UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
SOLEDAD PALAMETA
Desenvolvimento de nanopartículas biológicas, derivadas
de capsídeos retrovirais, para imunomodulação
antitumoral alvo-dirigida
CAMPINAS 2019
Desenvolvimento de nanopartículas biológicas, derivadas
de capsídeos retrovirais, para imunomodulação
antitumoral alvo-dirigida
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências, na Área de Fármacos, Medicamentos e Insumos de saúde.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA SOLEDAD PALAMETA E ORIENTADA PELO MARCIO CHAIM BAJGELMAN ORIENTADOR.
Orientador: Dr. MARCIO CHAIM BAJGELMAN
CAMPINAS 2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. MARCIO CHAIM BAJGELMAN
Profa. Dra. ANA CAROLINA MIGLIORINI FIGUEIRA
Profa. Dra. ANA PAULA LEPIQUE
Profa. Dra. MARIANA MASCHIETTO
Profa. Dra. RAQUEL CHACON RUIZ MARTINEZ
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
“Dedico este trabalho a Deus, meus pais e minhas irmãs” “Dedico este trabajo a Dios, mis papás y hermanas”
À UNICAMP pela oportunidade acadêmica no programa de pós-graduação.
Ao CNPEM por ter cedido toda a estrutura laboratorial para a realização deste projeto. Ao Dr. Kleber Gomes Franchini, diretor do LNBio, pela oportunidade e confiança. Ao meu orientador, Dr. Marcio Chaim Bajgelman, por todos os ensinamentos, liberdade e confiança para desenvolver minhas idéias e criatividade.
A todo o LVV pela convivência, apoio, troca de conhecimento e colaboração no desenvolvimento técnico deste projeto.
A todos os funcionários e colegas do LNBio, pela ajuda e colaboração no dia a dia do laboratório, disponibilidade e ensinamentos.
À Jessica Marcelino Toscaro, pela imensa ajuda na realização de vários experimentos, no suporte técnico e principalmente pela amizade, carinho e diversão. À Maria Eugenia Camargo e à Andrea Manrique pelas contribuições técnicas e
científicas prestadas em vários experimentos.
À Luciana Ruas Pereira e Michael Edward Miller, pelo auxílio e aprimoramento na etapa de escrita do presente trabalho.
Em especial, à Isadora Semionatto e Rhubia Silveira Martins pela amizade, suporte, carinho e diversão do dia a dia.
Ao Luís Peroni e à Juliana Branco pela amizade, compreensão e colaboração no laboratório durante a redação do presente trabalho.
Ao Dr. Paulo Sergio Lopes de Oliveira pela ajuda nos desenhos dos peptídeos LD e LM para geração de VLPs alvo-dirigidas.
A meus pais Omar e Susana, exemplos de vida, que têm me ensinado a fé, amor e dedicação ao trabalho, esforço e honestidade, também a minhas irmãs Florencia e Juliana, pelo amor incondicional e apoio que superou qualquer distância física.
Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Este trabalho também teve apoio do processo nº 2015/01488-2, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade do(s) autor(es) e não necessariamente refletem a visão da FAPESP.
Estratégias terapêuticas baseadas em imunomodulação têm revolucionado o tratamento do câncer. Estas estratégias são em sua maioria dirigidas à inibição de mecanismos associados à tolerância imunológica de células tumorais. Dessa maneira, destacamos a importância de anticorpos inibidores de checkpoint, descoberta a qual recentemente foi atribuído o prêmio Nobel de medicina de 2018. Estes anticorpos inibidores de checkpoint bloqueiam os receptores CTLA-4 e PD1, relacionados à manutenção da imunossupressão. Além do bloqueio de receptores inibidores de imunossupressão em células T, outra estratégia de imunomodulação consiste em estimular receptores agonistas, como OX40 e 4-1BB, potencializando a atividade linfocitária e estimulando a imunovigilância antitumoral. Neste trabalho, apresentamos o desenvolvimento de uma nova plataforma de imunomodulação antitumoral, baseada na engenharia de nanopartículas biológicas derivadas de capsídeos retrovirais, denominadas vírus-like particles (VLPs). Demonstramos que VLPs imunomodulatórias decoradas com ligantes TNFSF e GM-CSF induzem à proliferação de células T, secreção do IFN-gama e inibição de células T regulatórias, potencializando assim os efeitos antitumorais. Além disso, esplenócitos isolados de animais na presença dessas VLPs exerceram um efeito citotóxico, eliminando células tumorais em experimentos in vitro. Ainda, verificamos que as VLPs imunomodulatórias podem ser decoradas com um peptídeo alvo-específico a fim de direcionar o tropismo da partícula para células tumorais PSMA positivas. Nossos resultados sugerem que VLPs imunomodulatórias apresentam grande potencial para serem utilizadas no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas no tratamento do câncer humano.
Therapeutic strategies based on immunomodulation have revolutionized the treatment of cancer. These strategies are mostly aimed to inhibit mechanisms associated with immunological tolerance of tumor cells. Thus, we highlight the importance of
checkpoint inhibitors antibodies discovery which was recently awarded the Nobel Prize
of medicine in 2018. Checkpoint inhibitory antibodies are able to block the CTLA-4 and PD1 receptors related to the maintenance of immunosuppression. In addition to the blockade of T-cell immunosuppressive receptors, another immunomodulation strategy consists on stimulating agonistic receptors such as OX40 and 4-1BB, potentiating lymphocyte activity and enhancing antitumor immune surveillance. In this project, we introduce the development of a new antitumor immunomodulation platform, based on the engineering of biological nanoparticles derived from retroviral capsids, named virus-like particles (VLPs). We demonstrate that immunomodulatory VLPs decorated with TNFSF ligands and GM-CSF cytokine induce T-cell proliferation, IFN-gamma secretion and inhibition of regulatory T cells, therefore potentiating the antitumor effects. In addition, these VLPs mediated a cytotoxic effect by killing tumor cells, cocultivated to splenocytes, in vitro. We have also found that immunomodulatory VLPs can be decorated with a target-specific peptide driving particle tropism to PSMA positive tumor cells. Our results suggest that immunomodulatory VLPs may have the potential to be used for the development of new therapeutic approaches in the treatment of human cancer.
APC- Célula Apresentadora de Antígenos APC- Allophycocyanin
CFSE – Carboxyfluorescein Succinimidyl CTLA-4- Antígeno 4 de Linfocito T Citotóxico
CNPEM – Centro de Pesquisa em Energia e Materiais DC- Célula Dendrítica
DMEM - Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium FBS – Soro Fetal Bovino
FITC- Fluorescein isothiocyanate FOXP3 – Forkhead Box P3 GFP – Green Fluorescent Protein
GM-CFS- Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Macrófagos IFN-Υ- Interferon Gama
IL- Interleucina
ITR- Células T Regulatórias Induzidas
LNBio – Laboratório Nacional de Biociências LVV – Laboratório de Vetores Virais
MHC – Complexo Principal de Histocompatibilidade
MDSC- Células Supressoras Derivadas da linhagem Mieloide NK- Célula Natural Killer
NTA – Análise de Rastreamento de Nanopartículas PBS – Tampão Fosfato Salino estéril
PSMA- Antígeno de membrana específico de próstata RPMI – Roswell Park Memorial Institute
T reg – Células T Regulatórias
TAA – Antígenos Associados ao Tumor TAM- Macrófagos Associados ao Tumor TCR- Receptor de Antígeno de Células T
TGF-β – Fator de Transformação do Crescimento Beta TIL- Linfócitos T Infiltrantes
TNF- Fator de Necrose Tumoral
TNFSFR – Superfamília dos Receptores do Fator de Necrose Tumoral TSA- Antígenos Específicos ao Tumor
1. Introdução ... 15 1.1 Aspectos imunológicos do câncer ... 15 1.2 A resposta imune antitumoral depende de uma sucessão de eventos que ocorrem no sítio tumoral e órgãos linfoides ... 17 1.3 Imunovigilância, Imunoedição e mecanismos de controle da progressão
tumoral ... 21 1.4. Evasão ao sistema imune no microambiente tumoral ... 24
1.4.1. A imunossupressão pode ser mediada por células T regulatórias, que apresentam a propriedade única de inibir a proliferação de células T efetoras . 24 1.4.2. A baixa imunogenicidade tumoral e reduzida apresentação de antígenos para células T efetoras torna as células tumorais invisíveis ao sistema imune .. 26 1.4.3. Alteração do metabolismo no microambiente tumoral induz à
imunossupressão das células T efetoras que favorece o crescimento tumoral . 27 1.4.4. Inibição da resposta imune por células dendríticas ... 28 1.4.5. Acúmulo de células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) e macrófagos associados ao tumor (TAMs) ... 29 1.5. A resposta imunológica depende de processos de ativação celular que são regulados por sinalizações mediadas por receptores de superfície ... 31
1.5.1. O receptor de superfície 4-1BB pode desempenhar um papel muito importante na coestimulação e ativação de células T ... 38 1.5.2. A célula T pode receber sinais co-estimulatórios pelo receptor de
superfície OX40, aumentando sua ativação, longevidade e sobrevivência ... 39 1.5.3. Estratégias para fortalecer ativação de células dendríticas e de co-estimulação em células T podem ser utilizadas para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas para o tratamento de câncer ... 41 1.6. Desenvolvimento de nanopartículas biológicas derivadas de capsídeos virais... ... 51
1.6.2. VLPs como uma nova plataforma para imunomodulação antitumoral alvo-dirigida ... 57 2. Objetivos ... 59 3. Metodologia ... 61 3.1. Produção e purificação de VLPs ... 61 3.1.1. Produção de VLPs ... 61
3.1.2. Analise de rastreamento (NTA) ... 62
3.2. Caracterização de VLPs ... 63
3.2.1. Ensaios com partículas de poliestireno ... 63
3.2.2. Ensaios com células modificadas geneticamente para expressar receptores correspondentes aos ligantes alvos ... 63
3.3. Avaliação funcional das VLPs ... 64
3.3.1. Ensaios de inibição de Foxp3 ... 64
3.3.2. Experimentos de proliferação de células T efetoras e quantificação de IFN gamma ... 65
3.3.3. Experimentos de inibição de imunossupressão ... 66
3.3.4 Teste in vitro de citotoxicidade celular ... 66
3.3.5. Experimentos in vivo ... 67
3.4. Análise estatística ... 67
4. Resultados ... 68
4.1. Produção e caracterização de VLPs imunomodulatórias ... 68
4.2. Avaliação da função imunomodulatória das VLPs em ensaios in vitro e in vivo... ... 75
4.3. Desenvolvimento de VLPs imunomodulatorias carregando ligantes alvo-específicos que apresentam tropismo por células tumorais PSMA positivas ... 80
imunocompetente desafiado com células tumorais singênicas. ... 88
5. Discussão ... 91
6. Conclusões ... 96
7. Bibliografia ... 97
1 Introdução
1.1. Aspectos imunológicos do câncer
O câncer é uma doença genética que ocorre quando a informação no DNA celular é alterada, levando a padrões anormais de expressão gênica. Consequentemente, os genes que regulam as funções celulares, como o crescimento, a sobrevivência, a invasão e motilidade, podem ser superexpressos e os genes que suprimem essas funções podem ser inibidos, levando à multiplicação celular descontrolada. A principal causa é o acúmulo de mutações, dadas por predisposição genética, hábitos alimentares, excessiva exposição ao sol e a produtos químicos, tabagismo, obesidade, uso de drogas, vírus, alcoolismo e sedentarismo, embora alterações não-mutacionais (epigenéticas) também contribuam para a tumorigênese (You and Jones 2012).
A expressão gênica aberrante causa mudanças fundamentais nos processos biológicos nas células cancerígenas. Esses processos foram detalhadamente discutidos no trabalho de Hanahan e Weinberg, em que os autores organizaram características associadas à complexidade da biologia do câncer em seis grupos principais: autossuficiência em sinais de crescimento, insensibilidade a sinais anti-crescimento, evasão de apoptose, potencial replicativo ilimitado, angiogênese sustentada, potencial de invasão reprogramação do metabolismo energético e evasão da resposta imune, assim como duas características facilitadoras: instabilidade genômica e inflamação promotora do tumor (Figura 1) (Hanahan and Weinberg 2000 e 2011).
1.2 A resposta imune antitumoral depende de uma sucessão de
eventos que ocorrem no sítio tumoral e órgãos linfoides
O processo de resposta imune antitumoral foi descrito didaticamente como um ciclo imuno-tumoral (Chen and Mellman 2013). Este ciclo se inicia com a expressão de antígenos tumorais, fagocitose e apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos (APCs), ativação e migração de APCs para órgãos linfoides, ativação e proliferação de células T, migração linfocitária para o sítio tumoral e eliminação do tumor (Figura 2).
A progressão em cada etapa deste ciclo imuno-tumoral requer a coordenação de vários fatores, tanto estimulatórios quanto inibitórios. Fatores estimulatórios promovem a imunidade e a resposta antitumoral, enquanto os inibidores ajudam a manter o processo sob controle e reduzem a atividade imunológica e/ou previnem a autoimunidade atuando como feedback regulatório imunológico.
Num primeiro passo do ciclo imuno-tumoral, células cancerígenas liberam antígenos no microambiente. Durante o processo de transformação, uma célula pode vir a expressar uma proteína em níveis anormais ou mesmo novas proteínas que não tinham expressão anteriormente, como por exemplo moléculas induzidas por estresse, tais como calreticulina de superfície e outras macromoléculas. Essas macromoléculas podem ser processadas e apresentadas na superfície das células tumorais, no contexto de moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), como antígenos alterados em relação às células normais (Antígenos associados ao tumor-TAAS) ou mesmo antígenos específicos de tumores (Antígenos específicos de tumor-TSAs) (Coussens and Werb 2002; Kelderman and Kvistborg 2016). Esses complexos MHC-Antígenos podem ser reconhecidos por células T efetoras citotóxicas e células natural killer (NK), desencadeando a resposta citotóxica específica contra as células tumorais. Dessa forma, para que se produza uma resposta de célula T anticancerígena, ela deve ser acompanhada de sinais potencializadores de modo que a tolerância periférica aos antígenos tumorais não seja induzida. Essa sinalização imunogênica pode incluir a secreção de citocinas e fatores liberados pelas células em processo de morte.
As citocinas são mensageiros moleculares que permitem que as células do sistema imunológico se comuniquem de maneira eficiente umas com as outras para gerar uma resposta rápida, coordenada e robusta. Diferentes tipos de células secretam a mesma citocina e uma única citocina pode agir em diversos tipos de células, fenômeno denominado pleiotropia. As citocinas são redundantes em suas atividades, ou seja, ações semelhantes podem ser desencadeadas por diferentes citocinas. No microambiente tumoral encontram-se citocinas pró-inflamatórias, como as interleucinas IL1, IL 2, IL 6, IL 7, IL12 e o fator de necrose tumoral (TNF) que potencializam a resposta inflamatória induzindo à proliferação, diferenciação e ação das células T favorecendo o reconhecimento das células tumorais; e citocinas anti-inflamatórias como as interleucinas IL-4, IL-10, IL-13 e fator transformador de crescimento β (TGF-β), que favorecem ao ambiente imunossupressor e a progressão tumoral mediante mecanismos de inibição e anergia nas células T e outras células imunes.
No segundo passo do ciclo imuno-tumoral, as células dendríticas (DC), principais APCs, devido a alto nível de expressão constitutiva do MHC e de moléculas estimulatórias, capturam esses antígenos podendo receber sinalizações de ativação, estimulando-se a sua migração para os órgãos linfoides.
A seguir, temos o terceiro passo, o qual ocorre no órgão linfoide. Neste passo a célula DC ativada apresenta o antígeno tumoral para às células T virgens. A célula T virgem é um tipo de célula T madura, diferenciada no timo que se localiza nos órgãos linfoides periféricos e que se caracteriza por nunca ter tido contato com um antígeno. Quando um antígeno apresentado por uma APC se liga ao receptor de antígeno de célula T (TCR) localizado na membrana celular das células T virgens, essas células são ativadas através da cascata de transdução de sinal. A partir deste processo de ativação, estas células T são estimuladas a proliferar e se diferenciar em células T efetoras, as quais estarão ativamente envolvidas na resposta imune (linfócitos T citotóxicos e linfócitos T helper), ao saírem do órgão linfoide e ganharem a circulação. Outras células também são estimuladas a se multiplicarem e se diferenciarem em células T de memória. Estas células de memória não atuam diretamente na resposta efetora, mas são mais facilmente e rapidamente induzidas a se tornarem células T efetoras por um encontro posterior com o mesmo antígeno. (Abbas 2015).
Posteriormente, no quarto passo do ciclo imunológico antitumoral, células T ativadas migram através dos vasos sanguíneos para o local do tumor. Uma vez na corrente sanguínea, os linfócitos são atraídos para o sítio tumoral por fatores quimiotáxicos liberados pelo tumor ou células imunitárias no microambiente tumoral, bem como sinais nos vasos sanguíneos perto da área do tumor.
No quinto passo, as células T efetoras precisam se infiltrar no tecido tumoral de modo a alcançar as células cancerígenas e atacá-las. Assim, vasos sanguíneos podem se dilatar, tornando-se mais finos e células imunitárias reconhecem moléculas de adesão celular expressas nas células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos para aderir-se aos mesmos.
No sexto passo, as células T efetoras reconhecem os antígenos do tumor (TAAs ou TSAs), que devem ser os mesmos previamente apresentados no linfonodo, para a ativação e expansão de células T. Como consequência, mecanismos endógenos nas células T são ativados, agora no sétimo passo do ciclo imunológico antitumoral, com o fim de eliminar as células cancerígenas, entre eles, a liberação do IFN-γ, que pode mediar os efeitos antitumorais, inibindo a proliferação de células tumorais e a angiogênese, a indução à apoptose das células tumorais pelas células T citotóxicas (CD8+) mediada por receptores como Fas e TRAIL, ou secretando perforina e granzimas. As células T efetoras também colaboram na produção e secreção de citocinas pro-inflamatórias ou antitumorais que promovem a fagocitose, citotoxicidade e a proliferação de células da imunidade inata. Por conseguinte, a morte das células tumorais ocasiona liberação antígenos adicionais que permitem um novo reconhecimento pelas APCs. Estas, por sua vez, ativam células T nos linfonodos que migram para o sítio tumoral, aumentando assim a resposta imune antitumoral e reiniciando o ciclo imunológico.
Figura 2. Ciclo imunológico antitumoral. A eliminação das células tumorais envolve mecanismos do sistema imunológico inato e adaptativo com a participação de uma variedade de células imunitárias e fatores estimulátorios (em verde) que podem favorecer a defesa antitumoral ou inibitórios (vermelho) levando à tumorogênese e escape do sistema imunológico promovendo a progressão do tumor. Adaptado de Chen and Mellman 2013.
1.3 Imunovigilância, imunoedição e mecanismos de controle da
progressão tumoral
O desenvolvimento de câncer pode representar uma falha no reconhecimento dos antígenos associados a tumores e falta de respostas de células T específicas a tais antígenos. A capacidade de detecção de um tumor pelo sistema imune foi chamada de imunovigilância, teoria formada desde que Ehrlich, em 1909, propôs pela primeira vez a ideia de que células nascentes transformadas (células tumorais) surgem continuamente em nossos corpos e que o sistema imunológico detecta e erradica essas células antes que elas se manifestem clinicamente.
Recentemente, o entendimento dos mecanismos de interação do sistema imune com o tumor levou a propor-se o conceito de imunoedição do câncer, processo complexo que envolve desde a imunovigilância até a fuga imunológica e que consiste em três fases essenciais : (1) eliminação; (2) equilíbrio e (3) escape (Figura 3) (Swann and Smyth 2007).
O ciclo imunológico antitumoral previamente descrito por Chen e Melman 2013, representa a fase de eliminação tumoral, quando antígenos associados ao tumor são reconhecidos e componentes do sistema imune inato e adaptativo são acionados para desenvolver respostas contra o tumor. De fato, é evidenciado em tecidos neoplásicos a presença de linfócitos T infiltrantes (TIL) CD4+ e CD8+ específicos para peptídeos tumorais, como também macrófagos ativados, células NK, aumento da expressão de moléculas MHC de classe II e das moléculas 1 de adesão intercelular (ICAM-1), além de altos títulos de imunoglobulinas contra um vasto repertório destes antígenos (Hanahan and Coussens 2012).
A fase de eliminação tumoral, entretanto, pode ser completa ou parcial, em função de mecanismos de feedback regulatórios, imunológicos ou componentes inibitórios do ciclo antitumoral que podem interromper o desenvolvimento ou limitar a imunidade. Células tumorais resistentes à eliminação se multiplicam em um microambiente em equilíbrio, onde o tumor se desenvolve enquanto o sistema imune o contrapõe.
Consequentemente, na fase de equilíbrio, o sistema imunológico mantém o tumor em um estado de dormência funcional. Algumas células tumorais sofrem alterações genéticas e epigenéticas e, devido à pressão imune constante, evoluem variantes de células tumorais que resistem ao processo de imunovigilância (perda de antígeno ou defeitos na apresentação do antígeno) e induzem à imunossupressão. A fase de equilíbrio é um equilíbrio entre citocinas pro-inflamatórias ou antitumorais (que favorecem a proliferação, diferenciação e ação de células imunitárias) e citocinas anti-inflamatórias ou promotoras de tumor (que inibem a ação de células imunes favorecendo o fenótipo imunossupressor) (Coussens and Werb 2002).
A pressão exercida pelo sistema imunológico durante esta fase é suficiente para controlar a progressão tumoral, mas, eventualmente, se a resposta imune ainda não elimina completamente o tumor, o processo resulta na seleção de variantes de células tumorais que são capazes de resistir, evitar ou suprimir a resposta imune antitumoral levando à fase de escape.
Durante a fase de escape, o sistema imunológico é incapaz de restringir ao crescimento do tumor e, portanto, as células tumorais causam a doença clinicamente visível. Nesta fase, as células tumorais evadem ao reconhecimento imunológico, expressam moléculas de resistência aumentada, sobrevivência, imunossupressão e angiogênese (Dunn et al. 2002; Swann and Smyth 2007).
Figura 3. Imunoedição do câncer. Processo pelo qual o câncer progride a partir de novas variantes de células tumorais resistentes à vigilância imunológica. Adaptado de Swann and Smyth 2007.
1.4. Evasão ao sistema imune no microambiente tumoral
Durante a fase de escape, o microambiente tumoral é considerado um fator chave no processo de imunossupressão, contendo principalmente células endoteliais vasculares angiogênicas, células imunes infiltrantes e células estromais (Hanahan and Coussens 2012). Deste modo, para ludibriar a vigilância imunológica, células tumorais fazem uso de mecanismos que envolvem células do sistema imune. A seguir são detalhados alguns desses mecanismos supressores.
1.4.1. A imunossupressão pode ser mediada por células T regulatórias, que apresentam a propriedade única de inibir a proliferação de células T efetoras
As células T regulatórias (Treg) são uma subpopulação de células T que apresentam a capacidade de inibir a proliferação de células T efetoras, desempenhando, portanto, um importante papel na tolerância imunológica (Dasgupta and Saxena 2012). A células T regulatórias CD4 positivas apresentam diversos marcadores de superfície também existentes em outras células CD4 ativadas, como 4-1BB, OX40, CD27, CTLA-4 (antígeno 4 associado a linfócitos T citotóxicos, também conhecido como CD152) entre outros (Chen and Oppenheim 2011). Além disso, dados da literatura demonstram a importância do fator de transcrição FOXP3, associado à manutenção do fenótipo imunossupressor (Hori, Nomura and Sakaguchi 2003). Alguns trabalhos também descrevem a existência de células T regulatórias CD8 positivas e FOXP3 negativas (Yu et al. 2018).
Circulando no sangue periférico, células Treg podem migrar para o sítio tumoral e exercer uma função imunossupressora no local. O recrutamento dessas células é principalmente devido às quimiocinas liberadas pelas células tumorais e células mieloides que interagem com receptores quimiotáxicos das células Treg, atraindo-as. Quimiocinas como CCL17, CCL22, CCL5, entre outras, e receptores correspondentes foram encontrados em vários tipos de câncer, sendo utilizados como alvo para estratégias terapêuticas (Gobert et al. 2009; Sarvaiya et al. 2013; Wu et al. 2009; Nishikawa and Sakaguchi 2010; Mougiakakos et al. 2010).
Um dos mecanismos de imunossupressão utilizados pelas células Treg envolve o contato direto com a célula T CD4+ efetora e requer a participação de moléculas inibitórias de superfície como a interação de CTLA-4, constitutivamente expresso nas células Treg, com B7-1 (CD80) encontrado na superfície das APCs e células T efetoras induzindo essas células à anergia (Read et al. 2006). Além disso, as células Treg expressam ectoenzimas, que são enzimas ectonucleotidases ligadas à membrana plasmática da célula que apresentam o sítio ativo voltado para o meio extracelular e que induzem supressão a traves da hidrólise de ATP à adenosina. Durante o processo de inflamação, ATP é liberado ao meio e a ectoenzima CD39 (dNTPase) o degrada até AMP-5’, que é posteriormente catabolizado pela ectoenzima CD76 para adenosina que, por sua vez, pode acoplar-se a receptores A2A da adenosina localizada na membrana celular de células T citotóxicas efetoras e exercer efeitos inibitórios na proliferação celular. Este processo ocorre através da inibição seletiva da expressão de citocinas, incluindo IL-2 e IFN-γ que pode ocorrer por bloqueio da proteína quinase A (PCA), do fator nuclear NF-κB ou através da ativação de um repressor de transcrição chamado ICER (repressor precoce de cAMP indutível) (Cekic and Linden 2014; Borsellino et al. 2007; Kobie et al. 2006).
As células Treg produzem e secretam citocinas inibitórias como a TGF-β, que pode atuar na modulação do fator de transcrição FoxP3, associado à conversão de células T efetoras em células T regulatórias induzidas (iTRs). A secreção da citocina IL-10, inibe a ativação das APCs e regula positivamente a expressão do inibidor PDL1 (Ligante da proteína de morte celular programada 1) na superfície destas células. O PDL1, por sua vez, interage com o receptor PD1 (Proteína de morte celular programa 1) da superfície de células T efetoras infiltrantes induzindo à anergia e apoptose (Annacker et al. 2003; Thomas and Massagué 2005 ; Neuzillet et al. 2015).
O sequestro ou captura de IL-2 a partir do meio extracelular é uma das consequências distintivas da expressão de FoxP3 em células Treg, coincidindo com a incapacidade de produzir tal citocina. Além disso, as células Treg apresentam expressão constitutiva de CD25 e cadeia α do receptor de alta afinidade para IL-2. Assim como as células T efetoras, as células Treg requerem IL-2 que exerce função na sua sobrevivência. Essa combinação de ausência de produção autócrina de IL-2 e alta expressão do seu receptor de alta afinidade leva ao sequestro de IL-2 do meio, privando os linfócitos efetores circundantes dessa citocina indispensável para
ativação, proliferação e função. Dados da literatura aonde foram analisadas amostras clínicas isoladas de pacientes com câncer demonstram a ocorrência de um aumento na população de células T regulatórias no sítio tumoral e no sangue periférico (Curiel et al. 2004; Wolf et al. 2003). Neste cenário, o resultado é o aumento de células Treg que podem suprimir linfócitos T efetores, os quais seriam úteis na destruição do tumor (Thornton and Shevach 1998; Fontenot et al. 2005).
1.4.2. A baixa imunogenicidade tumoral e reduzida apresentação de antígenos para células T efetoras torna as células tumorais invisíveis ao sistema imune
A perda de apresentação de antígenos é um mecanismo frequente e importante utilizado por células tumorais a fim de escapar ao reconhecimento e destruição do sistema imunológico (de Charette, Marabelle and Houot 2016).
Vários mecanismos podem levar a falha na apresentação de antígenos pelas células tumorais, como por exemplo, a regulação negativa ou mutações dos genes do MHC, que podem levar a uma baixa expressão de moléculas de MHC, ou mesmo a alteração no carregamento de antígenos tumorais no MHC devido a uma série de fatores: eventuais defeitos no imunoproteossoma, no mecanismo de processamento de antígenos (APM), no transportador associado ao processamento de antígenos (TAP) para o MHC-I e na enzima tiol redutase lisossômica indutiva de interferon-gama (GILT) ou HLA-DM para MHC-II. Por fim, a sinalização de MHC para células T pode ser dificultada por uma regulação negativa de moléculas co-estimulatórias como CD80 e CD86 (Garrido, Cabrera and Aptsiauri 2010).
De acordo com a literatura, observou-se que células tumorais expressam MHC II de forma constitutiva ou induzida após a estimulação com INF-γ (Rodriguez et al. 2007). Esse padrão de expressão foi primeiramente associado a um melhor prognóstico de vários tumores (Azimi et al. 2012; Johnson et al. 2016), embora o seu efeito permaneça controverso em alguns tumores, particularmente no melanoma (Colloby, West and Fletcher 1992). Esta controvérsia pode ser explicada pelo fato de que a apresentação do MHC-II na ausência de um segundo sinal co-estimulatório
(CD80 e CD86) pode levar à anergia das células T e isto seria uma estratégia de escape à vigilância imunológica pelas células tumorais. Portanto, dependendo da presença ou ausência de moléculas co-estimulatórias (Bernsen et al. 2003) juntamente com o MHC-II, as células tumorais podem ser “imunogênicas” (Guerry et al. 1984) ou "tolerogênicas". Além disso, foi reportado que o MHC-II apresenta um sítio de ligação para o gene de ativação 3 dos linfócitos (LAG-3), que é um receptor inibitório expresso nas células T, com uma afinidade maior do que a proteína CD4. O LAG-3 é expresso particularmente em células T infiltrantes do tumor ativadas regulando negativamente a funcionalidade dessas células (Demeure et al. 2001).
Portanto, tais alterações impedem o reconhecimento de antígenos tumorais por células T efetoras, tornando então as células tumorais "invisíveis” aos receptores das células T (TCRs) e dificilmente elimináveis pelo sistema imune.
1.4.3. Alteração do metabolismo no microambiente tumoral induz à imunossupressão das células T efetoras que favorece o crescimento tumoral
O metabolismo alterado das células cancerígenas influencia o estado nutricional no microambiente tumoral levando a uma alta taxa de proliferação de células tumorais e à inibição de células imune efetoras (MacIver, Michalek and Rathmell 2013).
As células cancerígenas são grandes consumidoras de glicose e utilizam a glicólise como via metabólica primária, capturando altas taxas de glicose do meio para a produção de energia. Consequentemente, este substrato pode ser depletado, levando as células T efetoras infiltrantes à hipoglicemia, o que impede a ativação completa dos linfócitos T citotóxicos e diminui também suas funções de expansão, diferenciação e ação no microambiente tumoral (Chang et al. 2015; Mendler et al. 2012). A acidificação do sítio tumoral também é responsável por aumentar a atividade de células supressoras mielóides derivadas de infiltração tumoral (MDSCs) e dos macrófagos associados a tumores (TAMs) (Freemerman et al. 2014).
A metabolização exacerbada dos aminoácidos triptofano, arginina e glutamina pelas células cancerígenas desencadeia deficiência de aminoácidos, o que pode suprimir as respostas antitumorais dos linfócitos T citotóxicos (Mezrich et al. 2010). O acúmulo de adipócitos e fibroblastos semelhantes a adipócitos, assim como a produção de grandes quantidades de ácidos graxos pelas células cancerígenas, levam ao enriquecimento lipídico no local. Tais condições metabólicas podem promover o desenvolvimento e diferenciação de células Tregs e suprimir as funções dos linfócitos T efetores (Currie et al. 2013).
1.4.4. Inibição da resposta imune por células dendríticas
Embora as células DC sejam as principais APCs e desencadeiam respostas imunes efetivas no microambiente tumoral, estas encontram-se inativas. Desta maneira, expressam baixos níveis de ligantes co-estimulatórios de células T efetoras como CD80, CD86 e CD40, superexpressando também ligantes de receptores inibidores como PDL1, CTLA4, Tim3 e LAg3 que após interagirem com células T efetoras, poderiam levar à inibição e anergia (Hurwitz and Watkins 2012).
Além de pouco imunogênicos, os tumores podem apresentar a capacidade de produzir citocinas e quimiocinas, entre outros fatores como o GM-CSF, IL-10, TGF-β, MIP3-α, VEGF, M-CSF, IL-6, IL-10 e gangliosideos, que também atuam na inibição e modulação do funcionamento das DCs, mantendo-as no fenótipo imaturo ou, ainda, promovendo o recrutamento de linfócitos Treg para o sítio tumoral (Kah-Wai et al. 2006).
Os linfócitos Tregs podem interferir na maturação das DCs através da liberação da enzima indoleamina 2,3 – dioxygenase (IDO) que, por sua vez, é estimulada por IFN-γ (Brandacher et al. 2006) e pela interação entre o CTLA-4 e as moléculas co-estimulatórias. A IDO acarreta na diminuição da expressão de moléculas co-estimulatórias nas DCs, por um mecanismo dependente da ligação entre a proteína de superfície CTLA-4 a moléculas co-estimulatórias (Wing and Sakaguchi 2012). Por outro lado, tem sido reportado que um grupo de DCs em nódulos linfáticos são capazes de secretar também IDO, o que favorece a conversão e função das células
Treg (Sharma et al. 2007). A enzima IDO também é responsável pelo catabolismo do triptofano e pela depleção deste aminoácido, acarretando na queda da produção de metabólitos no meio.
1.4.5. Acúmulo de células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) e macrófagos associados ao tumor (TAMs)
Os macrófagos podem ser classificados de acordo seu fenótipo: 1) macrófagos do tipo 1 (M1), capazes de produzir uma quantidade significativa de citocinas pró-inflamatórias e 2) macrófagos do tipo 2 (M2), capazes de produzir vários fatores de crescimento e estão envolvidos na remodelação tecidual e no controle de respostas imunes inatas. Os TAMs apresentam um fenótipo semelhante aos M2 e reportou-se que o aumento no número dessas células no microambiente tumoral pode piorar o prognóstico da doença devido à sua produção das citocinas inibitórias IL-10 e TGFβ, que suprimem a proliferação de linfócitos T e também podem estimular à conversão de linfócitos efetores em células Tregs. As células tumorais, através da produção de fatores que promovem a angiogênese, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e a angiopoietina 2, e fatores quimiotáxicos, como a quimiocina CCL2, promovem a migração de monócitos da corrente sanguínea para o sítio tumoral que, então, diferenciam-se em TAMs (Goswami et al. 2017). O acúmulo de MDSCs vem sendo reconhecido como um dos principais mecanismos capazes de promover a carcinogênese. Essas células são originárias de tecido mielóide e constituem progenitores de células mielóides, precursores de DCs, monócitos, macrófagos e granulócitos (Bronte 2009). MDSCs podem inibir a funcionalidade de linfócitos ativados e induzir a inibição de linfócitos T citotóxicos. Células produtoras de IL-10, como algumas DCs, podem estimular MDSCs a aumentar a expressão de PD-L1 em suas superfícies, o que acaba levando à disfunção de linfócitos T através da via PD-1 / PD-L1, enfatizando o papel das MDSCs na supressão tumoral (Gabrilovich 2017; Umansky et al. 2016).
Contudo, tais mecanismos imunossupressores no sítio tumoral favorecem ao crescimento e desbalanço do equilíbrio para as células tumorais, levando à disfunção de células T no contexto de anergia, senescência e exaustão. Entre as
características das células T exauridas encontram-se: 1) comprometimento progressivo da efetividade ou funcionalidade, 2) co-expressão regulada positivamente de receptores inibitórios (Fourcade et al. 2010; Fourcade et al. 2011), 3) produção diminuída de citocinas como IL-2, IFN-γ e TNF-α que inibem a proliferação de células NK tornando-as incapazes de lisar células que apresentem uma diminuição na expressão de MHC de classe I em sua superfície (Maj et al. 2013; Pauken and Wherry 2015), 4) perda da capacidade de sobrevivência em longo prazo , devido aos baixos níveis de expressão de CD122 (a cadeia β do receptor de IL-2 e IL-15) e CD127 (a cadeia α do receptor de IL-7), e 5) alteração no metabolismo celular, nível de transcrição de DNA e funcionalidade de fatores de transcrição, a exemplo T-bet e Eomes, que estão associados a diferenciação de células T e produção de citocinas antitumorais (Zenz 2013).
A exaustão das células T pode estar relacionada à formação defeituosa de células T de memória e num estado avançado de deleção física, onde células T severamente exauridas são eliminadas do microambiente tumoral, perdendo, assim, a capacidade de eliminar células tumorais.
Em contrapartida, para que o ciclo imunológico do câncer funcione corretamente, eliminando células tumorais e evitando prevalecer fatores inibitórios que levem ao escape da imunovigilância, as etapas de apresentação de antígenos tumorais pelas APCs e ativação de células T são cruciais.
A imunoterapia tem como um de seus principais objetivos desenvolver estratégias que modulem o ciclo imunológico antitumoral, permitindo que ele se amplifique e propague, além de procurar minimizar respostas inflamatórias autoimunes.Assim, o estudo dos processos de ativação de células T e apresentação de antígenos são de grande importância no avanço de terapias para o câncer.
1.5. A resposta imunológica depende de processos de ativação
celular que são regulados por sinalizações mediadas por
receptores de superfície
A ativação de células T envolve um processo complexo, onde as DCs desempenham um papel fundamental devido ao fato de serem potentes APCs e exercerem a capacidade de iniciar e modular respostas imune mediadas por células T (Steinman and Cohn 1973; Banchereau and Steinman 1998).
As DC encontram-se espalhadas por todo o corpo, residindo em diferentes tecidos num estado de repouso, considerando-se imaturas, mas preparadas para adquirir antígenos já que apresentam vários receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs), que são capazes de detectar a invasão destes (Medzhitov and Janeway 2002) e autoestruturas associadas ao estresse celular (Matzinger 2002).
Após exposição a "estímulos ativadores", as DCs sofrem uma série de alterações fenotípicas e funcionais, denominadas "ativação" e "maturação", respectivamente (Gerner et al. 2017).
O processo de ativação da DC é uma diferenciação rigidamente controlada e está intimamente associado à aquisição de antígeno. Assim, é caracterizada pela regulação positiva dos receptores de quimiocinas (por exemplo, CCR7), moléculas de adesão (ICAM-1), moléculas co-estimulatórias (CD40, CD80 e CD86), immunoproteosomas e MHC de classe I e moléculas II, essenciais para a migração das células para os tecidos linfoides e ativação ótima das respostas imunes. As citocinas produzidas durante esse processo influenciam as respostas imunológicas geradas pelos subtipos de células T.
A maturação de DC é reconhecida pela redução da capacidade fagocítica, melhoramento no processamento e apresentação de antígenos e migração para os tecidos linfoides, além do aumento da capacidade para estimular as células B e T. A maturação também pode ser induzida por agentes microbianos que desencadeiam a ativação de receptores de reconhecimento de patógenos: como receptores tipo Toll (TLRs), ativação de sensores intracelulares ou ação de moléculas inflamatórias (TNF, IL-1, IL-6, IFNα) produzida pelas células do sistema imunológico ou pelos tecidos
danificados. As células mortas também podem liberar fatores que ativam DCs como por exemplo, proteínas de choque térmico, RNA e DNA.
Assim, nos tecidos linfoides, DCs ativadas interagem com células T virgens de modo a ativá-las e convertê-las em células T efetoras responsivas aos antígenos apresentados.
A ativação das células T depende da intensidade e duração das interações células T: DCs, mediadas pela sinapse imunológica. A sinapse imunológica é formada como resultado da reorganização do citoesqueleto dentro da célula T levando ao agrupamento dinâmico de receptores de superfície de células T e moléculas sinalizadoras em agrupamentos de ativação supramolecular, que fornecem um ambiente ideal para moléculas de sinalização próximas ao TCR. A regulação positiva de moléculas co-estimulatórias (CD40, CD86) e moléculas de MHC durante a maturação de DC é crítica para estabelecer contatos estáveis e duradouros com células T através da sinapse imunológica, o que é necessário para a expansão e diferenciação de células T em células T efetoras e de memória (Abbas 2015).
Dessa forma, a ativação da célula T depende inicialmente de dois sinais (Figura 4). O primeiro sinal resulta da ligação de receptores de células T (TCRs) a antígenos peptídicos derivados de patógenos ou células tumorais que são apresentadas por moléculas do MHC de DCs, que são glicoproteínas da superfície das células que se ligam a fragmentos pépticos de proteínas sintetizadas dentro da célula (moléculas de MHC de classe I) ou que foram ingeridas pela célula e processadas proteoliticamente (moléculas de MHC de classe II). As moléculas de MHC de classe I estimulam linfócitos T citotóxicos (CD8+), enquanto moléculas MHC classe II estimulam linfócitos T helper (CD4+). Esse sinal é crucial para a ativação de células T virgens e importante para assegurar a especificidade antigênica da resposta imune, porém não é suficiente por si só para iniciar uma resposta eficaz.
Assim, um segundo sinal independente de antígeno, determina a eficácia da resposta imune. O segundo sinal é a ligação do receptor CD28 pelos seus ligantes B7-1 / B7-2 (CD80 / CD86) (Aruffo and Seed 1987; (Freeman et al. 1989) . Estudos demonstraram que a ativação de células T mediada por TCR na ausência do segundo sinal resulta em falta de responsividade específica do antígeno ou à anergia da célula
T, tornando-as incapazes de responder a exposição subsequente ao antígeno (June et al. 1990).
Figura 4. Ativação de células T. O processo começa com dois sinais dados pela APC. O primeiro sinal é conhecido como a interação do receptor de células T (TCR) e o principal complexo de histocompatibilidade (MHC) ligado ao antígeno na APC (sinal 1), seguido de um segundo sinal fornecidos pela interação entre CD28 e B7 dispensável para a ativação apropriada da célula T (sinal 2). Adaptado de Sharma et al. 2011.
Além desta ativação mediada pelo primeiro e segundo sinais, outras sinalizações co-estimulatórias mediadas por receptores de superfície das células T, da família do fator de necrose tumoral (TNFRs), incluindo TNFR (GITR; CD357), CD27, OX40 (CD134) e 4-1BB (CD137), podem fortalecer a sobrevivência, expansão e função efetora das células T, bem como impulsionar a diferenciação e desenvolvimento de células T efetoras e de memória (Croft 2003).
Receptores do sinal co-estimulatório de ativação de células T são definidos como receptores de superfície celular que podem transduzir sinais positivos (receptores co-estimulatórios), induzindo à proliferação e ação das células, ou negativos (receptores co-inibitórios), atuando como mecanismos de segurança que preveem extremos de reatividade prejudiciais descontrolados, neutralizando os sinais
co-estimulatórios (Figura 5). De fato, defeitos nestes receptores co-inibitórios levam a respostas imunes aberrantes, como linfoproliferação e autoimunidade.
Figura 5. Moléculas co-estimulatórias e co-inibitórias expressas em células T que interagem com ligantes ou receptores correspondentes em células APCs derivando em vias de ativação (indicado por setas verdes) ou anergia das células T (indicado por setas vermelhas). Adaptado de Pardoll 2012.
A maioria destes receptores são membros da superfamília das imunoglobulinas (IgSF) e da superfamília dos receptores do fator de necrose tumoral (TNFRSF) e podem ser subdivididas em famílias específicas com base na sequência primária de aminoácidos, estrutura e função da proteína (Chen and Flies 2013).
Para ter uma resposta eficaz e de longa duração, células T apresentam múltiplos sinais co-estimulatórios que podem ocorrer ao mesmo tempo ou num breve
período, conseguindo uma resposta máxima em curto prazo, ou um após outro assegurando uma resposta eficiente de longa duração (Croft 2003).
Receptores co-inibitórios são considerados “checkpoints” imunológicos que referem a múltiplas vias inibitórias responsáveis por frear certos passos cruciais da imunidade mediada por células T para manter a auto-tolerância e modular a duração e a amplitude das respostas imunes em condições normais. No entanto, no câncer estas proteínas apresentam uma expressão descontrolada levando à função de células T prejudicada ou mesmo ao estado de exaustão dessas células e consequentemente permitindo ao tumor evadir à resposta imune antitumoral. Atualmente, a imunoterapia está emergindo como uma modalidade importante no tratamento do câncer, desenvolvendo agentes inibidores de receptores checkpoints para aumentar as respostas imunes antitumorais. Assim, essas terapias estão se mostrando promissoras e evidências pré-clínicas e clínicas fornecem a justificativa para investigar a combinação de imunoterapias (Sathyanarayanan and Neelapu 2015; Melero et al. 2015; Redmond and Linch 2016).
Os receptores de checkpoints imunológicos que foram mais estudados no contexto da imunoterapia clínica contra o câncer são o CTLA-4 e o receptor PD1. A importância dos imunocheckpoints pode ser constatada nos trabalhos descritos pelo Dr. James Alisson e Dr. Tasuko Honjo, laureados com o prêmio Nobel de medicina de 2018 (Leach, Krummel and Allison 1996; Ishida et al. 1992; Iwai, Terawaki and Honjo 2004).
O receptor CTLA-4 é um membro da família B7 / CD28 que inibe as funções das células T, sendo constitutivamente expresso em células Tregs. Pode ser regulado positivamente em células T ativadas CD4+ e CD8+ ou exauridas, que se caracterizam por ter alta expressão de receptores inibitórios. O receptor CTLA-4 regula as respostas imunológicas no início da ativação das células T nos órgãos linfoides secundários pelas APCs. Os ligantes de CTLA-4 são as moléculas CD80 e CD86, expressas nas APCs, que apresentam uma maior afinidade que pelo receptor CD28, desencadeando um mecanismo de imunossupressão em virtude da competição dos receptores CTLA-4 e CD28.
O PD1 é um receptor de superfície que foi descoberto como o primeiro receptor envolvido na morte celular a partir de um hibridoma de células T de
camundongo (Ishida et al. 1992). Tal receptor encontra-se expresso em células T ativadas exauridas, que são induzidas a expressá-lo através de uma estimulação via TCR ou exposição a citocinas como IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 e TGF-β.
O receptor PD-1 pode ter dois ligantes: PD-L1 (B7-H1; CD274) e PD-L2 (B7-DC; CD273), que são encontrados na superfície de APCs, mas também podem ser expressos em tecidos não linfoides como o tecido tumoral. Ao interferir com a sinalização precoce de TCR / CD28, a sinalização de PD-1 resulta na produção reduzida de citocinas como IL-2, IFN-γ e fator de necrose tumoral TNF-α, progressão do ciclo celular e expressão do gene pró-sobrevivência Bcl-xL, bem como expressão reduzida dos fatores de transcrição envolvidos em funções efetoras, como T-bet e Eomes. A atividade da PD-1 é, portanto, relevante apenas em células T ativadas, já que sua transdução de sinal só pode entrar em vigor durante a sinalização dependente de TCR (Boussiotis 2016). Ao PD-1 é atribuído principalmente a capacidade de inibir a atividade de células linfocitárias, durante a fase efetora, em tecidos e tumores, induzindo anergia.
A imunoterapia com anticorpos monoclonais que bloqueiam checkpoints imunológicos tem revolucionado o tratamento do câncer, aumentando a sobrevida em melanoma, câncer de células renais, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de bexiga e linfoma de Hodgkin. Estratégias combinatórias com outras moléculas estimulatórias ou inibitórias estão sendo desenvolvidas e os resultados são promissores. Atualmente, entre os anticorpos comercializados encontram-se: Nivolumab, Pembrolizumab e Pidilizumab para PD1; Atezolizumab para anti-PDL1; Ipilimumab e Tremelimumab para anti-CTLA4 (Postow, Callahan and Wolchok 2015; Leach, Krummel and Allison 1996; Iwai, Terawaki and Honjo 2004).
Além dos estudos com inibidores de checkpoint, também existem trabalhos que buscam fortalecer sinalizações agonistas por meio de receptores co-estimulatórios da célula T. Dessa forma, buscam-se por ligantes agonistas que possam fortalecer a co-estimulação por meio de receptores da família TNFR (receptor do fator de necrose tumoral), como 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), GITR (CD357) e CD27, entre outros, que medeiam as respostas de proliferação, ativação e diferenciação em células T (Mellman, Coukos and Dranoff 2011).
Dados da literatura demonstram que combinações de estratégias que aumentam a função das células T efetoras e estratégias que inibam mecanismos imunossupressores mediados por MDSC, Tregs e macrófagos no microambiente tumoral podem ser complementares e até mesmo apresentarem um efeito aditivo (Figura 6) (Sathyanarayanan and Neelapu 2015). Adicionalmente, estas abordagens imunomodulatórias podem ser combinadas com terapias oncológicas tradicionais, como quimioterapia e radioterapia. Certos agentes quimioterápicos, como a ciclofosfamida, a doxorrubicina e a oxaliplatina, assim como a radiação, podem causar a morte de células tumorais, induzindo a liberação de neo-antígenos e desencadeando processos inflamatórios, promovendo imunogenicidade no microambiente tumoral e potencializando a ativação de células T efetoras (Kroemer et al. 2013; Sistigu et al. 2014). Resultados clínicos sugerem que a utilização combinada de anticorpos agonistas co-estimulatórios ou de anticorpos bloqueadores de checkpoints imunológicos podem atuar em sinergia e induzir uma forte resposta antitumoral, beneficiando pacientes acometidos de câncer (Melero et al. 2015; Redmond and Linch 2016).
Figura 6. Combinação de estratégias de imunoterapia para melhorar as funções de células T efetoras e consequentemente a resposta imune antitumoral. Adaptado de Sathyanarayanan and Neelapu 2015.
1.5.1. O receptor de superfície 4-1BB pode desempenhar um papel muito importante na coestimulação e ativação de células T
O receptor 4-1BB pertence à família TNF e foi descoberto em 1989 durante triagens em busca de novos receptores em linhagens de células T murinas. Utilizando estimulação com concanavalina A (Con A), Kwon e Weissman identificaram o 4-1BB como um gene induzível em células T ativadas e clonaram com sucesso o seu cDNA(Kwon and Weissman 1989). Além da expressão ocorrer em células CD8 positivas ativadas, o receptor 4-1BB também pode ser expresso em células CD4 ativadas (Cooper, Bansal-Pakala and Croft 2002; Nam et al. 2005; Lee et al. 2002; Dawicki and Watts 2004; Juyang Kim et al. 2003), células B (Zhang et al. 2010; Vinay et al. 2012), células Treg (Schoenbrunn et al. 2012), células NK (Barao 2013), células NKT (Kim et al. 2008), DCs (Kim et al. 2009), mastócitos (Nishimoto et al. 2005), osteoclastos, timóicitos e células endoteliais (Yan et al. 2013). Adicionalmente, estudos mostram que a expressão de 4-1BB também pode ser induzida em células humanas do sangue periférico após exposição de mitomicina e outros agentes que danificam o DNA como doxorrubicina, bleomicina e irradiação (Kim et al. 2002).
O 4-1BB forma um complexo heterotrimerico que consiste em dois complexos do fator associado ao receptor do TNF (TRAF2) em conjunto com o TRAF1. Essa interação, que ocorre via proteína 1 específica de leucócito (LSP-1), potencializa a sinalização através da via c-Jun N-terminal quinase (JNK), as vias da cinase regulada pelo sinal extracelular (ERK), bem como através de β-catenina e AKT. Essas vias de sinalização convergem no fator mestre de transcrição NF-kB para regular a sinalização 4-1BB, bem como nas respostas imunes efetoras (Oussa, Soumounou and Sabbagh 2013; Jae-Ouk Kim et al. 2003).
Em células T, a sinalização 4-1BB, inibe a morte celular induzida por ativação (AICD) em células T (Hurtado, Kim and Kwon 1997), promove a sobrevivência (Nam et al. 2005; Lee et al. 2002), induz proliferação de células T e melhora a função efetora (Choi et al. 2017; Cannons et al. 2001), aumenta a produção de IFNγ, TNFα e IL-13 (Choi et al. 2011; Shin et al. 2007). Assim, a produção aumentada de IFNγ leva à geração de indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO) por células dendríticas que podem atenuar as respostas efetoras mediadas por 4-1BB (Choi et al.
2009), induz a maturação das células dendríticas levando à regulação positiva dos ligantes co-estimuladores B7, assim como a sobrevivência e produção de citocinas inflamatórias, como IL-6, IL-12 e IL-27.
1.5.2. A célula T pode receber sinais co-estimulatórios pelo receptor de superfície OX40, aumentando sua ativação, longevidade e sobrevivência
O OX40 (CD134, TNFRSF4) é um membro da superfamília de TNFR que foi descoberto em 1987, utilizando-se o anticorpo MRC OX40 que apresentava ligação nas células CD4+ ativadas de camundongo e aumentava a proliferação das mesmas(Paterson et al. 1987).
Células CD4+ e CD8+ ativadas apresentam expressão constitutiva de OX40 sendo a expressão induzida após a ligação TCR/CD3 (sinal 1 de ativação de células T) e a presença de citocinas inflamatórias incluindo IL-1, IL-2 e TNF-α. A ligação ao receptor de célula T por si só não é suficiente para conduzir a expressão de OX40 em células T CD4+ mas a ligação de co-estimulação de CD28 por CD80 e CD86 (em conjunto B7) aumenta a expressão, tal como a ligação CD40-CD40L (Walker et al. 1999). Além disso, as proteínas Roquin 1 e 2 atuam como reguladores pós-transcricionais da expressão da proteína e parecem agir para degradar os mRNAs do OX40 considerando que a deficiência na Roquin funcional resulta em aumento da expressão de OX40 (Vogel et al. 2013; Croft 2009).
Nessas células, a indução de OX40 ocorre dentro de 24 horas e atinge um pico de 48 a 72 horas após a estimulação inicial com TCR e a duração da expressão depende da potência da sinalização e co-estimulação do TCR, mas normalmente dura de 3 a 4 dias (Gramaglia et al. 1998). Outros tipos de células também expressam OX40, como por exemplo, células T NK e neutrófilos (Baumann et al. 2004; Zaini et al. 2007) enquanto que em células T virgens e células T de memória o receptor não é observado (Soroosh et al. 2007; Paterson et al. 1987).
O ligante para o OX40 (OX40L, CD252, TNFSF4) foi inicialmente descoberto em células T transformadas pelo vírus linfotrópico T humano (HTLV-1) e denominado gp34 (Tanaka et al. 1985; Miura et al. 1991). Posteriormente, a gp34 foi
identificada como parceira de ligação do OX40 (Baum et al. 1994). OX40L é uma proteína transmembrana tipo II contendo 183 aminoácidos (um domínio citoplasmático com 23 aminoácidos e um domínio extracelular com 133 aminoácidos) que na superfície se apresentando como um trímero, permitindo se ligar a três moléculas de OX40 (Compaan and Hymowitz 2006).
OX40L é expresso em APCs ativadas, incluindo células dendríticas, células B e macrófagos, células endoteliais e células de Langerhans (Ohshima et al. 1997 ; Flynn et al. 1998; Imura et al. 1996; Sato et al. 2002). No entanto, foi reportado que OX40L pode ser induzido em células T ativadas, proporcionando sinais co-estimuladores entre células T após estimulação com níveis sub-óptimos de antígeno (Soroosh et al. 2006 ; Mendel and Shevach 2006) .
Por outro lado, a sinalização através do CD40 pelos receptores tipo Toll (TLR2, TLR4, TLR9) induz a expressão de OX40L em APCs (Ohshima et al. 1997), assim como IFNγ, num mecanismo dependente de receptor de IFN (Kurche et al. 2012) prostaglandina E2 (Krause et al. 2009), Linfopoetina estromal tímica (TSLP) (Ito et al. 2005) IL-18 (Maxwell et al. 2006), e IL-33 (Murakami-Satsutani et al. 2014).
Em células CD4, a ligação de OX40L ao receptor OX40 promove diferentes processos que levam à ativação, proliferação, longevidade (Soroosh et al. 2006) e sobrevivência. Assim, favorece o fenótipo efetor de células T, aumentando a expressão de IL2, IL4, IL5, IFN-gama, IL-12 e a diferenciação em células Th1, Th2 e Th17 (Mendel and Shevach 2006; Soroosh et al. 2007). Dados da literatura também demonstram que a sinalização por OX40 pode inibir o fenótipo imunossupressor de células T regulatórias, com a consequente redução na expressão do fator de transcrição FoxP3 (So and Croft 2007; Zhang et al. 2018), do receptor de CTLA-4, do fator TGF-β e citocina IL10 (Vu et al. 2007; Ruby et al. 2009; Ito et al. 2006) . A sinalização via OX40 incrementa a sobrevivência das células, reduzindo a expressão de Fas e incrementando a expressão das proteínas pro-apoptóticas Bcl-2, Bcl-xL (Rogers et al. 2001) e do gene Survivin (Song et al. 2005). Por outro lado, essa sinalização regula positivamente a expressão de genes associados a migração das células T para sítios inflamatórios, como os receptores quimiotáxicos CXCR5 e CXCR4 (Walker et al. 1999; Jourdan et al. 2000).
Em contrapartida, células que expressam o ligante OX40L apresentam outros efeitos. Em células B, incrementa a produção de anticorpos, aumenta a sinalização de CD40L e contribui na diferenciação do fenótipo de células plasmáticas, enquanto que em DCs, incrementa a produção de TNF-α, IL1, IL-12 e IL-6, assim como moléculas co-estimulatórias como CD80, CD86 e CD40. Além disso, estimula o processo de formação e maturação destas células por expressão de CD83.
1.5.3. Estratégias para fortalecer a ativação de células dendríticas e de co-estimulação em células T podem ser utilizadas para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas para o tratamento de câncer
Atualmente, as terapias dirigidas para o câncer visam estudar os mecanismos do sistema imune, desenvolvendo várias estratégias que favorecem a maturação e ativação de DC como a ativação de células T de modo a potencializar a resposta antitumoral. Consequentemente, o avanço na geração de vacinas, anticorpos monoclonais agonistas, proteínas solúveis e aptâmeros têm mostrado resultados promissores na luta contra o câncer.
Citocinas como importantes mediadores na imunidade antitumoral
As citocinas são importantes mediadores na imunidade e devido ao fato de que algumas citocinas estimulam diretamente células efetoras no local do tumor e aumentam o reconhecimento de células tumorais por células T efetoras citotóxicas,
estudos têm sido realizados para caracterizar e explorar a sinalização dessas citocinas, visando desenvolver tratamentos contra o câncer. Já existem protocolos clínicos que utilizam terapias baseadas na veiculação de citocinas, como IL-2, IFN- α, GM-CSF e TNF- α, que aumentam as respostas imunes por meio do recrutamento e maturação de uma variedade de células efetoras imunológicas.
A IL-2 desempenha um papel crítico na ativação do sistema imunológico o que pode ser uma maneira efetiva de erradicar o câncer. Como monoterapia, demonstrou-se que a IL-2 é capaz de mediar a regressão tumoral e foi aprovada para o carcinoma de células renais metastático e o melanoma metastático. No entanto, a
IL-2 é insuficiente para melhorar a sobrevida dos pacientes devido às suas propriedades funcionais duplas nas células T, estimulando a atividade de células T efetoras e células Treg e apresentando efeito adverso grave em altas doses. A utilização da IL2 em combinação com outras terapias e a administração de uma menor dose, sugerem a possibilidade de superar essas desvantagens e trazer benefício terapêutico (Wrangle et al. 2018; Passalacqua et al. 2014).
IFN-α pode causar apoptose direta de células tumorais de forma dependente de caspase, o que pode contribuir para as propriedades bem conhecidas dos IFNs de tipo I e II aumentando a expressão dos antígenos tumorais. Em doses baixas, IFN-α age como um agente anti-angiogênico, aprovado como terapia adjuvante destinada a pacientes com melanoma em estágio II de alto risco ou estágio III.
Além do tratamento do melanoma, o IFN-α é aprovado para o tratamento de algumas doenças tais como neoplasias hematológicas malignas, sarcoma de Kaposi relacionado à AIDS, leucemias e como anti-angiogênica para câncer renal avançado, aumentando a sobrevivência em pacientes com câncer avançado (Wrangle et al. 2018; Passalacqua et al. 2014).
Devido ao fato que as citocinas apresentam a capacidade de ação em vários tipos de células, podendo atuar a favor ou contra à resposta antitumoral, como também sua vida média baixa, têm sido utilizadas em determinados tipos de câncer em dose controlada. Além disso, os efeitos colaterais da administração de citocinas são graves e muitas vezes limitantes, produzindo sintomas semelhantes aos da infecção sistêmica, incluindo hipotensão, vômitos, diarreia, febre e mal-estar.
Apesar de tais limitações, o GM-CSF é o mais amplamente estudado devido a sua atuação principalmente em células mieloides e no recrutamento e amadurecimento de DCs, aumentando a apresentação de antígenos tumorais ao sistema imunológico. No protocolo clínico, o GM-CSF foi administrado como citocina solúvel em 97 pacientes com melanoma em estágio avançado e observou-se um aumento de basófilos e eosinófilos no sangue periférico e uma diminuição de monócitos no baço dos pacientes. O resultado foi relacionado a um pior prognóstico e morte nos pacientes, concluindo que o GM-CSF nessa dose e administração é prejudicial (Faries et al. 2009). Outros trabalhos têm observado o mesmo padrão,
estudando-se outras vias de administração do GM-CSF como adjuvante imunológico, como o uso de citocinas ligadas à membrana em vacinas tumorais, o que tem mostrado resultados impressionantes (Huang et al. 2015).
Além das terapias que potencializam a ação de citocinas antitumorais existem outras focadas na neutralização de citocinas supressoras, isto é, terapias que inibem citocinas que favorecem a progressão tumoral, por exemplo, IL-10, TGF-beta, entre outras.
Geração de vacinas de DC e células tumorais
Além da aplicação de GM-CSF na forma de citocina solúvel, outros trabalhos descrevem a sua utilização em vacinas antitumorais. No trabalho descrito pelo grupo do Dr. Mulligan (Drannoff 1993), células tumorais são geneticamente modificadas para expressar GM-CSF, gerando uma vacina terapêutica que induziu efeito protetor antitumoral em modelos com animais imunocompetentes desafiados com tumores singênicos. Da mesma forma, em pacientes com câncer, a injeção de células tumorais inteiras, irradiadas, autólogas e manipuladas para produzir GM-CSF (GVAX) pode induzir respostas coordenadas de células B e T a uma ampla gama de antígenos tumorais. Embora a utilização da GVAX como monoterapia tenha apresentado um limitado efeito terapêutico, atualmente existem ensaios clínicos que investigam o efeito adjuvante da GVAX em combinação com outras imunoterapias, em que são observados resultados de maior potencial (Shi et al. 2006; van de Laar, Coffer and Woltman 2012; Hong 2016; Shi et al. 2018).
Uma estratégia que utiliza o benefício adjuvante de GM-CSF foi desenvolvida para o câncer de próstata. A vacina chamada Sipuleucel-T, aprovada pela FDA em 2010 para uso clínico, combina o efeito de GM-CSF com um dos antígenos expressos no tumor. A terapia é personalizada e consiste em isolar células APCs de pacientes, que são ativadas ex vivo com uma proteína recombinante composta pela citocina GM-CSF fusionada ao antígeno prostático fosfatase acida prostática (PAP). Essa vacina se encontra em ensaio clínico de fase 3 e já estão sendo estudadas combinações de Sipuleucel-T com outras imunoterapias.
Nosso grupo de pesquisa apresentou resultados prévios no laboratório que demonstram o benefício terapêutico da combinação de vacinas antitumorais que apresentam ligantes de TNFSF e GM-CSF (Manrique-Rincón et al. 2017). Observou-se que algumas destas combinações não só induziram a completa eliminação do tumor, como preveniram o desenvolvimento de tumores em animais curados e redesafiados, sugerindo a indução de uma memória imunológica antitumoral.
Alternativamente, outra terapia tem como alvo estimular a apresentação de antígenos pelas DC no tratamento do câncer. O protocolo envolve a retirada de DC autólogas do paciente ou doador, a modificação ex vivo destas células com antígenos associados ao tumor (TAA) e a administração das células no paciente de novo com o objetivo de gerar DC carregadas de antígenos que induzam respostas de células T potentes e duradouras no paciente (Gilboa 2007). Desta forma, monócitos derivados do sangue periférico são diferenciados ex vivo com agentes que promovem a diferenciação, como GM-CSF e IL-4, amadurecidos com outros reagentes biológicos que induzem ao fenótipo ativo para a migração das células nos linfonodos para apresentar os antígenos, carregados com antígenos associados ao tumor (TAA) e reinfundidos no paciente (Figura 7).
Figura 7. Produção de vacinas de DC ex vivo. Células DC são retiradas do paciente ou doador e modificadas ex vitro para ser administradas novamente no paciente com um fenótipo de célula ativada. Adaptado de Gilboa 2007.
