de espécies cultiváveis em frequências mais elevadas por métodos moleculares pode ser explicada com base na maior sensibilidade dos métodos quando comparados à cultura, ou mesmo pelo fato de nem todas as cepas dentro de uma espécie poderem ser cultivadas. Além de detectar algumas espécies cultiváveis em maior prevalência, os métodos moleculares também expandiram a lista de patógenos putativos envolvidos com falhas de tratamento, incluindo algumas espécies fastidiosas ou mesmo micro-organismos ainda não cultivados, como archea, que nunca fora previamente isolada de canais tratados. (Siqueira e Rôças, 2005ab).
Em 2002, Munson e colaboradores, utilizaram o sequenciamento de DNA para identificar micro-organismos presentes em suas amostras e perceberam que a microbiota associada a infecções endodônticas é muito mais diversa do que foi mostrado anteriormente por estudos dependentes de cultura. O número médio de táxons recuperados de cada amostra foi de 20,2 combinando análises culturais e moleculares, e 12,6 por cultura isoladamente. Estudos anteriores têm recuperado de 1 a 12 taxa por amostra utilizando métodos de cultura (Sundqvist, 1992).
Muitos avanços no diagnóstico molecular microbiano com métodos como o checkerboard DNA-DNA hybridization, bem como a tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) e seus derivados tem permitido uma maior detecção de microrganismos na cavidade oral e nos canais radiculares (Siqueira e Rôças, 2005a).
2.4.1 Checkerboard DNA-DNA hybridization
Socransky et al. (1994) introduziram um método para hibridizar um grande número de amostras de DNA contra um grande número de sondas de oligonucleótidos baseadas em DNA genômico inteiro, marcado com digoxigenina ou 16S rDNA numa membrana de suporte única. O DNA desnaturado de amostras clínicas é colocado em pistas numa membrana de nylon utilizando um dispositivo chamado Minislot 30® (Immunetics, Cambridge, MA - USA). Após a fixação das amostras à membrana, ela é colocada num Miniblotter 45® (Immunetics, Cambridge, MA - USA) com as pistas de amostras a 90° das pistas do dispositivo. As sondas de DNA genômico completo marcadas com digoxigenina são então carregadas em
pistas individuais do Miniblotter. Após hibridação, as membranas são lavadas e as sondas de DNA são detectadas utilizando anti-corpo para digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina e detecção de quimioluminescência. O método de checkerboard permite a determinação simultânea da presença de uma multiplicidade de espécies bacterianas em amostras clínicas únicas ou múltiplas.
A técnica de checkerboard oferece uma série de vantagens para o estudo de múltiplas espécies de bactérias em grande número de amostras contendo misturas complexas de micro-organismos, visto que essa técnica é rápida, sensível e relativamente barata. Ademais, supera muitas das limitações das técnicas de cultura, incluindo a perda de viabilidade dos organismos durante o transporte e o problema da recuperação de espécies difíceis de cultivar (ou mesmo incultiváveis). Finalmente, a técnica fornece dados semi-quantitativos que podem ser importantes para estudos de tratamento de infecções por biofilme, onde os níveis e proporções das espécies podem ser acentuadamente diminuídos, mas as espécies não eliminadas. O checkerboard tem, contudo, limitações, pois detecta apenas espécies para as quais foram preparadas sondas de DNA. Assim, novos agentes patogênicos ou espécies ambientalmente importantes que possam ser detectadas em cultura ou por outras técnicas moleculares não serão detectados por este método (Socransky et al., 2004).
Esse método foi empregado na caracterização da microbiota da infecção primária por Martinho et al., (2014) que observaram a prevalência de bactérias como Parvimonas micra (16/21, 76%), Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum (15/21, 71%), e Porphyromonas endodontalis (14/21, 66%). Vianna et al., (2008), que também estudaram casos de necrose pulpar, encontraram, pelo checkerboard, frequência de Fusobacterium nucleatum sp. polymorphum, Treponema socranskii, Parvimonas micra e Enterococcus faecalis, em suas amostras iniciais. Após os procedimentos de modelagem e limpeza dos canais radiculares, um total de 8 diferentes espécies, foram identificadas.
Na infecção secundária, Rôças e colaboradores (2008), verificaram que um número médio de cinco espécies estava presente por canal, com cinco casos apresentando 10 ou mais espécies. As vantagens são que métodos moleculares ajudam a explicar porquê bactérias foram detectadas em todos os casos tratados com doença pós-tratamento neste e em outros trabalhos (Rôças et al., 2004; Siqueira e Rôças, 2004), enquanto estudos dependentes de cultura encontraram bactérias em 44% à 85% dos casos (Sundqvist et al., 1998; Molander et al., 1998; Pinheiro et al., 2003).
2.4.2 Real-time PCR
Um dos métodos moleculares de identificação bacteriana mais usado é a reação em cadeia da polimerase (PCR) e suas variações. O PCR é um método para a amplificação de segmentos específicos de DNA ou cDNA transcritos reversamente do RNA. Muitas modificações do procedimento padrão de PCR foram desenvolvidas, como: nested-PCR, PCR de transcriptase reversa, multiplex PCR, e o real-time PCR. Destes a maior parte é qualitativo ou semi-quantitativo, com uma exceção para o real-time PCR que permite a quantificação de bactérias totais e espécies alvos (Diss, 2003; Ozbek et al., 2009b).
O real-time PCR permite a identificação e quantificação de bactérias cultiváveis e incultiváveis com alta especificidade e sensibilidade (Siqueira e Rôças, 2005). O método funciona por meio da análise de padrões de amplificação mostrados em tempo real, ou seja, a cada ciclo do PCR o aumento de um sinal fluorescente (threshold cycle, CT) pode ser determinado e é proporcional ao montante de DNA amplificado (Bustin 2002; Sedgley et al., 2005). Essa variação do PCR apresenta vantagens sobre as técnicas dependentes de cultura e sobre o PCR convencional, visto que: são mais rápidos; elucidam bactérias incultiváveis; tem a habilidade tanto de identificar quanto de quantificar produtos do PCR; eliminam a etapa da eletroforese em gel de agarose; e limitam a contaminação dos ácidos nucléicos, pois não há manipulação pós-amplificação (Raoult et al., 2004).
Em um estudo de Sedgley e colaboradores (2006), foi comparada a habilidade dos métodos de cultura e real-time PCR na detecção e quantificação de E. faecalis em amostras de canais radiculares provenientes de infecções primárias e secundárias. A espécie foi detectada em 10,2% e 79,5% das amostras pela cultura e por real-time PCR, respectivamente, sendo a espécie foi mais prevalente nas coletas de retratamento.
Rôças e Siqueira (2012), utilizaram checkerboard e real-time para avaliar a microbiota de 42 dentes submetidos ao retratamento endodôntico. Encontraram que Propionibacterium spp, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus spp, e Pseudoramibacter alactolyticus foram as espécies mais relevantes identificadas pelo checkerboard. Por PCR quantitativo detectaram E. faecalis e Streptococcus spp. em 38% e 41% dos casos, compreendendo 9,76% e 65,78% da contagem total de bactérias, que teve média de 3,2 x 105 por canal radicular.
Da mesma forma, estudando infecções secundárias, Antunes et al. (2015) verificaram por real-time PCR, em 27 amostras da porção apical de canais radiculares removidas durante cirurgia parendodôntica, que 21 dentes foram positivos para bactérias. Além disso das 7 espécies estudadas, Streptococcus spp. foi a mais prevalente (76%). Com relação a quantificação das células bacterianas, a média de bactérias totais foi de 5,7 x 104 por porção apical da raiz. Streptococcus spp. compreendeu de 0.02%–99.9% do total de bactérias, enquanto E. faecalis de 9%–99.8%, porém estando presente em apenas 3/21 casos.
Além de identificar e quantificar micro-organismos, é possível por essa metodologia avaliar a redução microbiana após as etapas do tratamento endodôntico. Nesse sentido, Sakamoto et al. (2007) em infecções primárias, observaram que após a instrumentação com NaOCl como irrigante e depois de uso de medicação intracanal de hidróxido de cálcio, os níveis de bactérias foram reduzidos em 99.67% e 99.85%, respectivamente, em relação as amostras iniciais.
Blome et al. (2008) estudaram a redução de bactérias após instrumentação e uso de medicação intracanal em infecções primárias e secundárias e com seus resultados notaram que a média de bactérias da infecção primária na amostra inicial foi de 4,6 x 107, sendo reduzida para 3,6 x 104 após a instrumentação e para 6,9 x 104 após o uso de medicação intracanal, enquanto na infecção secundária os valores correspondentes foram: 2,1 x 106, 3,6 x 104 e 1,4 x 105.
2.5 FATORES DE VIRULÊNCIA
Os fatores de virulência bacterianos compreendem componentes estruturais celulares e produtos liberados. Diferentes fatores de virulência geralmente agem em combinação, em vários estágios da infecção, e um único fator pode ter várias funções em estágios diferentes. Fatores de virulência estão envolvidos em cada etapa do processo infeccioso (agregação, invasão, sobrevivência e dano) (Siqueira e Rôças, 2007).
Os micro-organismos desempenham um papel fundamental na patogênese da periodontite apical, em grande parte em função dos seus fatores de virulência presentes na parede celular (Manzur et al., 2007). Dentre eles o LPS, encontrado no envelope celular de bactérias Gram-negativas, é o mais importante, e está envolvido no desenvolvimento da
inflamação periapical, ativando células do sistema imune e levando a liberação de uma variedade de mediadores pró-inflamatórios (Pitts et al., 1982; Hong et al., 2004; Martinho et al., 2010; Gomes et al., 2012; Herrera et al., 2015).
Além dele, outros fatores encontrados em bactérias Gram-postivas devem ser investigados na doença periapical refratária. Enterococcus faecalis, por exemplo, contém vários fatores de virulência, tais como ácido lipoteicóico (LTA), peptidoglicano, substância de agregação, citolisina e enzimas líticas (Kayaoglu e Ørstavik, 2004, Barbosa-Ribeiro et al., 2016).
2.5.1 Lipopolissacarídeo (LPS)
Os lipopolissacarídeos, também conhecidos como endotoxinas, constituem uma parte da parede celular das bactérias Gram-negativas. Eles são liberados no processo de desintegração da parede, depois da morte da célula, assim como durante sua multiplicação e crescimento. Dentre as funções do LPS temos a ativação de macrófagos na produção de diversos mediadores moleculares, como o fator de necrose tumoral (TNF-α) e interleucinas (IL) (Nair, 2004). Tais medidores inflamatórios por sua vez, ativam os leucócitos inflamatórios, modificam a permeabilidade vascular e induzem a reabsorção óssea (Artese et al., 1991; Matsuo et al., 1992; Hong et al., 2004; Martinho et al., 2010b; Graves et al., 2011).
A presença de LPS tem sido reportada dentro do sistema de canais radiculares (Martinho et al., 2008, 2010ab, 2014; Gomes et al., 2012; Herrera et al., 2014; Marinho et al., 2015). Os micro-organismos multiplicam-se e morrem nos canais radiculares, liberando LPS que egressa para a região periapical, onde eles iniciam e mantém a periodontite apical (Nair, 2004). Além disso, níveis elevados de endotoxinas estão relacionados à sintomatologia clínica (Martinho et al., 2008).
Martinho e colaboradores, em 2014, encontraram endotoxinas em 100% (média de 7,49 pg/mL) dos canais radiculares de dentes com infecção primária investigados. Os autores igualmente observaram que os altos níveis de LPS estavam relacionados com o aumento na produção de IL-6 e IL-10 por macrófagos, assim como com o tamanho da lesão periapical do dente afetado. Esses resultados indicaram que as citosinas estudadas e a destruição óssea parecem ser diretamente estimuladas por moléculas de endotoxinas.
