BIOQUÍMICA 1º ano de Medicina Ensino teórico 2010/2011

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BIOQUÍMICA

1º ano de Medicina

Ensino teórico

2010/2011

10ª aula teórica

19 Outubro 2010

Príncipios gerais de enzimologia . Modo de acção das enzimas

. Cinética enzimática (Eq. Michaelis-Menten; K_Me V_max) Acção e regulação enzimática (ex. enzimas alostéreas).

1. Compreender as propriedades e modo de acção das

enzimas

2. Interpretar os parâmetros de cinética enzimática, de

acordo com a equação de Michaelis-Menten

nomeadamente K

M

e V

max

3. Analisar a regulação e controlo da actividade das

enzimas

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Enzimas - são catalizadores biológicos

- Favorecem as reacções químicas; não alteram o equílibrio químico

* A reacção processa-se mais rapidamente (eg oxidação glucose) - As enzimas regulam as reacções químicas nas células

- As enzimas apresentam:

* elevado poder catalítico * elevada selectividade

- As enzimas celulares são catalizadores invulgares:

* A sua eficiência é adaptada às necessidades celulares * regulação e controlo metabólico

Reacção normal: A ⇔⇔⇔⇔B

Reacção catalizada: A + E ⇔⇔⇔⇔AE ⇔⇔⇔⇔E + B A E é altamente selectiva

R

T

ENZIMAS

As enzimas, como catalizadores, alteram as constantes de velocidade, ie, alteram a velocidade de processamento das reacções

As enzimas baixam a energia de activação (G_A)

- Facilitam o encontro mútuo das moléculas e orientação

- Baixam a energia necessária para alterar a estabilidade das moléculas

∆∆∆∆G_A– Energia que é necessário fornecer a uma molécula de uma substância para se atingir o

Estadio Activado

Uma redução da energia de activação subentende uma maior velocidade de reacção

As enzimas não alteram o equilíbrio químico, mas favorecem a probabilidade de uma reacção ocorrer, baixando a energia de

activação reaccional

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Exemplos das classes de enzimas mais importantes

A maioria das enzimas são proteínas As enzimas são renovadas (“turnover”)

Dieta aporta: AA essenciais, metais, vitaminas Componente proteíco

+

Componente não-proteíco * Cofactor (ião)_{* Coenzima (molécula orgânica, vitaminas)}

* Grupo prostético (heme da Hb) Natureza química das enzimas

apoenzima + holoenzima

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A actividade das enzimas depende do pH e da temperatura

Exemplo: A PFK é inibida pelo pH

Logo, a acidose favorece a formação de glucose e a formação de piruvato e lactato

1. Se [S] é baixa, K_M>> [S], então

V= V_max[S]/K_Me V aumenta linearmente com [S] 2. Se [S] é alta, [S] >> K_M, então V=V_max

V=V_max[S]/K_M [S] V=V_max V e lo c id a d e d e r e a c ç ã o ½ V_max K_m

(*) A curva é uma hipérbole

KM- a [S] correspondente a ½ Vmax,

é a constante de Henri-Michaelis-Menten(medida de afinidade E-S)

EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN [S] V = V_max K_M+ [S]

Cinética enzimática

A primeira fase da catálise é a formação do complexo ES E + S ⇔⇔⇔⇔ES⇔⇔⇔⇔E + P

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V = Vmax [S] KM + [S] 1 = KM + [S] V Vmax[S] 1 = KM + [S] V Vmax[S] Vmax[S] 1 = KM 1 + 1 V Vmax [S] Vmax

1/V = K

_M

/V

_max

1/[S] + 1/V

_max

(y = ax + b)

Conversão num gráfico de duplos inversos

ou Lineweaver-Burk

[S] V_max V e lo c id a d e d e r e a c ç ã o

1. Local activo: ocupa uma pequena parte do volume total da enzima

* A maior parte dos aa na enzima não contactam com o substrato

2. O local activo é tridimensional

* Formado por grupos situados em diferentes partes da seq linear de aa. 3. O substrato liga-se à enzima por forças fracas, mas múltiplas:

* interacções electrostáticas

* ligações hidrogénio Interacção reversível * forças de Van der Waals entre as biomoléculas * interacções hidrófobas

* Cria-se um microambiente em que os resíduos adquirem

propriedades especiais para a catálise enzimática 4. A especificidade da ligação depende do arranjo precisamente definido dos

átomos no local activo

* Teoria da Chave e Fechadura

* Teoria da Conformação Induzida ou “Induced-Fit”

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1. Teoria da Chave e Fechadura:

As enzimas são altamente específicas

Reconhecem um determinado substrato Alteração de um grupo químico do substrato

As enzimas deixam de reconhecer esse substrato O local de interacção E/So(onde reside a actividade funcional da enzima)possui:

* Afinidade geométrica Simetria do local

* Afinidade de ligação química 1 só S aceite pela E

Acção das Enzimas

2. Teoria da Conformação Induzida (“Induced-Fit”)

Interacção Enzima/Substrato: Alteração da Conformação

O substrato ligado “quebra” num determinado ponto

Organização de vias metabólicas

S

→

P1

→

P2

→

...

→

Pf

Vias metabólicas: concatenação de

actividades enzimáticas que, pela

sua inter-penetração, tornam difícil

definir o S e P final de uma via

O estudo do metabolismo celular pressupõe estudar a dinâmica

de formação de S em P, i.e. o fluxo metabólico da via

E1 E2 E3 En

v

₁

v

₂

v

₃

v

_n

HOMEOSTASE: a manutenção da viabilidade celular pressupõe

que uma célula tenha a capacidade de manter um fluxo metabólico

adaptado às suas necessidades em função do seu meio ambiente.

⇒ Necessidade de ‘sentir’ o meio ambiente

(receptores e sistemas de transdução)

⇒ Capacidade de regulação metabólica

(‘steady-state’ metabólico)

Regulação-controlo

metabólico:

capacidade

de

modificar

actividades enzimáticas para modificar o fluxo metabólico

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Identificação tradicional de enzimas

‘reguladores’ e de ‘controlo’

Razão de acção de massas: a E com maior capacidade de regular o

fluxo de uma via seria a que teria a velocidade mais baixa, i.e.

maior razão [P] / [S]

S

→

P1

→

P2

→

...

→

Pf

E1 E2 E3 En

v

₁

v

₂

v

₃

v

_n

A fluxo é constante, todas as reacções

têm de ocorrer à mesma velocidade !

Newsholme: a E reguladora será aquela que responde com maior

amplitude a variações da [S] e cuja actividade possa ser controlada

por outros factores que não a [S]

Será que uma cinética ‘Michaeliana’ satisfaz estes critérios ?

0 5 10 15 20 25 30 12 3

[REAGENTE] (unidades arbitrárias)

A

C

T

IV

ID

A

D

E

(v

a

lo

re

s

a

rb

it

rá

ri

o

s

)

Modificação da actividade enzimática

-enzimas alostéreas

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NÃO OBEDECEM À CINÉTICA DE MICHAELIS-MENTEN 1. A molécula de enzima é frequentemente formada por subunidades 2. A interacção entre as subunidades permite que a ligação E-S assuma

características de cooperativadade (homoalosteria)

⇓ ⇓ ⇓ ⇓

A curva de saturação da enzima pelo substrato é uma SIGMÓIDE A ligação do substrato a um local activo afecta as propriedades de ligação do outro local activo na mesma molécula de enzima

3. A actividade de uma enzima alostérea pode ser modificada por moléculas reguladoras (heteroalosteria), que se ligam a locais diferentes dos locais catalíticos

⇓ ⇓ ⇓ ⇓

inibidores / activadores alostéreos

Enzimas alostéreas

Os inibidores alostéreos desviam para a forma T Os activadores alostéreos desviam para a forma R

Regulação da actividade enzimática

-

Regulação alostérea (feedback, feedforward)

- Modificação covalente reversível (e.g. fosforilação, outras) - Activação por clivagem proteolítica - Proteases enzimáticas

(e.g. coagulação) - Ciclos de substrato

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A activação e inibição de E por efectores alostéricos

Controlo de feedback (‘retro-inibição’) inibição pelo produto

Regulação da síntese das pirimidinas

Aspartato carbamoil transferase (ATCase)

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ISOENZIMAS E REGULAÇÃO FEEDBACK

↑intensidade inibição feedback

► ↑oscilação de fluxo na via

REGULAÇÃO FEEDFORWARD activação da PK pela 1,6 BPF

+

(‘limpa o caminho’ na via glicolítica) Modulação da formação de adenosina nos terminais nervosos

0 ATP NT ATP NT NT ATP ATPDase AMP Adenosine A1 -A2A + 5’-N

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REGULAÇÃO e CONTROLO

Regulação

flutuação de actividade E condicionada por restrição dos graus de liberdade da estrutura peptídica(mudança de software mantendo o hardware)

permite o ajuste fino da actividade individual de cada via

Controlo

Modificação covalente do E, forçando uma modificação drástica da sua actividade

(mudança de hardware)

permite grande modificação da actividade de várias vias

Controlo da actividade enzimática por modificação covalente Algumas enzimas são reguladas por metilação, ADP-ribosilação, palmitoilação (ou acilação) mas a forma mais comum de regulação enzimática por modificação covalente reversível é por fosforilação

1. Enzimas do metabolismo dos glúcidos - Fosforilase do glicogénio - Fosforilase cinase - Glicogénio sintetase - Fosfofrutocinase-2 - Piruvato cinase - Piruvato desidrogenase 2. Enzimas do metabolismo lipídico

- Hidroximetilglutaril-CoA redutase - Acetil-CoA carboxilase

- Triacilglicerol lipase

3. Enzimas do metabolismo dos aminoácidos - Cetoácido desidrogenase - Fenilalanina hidroxilase - Tirosina hidroxilase Enz – CH₂O-P-O -Enz – CH2OH Cinase Fosfatase ADP~~P ADP P_i H₂O O O -As ‘fosforilações’ não são todas equivalentes

Ser - Thr - Tyr sequências consensus (e.g. fosforilase cinase)

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Regulação por modificação covalente reversível - AMPLIFICAÇÃO

X

Y

A

B

‘ADP + Pi’

‘ATP’

E1

E-1

E

_X

_E

Y

CICLOS DE SUBSTRATO (ciclos fúteis)

Vantagens: permite levar o fluxo de uma via a zero (⇒máximo aumento percentual) Desvantagens: consomem energia (ciclo fútil) Quanto mais rápido o fluxo interno do ciclo mais

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Regulação da actividade enzimática por activação proteolítica: Algumas enzimas são reguladas por Proteólise

1. Enzimas digestivas - Tripsina - Quimotripsina - Carboxipeptidase A e B - Pepsina - Fosfolipase

2. Enzimas da coagulação sanguínea - Factores VII, IX, X, XI e XII, trombina

3. Enzimas envolvidas no desenvolvimento - Colagenase 4. Enzimas apoptóticos -Caspases Tripsinogénio Tripsina (T) Enteropeptidase Quimotripsinogénio Proelastase Elastase ππππ-Quimotripsina Quimotripsina Procarboxipeptidase Carboxipeptidase T T T T ππππ

Muitas enzimas são sintetizadas sobre a forma de

pró-enzimas ou zimogénios

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BIOQUÍMICA

1º ano de Medicina

Ensino teórico

2010/2011

11ª aula teórica

Cristina Rego

As enzimas como alvo terapêutico e utilização em meios de diagnóstico. Conceito de inibição enzimática:

- reversível e irreversível; - competitiva e não-competitiva. Exemplos de inibição enzimática:

- intoxicação por organofosforados; - Inibidores como agentes terapêuticos.

Conceito de isoenzima (a creatina fosfocinase e a lactato desidrogenase no diagnóstico do enfarte do miocárdio).