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UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO
RIO GRANDE DO SUL
DEPARTAMENTO DE ESTUDOS AGRÁRIOS
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR
SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
GRADUAÇÃO
Patrícia Carvalho Gindri
Ijuí, RS, Brasil
2016
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RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR
SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
Patrícia Carvalho Gindri
Relatório do Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária,
Área de Clínica e Reprodução de Grandes Animais, apresentado ao
Curso de Medicina Veterinária, da Universidade Regional do Noroeste
do Estado do Rio Grande do Sul (UNIJUÍ, RS), como
requisito parcial para obtenção do grau de
Médica Veterinária.
Orientadora: Profª Med. Vet. MSc. Luciane Ribeiro Viana Martins
Supervisora: Med. Vet. Dra. Ligia Margareth Cantarelli Pegoraro
Ijuí, RS, Brasil
2016
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Universidade Regional do Noroeste do Estado do
Rio Grande do Sul
Departamento de Estudos Agrários
Curso de Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova o
RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR
SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
elaborado por
Patrícia Carvalho Gindri
como requisito parcial para obtenção do grau de
Médica Veterinária
COMISSÃO EXAMINADORA:
____________________________________________________ Luciane Ribeiro Viana Martins, MSc. (UNIJUÍ)
(Orientadora)
____________________________________________________ Roberta Carneiro da Fontoura Pereira, Dra. (UNIJUÍ)
(Banca)
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AGRADECIMENTOS
Ao criador por me dar a capacidade de aprender e evoluir a cada dia.
A meu pai, Amir, que me fez criar gosto pela lida da pecuária desde pequena, e que mesmo com dificuldades não mediu esforços para que chegasse até aqui.
A minha mãe, Tânia, e minha irmã Érica, que nas horas de desespero não me deixaram desistir nunca, e que sempre estiveram do meu lado e me deram forças pra alcançar meus objetivos.
Quero agradecer também aos meus familiares que mesmo distantes, sempre estiveram torcendo por mim.
Devo a minha gratidão também aos meus amigos, os distantes e os que encontrei nesta longa caminhada da graduação e morada de Ijuí.
Agradeço de coração a professora Denize Fraga que me fez criar gosto na pesquisa e sempre acreditou na minha capacidade, e não me fez por vez desistir, ao pessoal do Grupo de Pesquisa Saúde Animal, que me proporcionaram ao longo desta caminhada, muitas trocas de conhecimentos, e alegrias.
Ao Irder que me proporcionou a estrutura para as aulas práticas, as quais foram fundamentais durante a minha escolha de gosto para a formação acadêmica.
Aos professores da UNIJUI pelos conhecimentos, e ensinamentos durante a vida acadêmica. Em especial a professora Luciane Viana que me orientou durante o estágio, sempre com muita paciência e alegria.
A Embrapa Clima Temperado e toda a equipe do laboratório de reprodução que me auxiliaram, e me mantiveram calma nas horas de ansiedade, e torceram para que eu chegasse até aqui.
A Dra. Lígia Margareth Cantarelli Pegoraro pela compreensão, oportunidades e conhecimentos transmitidos durante o estágio, que de forma alegre e constante me despertou a curiosidade pelo diferencial.
As mestrandas do Laboratório, Bruna Mion e Letícia Collares, pelo conhecimento e experiências trocadas, e pela amizade que levarei para sempre.
Por fim, serei eternamente grata de alguma forma por aqueles que contribuíram para realização deste sonho e que torceram por esta realização.
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“Sei que meus ensinamentos não se encerram por aqui, a única coisa que realmente sei é que ainda tenho muito que aprender”.
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RESUMO
Relatório do Estágio Curricular Supervisionado
Curso de Medicina Veterinária
Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul
RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM
MEDICINA VETERINÁRIA – ÁREA DE CLÍNICA E
REPRODUÇÃO DE GRANDES ANIMAIS
AUTORA: PATRÍCIA CARVALHO GINDRI
ORIENTADORA: LUCIANE RIBEIRO VIANA MARTINS Data e Local da Defesa: Ijuí, 02 de julho de 2016.
O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária foi realizado na área de Reprodução de Grandes Animais, no Laboratório de Reprodução da Embrapa Clima Temperado, que está localizado na cidade de Pelotas – Rio Grande do Sul, durante o período de 01 de março a 05 de abril de 2016, contabilizando um total de 150 horas. O estágio ocorreu sob supervisão interna da Dra. e Pesquisadora da Embrapa Clima Temperado Ligia Margareth Cantarelli Pegoraro e com orientação da professora Mestre em Medicina Veterinária Luciane Ribeiro Viana Martins. A realização do estágio teve como principal objetivo aplicar os conhecimentos teóricos obtidos durante a graduação, permitindo uma visão mais ampla sobre a prática envolvendo a reprodução animal e biotécnicas como a Produção in vitro de embriões. As atividades que foram desenvolvidas durante o estágio serão apresentadas em forma de tabelas onde estão especificadas de acordo com as atividades laboratoriais e complementares, bem como as práticas envolvendo a Reprodução Animal. No decorrer do relatório será descrita a técnica de Produção in
vitro de embriões (PIV) que foi selecionada para a discussão e revisão bibliográfica.
O estágio curricular obrigatório supervisionado me proporcionou o contato profissional, a troca de conhecimentos entre acadêmicos, mestrandos e supervisor, bem como a vivência da realidade encontrada na reprodução animal, e o conhecimento de novas biotecnologias e a troca de experiências.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estação Experimental Terras Baixas, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul... 11 Figura 2 – Laboratório de Reprodução Animal da Embrapa Clima
Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul... 11 Figura 3 – Punção folicular realizada durante o Estágio de Reprodução
Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil... 17 Figura 4 – Seleção dos oócitos realizada durante o Estágio no Laboratório
de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul... 18 Figura 5 – Lavagem dos oócitos em gotas de meio de maturação, realizada
durante o Estágio no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul... 18 Figura 6 – Estufa de cultivo de embriões do Laboratório de Reprodução
Animal, Embrapa Clima Temperatura, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil... 19 Figura 7 – Avaliação da concentração espermática por câmara de
Neubauer no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul... 21 Figura 8 – Transferência de prováveis zigotos para a placa Nunc®,
realizado no laboratório de Reprodução da Embrapa, Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul... 21 Figura 9 – Avaliação da clivagem de embrião bovino, realizada no
Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil... 22 Figura 10 – Avaliação de embriões bovinos produzidos no Laboratório de
Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul... 23
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Atividades laboratoriais desenvolvidas durante o Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 01 de março a 05 de abril de 2016... 12 Tabela 2 – Atividades Clínicas Reprodutivas desenvolvidas a campo
durante o Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 01 de março a 05 de abril de 2016... 13 Tabela 3 – Atividades complementares desenvolvidas durante o Estágio
Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 01 de março a 05 de abril de 2016... 13
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LISTA DE ANEXOS
Anexo A – Certificado do Curso de Ultrassonografia em bovinos realizado durante período de Estágio Supervisionado em Medicina Veterinária... 34 Anexo B – Atestado de conclusão de estágio... 35 Anexo C – Fontes de aquisição... 36
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 10
2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ... 12
3 PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES ... 15
4 CONCLUSÃO ... 30
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 31
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1 INTRODUÇÃO
O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária foi realizado no período de 01 de março á 01 de abril de 2016, totalizando uma carga horária de 150 horas. Foi realizado em Pelotas, na Embrapa Clima Temperado na área de Reprodução e Clínica Animal, tendo como supervisora a pesquisadora da Embrapa, Dra. Lígia Margareth Cantarelli Pegoraro, e como orientadora a professora da Unijuí, Msc. Luciane Ribeiro Viana Martins.
A Embrapa Clima Temperado (Figura 1) está localizada na BR 392, km 78, em Pelotas, Rio Grande do Sul. O Laboratório de Reprodução Animal (Figura 2) está localizado na subunidade da Embrapa Estação Experimental Terras Baixas (ETB), no município de Capão do Leão/RS. O setor de reprodução animal da ETB desenvolve experimentos na área de biotecnologia da reprodução e é constituído de um Laboratório e da área de campo. O Laboratório de Reprodução é dividido em recepção (escritório), sala de procedimentos laboratoriais, e sala de cultivo. A área de campo é constituída pela Unidade de Melhoramento Genético (UMG), onde estão alocados carneiros e ovelhas, e pela unidade de manejo Reprodutivo, onde permanecem as vacas, para a realização dos experimentos in vivo.
As principais atividades desenvolvidas no Laboratório são pesquisas relacionadas á produção in vitro de embriões, criopreservação de gametas e fisiologia reprodutiva. A equipe de trabalho de funcionários é constituída por um laboratorista com formação em Técnico em Química, duas estudantes de pós-graduação (mestrado), com formação em Medicina Veterinária, um estudante de pós-graduação (doutorado), com formação em Zootecnia e uma estudante da graduação, do curso de Biotecnologia.
O estágio curricular supervisionado em Medicina Veterinária proporcionou aprimorar meus conhecimentos na área de Reprodução Animal, bem como estudar, e conhecer novas áreas dentro da Reprodução e o domínio da própria postura profissional.
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Figura 1 – Estação Experimental Terras Baixas, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul
Figura 2 – Laboratório de Reprodução Animal da Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul
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2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
Durante o estágio curricular supervisionado em Medicina Veterinária, dentre as atividades desenvolvidas foram acompanhadas a produção in vitro de embriões bovinos e ovinos, que envolve todo o processo de maturação in vitro, bem como a fertilização in vitro, cultivo in vitro, e desenvolvimento embrionário. As atividades realizadas nas etapas de produção in vitro de embriões e a manutenção do laboratório, tais como a limpeza e esterilização de materiais na técnica de PIV estão descritos na tabela 1.
Tabela 1 – Atividades laboratoriais desenvolvidas durante o Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 01 de março a 05 de abril de 2016
Atividades Desenvolvidas Número de Rotinas %
Atividades complementares de laboratório 25 32,46 Preparação de solução salina para
transporte de ovários de bovinos e ovinos
7 9,09
Preparação de meio de maturação bovino 1 1,29
Maturação in vitro de oócitos bovino 5 6,49
Preparação de meio de fecundação bovino 1 1,29
Fecundação in vitro de oócitos bovino 5 6,49
Preparação de meio de cultivo bovino 1 1,29
Cultivo in vitro de bovinos 5 6,49
Avaliação de Clivagem embrião bovino 5 6,49
Avaliação de desenvolvimento embrionário bovino
5 6,49
Feeding 7 9,09
Congelamento de embriões bovinos 5 6,29
Aspiração folicular in vitro de ovinos 1 1,29
Maturação in vitro de oócitos de ovinos 1 1,29
Fecundação in vitro de oócitos ovinos 1 1,29
Avaliação de clivagem embrião ovino 1 1,29
Avaliação do desenvolvimento embrionário Ovino
1 1,29
Total 77 100
As atividades desenvolvidas na área clínica com enfoque em manejos reprodutivos serão descritos na tabela 2.
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Tabela 2 – Atividades Clínicas Reprodutivas desenvolvidas a campo durante o Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 01 de março a 05 de abril de 2016
Atividades/campo Número %
Diagnóstico de gestação em bovinos 91 41,93
Coleta de sêmen ovino 4 1,84
Hidrometra 2 1
Diagnóstico de gestação em ovinos 24 11,05
Protocolo de sincronização em ovinos 19 8,75
Coleta de sangue ovino 16 7,37
Observação de cio ovino 20 9,21
Inseminação em ovino 1 0,46
Avaliação de escore de condição corporal em bovinos 25 11,52 Monitoramento de monta natural em ovinos 15 6,91
Total 217 100
As atividades complementares que envolvem as reuniões, dias de campo, e cursos serão descritos na tabela 3.
Tabela 3 – Atividades complementares desenvolvidas durante o Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 01 de março a 05 de abril de 2016
Atividades complementares Número %
Curso de Ultrassonografia 1 11,11
Participação como ouvinte em defesa de mestrado 1 11,11 Participação em reunião de projetos em andamento 3 33,33
Participação em reunião dos estagiários 1 11,11
Dia de campo 3 33,33
Total 9 100
Durante a presença no laboratório de reprodução Animal/Embrapa foi acompanhado o desenvolvimento de um projeto de pesquisa intitulado “Efeito da suplementação com diferentes soros no meio de maturação in vitro sobre a taxa de clivagem e desenvolvimento embrionário inicial”, este experimento faz parte de um projeto de mestrado da aluna Leticia Franco Collares, do curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da UFPel.
A limpeza e esterilização de materiais no laboratório seguiam as normas básicas de seguranças sendo que a limpeza dos materiais deveria ser procedida de acordo com sua categoria. O material utilizado na produção de embriões deveria ser
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cuidadosamente limpo para evitar contaminações por microrganismos e a presença de material tóxico, que poderiam prejudicar no desenvolvimento embrionário.
Para a permanência no laboratório era preconizado o uso de avental, sandálias crocs e as mãos deveriam ser lavadas com sabonete desinfetante. Na sala de cultivo dos embriões usava-se um avental especifico para a área de cultivo, touca e máscara cirúrgica e para trabalhar no fluxo laminar era recomendado o uso de solução antisséptica nas mãos. O material usado na produção in vitro dos embriões era esterilizado e preparado anteriormente juntamente com a limpeza das bancadas da sala de cultivo com álcool 70%. A limpeza do chão da sala de cultivo era realizada com desinfetante LETAH MAX® a cada sete dias.
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3 PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES
Patrícia Carvalho Gindri; Luciane Ribeiro Viana Martins
Introdução
O avanço da agricultura, a valorização da terra, o aumento no valor pago pela produção de grãos e a redução de áreas para outras atividades tem levado a uma crescente exigência de eficiência econômica na pecuária brasileira (GUIMARÃES JUNIOR et al., 2008). Uma ferramenta pra incrementar eficiência é a utilização de biotécnicas reprodutivas como a inseminação artificial, criopreservação de embriões, superovulação e transferência de embriões, bem como a recuperação de oócitos e a fecundação in vitro, técnicas que também promovem o desenvolvimento científico, tornando o Brasil uma referência na produção in vitro de embriões (VIEIRA, 2012). A produção in vitro (PIV) está sendo gradualmente integrada nos programas de melhoramento genético, como uma ferramenta complementar á inseminação artificial e a transferência de embriões (RUMPF, 2007).
Com o desenvolvimento da PIV, ocorreu um grande avanço na otimização e multiplicação de fêmeas não só para a produção, mas também para a conservação e regeneração de espécies em perigo de extinção (RUMPF, 2007). A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia utilizada como alternativa para acelerar a produção de animais geneticamente superiores. Além disso, a técnica em bovinos é utilizada para evitar o descarte de fêmeas de alto valor genético portadoras de alterações adquiridas, ou alterações que impeçam que a reprodução ocorra de forma natural (GONÇALVES et al., 2008). Segundo Palhano (2008), a PIV permite a produção de uma gestação semana/vaca, podendo aumentar rapidamente o intervalo entre gerações e aumentando a intensidade de seleção destes animais. A PIV envolve três etapas que são desenvolvidas em laboratório; a maturação oocitária, a fecundação dos oócitos, e o cultivo embrionário até os estágios de mórula e blastocisto, que poderão ser transferidos para receptoras, previamente sincronizadas, ou criopreservadas (VARAGO et al., 2008).
O aprimoramento dos sistemas envolvidos no processo da PIV na espécie bovina, a partir de oócitos recuperados de ovários oriundos de abatedouros tem sido fundamental para o estudo e a compreensão de vários fenômenos e mecanismos
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biológicos, desde a maturação dos oócitos, fecundação, até o início do desenvolvimento embrionário (HOSHI, 2003). No entanto apesar de muitas pesquisas e estudos, os resultados da técnica ainda são bastante variáveis de um laboratório para outro e até dentro do mesmo laboratório (GARCIA et al., 2004).
Na produção animal, particularmente nos bovinos, a utilização da PIV ainda é limitada em função da inconsistência dos resultados referentes ás taxas de qualidade de mórulas e blastocistos, da infraestrutura necessária e do tempo consumido para executar a rotina da produção de embriões, que vai desde a punção
in vivo até o desenvolvimento in vitro de embriões (GONÇALVES et al., 2008).
O objetivo deste trabalho é relatar as atividades desenvolvidas durante o estágio curricular supervisionado, realizado no laboratório de Reprodução Animal da Embrapa Clima Temperado, no município de Pelotas/RS, no período de 01 de março a 05 de abril de 2016 totalizando 150 horas.
Metodologia
Etapas da Produção in vitro de embriões:
Durante a realização do estágio foi possível o acompanhamento das etapas referentes á produção in vitro de embriões: recepção dos ovários, aspiração folicular, maturação oocitária, fecundação in vitro (FIV), cultivo in vitro (CIV) e avaliação embrionária. As etapas serão descritas a seguir.
Aspiração folicular:
Os ovários para a aspiração folicular eram provenientes de abatedouros locais, transportados ao Laboratório de Reprodução/Embrapa em garrafas térmicas com solução salina 0,9% de NaCl, suplementada com o antibiótico gentamicina e aquecida a 30-35°C. No laboratório, os ovários eram lavados novamente com solução salina 0,9% de NaCl, suplementada com gentamicina e aquecida a 30-35° e posteriormente contabilizados para controle interno.
A aspiração dos ovários (Figura 3) era realizada com uma bomba de vácuo digital com uma pressão de 10-12 mmHg, e uma agulha de 19G acoplada. A bomba era ligada uma hora antes do início da aspiração, para que houvesse estabilização da temperatura (30-35°C) no interior da máquina e nos tubos Falcon® de 15 mL, onde era depositado o conteúdo aspirado. Durante a realização da aspiração folicular, deve-se ter o cuidado de introduzir a agulha através do parênquima
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ovariano, evitando puncionar diretamente o folículo para que não haja rompimento e extravasamento do liquido folicular e perda do oócito, outro cuidado que se deve ter é não aspirar folículos dominantes, no laboratório era recomendado não aspirar os folículos maiores que 8 mm, pois estes se encontram em processo de maturação o que é indesejável na PIV. A aspiração era realizada na sala de procedimentos laboratoriais.
Figura 3 – Punção folicular realizada durante o Estágio de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
Seleção oocitária:
Após a aspiração estes recipientes Falcon® permaneciam em repouso por aproximadamente 10 min para ocorrer a sedimentação celular formando um pellet, que é constituído por oócitos, células de descamação e células da parede de folículo. O pellet era retirado com auxílio de uma pipeta de Pasteur e colocado em uma placa de Petri com liquido folicular, para realização da seleção oocitária. A seleção dos oócitos (Figura 4) era realizada na sala de cultivo embrionário com o auxílio de um esteromicroscópio. A classificação dos oócitos era realizada de acordo com a qualidade do citoplasma e o número de camadas do cumulus-oophorus.
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Figura 4 – Seleção dos oócitos realizada durante o Estágio no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul
Após a seleção, os oócitos eram lavados em gotas de líquido folicular para retirada de restos celulares e células de descamação. Finalmente, os oócitos eram lavados em meio de maturação (Figura 5) e transferidos para as placas Nunc® de 4 poços contendo 400 µL de meio de maturação.
Figura 5 – Lavagem dos oócitos em gotas de meio de maturação, realizada durante o Estágio no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul
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Maturação in vitro (MIV):
Na etapa de maturação era necessário que os meios fossem preparados com antecedência de no mínimo 2 horas, para que o meio estabilizasse a temperatura e o pH. O base utilizado no meio de maturação era o TCM-199®, com acréscimo de hormônios como o folículo estimulante (FSH), e hormônio luteinizante (LH), amicacina, penicilina e piruvato. Durante a realização do estágio eram testados diferentes tipos de soros no meio de maturação: o soro de ovelha em cio (controle), soro de vaca no pós-parto recente e soro de vacas no final da lactação. Os meios eram colocados em diferentes poços da placa Nunc® e aproximadamente 45 oócitos eram depositados de forma aleatória em cada poço de tratamento. Os oócitos permaneciam no meio de maturação por um período de 22 a 24 horas, no interior de uma estufa (Figura 6) de atmosfera controlada, com 5% de gás carbônico e 20% de oxigênio, e temperatura de 39°C.
Figura 6 – Estufa de cultivo de embriões do Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperatura, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
Fecundação in vitro (FIV):
Os oócitos eram retirados do meio de maturação e passados para a placa Nunc® contendo 400 µL de meio FIV (Fert-TALP®), com adição de BSA (albumina sérica bovina), penicilina, hipotaurina e a epinefrina (PHE), piruvato e heparina para capacitação espermática. A transferência dos oócitos para a placa deveria ser o mais breve possível, evitando assim mudanças no pH do meio e variações de
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temperatura. No laboratório, a incubação dos oócitos com os espermatozoides era realizada durante 18 – 20 horas a 39°C, sob atmosfera de 5% de gás carbônico e 20% de oxigênio.
Separação e capacitação espermática:
O laboratório utilizava amostras de sêmen comercializado congelado para a fertilização dos oócitos. A palheta do sêmen desejado era descongelada em banho-maria a 35°C por 30 segundos. Após o processo de descongelamento, o sêmen era colocado em um tubo eppendorf de 2mL e uma alíquota era retirada para avaliação da motilidade (quantificada em porcentagem) e vigor (escala de 0 a 5). Essa avaliação era realizada em microscópio óptico e a amostra era depositada em lâmina e lamínula pré-aquecidas.
O método de eleição utilizado para a separação espermática era o Percoll®, utilizando duas concentrações do gradiente (45% e 90%). Em um eppendorf de 2 mL eram depositados 400 µL de Percoll® 90% e sobre ele eram depositados 400 µL de Percoll® 45%. Estes frascos devem ser preparados duas horas antes da realização da FIV, para a estabilização dos gradientes.
O sêmen já descongelado era depositado na porção superior aos dois gradientes e colocado na centrifuga (5min x 700 giros). Após a centrifugação era realizada a remoção do sobrenadante e retirado o pellet. O pellet era depositado em meio SPERM-TALP®, para promover a capacitação espermática e novamente centrifugado (5min x 700 giros). Após a segunda centrifugação, novamente retirava-se o sobrenadante e avaliava-retirava-se a motilidade, vigor e concentração espermática do pellet. A concentração espermática é realizada com auxílio de uma câmara de Neubauer (Figura 7) e fornece a contagem de espermatozoides que entrarão no cálculo da dose inseminante. Esse cálculo também deve considerar a motilidade final da amostra e o volume da gota de meio FIV onde os oócitos estarão depositados. Como descrito a seguir:
Ci x Vi = Cf x Vf sendo que:
Ci = Concentração encontrada na câmara de Neubauer; Vi = Dose inseminante;
Cf = 1 x 106 SPTZ/ml
Vf = Volume da gota fecundação; Dose inseminante = Volume da gota µL N. encontrado C.N.
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Figura 7 – Avaliação da concentração espermática por câmara de Neubauer no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul
Cultivo in vitro (CIV):
O CIV corresponde à etapa de desenvolvimento do oócito fertilizado até o estágio de blastocisto. Após 18-20 horas de co-cultivo dos oócitos e espermatozóides, os prováveis zigotos eram retirados do meio de FIV e submetidos a repetidas pipetagens com posterior lavagem em gotas contendo meio de CIV, para retirada das células do cumulus-oophorus (desnudamento) e dos espermatozóides ainda aderidos à zona pelúcida. Após as lavagens, as estruturas eram transferidas para as placas Nunc® (Figura 8), contendo 400 µL de meio SOFaa® com acréscimo de proteína soro de ovelha em cio (controle) e piruvato, coberto com óleo mineral. A troca de meios (feeding) era realizada no dia da avaliação da clivagem (Dia 2), e no dia da avaliação das mórulas (Dia 5).
Figura 8 – Transferência de prováveis zigotos para a placa Nunc®, realizado no laboratório de Reprodução da Embrapa, Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul
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Avaliação da Clivagem:
A avaliação da clivagem (Figura 9) era efetuada 48 horas após a inseminação (Dia-2). Esta avaliação deve ser realizada em menor tempo possível para evitar alterações da temperatura e pH, com consequente dano ao desenvolvimento embrionário. No laboratório, o critério para avaliação da clivagem era a visualização de estruturas com 2 a 8 células.
Figura 9 – Avaliação da clivagem de embrião bovino, realizada no Laboratório
de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
Avaliação do desenvolvimento embrionário:
No laboratório de Reprodução, a avaliação embrionária era realizada mediante a observação do desenvolvimento das estruturas (Dia-7). Após a avaliação, os embriões eram congelados em Trizol® para avaliação da expressão gênica, conforme metodologia estabelecida pelo experimento da suplementação de diferentes soros.
Os embriões podem ser avaliados de acordo com as seguintes classificações (Figura 10):
Mo- (Mórula); Mc- (Mórula Compacta); Bi (Blastocisto Inicial); Bl (Blastocisto); Bx (Blastocisto Exapandido), Bn (Blastocisto em Eclosão); Be (Blastocisto Eclodido).
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Figura 10 – Avaliação de embriões bovinos produzidos no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul
Resultados e discussões
A PIV de embriões envolve as etapas de coleta, maturação in vitro (MIV) e fecundação in vitro de oócitos (FIV), bem como cultivo ou co-cultivo de zigotos e estruturas embrionárias (GONÇALVES et al., 2008).
Os oócitos utilizados para a PIV podem ser obtidos de ovários coletados em matadouros ou, in vivo, por punção folicular guiada por ultrassonografia (PALHANO, 2008). O laboratório de Reprodução da Embrapa tem como finalidade a pesquisa e utiliza ovários provenientes de abatedouros, e os protocolos de transporte e lavagem seguem o padrão utilizado por Gonçalves et al. (2008), diferindo apenas no antibiótico utilizado onde o autor usou penicilina ao invés de gentamicina. Segundo Palma (2008) é recomendável que se adicione antibióticos na solução salina na limpeza dos ovários ao chegarem no laboratório para melhorar as condições de higiene e diminuir o índice de contaminação.
A técnica de aspiração dos ovários, foi realizada com uma bomba vácuo digital pressão de 10-12 mmHg e uma agulha acoplada de 19G, da mesma forma proposta por Palma (2008) que também comenta que este procedimento pode ser efetuado sem dano aos oócitos se realizado com seringas estéreis. É de grande importância avaliar o tamanho dos folículos que não devem ultrapassar de 8 mm nem serem menores que 2 mm, importância que também foi observada por Alves et
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al. (2001). Gonçalves et al. (2008) ressalta que folículos menores que 2 mm não estão aptos a reiniciar o processo da meiose e já folículos maiores que 8 mm poderão encontrar-se em processo de atresia ou maturação, sendo assim ambos tornam-se inviáveis para a realização das técnicas de PIV.
O procedimento de sedimentação e retirada do pellet que é formado por oócitos, células de descamação e parede folicular e a sua transferência para placas de Petri onde ocorre a seleção dos melhores oócitos, também é utilizado por Palma (2008), que relata que oócitos do fundo do tubo com líquido folicular devem ser retirados com uma pipeta Pasteur estéril e depositados em uma placa de Petri, para assim serem realizadas a lavagem e a seleção. A seleção dos oócitos é realizada pela análise do aspecto do citoplasma e o revestimento da camada do
cumulus-oophorus; o ideal é que os oócitos contenham várias camadas de células do cumulus-oophorus, pois aqueles que contêm mais que três camadas são
considerados de melhor qualidade (GONÇALVES et al., 2008). No laboratório de reprodução/Embrapa a seleção dos oócitos se baseava na avaliação do
cumulus-oophorus e na qualidade do citoplasma.
Os oócitos aspirados no interior dos folículos ovarianos não se encontram ainda capazes de serem fecundados, sendo necessária uma série de transformações moleculares do núcleo e do citoplasma que consistem na maturação oocitária (GARCIA et al., 2004; GONÇALVES et al., 2008). Após estas mudanças estruturais e bioquímicas o oócito já se encontra capacitado à fecundação e ao seu posterior desenvolvimento embrionário (GONÇALVES et al., 2008).
Em condições in vivo, o processo de maturação tem início, com o pico pré ovulatório de LH durante o estro, e in vitro, com a simples retirada do oócito do folículo (MONTAGNER et al., 2000; GONÇALVES et al., 2008).
Para que todos os eventos da maturação oocitária ocorram in vitro, é necessário que os meios utilizados durante este período mimetizem as condições encontradas durante o processo de maturação in vivo (SANGILD et al., 2000). O conjunto de meios de maturação utilizado foi o sugerido por Rodrigues e Garcia (2000), onde diferentes formulações foram testadas durante a MIV em bovinos, a grande maioria dos laboratórios tem optado pelo meio TCM-199®, suplementado com soros bovinos, e hormônios como FSH, e LH. Para Gonçalves et al. (2008), ainda há controvérsia sobre a necessidade de suplementação como uso do hormônio FSH e LH mas a maioria dos resultados já estudados demonstraram um
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aumento na capacidade de fecundação e desenvolvimento embrionário, já a adição dos soros tem sido sugerido para alcançar a perfeita expansão do cumulus-oócito. Porém componentes destas formulações poderão afetar a maturação destes oócitos. Após os oócitos serem lavados nos meios e colocados em placas Nunc® de MIV, permaneciam durante um período de 22 a 24 horas, no interior de uma estufa de atmosfera controlada, com temperatura de 39°C, 5% de gás carbônico e 20% de oxigênio, conforme recomenda Palhano (2008). Os oócitos imaturos se encontram parados no estágio de prófase I, e completam a maturação quando ocorre a passagem da Prófase I para Metáfise II entre 20 e 24 horas após o início do cultivo, e com a extrusão do primeiro corpúsculo polar, estando aptos para a próxima fase chamada de fecundação in vitro (GARCIA et al., 2004). Para Palhano (2008), cerca de 80 a 90% dos oócitos completam a maturação nuclear in vitro.
A próxima etapa da PIV consiste na FIV que resume os eventos iniciados pela penetração do espermatozoide através das camadas celulares e acelulares que rodeiam o oócito (PALMA, 2008). Segundo Loiola et al. (2014), a fecundação in vitro é caracterizada pela fusão do espermatozoide com o oócito, seguida de exocitose dos grânulos corticais e a retomada da meiose com a extrusão do segundo corpúsculo polar e a formação do pró-núcleo feminino.
Os meios utilizados para a FIV seguiam um protocolo adaptado ao usado por Palhano (2008), onde preconiza o emprego de meio base de fecundação Fert-TALP® com adição de BSA (albumina sérica bovina), acrescido de substâncias como a penicilina, hipotaurina, e a epinefrina (PHE), com o intuito de aumentar a fertilidade espermática facilitando sua penetração no oócito. Além destes componentes no laboratório de Reprodução/Embrapa utiliza-se a heparina e o piruvato. Segundo Gonçalves et al. (2008) a heparina tem sido utilizada para capacitar espermatozoides bovinos, pois atua desencadeando mudanças bioquímicas na sua membrana. Conforme Palhano (2008), no processo in vivo, o espermatozoide quando ejaculado não se encontra apto para realizar a fertilização, algumas glicosaminoglicanas presentes no trato genital feminino são responsáveis pela indução e a capacitação espermática, processo este realizado pela heparina quando in vitro.
Antes de co-cultivar os oócitos e os espermatozoides em meio de fertilização, o sêmen do touro deve ser preparado por técnicas que permitem a separação dos espermatozoides vivos dos demais componentes do sêmen e seus crioprotetores
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(GONÇALVES et al., 2008). Para o processo de FIV são utilizados espermatozoides de palhetas de sêmen congelado, e a separação em gradiente de Percoll® tem sido o método mais comum para a obtenção da fração e seleção espermática viva após o descongelamento (GALLI e LAZZARI, 1996). Para Palma (2008), o gradiente de Percoll® corresponde a maior parte dos quesitos de uma técnica eficaz para a seleção espermática e, também resulta em frações límpidas, com espermatozoides de alta motilidade, não causando lesões na cromatina e proporcionando uma alta taxa de recuperação de gametas, mesmo quando amostras com baixa concentração são usadas. No laboratório o sêmen utilizado era congelado, e o método aplicado era gradiente de Percoll® que consiste nas diferenças de densidades e a separação é realizada pela centrifugação do sêmen conforme citam Palhano (2008) e Palma (2008). Após o processo de seleção no gradiente de Percoll®, o sêmen passava pelo processo de capacitação espermática. Para Varago et al. (2008), a capacitação ocorre pela remoção dos fatores descapacitantes presentes no plasma seminal, como proteínas e outras substâncias que recobrem a membrana do espermatozoide. O meio mais utilizado para a capacitação, e que também foi utilizado no laboratório é o Sperm-TALP®, o mesmo citado Gonçalves et al. (2008).
Após a seleção e a capacitação espermática, avaliava-se a motilidade, vigor e concentração espermática. Segundo Garcia et al. (2004), a concentração usada para a fertilização in vitro é de 2 x 106 espermatozoides/mL, calculada de acordo com a motilidade e a concentração da fração viva de espermatozoides obtida após a capacitação espermática, este cálculo evita que ocorra a polispermia. O período de incubação dos oócitos com os espermatozoides varia entre 6 e 20 horas. Para Golçalvez et al. (2008), o co-cultivo (espermatozoides e oócitos) é realizado por um período que, dependendo do laboratório, pode variar de 6 a 9 ou 18 a 22h, a uma temperatura de 39°C, e uma atmosfera de 5% de CO2 em ar e umidade saturada. O
tempo de permanência dos oócitos com os espermatozoides era de 18-20 horas no laboratório de Reprodução/Embrapa.
A próxima etapa é o cultivo in vitro. Segundo Garcia et al. (2004), é durante este período de desenvolvimento que ocorrem os eventos como ativação do genoma embrionário (transição materno-zigótica), divisão celular (clivagem), compactação dos blastômeros no estádio de mórula, início da diferenciação embrionária (células do trofoblasto que darão origem a placenta e anexos fetais) e a formação da blastocele. A metodologia empregada foi mesma usada por Palhano (2008), Palma
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(2008) e Gonçalves et al. (2008), onde os meios necessários para o desenvolvimento embrionário devem ser simples, suportar a nutrição celular e o desenvolvimento durante a fase pré-implantação embrionária, sendo baseado nos fluidos do útero e do oviduto durante o início da gestação. Basicamente o meio base que tem apresentado melhor resultados é o SOFaa®, acrescido de uma fonte de energia como o piruvato, e também por uma fonte de proteína (PALMA, 2008). Gonçalves et al. (2008) sugere que o meio seja renovado (feeding) de forma total ou parcial, em um intervalo de um ou dois dias, para o controle da osmolaridade e do pH do meio. O feeding era realizado na avaliação da clivagem (Dia 2), e na avaliação das mórulas (Dia 5).
Antes mesmo de os prováveis zigotos serem transferidos para a placa de cultivo, estes devem ser separados das células do cumulus-oophorus por repetidas pipetagens e lavados com meio cultivo, a fim de evitar a transferência de qualquer célula do cumulus-oophorus para o meio de desenvolvimento embrionário (SIRARD e COENEN, 2006). Assim como o utilizado no laboratório, evitando a competição de nutrientes com os possíveis zigotos.
Apesar dos avanços obtidos nos últimos anos da PIV, a proporção de embriões que atingem o estágio de blastocisto é raramente superior a 40% (NEVES et al., 2010), a taxa de produção de embriões obtida no laboratório de reprodução da Embrapa gerava em torno de 30%.
Após 48 horas da inseminação, era realizada a avaliação da clivagem (Dia 2), que consistia na observação das estruturas embrionárias com 2 ou 8 células. Golçalves et al. (2008), cita que neste período os embriões já se encontram com duas, quatro e oito células, denominados de blastômeros.
O desenvolvimento embrionário in vitro, consiste na visualização da compactação dos blastômeros e o início da formação da blastocele, esta avaliação final pode ser realizada no 7° dia, e após os embriões poderão ser transferidos a fresco para as vacas receptoras previamente sincronizadas ou criopreservados (THOMPSON, 2000).
Os embriões também eram avaliados no dia 7 de acordo com as seguintes classificações, sugeridas pela sociedade internacional de tecnologia de embriões (IETS) segundo STRINGFELLOW e SEIDEL (1998).
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Mo - Mórula: Blastômeros ainda evidentes, porém ainda não é possível determinar número exato. Massa de células ocupa maior parte do espaço dentro da zona pelúcida. Visível entre os dias 5,5 e 6,0 do cultivo embrionário.
MC - Mórula Compacta: Compactação torna a massa de células coesa, dificultando a individualização dos blastômeros, causando retração do embrião á zona pelúcida. Formação de junções de adesão e de oclusão entre as células, preparando o embrião para a formação da blastocele. Visível entre o dia 6,0 a 6,5 do cultivo embrionário.
Bi - Blastocisto Inicial: Blastômeros criam gradiente osmótico que atrai água para o espaço intracelular iniciando a formação de uma cavidade denominada blastocele. Formam-se duas populações celulares distintas: o trofoblasto que reveste a blastocele, e a massa celular interna lateral a blastocele. Visível entre os dias 6,5 a 7,0 do cultivo embrionário.
Bl - Blastocisto: Blastocele aumenta de tamanho, tornando-se proporcionalmente maior que a massa celular interna e ocupando gradualmente todo o espaço perivitelínico. Trofoblasto sofre diferenciações morfológicas e funcionais associadas à captação de nutrientes enquanto as células da massa celular interna mantém a sua potencialidade. Visível entre os dias 7,0 e 7,5 do cultivo embrionário.
Bx - Blastocisto Expandido: Expansão da blastocele causa aumento de tamanho do embrião e progressiva redução na espessura da zona pelúcida. Maior desenvolvimento do trofoblasto, a massa celular interna é visível dependendo da posição do embrião. O rompimento da zona pelúcida caracteriza eclosão. Visível entre os dias 7,0 e 7,5 do cultivo embrionário.
Bn - Blastocisto em Eclosão: o embrião está começando o processo de saída da zona pelúcida. Visível entre os dias 7,0 e 7,5 do cultivo embrionário.
Be - Blastocisto Eclodido: o embrião está totalmente livre da membrana pelúcida, sendo ainda nítido a presença da blastocele. Visível entre os dias 7,0 e 7,5 do cultivo embrionário.
Segundo Gonçalves et al. (2008), os índices de blastocisto expandido e eclodido é o principal fator para determinar a eficácia do sistema de maturação do oócito, bem como a fecundação e o desenvolvimento embrionário.
Após este período os embriões podem então serem criopreservados ou transferidos para doadoras previamente sincronizadas. No laboratório de reprodução
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da Embrapa os embriões estavam sendo produzidos e criopreservados para uma futura avaliação gênica, dando continuidade ao projeto de pesquisa.
Conclusão
Os avanços alcançados nas biotécnicas reprodutivas ao longo dos anos estão permitindo um grande avanço nos melhoramentos genéticos de bovinos. Portanto, a busca pelo conhecimento continua e o aperfeiçoamento de cada umas das três técnicas na produção in vitro de embriões, para que cada vez mais se busque novos métodos para melhorar a eficiência e o melhoramento dos embriões.
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4 CONCLUSÃO
O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária proporcionou-me um grande aprendizado compleproporcionou-mentar para a formação acadêmica. O período de estágio na Embrapa Clima Temperado e a busca sempre pelo diferencial me possibilitaram a obtenção de novos conhecimentos e aperfeiçoamentos frente aos avanços alcançados com o uso de biotécnicas reprodutivas.
O estágio é extremamente importante, pois possibilita colocar em prática a teoria vivenciada durante a vida acadêmica, estimulando o raciocínio lógico a frente de novos desafios. Com conhecimento acadêmico concluo que a formação profissional é um momento único e que permite a aquisição de experiências e ligação com diversas pessoas, novos lugares e oportunidades.
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5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALVES, J. D. R.; et al. Altas concentrações de FSH-p na maturação in vitro de oócitos Bos indicus. Ciência Rural, Santa Maria, v. 31, n. 4, p. 645-649, 2001.
GALLI, C.; LAZZARI, G. Practical aspects 01IVM-IVF in cattle. Anim. Reprod. Scie., v.42, p.371-379, 1996.
GARCIA, J. M.; AVELINO, K. B.; VANTINI, R. Estado da arte da fertilização in vitro em bovinos. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE REPRODUÇÃO ANIMAL APLICADA, 1, 2004, Londrina. Anais... Londrina, p. 223-230, 2004.
GONÇALVES, P. B. D. et al. Produção in vitro de embriões. In: GONÇALVES, P. B. D.; FIGUEIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F. Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. 3. ed. São Paulo: Roca Ltda, p. 261-290, 2008.
GUIMARÃES JÚNIOR, R., et al.. Ureia na alimentação de vacas leiteiras. Embrapa Cerrados, ISNN 1577-5111, p.186, 2008.
HOSHI, H. In vitro production of bovine embryos and their application for embryo transfer. Theriogenology, v.59, p.675-685, 2003.
LOIOLA, M. V. G. et al. Validação de um programa de produção in vitro de embriões bovinos com transporte de ovócitos e de embriões por longas distâncias. Ciência Animal Brasileira, v. 15, n. 1, p. 93-101, 2014.
MONTAGNER, M. M., et al. Hepes na Produção de Embriões in Vitro. Ciência Rural, Santa Maria, RS, v.30 n.3, p.469-474, 2000.
NEVES, J. P.; MIRANDA, K. L.; TORTELLA, R. D. Progresso cientifico em reprodução na primeira década do século XXI. Revista Brasileira de Zootecnia, Brasilia – DF, v.39 p.414-421, 2010.
PALHANO, H. B. Reprodução em Bovinos: Fisiopatologia, Terapêutica, Manejo e Biotecnologia. In: Produção in vitro de Embriões Bovinos. 2 ed. Editora LF Livros, Rio de Janeiro: p.206-218, 2008.
PALMA, G. Producción in vitro de embriones bovinos. In: PALMA, G. Biotecnologia de la reprodución. 2a. ed. Mar del Plata: el autor, p. 313-380, 2008.
RODRIGUES, C.F.M., GARCIA, J.M. Fecundação in vitro em bovinos: aplicação comercial. Arquivo da Faculdade de Veterinária UFRGS., v.28, p.186-187, 2000. RUMPF R. Avanços metodológicos na produção in vitro. Revista Brasileira de Zootecnia, v.36, p.229-233, 2007.
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SANGILD, P.T., et aI. Blood chemistry, nutrient metabolism, and organ weights in fetal and newborn calves derived from in vitro produced bovine embryos. Biol. Reprod., v.62, p.1495-1504, 2000.
SIRARD, A. M.; COENEN, K. In Vitro Maturation and Embryo Production in Cattle. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, v. 348, p. 35-42, 2006.
STRINGFELLOW, D.A.; SEIDEL, S.M. Manual da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões. IETS, p. 112-113, Illinois, 1998.
THOMPSON, J.G. In vitro culture and embryo metabolism of cattle and sheep embryos - a decade of achievement. Anim. Reprod. Sci, v.60-61, p.263-275, 2000. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA. Estrutura e apresentação de monografias, dissertações e teses: MDT. 8. ed. Santa Maria: Ed. UFSM, 2012. VARAGO, F. C., MENDONÇA, L. F., LAGARES, M. A. Produçao in vitro de embriões bovinos: estado da arte e perspectiva de uma técnica em constante evolução. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 32, n.2, p.100-109, 2008.
VIEIRA, R. J. Biotécnicas aplicadas à reprodução bovina: generalidades. Ciência Animal, v.22, n.1, p. 55-65, 2012.
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Anexo A – Certificado do Curso de Ultrassonografia em bovinos realizado durante período de Estágio Supervisionado em Medicina Veterinária
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Anexo C – Fontes de aquisição
1. Letah Max®. Indeba- Mercoclean Ltda, Tupã – SP. 2. Tubo Falcon®. Ciencor, São Paulo – SP.
3. Placas Nunc®. Ciencor, São Paulo – SP.
4. TCM-199®. Life Technologies do Brasil Ltda, São Paulo – SP. 5. Fert-TALP®. Life Technologies do Brasil Ltda, São Paulo – SP. 6. Percoll®. Life Technologies do Brasil Ltda, São Paulo – SP.
7. SPERM-TALP®. Life Technologies do Brasil Ltda, São Paulo – SP. 8. SOFaa®. Life Technologies do Brasil Ltda, São Paulo – SP.
