EFEITO DO BLOQUEIO DO RECEPTOR DE IL-10 NA RESPOSTA IMUNE CONTRA Leishmania amazonensis

E

B

R

IL-10

R

IMUNE CONTRA

Leishmania amazonensis

AUTORA: JOANA FERREIRA DO AMARAL ORIENTADOR: Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitoas para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, com área de concentração em Protozoologia parasitária humana.

Universidade Federal de Ouro Preto, sob orientação do Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso e com auxílio financeiro da Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES).

A

A

Ao Prof. Luís pelas lições de Imunologia,Leishmania e de Vida.

À Profa. Leda pelo apoio, colaboração e receptividade em seu laborátorio.

Ao Dr. David Sacks, pelo anticorpo cedido e por todas as contribuições feitas ao nosso trabalho.

À profa. Cláudia, por todo o trabalho de análise histopatológica, e pela amizade, carinho e empenho.

Aos técnicos Leandro e Maria Chaves pelo apoio e compreensão. Aos bioteristas, em especial ao Celso, que, mesmo com recursos limitados, empenharam-se com carinho no trato dos nossos animais.

À equipe do CEBIO-UFMG: Gilmar, Elmo e Adelaide pela disposição em atender aos nossos pedidos de animais.

Aos amigos do laboratório, sempre dispostos a ajudar nos experimentos. O nosso convívio com certeza renderia muito mais que uma dissertação de mestrado. Em especial à Tati, Ju, Baiano e Bia.

À Denise pela amizade e boa vontade em todos os momentos. À Profa. Simone, sempre interessada em nosso trabalho.

Ao Prof. Babá pelo carinho, disponibilidade e bom humor, sempre. Aos demais professores do NUPEB, pela disponibilidade a qualquer hora.

Aos colegas de turma, que muito colaboraram em todas as etapas realizadas, seja com a amizade ou com o trabalho. Em especial à Silvana e Baiano.

À Cida, por todo o trabalho e pelos momentos de alegria e descontração.

Aos Profs. Leda, Jaqueline e Ricardo Gazzinelli dos Laboratórios de Nutrição e Gnotobiologia e de Imunoparasitologia do ICB-UFMG pela disponibilidade e paciência. Sempre colhemos lições, mesmo quando nossas tentativas parecem em vão ...

Ao carinho e receptividade de todas as pessoas do LNG e IMPAR. Em especial à Cláudia Beatriz pelo carinho e amizade e ao Helton por tudo o que pode fazer por nosso trabalho.

Ao Sr. Sérgio e D. Marilac, uma segunda família muito especial.

Às irmãs Tati, Dani, Vanessa, Alê, Marcela e Clarissa, pela paciência nos momentos mais difíceis e pela amizade e carinho diários.

E, em especial, ao Kleber, sempre presente nos momentos mais difíceis e cansativos, com apoio, carinho e compreensão.

R

R

A avaliação do papel da IL-10 na leishmaniose é de extrema importância, pois sendo uma citocina anti-inflamatória, inibe a ação de IFN-γe NO, que têm papel importante na eliminação do parasita e no controle da lesão. O papel da IL-10 na infecção por L.(L.) amazonensis foi avaliado in vivo neste trabalho tratando-se camundongos C57BL/6, suscetíveis à essa espécie de Leishmania, com anticorpos monoclonais anti-receptor de IL-10 (α−IL-10R) na fase inicial da infecção. Como controle de tratamento inoculamos um grupo de animais com IgG total de rato na mesma dose usada para o anticorpoα−IL-10R (0,5mg/animal/dose) e mantivemos outro grupo sem nenhum tratamento.

Os animais tratados com α-IL-10R, após 3 semanas de infecção, apresentaram perfil histopatológico, produção de TNF e quantificação de parasitas semelhante aos grupos controle, com exceção da produção de IFN-γ produzido por células mononucleares de linfonodo de camundongos tratados com α-IL-10R, que apresentaram quantidades dessa citocina superiores aos animais controles. Em relação aos animais sacrificados 12 semanas após a infecção, o curso da infecção, o parasitismo e a produção de citocinas foram semelhantes para todos os grupos. Em relação à análise histológica, observamos um maior infiltrado inflamatório e um parasitismo tecidual ligeiramente mais acentuado no grupo tratado comα-IL-10R em relação aos controles.

Dessa forma, podemos concluir que outros mecanismos de escape do parasita, que não a produção de IL-10, estejam envolvidos na infecção porL.(L.) amazonensis, já que mesmo em presença de um aumento da produção de IFN-γa infecção permanece inalterada. A indução da produção de TGF-β por parte do parasita, assim como a resistência da L.(L.) amazonensis à ação do NO em comparação a outras espécies de Leishmania são levantados como hipótese.

A

A

The evaluation of the role of IL-10 in leishmaniasis is of extreme importance since this anti-inflammatory cytokine inhibits the action of IFN-γand NO, which play an important role in the elimination of the parasite and control of lesion development. In this study, the role of IL-10 in the infection byL.(L.) amazonensis was evaluated in vivo by treating infected C57Bl/6 mice with monoclonal antibodies against the IL-10 receptor (α-IL-10R) during the initial phase of the infection. Rat IgG was used as treatment control at the same dose used for the α-IL-10R antibody (0.5 mg/animal/dose). Another group was left untreated.

After three weeks, mice treated with α-IL-10R presented histopathological profile, TNF production and parasite quantification similar to control animals. On the other hand, IFN-γproduction by lymph node cells fromα-IL-10R treated animals was higher than in control groups. No differences in course of infection, parasitism and cytokine production were observed between animals treated or not sacrificed at 12 weeks of infection. Histologically, a greater inflammatory infiltrate and an slightly increased tissue parasitism was observed inα-IL-10R treated animals at this time point.

Our data suggest that a different mechanism of evasion, other than induction of IL-10, are involved in the infection byL.(L.) amazonensis, since even in the presence of an increased IFN-γproduction the infection remains unchecked. The role of TGF-β induction by the parasite, as well as the resistance of L.(L.) amazonensis to NO in comparison to otherLeishmania species are discussed.

Í

Í

A

A

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

I

I

I

I

I

I

R

R

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

V

V

A

A

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

V

V

I

I

Í

Í

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

V

V

I

I

I

I

L

L

F

F

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

V

V

I

I

I

I

I

I

L

L

S

S

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

I

I

X

X

I

I

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1

1

O

O

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1

1

5

5

M

M

M

M

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1

1

7

7

Acompanhamento do desenvolvimento da lesão ... 19

Quantificação de parasitas... 20 Cultura de células... 20 Dosagem de citocinas... 21 Análise histológica... 22 Análise estatística ... 23

R

R

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

2

2

5

5

D

D

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

3

3

4

4

C

C

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

4

4

6

6

R

R

B

B

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

4

4

8

8

L

F

Figura 1 - Efeito do bloqueio do receptor de IL-10 sobre o curso da infecção de animais

C57BL/6 inoculados comL.(L.) amazonensis...26 Figura 2 - Efeito do bloqueio do receptor de IL-10 sobre o parasitismo da pata de animais

C57BL/6 inoculados comL.(L.) amazonensis...27 Figura 3 - Avaliação da produção de IFN-γe TNF-αpor animais C57BL/6 infectados por 3

semanas comL.(L.) amazonensis e tratados comα−IL-10R ou IgG total de rato...29 Figura 4 - Análise histológica do processo inflamatório em camundongos C57BL/6 tratados

com IgG total de rato (A) ou anti IL-10R (B) inoculados comLeishmania amazonensis e sacrificados após três semanas de infecção. ...30 Figura 5- Efeito do bloqueio do receptor de IL-10 sobre o parasitismo da pata de animais

C57BL/6 inoculados comL.(L.) amazonensis...31 Figura 6 - Avaliação da produção de IFN-γe TNF-αpor animais C57BL/6 infectados com

L.(L.) amazonensis e tratados comα−IL-10R ou IgG total de rato ...33

Figura 7 - Avaliação da produção de IFN-γe TNF-αpor animais C57BL/6 infectados com

L.(L.) amazonensis e tratados comαIL-10R, IgG total de rato ou não tratados...34

Figura 8 - Análise histológica do processo inflamatório em camundongos C57BL/6 tratados com IgG total de rato (A) ou anti IL-10R (B) inoculados comLeishmania amazonensis e sacrificados após 12 semanas de infecção...35 Figura 9 - Análise histológica do parasitismo em camundongos C57BL/6 tratados com IgG total de rato (A) ou anti IL-10R (B) inoculados comLeishmania amazonensis e sacrificados após 12 semanas de infecção. ...36

L

S

ABTS – [2,2’-azino-bis(3 ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid)] APC – Célula apresentadora de antígeno

DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium ELISA – Enzime Linked Immunosorbent Assay gp63 – Glicoproteína de superfície 63

HCl – Ácido clorídrico

HEPES – N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid IFN-γ– Interferon gama

IgG – Imunoglobulina G IL-1 – Interleucina 1 IL-1α– Interleucina 1 alfa IL-10 – Interleucina 10 IL-12 – Interleucina 12 IL-12R – Receptor de IL-12 IL-18 – Interleucina 18 IL-2 – Interleucina 2 IL-4 – Interleucina 4 IL-5 – Interleucina 5 IL-6 – Interleucina 6

iNOS – Óxido nítrico sintase induzível LPG – Lipofosfoglicano

LPS – Lipolissacarídeo

MHC I – Complexo de histocompatibilidade principal I MHC II – Complexo de histocompatibilidade principal II

MTT – (3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-dipheniltetrazolium bromide) NK – Células matadoras naturais

PBS – Salina tamponada com fosfato PNA – Fitohemaglutinina de amendoim

rIFN-γm – Interferon gama murino recombinante rIL-12 m - Interleucina 12 murino reconbinante rIL-4 m – Interleucina 4 murino reconbinante

rTGF-βm – Fator de crescimento tumoral murino recombinante rTNF-αm – Fator de necrose tumoral murino recombinante SDS – Lauril sulfato de sódio

TGF-β– Fator de transformação de crescimento beta TNF – Fator de necrose tumoral

TNFRp55 – Receptor p55 de TNF TNFRp75 – Receptor p75 de TNF α−IL-10R – Anti-receptor de IL-10

A leishmaniose é uma doença causada por protozoários pertencentes à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomastidae e ao gênero Leishmania. Apresentam-se sob duas formas principais no ciclo evolutivo: a forma amastigota, parasita obrigatório de células do sistema fagocítico mononuclear dos hospedeiros vertebrados e forma promastigota, encontrada no tubo digestivo do hospedeiro invertebrado. A forma amastigota é esférica ou oval e não apresenta flagelo livre, com tamanho variando entre as espécies. Já a forma promastigota é alongada com flagelo livre e longo, tendo em média 12 µm, de acordo com a espécie (Molyneux & Killick-Kendrick, 1987).

A leishmaniose é transmitida ao homem ou a outros hospedeiros vertebrados pela picada de insetos do gênero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomya no Novo Mundo (Ashford, 2000). Esses insetos têm atividade somente quando a temperatura e claridade são adequadas, preferindo geralmente alimentar-se durante o período da noite, quando essas condições são mais favoráveis (Marzochi, 1992). A maioria das leishmanioses são zoonóticas, e a transmissão ao homem ocorre acidentalmente, quando este é exposto ao ciclo silvestre (Ashford, 2000).

A doença apresenta-se sob diferentes formas clínicas, e grande parte dessa variedade de formas é devida à diversidade de espécies do parasita. A classificação atual destas diferentes espécies depende do seu desenvolvimento no tubo digestivo do inseto vetor. Nesta classificação são consideradas espécies do subgênero Leishmania aquelas que têm seu desenvolvimento suprapilário, e aquelas com desenvolvimento peripilário são pertencentes ao subgênero Viannia (Lainson & Shaw, 1987). Essa diversidade é ilustrada pela quantidade de espécies descritas, nem todas encontradas parasitando o homem. Até 1993, cerca de 20 espécies foram encontradas em humanos (Shaw, 1994).

Como mencionado anteriormente, diferentes formas clínicas da leishmaniose podem ser encontradas em humanos, variando com a espécie do parasita e a resposta imune do hospedeiro, mas os espectros da doença podem, no entanto, se sobrepor (Weigle & Saravia, 1996). A variação no perfil de resposta ao parasita também é diverso, e pode variar de um estado não responsivo (associado àL.(L.) amazonensis) até um estado hiper responsivo (associado à L.(V.) braziliensis). Entre as formas clínicas mais freqüentes, podemos citar a leishmaniose visceral, a cutânea, a mucocutânea e a cutânea difusa.

A forma visceral é a mais grave. Os sintomas são pouco específicos, como febre, anemia e hepatoesplenomegalia, o que dificulta o diagnóstico (Ashford, 2000; Grimaldi, Jr. & Tesh, 1993). As espécies envolvidas nesta apresentação clínica da doença são a L.(L.) infantum e L.(L.) donovani no Velho Mundo e L.(V.) chagasi no Novo Mundo. No entanto, L.(V.) chagasi já foi isolada em pacientes com lesão cutânea, enquanto L.(L.) amazonensis foi encontrada em pacientes com sintomas da doença visceral (Barral e cols., 1991).

A leishmaniose cutânea difusa é normalmente causada pelaL.(L.) aethiopica no Velho Mundo e L.(L.) amazonensis, L.(L.) mexicana e L.(L.) venezuelensis, no Novo Mundo. Sua ocorrência está associada a um estado de anergia do hospedeiro, que apresentam macrófagos intensamente parasitados e pouca resposta linfoproliferativa. As lesões características da doença são nodulares e não ulceradas, com um grande número de lesões devido à disseminação do parasita. Em vários casos, pacientes com esta forma clínica apresentam resistência ao tratamento (Convit e cols., 1972; Barral-Netto e cols., 1998).

Já a forma mucocutânea tem como característica uma resposta imune intensa, do tipo hipersensibilidade retardada. Os pacientes apresentam destruição do tecido mucoso e submucoso das cavidades nasal e oral (Grimaldi, Jr. & Tesh, 1993). A resposta é intensa, e as células locais pouco parasitadas. As espécies envolvidas com essa forma da doença são a L.(V.) braziliensis, a L.(V.) panamensis e a L.(V.) guyanensis, além de outras espécies, em menor proporção (Ashford, 2000).

A forma cutânea simples é a de ocorrência mais comum (Dowlati, 1996). No Velho Mundo é endêmica em 66 países, e no Novo Mundo em 21. Sua ocorrência é descrita a milhares de anos, incluindo passagens bíblicas que fazem referência à sua existência (Oumeish, 1999). Pessoas acometidas por essa forma da doença às vezes apresentam uma resposta imune efetiva, capaz de controlar e às vezes de curar a lesão espontaneamente (Ashford, 2000). Lesão única, ulcerada, com bordas elevadas e repletas de infiltrado inflamatório é o perfil comumente encontrado nesta forma clínica, mas, no entanto, lesões não ulceradas também podem ocorrer (Ashford, 2000; Dowlati, 1996). No Novo Mundo, a forma cutânea simples é causada principalmente por L.(V.) braziliensis, mas L.(L.) amazonensis, L.(V.) panamensis e L.(V.) guyanensis também

são encontradas parasitando o homem. No Velho Mundo, a espécie mais encontrada causando esse tipo de lesão é aL.(L.) major (Grimaldi, Jr. & Tesh, 1993).

A leishmaniose tem distribuição ampla em toda a superfície terrestre, e a Organização Mundial de Saúde classifica a doença como endêmica em 88 países dos 5 continentes, sendo 72 países em desenvolvimento (World Health Organization, 2000). A maioria destes países possui clima tropical ou sub-tropical, e a transmissão da doença é limitada por aspectos climáticos devido ao fato de os vetores não se adaptarem bem a climas frios (Shaw, 1997). Acredita-se que há cerca de 12 milhões de pessoas afetadas pela doença e cerca de 350 milhões de pessoas encontram-se sob risco de infecção. A maioria dos novos casos são representados pela leishmaniose cutânea, sendo outras formas da doença menos abundantes. Grande parte dos casos de leishmaniose cutânea ocorrem no Afeganistão, Irã, Arábia Saudita, Síria, Brasil e Peru. No nosso país há também alta prevalência da leishmaniose visceral, bem como em Bangladesh, Índia e Sudão. A doença, além de relacionada com o clima e a presença do inseto vetor, pode também estar associada ao desenvolvimento econômico dos países afetados e alterações do ambiente causadas pelo homem. Atividades econômicas como extração de madeira, construção de barragens, mineração, construções em áreas de florestas são fatores que aumentam a possibilidade de contato entre o vetor e o homem, facilitando a transmissão (World Health Organization, 2000).

Atualmente, tem ganhado importância epidemiológica a reativação da leishmaniose em pacientes que adquiriram o vírus HIV, e há recomendações para a inclusão da leishmaniose no diagnóstico diferencial das doenças oportunistas que acometem indivíduos com AIDS. Esta reativação ocorre mais freqüentemente quando a contagem de células T CD4+ cai drasticamente (World Health Organization, 2000).

O ciclo evolutivo do parasita ocorre em dois hospedeiros, um vertebrado e outro invertebrado. As formas infectantes do parasita são transmitidas do inseto vetor ao hospedeiro vertebrado pela picada do inseto fêmea [revisto por Shaw (1997)] que, no momento do seu repasto sangüíneo, inocula formas promastigotas metacíclicas na derme do hospedeiro quando regurgitam o excesso de sangue ingerido (Grimaldi, Jr. & Tesh, 1993). As formas promastigotas metacíclicas infectantes penetram em macrófagos locais através de interações com moléculas receptoras na superfície destas células. Essas interações são normalmente aleatórias. Receptores como os da lectina, complemento e

fatores derivados do soro estão implicados nessa internalização (Mosser & Rosenthal, 1993; Rittig & Bogdan, 2000).

A fagocitose da Leishmania pelo macrófago é iniciada pelo englobamento, através de pseudópodes, dando origem ao fagosomo. Em sequência, há fusão de vesículas lisosomais a estes fagosomos, dando origem ao vacúolo parasitóforo. As promastigotas rapidamente transformam-se em amastigotas, que sobrevivem neste ambiente e reproduzem-se por divisão binária simples. Além dos macrófagos, outras células podem ser parasitadas, mas não possuem capacidade potencial de eliminar o parasita e podem servir, portanto, de locais de sua sobrevivência (Rittig & Bogdan, 2000).

Posteriormente, o macrófago se rompe, possivelmente, por ação de proteínas formadoras de poros presentes na membrana do parasita (Horta, 1997; Noronha e cols., 1996; Noronha e cols., 2000). Essas amastigotas liberadas podem então infectar novos macrófagos, levando à expansão do parasita, que culmina com a formação da lesão (Noronha e cols., 2000). Quando o mamífero infectado é picado pelo flebótomo, macrófagos infectados são ingeridos e se rompem no trato digestivo do inseto, transformam-se em promastigotas, aderem à membrana do intestino e são protegidos da lise protéica por uma membrana que os envolve, denominada membrana peritrófica. As formas promastigotas passam então por diferentes estágios, e quando tornam-se infectantes e são novamente inoculadas no hospedeiro vertebrado (Bates, 1994).

O sistema imune local consegue eliminar boa parte dos parasitas após a inoculação, mas este é capaz de sobreviver lançando mão de diferentes mecanismos de escape capazes de “burlar” a resposta do hospedeiro. A molécula de superfície do parasita denominada LPG (lipofosfoglicano), por exemplo, impede a deposição dos componentes C5b-C9 do complemento, conferindo uma distância protetora entre o complexo C5b-C9 e sua membrana pelo tamanho de sua molécula. A gp63, outra molécula de superfície do parasita, é capaz de inativar C3b (Nunes e cols., 1997).

A fusão de vesículas lisosomais com o fagosomo tornam o pH do vacúolo parasitóforo ácido, o que é necessário para a ação das enzimas lisosomais. No entanto, as formas amastigotas de Leishmania conseguem evitar a lise através das moléculas gp63 e LPG, o que não acontece com outros microorganismos tais como Trypanosoma cruzi e Listeria monocytogenes, que são sensíveis à ação das enzimas lisosomais e ao

pH ácido do fagolisosomo (Solbach & Laskay, 1996). As amastigotas impedem ainda a ativação do macrófago, pela inibição da síntese de IL-12, via proteofosfoglicano (Piedrafita e cols., 1999). Citocinas anti-inflamatórias como IL-10, IL-4 e TGF-β são induzidas por amastigotas, e novamente o parasita garante sua sobrevivência (Solbach & Laskay, 1996), já que essas citocinas inibem a ativação de linfócitos no local. A inibição da produção de óxido nítrico (NO) também é observada, impossibilitando a morte do parasita e o controle da infecção pelo macrófago (Linares e cols., 2000). Além disso, amastigotas de L.(L.) amazonensis são capazes de internalizar e degradar moléculas de MHC II que seriam expressas na superfície da célula hospedeira. Dessa forma, o parasita tem novamente um mecanismo de escape da resposta imune (De Souza e cols., 1995).

Um outro mecanismo de escape da Leishmania é através da glutationa presente em sua superfície. A glutationa é um tiol presente em um grande número de células animais, que protege essas células de agentes tóxicos como o NO. No entanto, parasitas do gênero Leishmania também apresentam glutationa, em diferentes concentrações, variando com a espécie. A depleção de glutationa em L.(L.) major aumenta a sua suscetibilidade ao NO, enquanto a depleção deste tiol nos macrófagos, faz com que essas células permitam uma melhor sobrevivência do parasita (Romão e cols., 1999).

Apesar dos diversos mecanismos de escape apresentados pelo parasita, uma resposta contra o mesmo pode ser montada. Essa resposta é dependente de diversos fatores como a espécie de Leishmania e o estado imunológico do hospedeiro. Após a inoculação dos parasitas, as formas promastigotas entram em contato com diferentes componentes do sistema imune local, como eosinófilos, leucócitos polimorfonucleares e componentes do sistema do complemento, que eliminam boa parte das formas infectantes inoculadas pelo vetor. No entanto, a eliminação deste depende basicamente da montagem de uma resposta celular do tipo Th1, que inicia-se logo que o parasita penetra no macrófago local.

Células de Langerhans podem também ser infectadas por amastigotas, ou até mesmo englobar antígenos das promastigotas mortas pelo complemento. Essas células expressam na sua superfície antígenos do parasita, via complexo de histocompatibilidade principal tipo II (MHC II). Assim, podem migrar até as áreas de

células T dos órgãos linfóides periféricos, como linfonodos, e ativar a resposta imune primária celular (Overath & Aebischer, 1999).

Nas horas subsequentes à infecção, observa-se acúmulo de células linfocitárias no local da picada do vetor, que têm como função eliminar o dano ao tecido causado pela picada do inseto e iniciar a resposta contra o parasita (Solbach & Laskay, 1996). Essas células chegam ao local da infecção por atração quimiotática de macrófagos locais infectados capazes de secretar quimiocinas, substâncias capazes de alterar o perfil de moléculas de adesão de células endoteliais e promover a adesão e infiltração de monócitos, eosinófilos e, posteriormente, de linfócitos T ativados que irão responder ao parasita (Rossi & Zlotnik, 2000).

A diferenciação das células T CD4+ é um ponto crucial no estabelecimento da resposta contra Leishmania. As quimiocinas têm ainda papel na diferenciação de linfócitos T em seus subtipos, Th1 ou Th2. Muitas das quimiocinas mostram atividade na promoção da inflamação, com indução da produção de citocinas pro inflamatórias em macrófagos ou em células epiteliais, endoteliais ou fibroblastos (Rossi & Zlotnik, 2000). MIP1-α, por exemplo, quando adicionado a cultura de células T estimuladas com antígeno de ovo deSchistosoma ou concanavalina-A, leva à diminuição da produção de IL-4 por essas células (Lukacs e cols., 1997). Essa quimiocina tem sua expressão aumentada em macrófagos com expressão significativa de IL-12 (Zou e cols., 2000). No entanto, RANTES tem importância tanto no desenvolvimento de uma resposta Th1 como Th2. Sua expressão está aumentada tanto em animais infectados com Mycobacterium bovis, infecção granulomatosa pulmonar de resposta característica Th1, quanto em animais infectados com Schistosoma mansoni, infecção de resposta típica Th2 (Chensue e cols., 1999).

A imunidade inata tem papel importante na resistência ao parasita, pois a ação de células como macrófagos, células de Langerhans e NK determinam o perfil de resposta celular específica adotada pelo indivíduo e, consequentemente, estabelece uma resposta que poderá ou não ser efetiva contra o parasita.

A resposta imune do hospedeiro que determina a resistência à Leishmania inicia-se com a imunidade inata quando macrófagos locais produzem IL-12, citocina

que age sobre células matadoras naturais (NK). Essa ação culmina na produção de IFN-γpor células NK, citocina indispensável, juntamente com IL-12, na diferenciação de células CD4+ Th0 para o fenótipo Th1 (Kemp, 1997). As células Th1, por sua vez, intensificam a produção de IFN-γ, que estimula a secreção de TNF-α pelos macrófagos infectados. TNF-αe IFN-γagem então, em conjunto, sobre estes macrófagos infectados estimulando a produção de óxido nítrico e outros reativos derivados do oxigênio com o objetivo de eliminação do parasita. A IL-12 produzida por macrófagos no local da infecção é importante para manter uma ativação permanente dessas células, juntamente com o IFN-γ produzido por células NK e células T que migraram para o local (Trinchieri, 1995). No entanto, a IL-12 produzida por macrófagos não age na diferenciação das células TCD4+, pois sua ação é restrita ao sítio da infecção. A diferenciação de células T CD4+ no linfonodo é relacionada, então, com a produção de IL-12 por células dendríticas que expressam antígenos de superfície e migram do local da infecção para órgãos linfóides. Assim, essas células apresentam os antígenos de Leishmania a células T virgens e secretam IL-12, o que culmina com a ativação da célula T e sua diferenciação para o tipo Th1 (Bottomly, 1999). Essa secreção de IL-12 está diretamente relacionada com o tipo de célula dendrítica envolvida. A tipo 1 (DC 1) secreta IL-12, mas a tipo 2 (DC 2) secreta TGF-βe IL-10, e induzem uma resposta tipo Th2 (Rissoan e cols., 1999). Quando em sinergia com IL-18, a IL-12 induz a ativação da molécula de sinalização STAT4 e promove o aumento da transcrição de IFN-γ. Assim, a presença de IL-18, juntamente com IL-12, reforça esse mecanismo (Nakahira e cols., 2002).

A participação de células NK é importante na indução da resposta Th1, pois estas células são fonte primária de IFN-γno início da infecção por L.(L.) major. Sua atividade é maior em camundongos C3H quando comparada à linhagem BALB/c. No entanto, essa participação de NK não é fundamental, pois a depleção dessas células em animais C3H/HeN retarda a cura da lesão, mas não altera o perfil de resistência nesses animais (Scharton & Scott, 1993). Além disso, na presença apenas do IFN-γproveniente de células TCD4+ e na ausência de células NK, animais resistentes continuam a controlar a lesão, mostrando que o IFN-γé capaz de agir de maneira autócrina e sustentar o desenvolvimento da resposta Th1 (Wakil e cols., 1998).

Modelos experimentais animais têm sido de grande ajuda na compreensão dos mecanismos de resposta contra a infecção por Leishmania. O modelo murino é sem dúvida o mais extensamente estudado, e resultados de infecção experimental porL.(L.) major mostram que grande parte do espectro de respostas encontradas no homem pode ser nele reproduzidas. Enquanto algumas linhagens de camundongos são resistentes à infecção, apresentando lesões que curam espontaneamente, outras espécies são suscetíveis a essa espécie do parasita. Entre as linhagens resistentes àL.(L.) major estão C3H/He, CBA e C57BL/6 e, entre as suscetíveis, podemos citar BALB/c, DBA/2 e A/Jax (Launois e cols., 1996). No entanto, animais resistentes à L.(L.) major podem apresentar-se suscetíveis para outras espécies do parasita. A linhagem C57BL/6, por exemplo, é resistente àL.(L.) major, mas apresenta um perfil de suscetibilidade frente a infecção por L.(L.) amazonensis (Scott e cols., 1987), assim como a linhagem de camundongos CBA. No entanto, a suscetibilidade do camundongo CBA à L.(L.) amazonensis está relacionada a um aumento na produção de IL-4 (De Souza e cols., 2000), diferentemente de animais C57BL/6, que não apresentam produção aumentada de citocinas do tipo Th2 quando infectados com essa espécie (Afonso & Scott, 1993).

O uso de anticorpos monoclonais anti-IFN-γem camundongos resistentes à infecção por L.(L.) major mostrou que essa citocina tem papel importante durante a imunidade específica (Belosevic e cols., 1989; Scott, 1991), pois esses animais, assim como camundongos resistentes deletados para o gene do receptor de IFN-γ(Wang e cols., 1994) mudaram seu fenótipo de resistência para suscetibilidade. A participação de células TCD8+ é restrita na infecção por Leishmania, mas, quando provenientes de animais resistentes reinfectados, são capazes de produzir altos níveis de IFN-γ(Muller e cols., 1993).

A eliminação efetiva do parasita, entretanto, é dependente de óxido nítrico. O NO é um mediador de diferentes funções biológicas, produzido por uma reação dependente da enzima óxido nítrico sintase (Bogdan, 2001). Na leishmaniose, assim como em outras doenças causadas por microorganismos intracelulares, a produção de NO ocorre pela enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS). A atividade dessa enzima é induzida por ação de citocinas como IFN-γe TNF-α, além de componentes dos próprios microorganismos como LPS (Evans e cols., 1993). A importância do NO

na eliminação do parasita é claramente mostrada quando camundongos resistentes tratados com inibidores de iNOS, ou cujo gene que codifica essa enzima foi deletado, não conseguem controlar a infecção (Wei e cols., 1995).

Em infecções por L.(L.) major, verificou-se que o TNF-α tem participação na proteção contra a doença (Liew e cols., 1990). Sua ação é dependente de IFN-γ, e, na presença dessa citocina, é capaz de induzir a produção de NO necessária para a morte do parasita (Green e cols., 1990). A ação do TNF é dependente de seus dois receptores, TNFRp55 e TNFRp75. Na leishmaniose, foi verificado que animais deficientes no receptor p55 eram capazes de produzir grandes quantidades de IFN-γ, de NO e controlavam o parasitismo, mas a lesão não curava. Assim sugere-se a participação do receptor p55 na regressão da lesão (Vieira e cols., 1996). Já o receptor p75 mostrou-se desnecessário para o controle da lesão, pois animais deficientes neste receptor não tiveram o curso da infecção alterado (Nashleanas e cols., 1998)

No entanto, uma resposta efetiva contra diferentes espécies deLeishmania nem sempre acontece, sendo a suscetibilidade a este parasita relacionada à expansão de células TCD4+ tipo Th2, onde a citocina IL-4 é a principal envolvida na diferenciação desses linfócitos. Esses resultados foram obtidos em infecção por L.(L.) major em camundongos BALB/c (Chatelain e cols., 1992). Além disso, a IL-4 é capaz de inibir a expressão de receptor de IL-12 (IL-12R) devido à sua rápida produção por células T de camundongos BALB/c infectados por L.(L.) major (Himmelrich e cols., 1998). Essa rápida produção de IL-4 é devida principalmente à resposta de células Th2 de memória já diferenciadas, ao antígeno LACK de L.(L.) major. Essas células Th2 de memória responderiam normalmente a algum componente da flora intestinal dos camundongos BALB/c (Launois e cols., 1997).

Entretanto, a participação exclusiva de uma resposta Th2 na suscetibilidade à infecção por L.(L.) major é questionada, pois animais deficientes em IL-4 e infectados com esta espécie não controlaram a lesão e não apresentaram o desenvolvimento de uma resposta Th1 (Noben-Trauth e cols., 1996). Surpreendentemente, a presença de IL-4, em pequenas concentrações nas primeiras horas de infecção, pode direcionar a resposta para um perfil Th1 (Biedermann e cols., 2001). A adição de IL-12 recombinante em camundongos BALB/c infectados com L.(L.) major bloqueou a

produção de IL-4 nesses animais, e o bloqueio de IL-12 em animais C3H, resistentes à infecção porL.(L.) major, promoveu o aumento na produção de IL-4.

Outro exemplo do não envolvimento da IL-4 com a suscetibilidade foi demonstrado por Afonso & Scott (1993). Esses autores mostraram que camundongos C57BL/10, resistentes à L.(L.) major mas suscetíveis à L.(L.) amazonensis, não produzem grandes quantidades nem de IL-4 nem de IFN-γquando infectados com a última espécie. Esses dados sugerem que a ausência de uma resposta Th1, com elevada produção de IFN-γ, esteja mais relacionada à suscetibilidade que a presença de uma resposta do tipo Th2.

Reforçando a idéia de que a ausência de resposta Th1 é mais importante para determinar a suscetibilidade que a presença de uma resposta Th2, foi verificado que a ausência de receptor para IL-12 em células TCD4+ em camundongos C3H infectados com L.(L.) amazonensis estaria diretamente envolvida com a suscetibilidade deste animal, de maneira independente de IL-4 (Jones e cols., 2000).

Dessa forma, a participação da IL-4 no desenvolvimento da suscetibilidade de camundongos BALB/c infectados comL.(L.) major é discutida, e seu papel na infecção por outras espécies de Leishmania nem sempre está diretamente relacionado à suscetibilidade .

A determinação de outras citocinas envolvidas com a suscetibilidade torna-se fundamental, já que somente a presença de IL-4 não é capaz de explicar todas as situações experimentais apresentadas. Assim, foi demonstrado que o TGF-β é outra citocina bastante envolvida na suscetibilidade. Essa citocina tem como ação principal a desativação de macrófagos pela inibição da ação de IFN-γ. A neutralização de TGF-βé capaz de mudar o perfil de suscetibilidade de camundongos BALB/c à L.(L.) major. Além disso, sua administração nestes animais, concomitantemente com L.(V.) braziliensis, promove o desenvolvimento da doença, o que não acontece com animais não tratados (Barral-Netto e cols., 1992). Camundongos BALB/c infectados por L. (V.) chagasi apresentam maiores níveis de TGF-β em granulomas do fígado que animais C3H, resistentes (Wilson e cols., 1998) . a interpretação para esse achado é que o TGF-β tem papel importante no desenvolvimento de um perfil de suscetibilidade na leishmaniose.