FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ANA CECILIA VERSIANI DUARTE DE ESPÍNDOLA
PSORÍASE PUSTULOSA GENERALIZADA – CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA, EVOLUTIVA, HISTOPATOLÓGICA E IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES NO GENE
IL36RN EM UM GRUPO DE PACIENTES BRASILEIROS
CAMPINAS 2019
PSORÍASE PUSTULOSA GENERALIZADA – CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA, EVOLUTIVA, HISTOPATOLÓGICA E IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÕES NO GENE
IL36RN EM UM GRUPO DE PACIENTES BRASILEIROS
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de mestra em Ciências, na área de concentração Clínica Médica.
ORIENTADOR: PROFA. DRA. RENATA FERREIRA MAGALHÃES
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA ANA CECÍLIA VERSIANI DUARTE DE ESPÍNDOLA
E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. RENATA FERREIRA MAGALHÃES
CAMPINAS 2019
COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE
MESTRADO/DOUTORADO
ANA CECILIA VERSIANI DUARTE DE ESPÍNDOLA
ORIENTADOR: PROFA. DRA. RENATA FERREIRA MAGALHÃES
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. RENATA FERREIRA MAGALHÃES
2. PROF. DR. PAULO EDUARDO NEVES FERREIRA VELHO
3. PROF. DR. ARTUR ANTONIO DUARTE
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
Dedico este trabalho aos meus pais, José Henrique e Cláudia, que
sempre me ensinaram o valor do estudo e o compromisso com a
educação; e ao meu esposo, Lucas, que me incentivou e foi meu ponto
de apoio e confiança em toda essa jornada.
Em primeiro lugar, agradeço à minha orientadora Profa. Dra. Renata
Magalhães, por dividir esse projeto comigo, por me conduzir nesse
estudo, pela serenidade e paciência com minhas dúvidas e,
principalmente, por me ensinar que devemos estar atentos à clínica
dermatológica e sempre buscar a excelência no conhecimento e no
cuidado com o paciente.
Agradeço à minha colega e amiga Ana Carolina Apolinário Sala, por me
apresentar a Unicamp, por caminhar comigo nessa jornada e me ajudar
a achar soluções com bom humor e persistência.
Expresso aqui minha gratidão à Unicamp e a todos os professores e
colegas do curso de pós-graduação, por contribuíram com tanto esmero
para essa formação.
Agradeço também a alguns profissionais que foram parceiros
imprescindíveis na realização desse trabalho: ao Prof. Dr. João
Pesquero e à colega Fernanda Casimiro, pelas valiosas contribuições
nesse projeto e pela parceria na realização dos testes genéticos; à Dra.
Maria Letícia Cintra, por dividir seu conhecimento com tanto carinho e
disponibilidade e por ter sido ajuda preciosa na condução das análises
histopatológicas; e à Ana Cristina Biral, em nome do laboratório de
imunologia da Unicamp, agradeço toda atenção e ajuda para a
realização desse estudo.
Por fim, quero agradecer à minha família, especialmente, meus pais,
minhas irmãs e meu esposo, pela presença constante, pelo apoio e pela
torcida que tornaram essa caminhada mais leve.
Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.
A psoríase é uma doença inflamatória crônica presente em 1 a 3% da população mundial com prevalência de cerca de 1,31% da população das capitais brasileira. Em relação à etiopatogenia, postula-se que seja uma resultante do efeito combinado de múltiplos loci de susceptibilidade genética, de um sistema imunológico desordenado e fatores de risco ambientais ubíquos. Estudos recentes relacionaram quinze loci de susceptibilidade genética na psoríase, entre eles os Psors 14 e Psors 15 com alta associação com psoríase pustulosa. A forma generalizada da psoríase pustulosa (PPG) é considerada a manifestação mais grave dessa dermatose e apresenta-se com febre alta, comprometimento do estado geral, aumento de provas inflamatórias e aparecimento súbito e disseminado de pústulas estéreis. A ocorrência de casos PPG sem psoríase em placas impulsionou estudos para identificação de fatores etiopatogênicos peculiares para PPG, inclusive genéticos. O gene IL36RN é expresso primariamente na pele e codifica o IL-36Ra, que neutraliza o efeito inflamatório da interleucina-36. Os pacientes com a mutação no IL-36Ra apresentam ativação não controlada da via inflamatória da IL-36 e manifestam-se com sintomas sistêmicos e erupção pustulosa generalizada. Esse distúrbio genético foi chamado de deficiência do antagonista do receptor da interleucina-36, que é representado pelo acrônimo na língua inglesa Ditra (Deficiency of the IL-36R
antagonist). O objetivo desse trabalho foi estudar um grupo de pacientes brasileiros
com diagnóstico de psoríase pustulosa generalizada em relação às suas características demográficas, clínicas, histológicas, evolutivas e genéticas, com o intuito de identificar mutação no gene IL36RN, o que pode modificar a conduta para estas pessoas. O estudo constitui uma coorte retrospectiva para detectar os casos, caracterizá-los quanto à evolução da doença e é exploratório e transversal para avaliação dos marcadores genéticos. Pacientes com diagnóstico de PPG com mais de 18 anos e disponibilidade para coleta de sangue periférico para estudo genético foram incluídos. Assim, foram identificados 12 pacientes com psoríase pustulosa generalizada, 66,67% do sexo feminino com média de idade ao diagnóstico de 31,92 anos, 58,34% tiveram febre, todos apresentaram eritema generalizado e pústulas e quatro participantes não tinham achados de psoríase em placas. Desses, três apresentaram a mesma mutação patogênica (c.338C > T [p.Ser113Leu]) no gene IL36RN, dois em homozigose e um em heterozigose, configurando os primeiros
psoríase vulgar com p = 0.0182, estatisticamente significativo. O HLA mais frequente neste grupo foi o HLA-C04 e foram identificadas peculiaridades histopatológicas nos espécimes de biópsia de pele dos pacientes com Ditra. As medicações utilizadas foram acitretina, metotrexato, ciclosporina e imunobiológicos inibidores de fator de necrose tumoral-alfa (anti-TNF-alfa) com respostas terapêuticas inconstantes entre os pacientes com Ditra com necessidade de associação de medicações para controle clínico. A análise desse grupo de pacientes mostrou que a pesquisa de mutação no gene IL36RN é um mecanismo de caracterização dos indivíduos com pustulose e, no futuro, poderá auxiliar a decisão terapêutica.
Psoriasis is a chronic inflammatory disease present in 1 to 3% of the world population with prevalence in 1.3% of the Brazilian population. Regarding the etiopathogenesis, it is postulated to be a result of the combined effect of multiple genetic susceptibility loci, a disordered immune system and omnipresent environmental risk factors. Recent studies have related fifteen genetic susceptibility loci in psoriasis, including Psors 14 and Psors 15 with a high association with pustular psoriasis. The generalized form of pustular psoriasis (GPP) is considered the most severe manifestation of this dermatosis and presents with high fever, impairment of the general condition, increased inflammatory evidence and sudden and widespread appearance of sterile pustules. The occurrence of GPP cases without psoriasis in plates boosted studies to identify etiopathogenic factors peculiar to GPP, including genetic. The IL36RN gene is expressed primarily on the skin and encodes IL-36Ra which counteracts the inflammatory effect of interleukin-36. Patients with the IL-36Ra mutation have uncontrolled activation of the IL-36 inflammatory pathway and manifest with systemic symptoms and generalized pustular eruption. This genetic disorder was called interleukin-36 receptor antagonist deficiency, which is represented by the English acronym DITRA (Deficiency of the IL-36R antagonist). The aim of this study was to study a group of Brazilian patients diagnosed with generalized pustular psoriasis in relation to their demographic, clinical, histological, evolutionary and genetic characteristics, in order to identify mutations in the IL36RN gene, which may modify the conduct for these people. The study is a retrospective cohort to detect the cases, characterize them as the disease progresses and is exploratory and cross-sectional for the evaluation of genetic markers, patients diagnosed with generalized pustular psoriasis, over 18 years old and who were available for collection of peripheral blood for genetic study were included. Thus, 12 patients with GPP were identified, 66.67% female with a mean age at diagnosis of 31.92 years, 58.34% had fever, all had generalized erythema and pustules and four participants had no plaque psoriasis findings. Of these, three presented the same pathogenic mutation (c.338C> T (p.Ser113Leu) in the IL36RN gene, two in homozygosis and one in heterozygosis, constituting the first cases of DITRA described in Brazilian patients. Fisher's exact test showed an association between presence of mutation in the IL36RN gene and absence of statistically significant
DITRA patients. Acitretin, methotrexate, cyclosporine and tumor necrosis factor-alpha (anti-TNF-alpha) inhibitor immunobiologicals with fluctuating therapeutic responses among DITRA patients in need of combination medication for clinical control. That IL36RN gene mutation screening is a mechanism for characterization of individuals with pustulosis and in the future may help the therapeutic decision.
Figura 1: Estrutura molecular do gene IL36RN ... 29 Figura 2: Paciente 2 com pústulas generalizadas coalescentes formando áreas com “lagos de pus” sobre base eritematosa. ... 36 Figura 3: Paciente 12 apresenta pústulas com conformação arciforme, formando placas anulares com superfície eritematosa, disseminadas no abdome e tórax anterior. ... 37 Figura 4: Achados histopatológicos encontrados apenas nos pacientes com Ditra .. 43
Quadro 1: Primers utilizados para marcar a transcrição dos seis éxons do gene IL36RN. ... 30 Quadro 2: Procedimento de PCR para a amplificação dos éxons do gene IL36RN com Taq DNA polimerase convencional. ... 31 Quadro 3: Dados demográficos e genéticos dos pacientes com psoríase pustulosa generalizada ... 34 Quadro 4: Dados clínicos dos pacientes com psoríase pustulosa generalizada ... 35 Quadro 5: Dados laboratoriais dos pacientes com psoríase pustulosa generalizada 38 Quadro 6: Dados de fatores desencadeantes, tratamentos utilizados e resposta terapêutica dos pacientes com psoríase pustulosa generalizada ... 39 Quadro 7: Tipificação do HLA-C e presença ou ausência de mutação no gene IL36RN ... 40 Quadro 8: Achados histopatológicos elencados para diagnóstico de psoríase pustulosa em biópsia de pele de nove pacientes do estudo ... 42
ACH – Acrodermatite contínua de Hallopeau
Anti-TNF-alfa – Inibidor de fator de necrose tumoral alfa
c.115 + 6T > C – Mutação no gene IL36RN que determina troca de uma base nitrogenada timina por citosina na posição 115
c.338C > T – Mutação no gene IL36RN com troca de base nitrogenada citosina por timina na posição 338
CD – Células de dendríticas
Dira – Deficiência do antagonista do receptor da interleucina-1 Ditra – Deficiência do antagonista do receptor da interleucina-36 DNA – Ácido desoxirribonucleico
EDTA – Ethylenediamine tetraacetic acid
HLA – Antígeno de histocompatibilidade humano HLA-C – Antígeno de histocompatibilidade C ICAM-1 – Moléculas de adesão intercelulares IF – Intensidade de fluorescência
IL-1 – Interleucina-1 IL-12 – Interleucina-12 IL-17 – Interleucina -17
IL-1RL2 – Receptor da interleucina-36 IL-22 – Interleucina-22
IL-23 – Interleucina-23 IL-36 – Interleucina-36
IL36G – Gene que codifica a interleucina-36
IL-8 – Interleucina-8
INF-gama – Interferon gama LT – Linfócitos T
p.Ser113Leu – Mutação no gene IL36RN que determina a troca de um aminoácido serina por leucina
PCR – Proteína C reativa
PCR – Reação em cadeia da polimerase PP – Psoríase pustulosa
PPG – Psoríase pustulosa generalizada PPP – Psoríase pustulosa palmo-plantar PsV – Psoríase em placas ou vulgar
ROR – Receptores órfãos relacionados ao retinóide
ROR-alfa – Receptor órfão relacionado ao retinóide – alfa RORγt – Fator de transcrição relacionado ao retinóide SIA – Sistema imune adaptativo
SAPHO – Sinovite, acne, pustulose e osteíte SII – Sistema Imune Inato
TNF-alfa – Fator de necrose tumoral-alfa
Unicamp – Universidade Estadual de Campinas VHS – Velocidade de hemossedimentação
SUMÁRIO... 16
INTRODUÇÃO ... 18
Epidemiologia ... 18
Etiopatogênese ... 18
Manifestações clínicas ... 21
Doenças autoinflamatórias e manifestações cutâneas ... 23
Alterações genéticas e identificação da deficiência do antagonista do receptor da interleucina-36 ... 24 OBJETIVOS ... 27 Objetivo geral ... 27 Objetivos específicos ... 27 MATERIAIS E MÉTODOS ... 28 Sujeitos da pesquisa ... 28 Coleta de dados ... 28
Fonte e extração do DNA ... 29
Pesquisa de Mutações ... 29
Sequenciamento ... 31
Tipificação HLA-C ... 32
Reavaliação dos exames histopatológicos ... 32
Metodologia Estatística ... 33
RESULTADOS ... 34
Aspectos demográficos e clínicos ... 34
DISCUSSÃO ... 44
Aspectos demográficos e clínicos ... 44
Aspectos genéticos ... 45
Aspectos histopatológicos ... 45
Implicações terapêuticas ... 46
CONCLUSÃO ... 50
REFERÊNCIAS ... 52
ANEXO I – Parecer consubstanciado do CEP ... 59
ANEXO 2 – Artigo aceito para publicação na revista Archives of Clinical and Medical Case Reports – Editora Fortune Journals ... 71
ANEXO 3 – Artigo enviado para publicação em análise pela equipe editorial ... 76
INTRODUÇÃO
Epidemiologia
A psoríase é uma doença inflamatória crônica presente em 1 a 3% da população mundial e, no caso dos brasileiros, estima-se que cinco milhões sejam afetados1-3. A idade de início das manifestações clínicas tem distribuição bimodal – 16 a 22 e 57 a 60 anos – e afeta igualmente homens e mulheres4,5.
Estudo populacional publicado em 2017 demonstrou prevalência dessa dermatose em 1,31% da população brasileira pesquisada nas capitais dos 26 estados da federação4. Esse estudo demonstrou ainda que houve um aumento estatisticamente significativo relacionado à idade na prevalência de psoríase ao se comparar três grupos compostos por indivíduos com menos de 30 anos, entre 30 e 60 anos e acima de 60 anos4.
Além disso, no Brasil observou-se uma discrepância na prevalência dessa dermatose nas regiões do país com valores mais altos no sul e no sudeste4. Este dado foi justificado por fatores heterogêneos em um país de dimensões continentais, como o clima, a composição étnica e a disponibilidade de dermatologistas4.
A psoríase é cada vez mais considerada uma doença multissistêmica, na qual o acometimento cutâneo e articular são os mais frequentes5.Estudos mostram que a alta morbidade associada a essa doença está relacionada às comorbidades que os pacientes frequentemente apresentam, como síndrome metabólica, doença intestinal inflamatória crônica e distúrbios psiquiátricos5,6.
Alguns autores consideram que pacientes com psoríase têm nível de limitação similar ao dos pacientes com angina ou hipertensão, apresentando, ainda, associações com doenças psiquiátricas que incluem ideações suicidas, depressão e ansiedade, ocasionando importante impacto na qualidade de vida com redução da autoestima e aumento do estresse, além de interferir no funcionamento social e nas relações interpessoais5-7.
Etiopatogênese
A etiopatogenia da psoríase não é totalmente conhecida. Postula-se que seja uma resultante do efeito combinado de múltiplos loci de susceptibilidade genética, de um sistema imunológico desordenado e fatores de risco ambientais obíquos.
Esses três componentes culminam na liberação de citocinas pró-inflamatórias, as quais estimulam a atividade mitótica dos queratinócitos e ocasionam dano tecidual1,5,6,7.
O componente genético da psoríase baseia-se na elevada incidência familiar, na concordância entre gemerales – taxa de concordância muito maior entre gêmeos monozigóticos (65-72%) do que gêmeos dizigóticos (15-30%) –7, na identificação de genes que codificam os antígenos de histocompatibilidade (HLA) – principalmente HLA-Cw6, HLA-B13 e HLA-B17 – e em estudos genômicos de famílias com múltiplos afetados1,7.
Recentemente, estudos de genes candidatos, de associação genômica ampla - de título na língua inglesa: genome wide scan (GWAS) - e de sequenciamento de próxima geração revelaram que a expressão da psoríase bem como sua suscetibilidade são influenciadas por três principais alterações genômicas: polimorfismos de nucleotídeo único, variações no número de cópias e mudanças epigenéticas8.
O estudo de Singh compilou 424 genes com polimorfismos de nucleotídeo único associados à psoríase. Esse conjunto inclui genes dos loci de susceptibilidade à psoríase, conhecidos como Psors, e outros genes que estão distribuídos em 22 autossomos8.
Os Psors são regiões de cromossomos que contêm genes diferenciados que já foram, por meio de bases moleculares e métodos estatísticos, comprovadamente associados a um aumento da suscehptibilidade à psoríase8.Atualmente, no genoma humano, quinze loci Psors foram identificados8.
Psors 1 é o principal determinante genético da psoríase em placas. Cerca de 15 genes compõem esse locus e o principal é o gene do complexo de histocompatibilidade humana C (HLA-C)8. O HLA-C é uma molécula do complexo de histocompatibilidade de classe I que reconhece antígenos não próprios e os apresenta aos linfócitos T CD8+, os quais ativam as células natural killer9. Assim, polimorfismos genéticos foram relatados no Psors 1 determinando alterações na resposta imune inata e, consequentemente, na adaptativa, que implicaram no desenvolvimento da psoríase.
Os outros 14 loci não fazem parte do complexo de histocompatibilidade humana. O Psors 2 está associado à forma familiar da psoríase; no Psors 3, ocorrem
polimorfismos de nucleotídeo único associados à psoríase ao alterarem a função da interleucina-2 e da interleucina-21, que participam da proliferação de linfócitos T, da diferenciação de Th17 e da proliferação de queratinócitos; já o Psors 4, assim como o Psors 13, quando contém mutações, foi reportado como importante fator desencadeante de psoríase em placas8.
No Psors 5, polimorfismos de nucleotídeo único que alteram a codificação de um transportador de potássio e cloro foram implicados na ocorrência de psoríase8. Alterações no Psors 6 potencializam o risco de início precoce da psoríase em pacientes portadores de mutações no Psors 110. Já o Psors 7, determina polimorfismos na interleucina-23 e é considerado hoje um dos principais loci que podem desencadear psoríase8.
Psors 8 é reportado como locus de susceptibilidade tanto à psoríase quando à doença de Crohn8. Enquanto os loci Psors 9, Psors 10, Psors 11 e Psors 12 não tiveram associação significativa para um subtipo clínico de psoríase, os loci Psors 14 e Psors 15 foram relatados como alta associação com psoríase pustulosa8, 11.
Estudos mostraram ainda que as variantes genéticas associadas à psoríase podem ser divididas em duas categorias: genes imunoespecíficos e genes específicos da pele. Entre estes, deve-se mencionar que as mutações do domínio de recrutamento de caspase contendo proteína 14 (CARD14) e IL36RN foram reconhecidas como fatores genéticos responsáveis pela psoríase pustulosa generalizada (PPG)12,13.
A imunopatogênese da psoríase envolve alterações no sistema imune inato (SII) e adaptativo (SIA), os quais se retroalimentam, originando uma complexa cascata na qual se encontram os potenciais alvos terapêuticos para essa doença14,15.
A ativação do SII por gatilhos como trauma mecânico, infecção, medicamentos, dieta, álcool e estresse emocional7 ocasiona liberação pelos queratinócitos de interleucina-1 (IL1) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa); essas substâncias ativam células dendríticas, que são apresentadoras de antígenos para linfócitos T (LT) no linfonodo regional, ativando, assim, o SIA6,7,14.
Os LT ativados diferenciam-se em três linhagens principais: TH1, produtores de interferon-gama (INF-gama), TNF-α e interleucina-2 (IL-2); TH17, que produzem
interleucina-17 (IL-17), TNF-α, interleucina-6 (IL-6) e interleucina-22 (IL-22); e LT CD8+ tipo 1, produtores de TNF-alfa, INF-gama, perforinas e granzima B14-16.
A retroalimentação do sistema imune adaptativo para o sistema imune inato ocorre quando os LT ativados migram para a pele e ativam CD e macrófagos. Essas células ativadas produzem citocinas como interleucina-12 (IL-12) e interleucina-23 (IL-23) que, por sua vez, retroalimentam o SIA ao favorecem a proliferação de linfócitos T de linhagem TH1 e TH17, respectivamente16,17.
Assim, na imunopatogênese da psoríase, duas vias de citocinas são formadas: uma primeira via TH1, na qual os linfócitos TH1 ativados liberam INF-gama, que induz expressão de moléculas coestimuladoras em células dendríticas e moléculas de adesão intercelular (ICAM-1) em queratinócitos. O INF-gama estimula também macrófagos a liberarem TNF-alfa, que inibe a apoptose de queratinócitos; na segunda via, as células Th17 liberam as citocinas efetoras principais 17 e IL-22. A IL-17 modula a expressão de TNF-α e de ICAM-1, aumenta a expressão de quimiocinas e reduz a expressão de moléculas de adesão nos queratinócitos. Já a IL-22 promove a proliferação dos queratinócitos18,19.
Essas duas vias resultam na ruptura da barreira cutânea e explicam porque atualmente a psoríase é descrita como uma doença autoimune mediada por células T, na qual INF-gama e TNF-alfa atuam como os principais efetores pró-inflamatórios influenciados por fatores ambientais e genes de susceptibilidade13,14.
Manifestações clínicas
Em relação ao quadro clínico, a psoríase caracteriza-se por pápulas ou placas eritemato-descamativas, com tamanhos, padrões e distribuição corpórea variável1. O eritema é vivo, vermelho claro ou rosa intenso, a descamação é branco-prateada e as lesões são classicamente bem demarcadas com bordas nítidas e pode cursar com comprometimento ungueal (50 a 80%) e articular em um terço dos pacientes 1.
As formas de apresentação clínica principais são: psoríase em placas ou vulgar (PsV), que é a mais comum, em torno de 80%, e há formas que acometem localizações restritas, como as dobras, no caso da psoríase invertida, a forma ungueal, palmo-plantar e do couro cabeludo1.
As pústulas podem ocorrer em qualquer forma clínica da psoríase, como lesões elementares isoladas, porém, a forma pustulosa da psoríase (PP), que se
destaca pela ausência de placas típicas eritematodescamativas e apresenta-se com grande quantidade de pústulas, corresponde a aproximadamente 5% dos casos1,18.
A PP pode ser dividida em quatro apresentações clínicas: psoríase pustulosa em placas ou anular, anteriormente chamada de psoríase pustulosa de Zampieri; psoríase pustulosa palmo-plantar (PPP); acrodermatite contínua de Hallopeau (ACH); e psoríase pustulosa generalizada (PPG)1.
A psoríase pustulosa em placas ou anular acomete principalmente adultos e caracteriza-se por surtos de pústulas com base eritematosa e conformação anular, localizadas, na maioria das vezes, em tronco e nos membros, sem manifestações sistêmicas1.
A PPP também não apresenta achados sistêmicos e manifesta-se por surtos de pústulas estéreis com acometimento simétrico palmo-plantar de caráter crônico com períodos variáveis de exacerbação e remissão1.
Já a ACH recebe essa denominação por não ter tendência à remissão espontânea. As pústulas têm curso crônico, podem confluir formando lagos de pus e são mais comuns nos quirodáctilos do que nos pododáctilos. As lesões podem atingir a matriz ungueal, levando à anoníquia, e as articulações, levando à artrite1.
A PPG foi descrita pela primeira vez em 1910 por Von Zumbusch e é uma doença rara, considerada o subtipo mais grave de psoríase14. Caracteriza-se por manifestações sistêmicas como febre alta, comprometimento do estado geral, perda de peso, fraqueza muscular, leucocitose, hipocalcemia e aumento de provas inflamatórias, como velocidade de hemossedimentação (VHS) e proteína C reativa (PCR), associadas ao aparecimento súbito de pústulas estéreis de 2 a 3 mm sobre base eritematosa que se disseminam para tronco e membros1,18, 19.
Historicamente, a PPG foi descrita em pacientes com psoríase em placas submetidos a fatores agravantes, como gestação, infecções, queimaduras solares, uso de medicações como lítio, salicilato, alcatrão, cloroquina, betabloqueadores e, em especial, o uso e a descontinuação de corticoide sistêmico18,19. Porém, existem casos de PPG sem manifestações prévias de PsV e em pacientes que não foram submetidos aos fatores agravantes citados20.
Doenças autoinflamatórias e manifestações cutâneas
As doenças autoinflamatórias originam-se de alterações na imunidade inata que foram melhor compreendidas a partir do conceito dos inflamassomas, que são complexos multiproteicos intracelulares responsáveis por controlar a reposta imune inata a diversos estímulos21. A função normal dos inflamassomas permite produção ordenada de interleucina-18 e, principalmente, de interleucina-1, que são citocinas necessárias para que o SII aja contra uma série de estímulos, como patógenos e células cancerígenas21,22. Quando a atividade dos inflamassomas torna-se excessiva, observa-se uma ativação não controlada de citocinas que culmina com efeitos deletérios para o organismo e manifestações clínicas decorrentes da inflamação crônica21, 23.
Cabe ressaltar que doenças autoinflamatórias diferenciam-se das doenças autoimunes, porque estas são decorrentes de alterações na imunidade adaptativa24. Assim, nas doenças autoimunes observa-se resposta exacerbada a autoantígenos com produção de autoanticorpos coordenada por linfócitos B e T21,24; enquanto nas doenças autoinflamatórias ocorrem desordens em fatores locais que levam à ativação do SII com participação de macrófagos, neutrófilos e células natural killer que ocasionam dano tecidual sem a presença de autoanticorpos24.
A participação dos inflamassomas como fator patogênico foi descrita em doenças dermatológicas como síndrome de Sweet, vitiligo, hidrosadenite, dermatite atópica e psoríase21. Além disso, as doenças inflamatórias monogênicas são um grupo de síndromes genéticas raras que levam à exacerbação da resposta imune inata com sinais recorrentes de inflamação sistêmica, como febre, que surgem na infância e podem ter manifestações cutâneas25. Fazem parte desse grupo a febre familiar do mediterrâneo, a síndrome de Muckle-Wells e a deficiência do antagonista do receptor da interleucina-1, nominada pelo acrônimo na língua inglesa Dira25-27.
A Dira foi descrita em pacientes recém-nascidos com quadro de osteomielite multifocal estéril, periostite, pústulas discretas a quadros ictiosiformes com úlceras orais e pittiings ungueais, sem febre, que apresentavam mutação no gene que codifica o antagonista da interleucina-1 (IL-1)26, 27. A ausência de controle na ativação da IL-1 determina um estado pró-inflamatório com ótima resposta ao tratamento com antagonista do receptor da interleucina-1 com melhora rápida dos sintomas28.
A descrição da Dira produziu insights para estudos de outras condições dermatológicas com manifestações sistêmicas que poderiam ter participação de mutações genéticas desencadeando autoinflamação, como na síndrome SAPHO (sinovite, acne, pustulose e osteíte) e na PPG28.
Alterações genéticas e identificação da deficiência do antagonista do receptor da interleucina-36
A ocorrência de casos PPG sem PsV tanto em indivíduos da mesma família quanto casos esporádicos foi considerada evidência adicional que ressaltou a necessidade de estudos para identificação de fatores etiopatogênicos peculiares para PPG, inclusive genéticos. Mutações em dois genes foram identificadas: no gene CARD14 e no gene IL36RN20.
O gene CARD14 codifica uma proteína que promove a ativação do fator nuclear (NF) kappaB, regulando positivamente a expressão dos genes da via pró-inflamatória20.
O gene IL36RN é expresso primariamente na pele e codifica o IL-36Ra, que neutraliza o efeito inflamatório de três citocinas da família da interleucina-1: IL-36a, IL-36b e IL-36c através da ligação com seu receptor (IL-1RL2). As IL-36 estão ausentes na pele normal; quando presentes, ativam várias vias pró-inflamatórias, como a via NF-kappaB, e a via da proteína quinase mitógena. Foram detectadas tanto mutações homozigóticas quanto heterozigóticas compostas no gene IL36RN, também conhecido como IL1F5, que codifica o antagonista do receptor de interleucina-36 (IL-36Ra) em pacientes com PPG9, 20, 29-32.
Os pacientes com a mutação IL-36Ra apresentam ativação não controlada da via inflamatória da IL-36 e manifestam clinicamente febre, queda do estado geral e erupção pustulosa generalizada. Esse distúrbio genético foi chamado de deficiência do antagonista do receptor da interleucina-36, que é denominado pelo acrônimo na língua inglesa Ditra (Deficiency of the IL-36R antagonist)9, 20, 28.
A Ditra foi inicialmente descrita em estudos para melhor caracterização da forma familiar da PPG20, desde então, outros trabalhos identificaram mutações no gene IL36RN em outros subgrupos de pacientes, como em casos esporádicos de
PPG30-32, pacientes com PPP, com ACH e com pustulose exantemática aguda
Os primeiros estudos postularam que a mutação no gene IL36RN não conferia susceptibilidade para PV20, 33, no entanto, rentemente, um estudo chinês relatou a ocorrência simultânea de PPG e PsV em paciente com mutação no gene IL36RN34.
Várias mutações homozigóticas e heterozigóticas compostas foram associadas à Ditra e estas ocorreram em diferentes faixas etárias de recém-nascidos a adultos28-32.
Pacientes com a mutação do IL36RN apresentam quadro clínico grave com pustulose generalizada e sintomas sistêmicos como febre, astenia, comprometimento do estado geral. Nesses pacientes foram observados períodos de exacerbação da pustulose nos quais podem ocorrer complicações do estado eritrodérmico, como sepse, e que podem ser fatais, já que há pouca resposta aos tratamentos convencionais para psoríase pustulosa, como metotrexate e ciclosporina, e os pacientes deixam de responder ao tratamento com inibidor de fator de necrose tumoral alfa (anti-TNF-alfa) em curto espaço de tempo30-32.
As informações quanto ao melhor tratamento para pacientes com Ditra ainda são escassas e baseiam-se em relatos e séries de casos, nos quais foram usados acitretina, leucoaférese35 e biológicos, como anti-TBF-alfa, inibidor da interleucina-136 e inibidor da interleucina-1737.
A psoríase pustulosa é rara, correspondendo a menos de 5% dos casos de psoríase, e a prevalência da Ditra neste grupo de pacientes é ainda mais incomum. Vários grupos em todo o mundo identificaram mutações no gene IL36RN tanto em famílias do sul da Tunísia13 como em casos esporádicos ou familiares de PPG da Europa e da Ásia20,29-32, mas, pelo conhecimento dos autores, este é o primeiro estudo realizado no Brasil.
OBJETIVOS
Objetivo geral
Estudar um grupo de pacientes brasileiros com diagnóstico de psoríase pustulosa generalizada em relação às suas características demográficas, clínicas, histológicas, evolutivas e genéticas, com o intuito de identificar mutações no gene IL36RN, o que pode modificar a conduta terapêutica nestes casos.
Objetivos específicos
a) Avaliar as características demográficas e clínicas desse grupo de pacientes e o comportamento evolutivo, inclusive a resposta aos tratamentos instituídos; b) Reavaliar os exames histológicos com relação a particularidades que possam
distinguir os achados nos pacientes com Ditra daqueles com psoríase pustulosa generalizada;
c) Tipificar os alelos HLA – C e relacioná-los com os HLA tradicionalmente descritos com tendo associação com a psoríase;
d) Fazer o sequenciamento do gene IL36RN em busca de mutações que propiciem o diagnóstico da deficiência do antagonista do receptor da IL-36 (Ditra).
MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo constituiu-se de uma coorte retrospectiva para detectar os casos e caracterizá-los quanto à evolução da doença. Também foi um estudo exploratório, a partir destes dados, transversal, para avaliação dos marcadores genéticos em questão.
Sujeitos da pesquisa
A pesquisa foi realizada no Ambulatório de Psoríase do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Foram selecionados pacientes cadastrados no banco de dados do ambulatório de dermatologia que se consultaram nos últimos dez anos e que mantinham acompanhamento regular no serviço com diagnóstico de psoríase pustulosa e que atendiam aos seguintes critérios de inclusão: idade maior que 18 anos, diagnóstico de formas pustulosas generalizadas de psoríase, incluindo psoríase em placas com transformação para pustulosa, psoríase pustulosa de Zampieri e pustulose generalizada de Von Zumbusch. A inclusão foi independente da modalidade de tratamento vigente e não requeria período de wash-out.
Foram considerados critérios de exclusão: formas de psoríase pustulosa localizada, como psoríase pustulosa palmo-plantar e acrodermatite contínua de Hallopeau, e falta de disponibilidade e/ou de autorização para participar das avaliações e da coleta de sangue.
Todos os princípios da declaração de Helsinque foram respeitados durante a condução do estudo, que foi aprovado pelo Comitê de Ética da instituição (parecer: 2.389.737). Os pacientes assinaram termo de consentimento informado.
Coleta de dados
As informações sobre o perfil demográfico, a evolução clínica, alterações laboratoriais e a resposta terapêutica dos pacientes foram obtidas a partir de revisão dos prontuários. As seguintes variáveis foram pesquisadas: gênero, idade, idade de início dos sintomas, história familiar de psoríase, consanguinidade entre os pais, presença de lesões de psoríase vulgar, presença de fatores desencadeantes de erupção pustulosa, velocidade de hemossedimentação, quantidade de neutrófilos no
sangue periférico, dosagem de cálcio no soro, tratamentos utilizados e resposta terapêutica.
Fonte e extração do DNA
As amostras de sangue periférico foram coletadas em tubos de 2mL com anticoagulante EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid); para a extração e purificação do DNA genômico, foi utilizado tampão de lise, combinado com uma coluna que contém uma membrana de sílica de adsorção seletiva do DNA e eluído em tampão (kit de extração de DNA DNeasy® Blood & Tissue - Qiagen). Duas alíquotas de DNA foram extraídas, sendo que um tubo foi encaminhado para o Centro de Pesquisa e Diagnóstico de Doenças Genéticas do Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo, onde foram realizadas análises das mutações genéticas, e o outro foi para o laboratório de imunopatologia do Hospital das Clínicas da Unicamp, no qual foi realizada a tipificação do HLA.
Pesquisa de Mutações
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para esses experimentos, foram sintetizados oligonucleotídeos específicos para os éxons do gene IL36RN (Figura 1) e utilizados como molde o DNA da etapa anterior.
Figura 1: Estrutura molecular do gene IL36RN
*os éxons estão identificados pela cor cinza, os íntrons localizam-se entre os éxons, a região codificante aparece em amarelo, o RNAm em vermelho ao longo do gene e os primers forward e
Os oligonucleotídeos (forward e reverse) foram utilizados na concentração de 5µM para cada reação e foram adicionados 40ng de DNA, 5µM de oligonucleotídeos, kit Master MixTopTaq™ (Qiagen) e água miliQ DNAase free para completar um volume final de reação de 20µL. As condições da PCR (Quadro 1 e 2) foram determinadas a partir das informações obtidas após a síntese dos primers.
Após a PCR, os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% e identificados de acordo com o peso molecular esperado. Os fragmentos da PCR foram purificados antes do sequenciamento por metodologia desenvolvida in house.
Quadro 1: Primers utilizados para marcar a transcrição dos seis éxons do gene IL36RN.
1F 5’ – GTGGCTGATCTGGATTTTCAGG – 3’ 2R 5’ – CCTCCACGGAGCAGATTCTG – 3’ 2F 5’ – CTGAAAGCCCCTGAGATGCA – 3’ 3R 5’ – GCTGGACAACGGGTCTATCC – 3’ 4F 5’ – GCTGTGCTGTTACTTCTGGC – 3’ 4R 5’ – CAATGCCTGGGCTCTGTAGG – 3’ 5F 5’ – TAGAGGGTGGAGTGGAGGTG – 3’ 5R 5’ – GAATCCTGCTAGGGTGTCCC – 3’ 6F 5’ – CTGAGCCTACTGAAGCCGG – 3’ 6R 5’ – CTAAGTCAGACGTGGGGGTC – 3’
Quadro 2: Procedimento de PCR para a amplificação dos éxons do gene IL36RN com Taq DNA polimerase convencional.
* Graus medidos em celsius (°C); µL – microlitros; µM – micrometro; H2O – água.
Purificação do DNA amplificado
As bandas identificadas no gel de agarose foram removidas com uma lâmina limpa, reduzindo o excesso de agarose, e transferidas para um tubo de reação de 1,5 mL. A purificação foi realizada através do congelamento por nitrogênio líquido e centrifugação (14000 x g / 10min) a fim de separar a solução líquida contida no gel. A solução líquida, que é o DNA de interesse, foi transferida para um tubo de 0,2mL para a etapa de sequenciamento.
Sequenciamento
Os DNAs purificados obtidos da amplificação por PCR foram sequenciados automaticamente por meio do sequenciador ABI PRISM 3500xl genetic analyser (Life Technologies). Foi utilizado o kit BigDye™Terminator Ready Reaction Mix, 500 ng do DNA, 5 pmoles de cada oligonucleotídeo (Forward e Reverse), 0,5 µL da solução Big Dye, tampão de reação e água para um volume final de 10 µL e foram amplificados em termociclador.
Posteriormente, a amostra obtida na reação foi purificada por precipitação através da adição de uma solução de 0,123g acetato de sódio, 0,0235g EDTA e 5 mL etanol absoluto. Trinta microlitros foram transferidos para cada poço de reação, seguida de agitação e incubação à temperatura ambiente por 15 min.
Reagentes Temperaturas
10 µL Master Mix Green GoTaq 0.5 µL primerFwd (5 ou 10 µM) 0.5 µL primerRev (5 ou 10 µM) 2 µL DNA 7 µL H2O 95 °C – 5 min 95 °C – 30 s 60 °C – 30 s x 35 72 °C – 1 min 4 °C – ∞
Após centrifugação (3.500g/ 15 min/ 16°C), a solução de etanol 70% foi desprezada e as amostras foram incubadas a 90°C por três minutos para completa evaporação do etanol 70%. O precipitado de DNA foi ressuspendido em 10 µL de formamida, as amostras foram desnaturadas a 95°C por dois minutos e imediatamente colocadas em gelo por um minuto, sendo armazenadas na geladeira até o momento da aplicação no gel.
A última etapa do sequenciamento consistiu na corrida eletroforética em gel de poliacrilamida, utilizando-se como corante fluorescente o reagente BigDye3 no método automatizado do aparelho ABI PRISM 3500xl genetic analyzer e, assim, todos os seis éxons do gene IL36RN (número de acesso GeneBank, NG_031864.1) foram sequenciados.
Tipificação HLA-C
Os alelos HLA-C foram tipificados através de PCR Oligonucleotídeo Sequência Específica (PCR/SSO) aplicada à tecnologia Luminex LaBScan 100 (Luminex Corp, Austin, TX – USA), que utiliza kit de tipificação LABType® SSO OneLambda (One Lambda, Inc., CA, USA). O DNA alvo foi amplificado através de
primer (iniciador) grupo específico marcado com biotina. Os amplicons hibridizados
foram marcados com Estreptavidina conjugada com R-ficoeritrina, que é um ligante fluorescente específico da biotina, e a intensidade de fluorescência (IF) e a intensidade colorimétrica foram quantificadas pelo analisador de fluxo Luminex LABScan 100. As reações positivas e negativas foram determinadas pela comparação das IFs das amostras ao seu correspondente valor de cut-off. Os padrões hibridizados foram classificados de acordo com as instruções do fabricante e do software HLA Fusion 4.2.
Reavaliação dos exames histopatológicos
No grupo de pacientes com psoríase pustulosa generalizada, foram recuperadas lâminas com fragmentos de pele obtidos por biópsias, arquivadas no serviço e disponíveis para avaliação. A revisão foi realizada de maneira cega e sem o conhecimento dos resultados das análises da mutação genética por dois examinadores independentes, um dermatologista e um dermatopatologista experiente.
Os seguintes critérios para diagnóstico histopatológico de psoríase foram elencados e buscados nos espécimes: hipogranulose com paraceratose intercaladas, pústula espongiforme, afilamento suprapapilar da epiderme, alongamento regular dos cones epiteliais com alargamento do ápice epitelial e papilas hipervascularizadas com infiltrado linfoide perivascular em derme papilar inferior. Além disso, características distintas desses achados que observadas nas lâminas foram anotadas.
Metodologia Estatística
A análise descritiva foi realizada para resumir as informações do banco de dados com a utilização das seguintes medidas: média, desvio padrão, mínimo, mediana e máximo da idade, idade de início da pustulose, frequência e porcentagem das variáveis categóricas.
O teste exato de Fisher foi empregado para avaliar a associação entre duas variáveis categóricas, como a associação dos dados genéticos com a presença de lesões de psoríase em placas e com os fatores desencadeantes. O nível de significância adotado foi de 5%.
Foi utilizado Statistical Analysis System for Windows (SAS System), versão 9.4. SAS Institute Inc, Cary, NC, USA para análise estatística.
RESULTADOS
O ambulatório de dermatologia da Unicamp tem 413 pacientes cadastrados com diagnóstico de psoríase; desses, um total de 12 pacientes atenderam aos critérios de inclusão do estudo.
Aspectos demográficos e clínicos
Quanto aos dados demográficos, 66,67% eram do sexo feminino, a média de idade ao diagnóstico foi de 31,92 anos com desvio padrão de 12,90, todos negaram história familiar de PPG e não havia consanguinidade entre os pais (Quadros 3 e 4).
Quadro 3: Dados demográficos e genéticos dos pacientes com psoríase pustulosa generalizada
Pacientes Sexo Idade no momento do estudo Idade de início da pustulose Mutação no gene IR36RN 1
1 Masculino 31 anos 26 anos p.Ser113Leu
Homozigose 1
2 Feminino 26 anos 23 anos p.Ser113Leu
Homozigose 1
3 Masculino 53 anos 45 anos Ausente
4 Masculino 17 anos 12 anos Ausente
5 Feminino 39 anos 27 anos Ausente
6 Feminino 25 anos 25 anos Ausente
7 Feminino 51 anos 48 anos Ausente
8 Feminino 62 anos 51 anos Ausente
9 Feminino 18 anos 16 anos Ausente
10 Feminino 63 anos 46 anos Ausente
11 Masculino 35 anos 31 anos Ausente
12 Feminino 42 anos 33 anos p.Ser113Leu
Heterozigose 1 * 1 – Mutação patogênica no gene IL36RN com troca de aminoácido serina por leucina.
Quadro 4: Dados clínicos dos pacientes com psoríase pustulosa generalizada
Pacientes Registro de febre Presença de lesões psoríase em placas 1 Sim Não 2 Sim Não 3 Sim Sim 4 Não Sim 5 Sim Sim 6 Não Sim 7 Sim Não 8 Não Sim 9 Não Sim 10 Não Sim 11 Não Sim 12 Sim Não
*aspectos clínicos registrados em prontuário durante consultas dos pacientes.
No grupo de pacientes do estudo, 58,34% tiveram registro de febre durante o atendimento, todos apresentaram eritema generalizado e pústulas (Figuras 2 e 3) e quatro participantes não tinham achados de psoríase em placas, sendo que em três destes foi identificada a mutação no gene IL36RN (Quadro 4). O teste exato de Fisher mostrou associação entre a presença da mutação no gene IL36RN e ausência de lesões de psoríase vulgar com p = 0.0182, estatisticamente significativo.
Na Figura 2, observa-se a paciente 1 com pústulas generalizadas com tendência a se agruparem em placas com fundo eritematoso formando lagos de pus e acometendo abdome e tórax anterior; e, na Figura 3, o paciente 12 com psoríase pustulosa generalizada e mutação para o gene IL36RN em heterozigose.
Figura 2: Paciente 2 com pústulas generalizadas coalescentes formando áreas com “lagos de pus” sobre base eritematosa.
Figura 3: Paciente 12 apresenta pústulas com conformação arciforme, formando placas anulares com superfície eritematosa, disseminadas no abdome e tórax anterior.
Quanto aos achados laboratoriais no primeiro atendimento no serviço, em 50% dos pacientes foi registrada hipocalcemia, em 66,67% observou-se elevação de velocidade de hemossedimentação e, em 75%, neutrofilia (Quadro 5).
Quadro 5: Dados laboratoriais dos pacientes com psoríase pustulosa generalizada Pacientes Dosagem de cálcio1 mg\dl Velocidade de Hemossedimentação2 mm\hour Dosagem de Neutrófilos3 B1 7,8 30 10275 B2 8,1 75 11960 B3 9,2 36 14960 B4 Sem registro 2 3340 B5 9,3 64 11264 B6 8,4 Desconhecido 12390 B7 8,7 21 10304 B8 8,7 78 12700
B9 Sem registro Desconhecido 5222
B10 9,6 6 9145
B11 7,8 19 14256
B12 9,1 20 6240
*1 – Valor de referência dosagem sanguínea de cálcio: 8,8-10,6 mg\dl em adultos.
2 – Valores de referência da velocidade de hemossedimentação: para homens até 10 mm / hora e para mulheres até 14 mm / hora.
3 – Valor de referência dosagem de neutrófilos.
Fatores desencadeantes de pustulose em pacientes com psoríase foram identificados em sete pacientes. Uma paciente com PPG apresentou infecção do trato urinário antes do início do quadro clínico, um paciente usou sulfassalazina e os outros cinco pacientes tinham usado corticoide, sendo que dois deles tinham a mutação no gene IL36RN.
Dentro desse contexto, a escolha terapêutica foi um desafio nesses pacientes. As medicações utilizadas foram acitretina, metotrexato, ciclosporina e imunobiológicos inibidores de fator de necrose tumoral-alfa (anti-TNF-alfa). As dosagens utilizadas bem como a resposta terapêutica de cada paciente estão apresentadas no Quadro 6.
O teste exato de Fisher não mostrou associação estatisticamente significativa entre a presença da mutação IL36RN e fatores desencadeantes de pustulose, como uso de medicações (p = 1,0000).
Quadro 6: Dados de fatores desencadeantes, tratamentos utilizados e resposta terapêutica dos pacientes com psoríase pustulosa generalizada
Pacientes Fator desencadeante da pustulose
Tratamento no momento o estudo
Resposta ao tratamento 1 Desconhecido Acitretina 25 mg por dia Excelente 2 Uso de corticoide
sistêmico
Adalimumab 40 mg SC
14-14 dias Moderada
3 Uso de sulfassalazina Acitretina 25 mg por dia Moderada 4 Desconhecido Acitretina 25 mg por dia Excelente 5 Uso de corticoide tópico Acitretina 20 mg por dia Moderada
6 Uso de corticoide sistêmico Ciclosporina 100 mg por dia e Metotrexato 15 mg por semana Excelente 7 Uso de corticoide sistêmico Infliximab 360 mg a cada 8 semanas Moderada
8 Infecção do trato urinário Infliximab 500 mg a cada
8 semanas Moderada
9 Desconhecido Metotrexato 5 mg por
semana Excelente
10 Desconhecido Acitretina 20 mg por dia Excelente 11 Desconhecido Acitretina 20 mg por dia Excelente
12 Uso de corticoide sistêmico Etanercepte e Metotrexato 15 mg por semana Excelente *mg – miligramas
Identificação de Mutações no Gene IL36RN
O sequenciamento dos éxons do gene IL36RN não encontrou nenhuma variação patogênica em nove dos 12 pacientes analisados. No entanto, foi identificada a mesma mutação patogênica (c.338C > T (p.Ser113Leu) no éxon 6 em três pacientes (1, 2 e 12), sendo que nos pacientes 1 e 2 a mutação era homozigótica e em na paciente 12 era heterozigótica.
Tipificação do HLA
Todos os 12 pacientes foram submetidos a tipificação HLA-C, nenhum dos pacientes com mutação para o gene IL36RN apresentou HLA-Cw6. Os HLA mais frequentes neste grupo foram o HLA-C04 (50% dos pacientes) e HLA-C07 (41,67% dos pacientes) (Quadro 7).
Quadro 7: Tipificação do HLA-C e presença ou ausência de mutação no gene IL36RN
Pacientes HLA-C Mutação no gene IR36RN
B1 HLA-C*04 C*08 p.Ser113Leu Homozigose 1
B2 HLA-C*03 C*07 p.Ser113Leu Homozigose 1
B3 HLA-C*03 C*04 Ausente B4 HLA-C*04 C*15 Ausente B5 HLA-C*03 C*06 Ausente B6 HLA-C*02 C*07 Ausente B7 HLA-C*04 C*12 Ausente B8 HLA-C*04 C*15 Ausente B9 HLA-C*03 C*07 Ausente B10 HLA-C*17 C*18 Ausente B11 HLA-C*04 C*07 Ausente
B12 HLA-C*07 C*07 p.Ser113Leu Heterozigose 1
*HLA – antígeno de histocompatibilidade humana; mutação p.Ser113Leu determina troca de
aminoácido serina por leucina.
Achados histopatológicos
Nesse grupo de 12 pacientes com psoríase pustulosa generalizada, nove realizaram biópsias de pele no serviço no momento do diagnóstico da psoríase pustulosa, incluindo os três pacientes com mutação do gene IL36RN, e as lâminas estavam disponíveis para revisão.
Os achados típicos elencados para diagnóstico histopatológico de psoríase foram heterogêneos neste grupo, como mostra o Quadro 8. Os pacientes 3, 9 e 10 não tinham lâminas no serviço e, por isso, seus dados não constam no Quadro 8.
Dentre os critérios diagnósticos buscados para psoríase, os três pacientes com Ditra apresentavam apenas a pústula espongiforme e o infiltrado linfoide perivascular na derme inferior.
Quadro 8: Achados histopatológicos elencados para diagnóstico de psoríase pustulosa em biópsia de pele de nove pacientes do estudo * - ausente e + presente Pacientes Hipogranulose paraceratose intercaladas Pústula espongiforme Afilamento supra papilar da epiderme Cones epiteliais alargados de maneira regular Ápice epitelial alargado Papila com aumento da vascularização Infiltrado linfoide perivascular na derme papilar inferior 1 - + - - - - + 2 - + - - - - + 4 + + + - - - + 5 + + + + - + + 6 + + - - - - + 7 - + - - - + + 8 + + + + + + + 11 + + + + + + + 12 - + - - - - +
Além disso, apenas nos pacientes com Ditra foram detectadas as seguintes peculiaridades: camada córnea fina e compacta, acidofílica com hipogranulose difusa entre as pústulas; espongiose ao longo do estrato espinhoso; neutrófilos que migram para a epiderme; queratinócitos basais de aspecto regenerativo; edema acentuado da derme papilar com extravasamento de hemácias; eosinófilos no infiltrado inflamatório linfo-histiocitário na derme papilar inferior (Figura 4).
Figura 4: Achados histopatológicos encontrados apenas nos pacientes com Ditra
A – pústula espongiforme subcórnea, derme papilar com acentuado edema e extravasamento de eritrócitos;
B – espongiose, infiltrado inflamatório perivascular superficial principalmente de linfócitos com eosinófilos;
C – exocitose de neutrófilos e eosinófilos;
DISCUSSÃO
Aspectos demográficos e clínicos
Ao se considerar a idade de início dos sintomas com PPG, observa-se uma ampla variação etária naqueles sem a mutação do IL36RN com idade mínima de 12 anos e máxima de 51 anos, enquanto nos pacientes com Ditra o início das lesões aconteceu na terceira e quartas décadas de vida.
Os pacientes com mutação p.Ser113Leu em homozigose para o gene IL36RN (paciente 1 e 2) apresentaram idade precoce de início dos sintomas, ambos na terceira década de vida, com eritrodermia difusa e sem sinais de psoríase vulgar, além de episódios de instabilidade clínica com febre, comprometimento do estado geral e hipocalcemia.
Na literatura30,32, a mesma mutação em homozigose foi identificada em outros três pacientes de origem europeia, nos quais a idade de início dos sintomas foi heterogênea ocorrendo aos cinco, 26 e 51. A apresentação clínica foi semelhante à observada nos pacientes brasileiros. Dados sobre a dosagem de cálcio não foram descritos nos trabalhos europeus, porém, os pacientes 1, 2 e 11 tiveram hipocalcemia durante as crises e foi feita correção com carbonato de cálcio via oral.
O paciente 12, no qual foi identificada a mutação em heterozigose para p.Ser113Leu, apresentou pustulose com conformação anular, caráter recidivante e início mais tardio, na quarta década de vida. As manifestações sistêmicas foram mais brandas, com febre baixa e não apresentou neutrofilia nem hipocalcemia. Essa tendência à apresentação clínica mais tardia, com pustulose mais localizada e sintomas sistêmicos menos exuberantes nos pacientes com mutação em heterozigose foi relatada em estudos semelhantes 29, 32, 38.
Neste trabalho não foram pesquisados pacientes com pustulose palmo-plantar (PPP) nem com acrodermatite contínua de Hallopeau (ACH), porém, recente revisão de literatura29 mostrou que a mutação encontrada p.Ser113Leu foi registrada em casos europeus com quadros de PPP e ACH38, 39, assim,
novos estudos podem ser conduzidos para identificação de mutações também nos pacientes brasileiros com psoríase pustulose localizada.
Apesar dos pacientes com Ditra terem manifestado clinicamente pustulose generalizada sem placas eritemato-descamativas e essa associação ter sido estatisticamente significativa, a ocorrência simultânea de PPG e psoríase em placas em pacientes com mutação para o gene IL36RN foi descrita em um estudo chinês34, no qual observou-se que uma minoria dos pacientes com a associação PPG e psoríase em placas carregavam a mutação c.115 + 6T > C no gene IL36RN, que ainda não foi descrita em brasileiros.
Novas evidências têm mostrado a participação da interleucina-36 fração gama na ocorrência de psoríase em placas. Por isso, regiões do gene que codificam a IL36 (IL36G) estão sendo estudadas e postula-se que polimorfismos genéticos do IL36G podem afetar a funcionalidade de IL-36 e, desse modo, influenciar na susceptibilidade à psoríase em placas34,40.
Aspectos genéticos
No contexto da patogênese multifatorial da psoríase, estudos mostraram susceptibilidade associada à presença de determinados HLA-C, inclusive em brasileiros7, 41. Neste grupo de pacientes com mutação para o gene IL36RN, não se encontrou HLA-Cw6, que é o mais descrito em associação à psoríase vulgar, sendo considerado um marcador de susceptibilidade encontrado em 30 a 50% dos pacientes, mas sabidamente não relacionado às formas pustulosas. Assim, esse dado pode ser considerado uma evidência adicional de que os aspectos genéticos relacionados à ocorrência de PPG e de Ditra são distintos dos marcadores de susceptibilidade para psoríase em placas.
Aspectos histopatológicos
Quanto ao aspecto histopatológico, Navarini42 observou que o edema e a infiltração celular, principalmente neutrofílica, são mais exuberantes nos pacientes que se manifestam com PPG em comparação àqueles com PsV. Uma grande quantidade de neutrófilos em todas as camadas da epiderme foi vista nas biópsias deste estudo.
Ressalta-se ainda que os neutrófilos apareceram migrando na epiderme desde a camada basal até a espinhosa, onde formavam-se as pústulas. Esse arranjo peculiar somado ao aspecto regenerativo dos queratinócitos basais permitem inferir que o processo de formação das pústulas ocorre rapidamente nos pacientes com a mutação do gene IL36RN e mediado por intensa inflamação em todos os níveis da epiderme.
Uma possível explicação para essa conformação dos neutrófilos, é que, em pacientes com PPG e Ditra, a ativação descontrolada da IL-36 induz a expressão de citocinas pró-inflamatórias nos queratinócitos, como a interleucina-8 (IL-8), que é responsável pelo rápido influxo de neutrófilos tanto na derme quanto na epiderme9, 44, 45.
Demonstrou-se também que a IL-36 é capaz de ativar o endotélio vascular43,45, levando a extravasamento plasmático significativo, resultando em edema acentuado da derme papilar, extravasamento de hemácias e de outras células, como eosinófilos, achados que foram observados nas espécimes deste estudo.
A presença de camada córnea fina e compacta, acidofílica, com hipogranulose difusa entre as pústulas observada nesse estudo pode ser ocasionada pelo prurido, em decorrência da inflamação e da manipulação das lesões pelos próprios pacientes.
Implicações terapêuticas
O tratamento da PPG, em especial dos pacientes com Ditra, é um desafio tanto pelo comportamento clínico da doença que cursa com períodos de acalmia e exacerbação quanto pela ausência de estudos baseados em evidências que abordem as opções terapêuticas mais efetivas dado a raridade dessa condição e sua descrição relativamente recente46.
O conhecimento atual acerca desse tópico é baseado em relatos e séries de casos, nos quais as drogas tradicionalmente utilizadas para psoríase pustulosa têm pouca resposta ou perdem rapidamente o efeito nos pacientes com mutação do gene IL36RN47.
Assim, o foco do tratamento para pacientes com PPG e Ditra é o controle de inflamação. Já foi descrita a utilização da associação de acitretina
com etanercepet , do inibidor da interleucina-17 , do antagonista de interleucina-136,48, bem como infliximab49, 50 e plasmaférese35.
Os pacientes deste trabalho apresentaram respostas terapêuticas distintas: o paciente 1 teve bom controle clínico com acitretina, que foi a primeira opção terapêutica; a paciente 2 teve curso clínico grave e flutuante, fez uso de metotrexato, prednisona, ciclosporina, acitretina sem controle completo das lesões e dos sintomas sistêmicos, sendo que a melhora clínica mais significativa ocorreu com a combinação de acitretina e adalimumabe e depois sustentou-se em manutenção apenas com adalimumabe. Já a paciente 12 teve evolução em surtos de pustulose com conformação anular e sintomas sistêmicos com falhas terapêuticas cíclicas a cada três anos. Apresentou uma boa resposta inicial a dapsona que se sustentou por três anos; após essa falha, foi tentado tratamento com metotrexato, ciclosporina e isotretinoína, porém, não houve boa resposta. O controle da doença foi atingido com uso de etanercepte em associação com metotrexato.
A acitretina foi relatada como opção terapêutica para PPG em pacientes jovens com melhora das lesões em casos de Ditra, apesar da ocorrência de surtos de pustulose em vigência dessa medicação, os quais podem requerer associação com biológicos, como inibidores de fator de necrose tumoral alfa51, 52.
O exato mecanismo de ação da acitretina na PPG não é conhecido, mas estudos em modelos animais51, 53 mostraram que ela pode suprimir as respostas TH17 através de receptores órfãos relacionados ao retinóide (RORs). O RORγt é um fator de transcrição relacionado a retinoide expresso exclusivamente em células do sistema imune e essencial para a diferenciação de TH1753. Os retinoides promovem down-regulation na expressão do RORγt ao estimularem a ligação deste fator de transcrição com outro receptor retinóide, o ROR-alfa, e, assim, suprimirem o desenvolvimento da resposta inflamatória mediada por TH17 que é induzida pelo RORγt53.
Na Ditra, a redução da função do IL36Ra ocasiona uma atividade não controlada das citocinas pertencentes à família IL-1, entre elas o TNF-alfa. O uso de inibidores de TNF em paciente com Ditra foi reportado com sucesso na literatura e foi observado em dois pacientes desse estudo47, 50, 54.
Revisões recentes de literatura mostraram uma resposta ao tratamento com biológicos em casos de Ditra de 57% de melhora completa em crianças e 61% em adultos43, 57. Além dos inibidores de TNF-alfa, que apresentaram uma resposta completa em 58% pacientes em um estudo43, relatos e séries de casos descrevem o uso de inibidores da interleucina-1, da interleucina-12, da interleucina-23 e da interleucina-17 em pacientes com mutação do gene IL36RN43, 57.
Uma das primeiras evidências que levaram a pesquisas de outras mutações e a descrição da Ditra foi a baixa taxa de resposta dos pacientes ao uso de anakinra em comparação àqueles com Dira28. O inibidor da interleucina-1 está relacionado à melhora de apenas cerca de 20% dos pacientes com Ditra tratados, independentemente da faixa etária48,56,57.
O tratamento com inibidor de interleucina-17 (secuquinumabe) garantiu resposta completa em 76% de um total de 32 adultos tratados e resposta parcial em mais de 20% dos adultos do mesmo estudo43. Em crianças, há registro de sucesso terapêutico com secuquinumabe inclusive em monoterapia37, 59, 60.
Já o inibidor das interleucinas-12 e 23 (ustequinumabe) foi considerado eficiente para garantir melhora completa tanto de crianças quanto de adultos com Ditra, tratados durante períodos de crises de pustulose e sintomas sistêmicos43, 55, 56,58.
A literatura mostra que a resposta terapêutica com esses dois últimos biológicos foi sustentada com ocorrência de recidivas leves ocasionais e com menores taxas de efeitos colaterais, motivos pelos quais esses medicamentos devem ser considerados no tratamento de pacientes com Ditra. 56
Estudo recente desenvolveu e avaliou a função de um anticorpo monoclonal anti-humano antogonista do receptor da interleucina-36. In vitro, o anticorpo foi capaz de bloquear a ligação da interleucina-36 ao seu receptor, inibindo a formação de citocinas inflamatórias em queratinócitos humanos primários e fibroblastos dérmicos61.
Além disso, ensaios clínicos fase três estão em andamento para avaliar a eficácia de biológicos em pacientes com Ditra (clinicaltrials.gov).
As limitações do presente estudo incluem o tamanho da amostra de 12 participantes, com três apresentando mutação, ou seja, 25%, porcentagem
semelhante à encontrada na literatura e que pode ser explicada pela raridade da Ditra. Houve limitação financeira para a pesquisa de outras mutações, como CARD-14, e para a ampliação dos participantes para pacientes com formas localizadas de psoríase, contudo, há perspectivas que esses aspectos sejam contemplados em trabalhos futuros.
CONCLUSÃO
Neste estudo, realizou-se a identificação de mutações no gene IL36RN em um grupo de pacientes brasileiros com PPG, bem com a caracterização dos aspectos clínicos, histológicos, evolutivos e terapêuticos dos pacientes com mutação do gene IL36RN atendidos em um centro de referência do estado de São Paulo – Brasil.
Em relação aos aspectos demográficos, não foram identificados casos familiares nem consanguinidade entre os pais, a mutação do gene IL36RN foi mais frequente no sexo feminino e a idade de início dos sintomas foi mais precoce nos pacientes homozigotos.
Quanto aos aspectos clínicos e bioquímicos, os pacientes apresentaram achados cutâneos com pustulose e eritema e sistêmicos, como febre e alterações laboratoriais de neutrofilia e elevação de velocidade de hemossedimentação. A evolução dos casos de Ditra foi flutuante com períodos de exacerbações sistêmicas, com uma resposta terapêutica insuficiente a metotrexato e ciclosporina e necessitaram acitretina e de biológicos anti-TNF para controle clínico.
As características histopatológicas distintas dos achados típicos de psoríase encontradas apenas nos pacientes com mutação do gene IL36RN foram edema papilar pronunciado, espongiose e migração de numerosos neutrófilos através da epiderme, culminando em pústulas espongiformes, e infiltrado linfohistiocitário misto na derme, inclusive com eosinófilos e extravazamento de hemácias. O conjunto de achados histológicos permite inferir-se que, nos pacientes com Ditra, o processo se desenvolve mais rapidamente que em outras pustuloses.
O HLA-Cw6, marcador genético mais associado à psoríase em placas, não foi identificado nos três pacientes com mutação do gene IL36RN desse estudo. Observou-se que o HLA-C mais frequente nesse grupo foi HLA-C*04.
A respeito da pesquisa genética, a mesma mutação patogênica (c.338C > T p.Ser113Leu) no éxon 6 do gene IL36RN foi identificada em três pacientes dos 12 pacientes do estudo.
Assim, a análise no gene IL36RN é um mecanismo de caracterização dos indíviduos com pustulose e no futuro deverá ser uma investigação
