UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
YZABELLA ALVES NOGUEIRA DE LIMA
AVALIAÇÃO DO IMPACTO DA HIPOFIBRINÓLISE INDUZIDA PELO USO DE ÁCIDO TRANEXÂMICO NA PROGRESSÃO DA SEPSE EXPERIMENTAL
MURINA
CAMPINAS 2017
AVALIAÇÃO DO IMPACTO DA HIPOFIBRINÓLISE INDUZIDA PELO USO DE ÁCIDO TRANEXÂMICO NA PROGRESSÃO DA SEPSE EXPERIMENTAL
MURINA
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências na Área de Concentração em Clínica Médica.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Erich Vinicius de Paula
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA YZABELLA ALVES NOGUEIRA DE LIMA, E
ORIENTADA PELO PROF. DR. ERICH VINICIUS DE PAULA.
CAMPINAS 2017
ORIENTADOR: Prof. Dr Erich Vinicius de Paula
MEMBROS:
1. Prof. Dr Erich Vinicius de Paula
2. Prof Dr Joyce Maria Annichino-Bizzacchi
3. Prof. Dr Eugenio Damaceno Hottz
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICO AOS MEUS TIOS RONALDO NOGUEIRA E VERA LÚCIA DO PATROCÍNIO NOGUEIRA; QUE FALECERAM EM DECORRÊNCIA DA SEPSE NO PRIMEIRO ANO DESTE TRABALHO
EM PRIMEIRO LUGAR A DEUS.SEM ELE SERIA UM SONHO IMPOSSÍVEL.
AOS ANIMAIS;
AO PROFESSOR ERICH.NÃO TENHO PALAVRAS PARA AGRADECER PELA SUA TRANQUILIDADE EM CONDUZIR ESTE PROJETO, A PACIÊNCIA PARA ENSINAR E PRINCIPALMENTE A CONFIANÇA EM MIM DEPOSITADA.LEVO DA UNICAMP MAIS QUE UM TÍTULO DE MESTRE, APRENDI OUTRA LIÇÃO SOBRE A VIDA;
AOS MEUS PAIS E AO MEU MARIDO, POR SUPORTAREM A DISTÂNCIA E A AUSÊNCIA;
AOS MEUS AMIGOS E COMPANHEIROS DE EQUIPE,FÁBIO,LOREDANA,MAIARA,SANDRA E
WILL.LONGE DE CASA, ENCONTRAMOS NA EQUIPE UMA FAMÍLIA;
AOS AMIGOS E FUNCIONÁRIOS DOS LABORATÓRIOS DE HEMOSTASIA, MICROBIOLOGIA E BIOQUÍMICA DA UNICAMP;
Sepse pode ser definida como um estado patológico potencialmente letal decorrente das consequências da resposta do organismo a uma infecção. A forma grave da doença pode chegar a 30% de letalidade em países desenvolvidos, e sua incidência mostrou aumento de 10% na última década. No Brasil esse valor varia de 32,8% até 72,7% para pacientes com choque séptico. Pela ausência de tratamento específico, o tratamento segue baseado em antibioticoterapia e terapias de suporte. A ativação da coagulação é parte indissociável da resposta imune à presença de patógenos invasores, e portanto, da sepse. No entanto, seu significado para a fisiopatologia desta condição permanece incerto. Do ponto de vista evolutivo, a ativação local da hemostasia pode contribuir para a compartimentalização de focos infecciosos, diminuindo ou até evitando a sua disseminação. Através do modelo considerado padrão-ouro para o estudo da sepse – a ligadura e punção cecal (CLP) - associado a um inibidor da fibrinólise, buscamos avaliar de forma geral o papel da ativação da coagulação na evolução da sepse, e de forma específica, o papel da hipofibrinólise nesta condição. Para tanto utilizamos camundongos C57Bl/6J que receberam o agente antifibrinolítico ácido tranexâmico ou solução salina desde dois dias antes do início dos experimentos até sua conclusão. Após a indução da sepse, os animais foram avaliados quanto à sobrevida em 7 dias, e quanto a parâmetros hematológicos, bioquímicos, inflamatórios e de disseminação bacteriana, 24 horas após a indução da sepse. O modelo de hipofibrinólise e hipercoagulabilidade foi confirmado pelo prolongamento do tempo de lise de euglobulina e pelo aumento da formação de complexos trombina-antitrombina nos animais tratados. Na dose de 100mg/kg, o AcTnx não modificou a mortalidade ou gravidade da sepse. Em uma dose mais elevada, de 600mg/kg, observamos um aumento da mortalidade em camundongos que receberam AcTnx. A avaliação de parâmetros laboratoriais da sepse como marcadores bioquímicos ou histológicos comumente alterados na sepse não mostrou diferenças entre os grupos tratados com AcTnx ou veículo. Observamos que o AcTnx resultou em uma redução significativa de alguns marcadores inflamatórios como a IL-6 e a quimiotaxina MCP-1. Além disso, embora o AcTnx não tenha reduzido o crescimento bacteriano em todos os sítios avaliados,
bacteriana em sangue, indicando que a ativação da coagulação influenciou na disseminação bacteriana.
KEY WORDS:SEPSIS, DISSEMINATED INTRAVASCULAR COAGULATION
Activation of coagulation is an integral part of the immune response to the presence of invading pathogens, and therefore, of sepsis. However, its significance to the pathophysiology of this condition remains uncertain. From the evolutionary view point, the local activation of hemostasis can contribute to the compartmentalization of infectious outbreaks, thus reducing or even avoiding its spread. Through the model considered the gold standard for the study of sepsis - the cecal ligation and puncture (CLP) - associated with an inhibitor of fibrinolysis, we assessed, generally, the role of coagulation activation in the sepsis development and specifically, the role of hypofibrinolysis in this condition. For this we used C57Bl/6J mice that received the anti-fibrinolytic agent tranexemic acid or saline, since two days before the start of the experiments until its completion. After the sepsis induction, the animals were assessed for 7-days survival and for hematological, biochemical, histological, inflammatory and microbiological parameters commonly changed in sepsis. The hypofibrinolysis model and hypercoagulability was confirmed through the elongation time of euglobulin analysis evaluation and the increasing of the Thrombin-Antithrombin complexes formation in the treated animals. In the 100mg/Kg dose, TnxAc not modified the mortality or sepsis severity. In a higher dose, 600 mg/kg, we observed a mortality increase in mice who received TnxAc. The laboratory parameters evaluation of sepsis as histological or biochemical markers commonly changed in sepsis, showed no differences between the groups treated with TnxAc or vehicle. We observe that the TnxAc resulted in a significant reduction of some inflammatory markers such as IL-6 and the chemotaxis MCP-1. Moreover, although TnxAc has not reduced bacterial growth on all sites evaluated, we observe that its use resulted in a reduction of the bacterial proliferation in liver, in addition a statistical trend that showed a bacterial proliferation reduced in blood.
iniciação. ... 16
Figura 2 - Ativação da coagulação – II: Amplificação. ... 19
Figura 3 – Representação esquemática do mecanismo de ação do ácido tranexâmico ... 26
Figura 4 - Etapas do modelo CLP: 1. Anestesia, contenção e procedimentos pré-operatório. ... 30
Figura 5 - Esquema ilustrativo do método de avaliação do clearance bacteriano. 36 Figura 6 - Tempo de lise da euglobulina (TLE)... 38
Figura 7 - Geração complexo trombina-antitrombina (TAT)... 39
Figura 8 - Curva de sobrevida AcTnx 100mg/Kg - I ... 40
Figura 9 - Curva de sobrevida AcTnx 100mg/Kg- II ... 41
Figura 10 - Curva de sobrevida AcTnx 600mg/Kg. ... 42
Figura 11 - Escore clínico da sepse ... 43
Figura 12 - Niveis das enzimas hepáticas nos grupos experimentais ... 44
Figura 13 - Função renal nos grupos experimentais ... 45
Figura 14 - Níveis de LDH e creatina quinase ... 46
Figura 15 - Níveis de IL-6 e MCP-1 ... 47
Figura 16 - Níveis de KC/CXCL-1 e TNF ... 48
Figura 17 - Clareamento bacteriano in vivo em líquido peritoneal e rins ... 50
Tabela 2 - Parâmetros hematológicos ... 37 Tabela 3 - Parâmetros histológicos: Frequência de tromboses microvasculares em pulmões e rins ... 49
LISTADEABREVIATURAS
ACTNX -Ácido tranexâmico
CIVD – Coagulação Intravascular Disseminada CLP- Ligadura e punção cecal
DNA – Ácido desoxiribonucleico FT – Fator tecidual
IL-6–Interleucina 6 IL-10 – Interleucina 10
KC/CXCL-1 – Quimiocina quimiotática de neutrófilos LDH–Lactato desidrogenase
MCP-1– Proteína quimiotática de monócitos
SIRS – Síndrome da resposta imunológica sistêmica TAT – Trombina – antitrombina
TLE – Tempo de lise de euglobulina TNFα – Fator de necrose tumoral
LISTADEFIGURAS ... 23
LISTADETABELAS ... 24
LISTADEABREVIATURAS ... 24
INTRODUÇÃO ... 14
1.1.Sepse: aspectos gerais e epidemiológicos ... 14
1.2. Fisiopatologia da sepse ... 15
1.3. Ativação da hemostasia na sepse ... 15
1.3.1 Mecanismo geral da hemostasia ... 15
1.3.2 Alterações de hemostasia na resposta a infecções e na sepse ... 19
1.4.O papel da ativação da hemostasia na fisiopatologia da sepse ... 20
1.5.Visão evolutiva do papel da ativação da coagulação na sepse ... 21
1.6.A inibição da ativação da hemostasia como fator de virulência de patógenos ... 24 1.7. Inibidores da Fibrinólise ... 25 OBJETIVOS ... 27 2.1 Objetivo geral ... 27 2.2 Objetivos específicos ... 27 MATERIAIS E MÉTODOS ... 28 3.1. Aspectos éticos ... 28 3.2. Modelo animal ... 28
3.3.Desenho geral do estudo ... 28
3.4. Indução da sepse ... 29
3.5. Coleta e processamento de amostras ... 30
3.5.1. Sangue ... 30
3.5.2.Órgãos e tecidos... 31
3.6. Parâmetros hematológicos ... 31
3.7. Tempo de lise de euglobulina (TLE)... 31
3.8. Dosagem de complexos trombina-antitrombina (TAT) ... 32
3.9. Avaliação histológica de lesão tecidual ... 32
3.10. Marcadores bioquímicos de lesão tecidual... 33
3.11. Curva de sobrevida ... 33
5.1. Caracterização do modelo de hipofibrinólise e ativação da coagulação .. 37
4.2. Impacto do AcTnx na sobrevida da sepse experimental murina... 39
4.3. Impacto do AcTnx na evolução clínica da sepse experimental murina ... 42
4.3. Marcadores bioquímicos de lesão tecidual... 43
4.4. Mediadores inflamatórios no plasma ... 46
4.5. Marcadores histológicos de lesão tecidual ... 49
4.6. Clareamento bacteriano ... 49
DISCUSSÃO ... 52
CONCLUSÕES ... 61
INTRODUÇÃO
1.1.Sepse: aspectos gerais e epidemiológicos
A sepse é um estado patológico potencialmente letal decorrente das consequências da resposta do organismo a uma infecção. A sepse pode ainda ser definida como a “resposta sistêmica a uma infecção, associada à presença de algum grau de disfunção orgânica” (Vincent et al., 2013). Esta resposta - definida por critérios clínicos e laboratoriais - recebe o nome de SIRS (síndrome da resposta inflamatória sistêmica). A SIRS ocorre não apenas como resposta a infecções, mas também a outros insultos como traumas, queimaduras, entre outros. A definição mais tradicional de sepse é a de uma SIRS desencadeada por uma infecção (Bone, 1992). Mais recentemente, uma nova definição de sepse foi proposta, consistindo na presença de “disfunções orgânicas associadas a risco para a vida do paciente, causada por uma resposta desregulada a uma infecção”. O objetivo deste ajuste foi principalmente deixar claro que a sepse está presente apenas quando a resposta à infecção está associada a aumento do risco de morte (Singer et al., 2016)
A sepse grave ainda apresenta taxas muito elevadas de mortalidade, de até 30% em países desenvolvidos (Gaieski et al., 2013). Além disso, o aumento da expectativa de vida da população, e o uso mais frequente de agentes imunossupressores e procedimentos invasivos, resultaram em um aumento progressivo em sua incidência, de mais de 10% na última década(Conde et al., 2013). No Brasil, taxas de mortalidade ainda mais altas, variando de 32,8% para pacientes com sepse até 72,7% para pacientes com choque séptico já foram reportadas (Van Der Poll e Herwald, 2014). Um estudo mais recente mostrou ainda que pacientes tratados no serviço público apresentam taxas de mortalidade mais elevadas para a sepse no Brasil que pacientes tratados na rede privada (Conde et al., 2013).
Outro ponto importante sobre a sepse é que a despeito dos grandes avanços obtidos na compreensão de sua fisiopatologia, seu tratamento segue baseado no uso de antibióticos e na terapia de suporte. De fato, não há até o momento, terapia direcionada para pontos específicos da resposta inflamatória da sepse. Em conjunto, estes dados deixam clara a importância de estudos que abordem a
fisiopatologia da sepse, abrindo caminho para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes para estes pacientes (Seeley et al., 2012).
1.2. Fisiopatologia da sepse
Na sepse, acredita-se que o principal elemento fisiopatológico não seja o patógeno invasor, mas sim a resposta inflamatória do hospedeiro à presença deste microorganismo. Esta resposta inflamatória pode variar desde auto limitada, que anula a ação do patógeno, até uma resposta inflamatória devastadora e sem controle, que pode levar por si só à morte do hospedeiro. Praticamente todos os seres vivos desenvolveram mecanismos sensores para a detecção rápida de patógenos invasores. Em mamíferos, estes mecanismos são representados pelos receptores reconhecedores de padrão (ou PRRs). Estes receptores reconhecem porções conservadas de patógenos de diferentes tipos, ou ainda, mediadores de lesão tecidual inespecíficos como o ácido úrico, DNA dupla fita livre, entre outros (Van Der Poll e Herwald, 2014). A ativação destes receptores desencadeia cascatas de sinalização que culminam com o recrutamento de leucócitos, ativação de genes pró-inflamatórios, produção de citocinas, modificações no endotélio que otimizam a capacidade de resposta imune inata, e ativação da hemostasia. O paradigma clássico de entendimento da fisiopatologia da sepse baseia-se no conceito que a sepse seria uma condição caracterizada pela ativação exacerbada e desregulada destes mecanismos, que de benéficos, passariam a deletérios (Seeley et al., 2012).
1.3. Ativação da hemostasia na sepse 1.3.1 Mecanismo geral da hemostasia
Para falar do papel da coagulação na fisiopatologia da sepse, é interessante fazer uma rápida revisão do processo de hemostasia. De acordo com o modelo tradicional, a hemostasia pode ser dividida em primária e secundária. A hemostasia primária engloba o endotélio, as plaquetas e o fator de Von Willebrand, que faz a ponte entre plaquetas e células endoteliais. A hemostasia secundária envolve os fatores da coagulação, classicamente apresentados sob a forma da cascata da
coagulação, com as vias intrínseca e extrínseca de ativação. Além disso, uma 3ª etapa, a fibrinólise, é responsável pela eliminação do coágulo formado, uma vez que ele não seja mais necessário. Estas 3 etapas da hemostasia devem funcionar de forma equilibrada e regulada – representando o conceito de “balanço hemostático” - para que a ativação da hemostasia não resulte em sangramentos ou tromboses.
Apesar da utilidade clínica e laboratorial do modelo em cascata, o modelo que melhor explica a regulação da hemostasia divide a coagulação em 3 fases: iniciação, amplificação e propagação. Na fase de iniciação, a coagulação é ativada quando o fator tissular (FT), uma proteína transmembrana expressada por praticamente todas as células do organismo, entra em contato com o plasma. Isto ocorre por exemplo quando há ruptura da integridade endotelial em um trauma. O FT se liga ao FVIIa formando o chamado complexo de iniciação da hemostasia, que ativa o FX em FXa, levando à geração de concentrações muito pequenas de trombina. Esta trombina é ainda insuficiente para converter o fibrinogênio em fibrina.
Figura 1 Ativação da coagulação I: Primeira fase da ativação da coagulação: iniciação. A coagulação é ativada quando o fator tissular (FT) se se liga ao FVIIa formando o chamado complexo de iniciação da hemostasia, que ativa o FX em FXa, levando à geração de concentrações muito pequenas de trombina.
Na fase seguinte, chamada de amplificação (Figura 2a), a trombina medeia uma série de reações que aumentam sua própria geração, de modo que a concentração final de trombina atinja valores que permitam a formação da fibrina a partir do fibrinogênio. Estas reações incluem: (1) ativação das plaquetas, sobre as quais a formação do trombo ocorre; (2) ativação do fator XI, que recruta uma nova via para conversão FX em FXa e geração de trombina (via também conhecida como “intrínseca); (3) ativação dos cofatores da cascata da coagulação (fatores V e VIII), aumentando a eficiência da ativação da coagulação; e (4) ativação do fator XIII, que atuará no fortalecimento das ligações entre monômeros de fibrina, tornando-os mais resistentes à ação da fibrinólise (Mann et al., 2006).Com a participação de todos estes mecanismos, a concentração de trombina atinge então quantidades necessárias para a formação de fibrina, dando início a fase final da coagulação, conhecida como propagação, quando um coágulo rico em plaquetas e fibrina propaga-se pela região onde a hemostasia foi iniciada pela expressão de FT (Figura 2b).
Todos estes passos possuem inibidores naturais, cuja ação fundamental para manter o sistema em equilíbrio, sem tendências a sangramentos ou a tromboses. Os inibidores conhecidos são: (1) o inibidor da via do fator tissular (TFPI), que inibe o complexo FT/FVII ativado; (2) a antitrombina (AT), que inibe as serina proteases da cascata como o fator X ativado e a trombina, e (3) a proteína C ativada (PCa), que inibe os cofatores V e VIII ativados. A diminuição destes inibidores aumenta o risco de tromboses venosas.
Um outro sistema regulador importante, cuja disfunção pode resultar em sangramentos ou tromboses é o sistema fibrinolítico. Este sistema é o principal responsável pela degradação do coágulo através do controle enzimático de degradação da fibrina, cuja enzima efetora é a plasmina. A plasmina é gerada a partir do plasminogênio, uma pró-enzima que pode ser ativada por fatores intrínsecos como a calicreína e o fator de Hageman. Também pode ser ativado através da ação de fatores extrínsecos como o ativador de plasminogênio tecidual (Collen et al., 1977) (t-PA) e a uroquinase ativadora de plasminogênio (u-PA). Uma vez ativado, o plasminogênio é convertido em plasmina, e esta degrada a fibrina em compostos solúveis (produtos de degradação da fibrina - PDFs) como o dímero
D, comumente utilizado no diagnóstico de trombose venosa profunda e tromboembolismo pulmonar(Suzuki et al., 2010). A ativação do plasminogênio tem como principal inibidor natural a α2 – antiplasmina, que interage de forma
irreversível, impedindo que a enzima forme um composto estável necessário para sua ativação. Por outro lado, a plasmina aumenta sua própria geração por mecanismos de feedback positivo, estimulando a produção de formas ativas tanto do t-PA quando do u-PA. Esses dois ativadores têm como inibidores naturais o inibidor do ativador de plasminogênio tipo 1 (PAI-1) e o PAI-2. A atividade da plasmina é também modulada pelo inibidor da ativação da fibinólise ativado pela trombina (TAFI) (Boffa et al., 1999), que pelo mecanismo de remoção do resíduo de fibrina C-terminal, importante para a ligação e ativação do plasminogênio, torna a fibrina mais resistente a ativação do plasminogénio mediado pelo t-PA.
Figura 2 - Ativação da coagulação – II: Na segunda fase da ativação da coagulação, ou
amplificação (a), a trombina medeia uma série de reações que tem como objetivo aumentar sua própria geração, de modo que sua concentração final permita a conversão do fibrinogênio em fibrina. Como resultado, inicia-se a fase de propagação (b), quando um trombo rico em plaquetas e fibrina se propaga pela região onde a hemostasia foi iniciada pela expressão do fator tissular.
1.3.2 Alterações de hemostasia na resposta a infecções e na sepse
Conforme já mencionado, a ativação da coagulação é parte integrante da resposta do hospedeiro à invasão por patógenos, assim como da resposta inflamatória a outros insultos (SIRS). Uma das primeiras evidências inequívocas desta ativação foi demonstração da expressão anômala de FT por monócitos e por células endoteliais induzida por agentes infecciosos d. No entanto, bem antes desta demonstração, a ideia de que a sepse era acompanhada por um estado de hipercoagulabilidade sistêmica já era bastante aceita pela comunidade científica, a partir da observação das alterações clínicas e laboratoriais observadas em pacientes com sepse. Este conjunto de alterações clínicas e laboratoriais é tradicionalmente conhecido como coagulação intravascular disseminada (CIVD).
A definição clássica de coagulação intravascular disseminada (CIVD) é de uma síndrome clínico-patológica caracterizada por ativação desregulada da coagulação e deposição de fibrina intravascular. Duas fases de CIVD são reconhecidas. Na primeira, subclínica, ocorre ativação da coagulação mediada por (i) expressão anômala de FT, (ii) deficiência adquirida dos anticoagulantes naturais TFPI, AT e PCa (tanto por consumo quanto por redução da produção), e (iii) aumento da expressão de PAI-1, um inibidor do sistema fibrinolítico. Nesta fase, testes clássicos de coagulação não mostram alterações significativas. Se o processo inflamatório não for interrompido, a CIVD progride para a segunda fase, (no inglês, “overt DIC”), caracterizada por consumo de fatores de coagulação e plaquetas, e frequentemente associada a sangramentos (Levi et al., 1999). Assim, a CIVD ilustra bem a regulação dinâmica do balanço hemostático durante a sepse, inicialmente desequilibrado para hipercoagulabilidade, mas que eu sua fase final, é predominantemente associado a hipocoagulabilidade.
1.4.O papel da ativação da hemostasia na fisiopatologia da sepse
A observação sistemática das fases da CIVD em pacientes com sepse, associada à descrição de trombos na microcirculação em órgãos acometidos por falência em pacientes com sepse em estudos de autopsia (Semeraro et al., 2012) levou à disseminação do conceito de que a ativação da coagulação seria responsável por estas tromboses, que por sua vez seriam uma das causas para a falência orgânica na sepse. Em outras palavras, o desenvolvimento de falência de múltiplos órgãos na sepse vem classicamente sendo atribuído, pelo menos em parte, a distúrbios da micro circulação decorrentes deste estado pró-coagulante, que levaria em última instância à formação de micro trombos e á isquemia tecidual.
No entanto, dados importantes surgidos nos últimos anos puseram em xeque este paradigma clássico. Entre estes dados, destacam-se os resultados de 3 grandes estudos clínicos randomizados de fase 3, que não conseguiram demonstrar benefício na reposição de anticoagulantes naturais em pacientes com sepse (Fourrier, 2012). Nestes estudos, o uso de formas recombinantes de proteína C ativada, AT ou TFPI em pacientes com sepse não resultou em qualquer benefício quando comparado com o placebo. Embora alguns autores argumentem que o desenho destes estudos possa ter sido inadequado para a demonstração do benefício clínico, a falha sistemática de três estratégias independentes baseadas no bloqueio da ativação da coagulação na sepse admite questionamento sobre a validade da premissa de que a ativação da coagulação seria um aspecto negativo na sepse. Além disso, uma análise cuidadosa sobre as evidências que sustentam esta premissa revela com relativa facilidade a fragilidade dos estudos de autopsia (um dos pilares desta premissa), tanto no que diz respeito ao número de estudo, quanto ao número de casos. De fato, estudos de autopsia mais recentes não foram capazes de demonstrar evidências sistemáticas da presença de tromboses em pacientes com sepse (Tajiri et al., 2012). Recentemente, nosso grupo realizou um estudo que avaliou os laudos de autopsia de 65 pacientes falecidos por choque séptico, no qual a frequência de tromboses microvasculares na circulação renal e pulmonar foi de apenas 5%, um valor semelhante ao observado no grupo controle, composto por pacientes falecidos por outras causas (Tani et al, submetido para publicação).
Por fim, a própria extensão da hipercoagulabilidade na sepse vem sendo questionada por estudos realizados com metodologias mais adequadas para avaliação da coagulação. Em um estudo baseado no teste de geração de trombina, um método capaz de avaliar globalmente a hemostasia, não pudemos observar sinais de hipercoagulabilidade evidente, mesmo nas fases iniciais da sepse (Picoli-Quaino et al., 2014).
1.5.Visão evolutiva do papel da ativação da coagulação na sepse
Além da falha dos estudos clínicos com anticoagulantes, e das limitações dos estudos que sustentam a presença de um estado de hipercoagulabilidade na sepse, há outro elemento importante que deve ser considerado quando na análise do papel da ativação da hemostasia na sepse. Este elemento consiste na forte associação evolutiva entre a resposta imune inata e ativação da coagulação. Evidências bioquímicas e moleculares têm demonstrado que os dois sistemas se desenvolveram de forma paralela há mais de 450 milhões de anos (Davidson et al., 2003),(Nonaka e Kimura, 2006). Um exemplo ilustrativo desta associação é o
artrópode Limulus polyphemus, também conhecido como caranguejo ferradura (embora não seja de fato um caranguejo). Por viver em costões rochosos, exposto ao efeito das marés e ondas do mar, e possuir sistema circulatório aberto, uma das maiores ameaças a este animal é a ruptura do tegumento e perda da integridade corporal por trauma. Esta pressão evolutiva levou ao desenvolvimento de uma cascata de proteases que quando estimulada pela endotoxina presente na água do mar (rica em algas cianofíceas), leva à gelificação da endolinfa, impedindo a ruptura completa do tegumento. Ao mesmo tempo, são produzidas substâncias capazes de eliminar microorganismos invasores que penetram no animal através destas brechas tegumentares (Loof et al., 2016). O fato de este mecanismo, que pode ser visto como uma versão muito primitiva da hemostasia e da imunidade inata, ser ativado pela endotoxina (um ativador comum da imunidade inata e da hemostasia em humanos) ilustra como estes dois sistemas estão ligados desde muito antes da emergência dos vertebrados.
De fato, diversas evidências obtidas em modelos animais de sepse sugerem que a redução da ativação da coagulação pode ter como consequência uma perda da capacidade de clareamento de infecções, sugerindo que além de seu papel clássico na hemostasia, a ativação da coagulação serviria também para compartimentalizar focos infecciosos, facilitando seu clareamento(Fiusa et al., 2015). Esta possibilidade foi proposta de forma direta pela primeira vez em 2008 como a hipótese de “contenção hemostática”(Alcock e Brainard, 2008). Cabe destacar no entanto, que os resultados com estes modelos são bastante heterogêneos, ora associando a ativação da coagulação com efeitos protetores, ora com efeitos deletérios na sepse experimental murina. Em 2011 nosso grupo contribuiu com a literatura nesta área em um estudo que mostrou que as deficiências de fatores VIII ou IX da coagulação não modificavam a evolução da endotoxemia murina(Vancine et al., 2011).
Por fim, outro conjunto de dados que sugere que a ativação da coagulação observada na resposta a infecções possa representar um mecanismo benéfico para o hospedeiro são os estudos que mostram que durante a geração de trombina, ou durante a conversão do fibrinogênio em fibrina, são gerados peptídeos com ação antimicrobiana (Hanington e Zhang, 2016).
Desse modo, uma das explicações possíveis para a falha dos anticoagulantes naturais no tratamento da sepse seria seu efeito negativo sobre os mecanismos de compartimentalização e de geração de peptídeos antimicrobianos durante as infeções. No entanto, o surgimento de novos conceitos como o de imunotrombose (que detalha os mecanismos pelos quais a ativação da coagulação contribui para a erradicação de patógenos) (Engelmann e Massberg, 2013), além de evidências mais robustas sobre a participação de neutrófilos, hemácias e plaquetas na fisiopatologia da sepse (Mcdonald et al., 2017) nos últimos cinco anos agregaram mais complexidade à questão do papel da ativação da coagulação na sepse. Esta complexidade é bem ilustrada por uma revisão recente sobre os resultados de estudos com modelos animais de sepse e de manipulação da hemostasia, que mostra que esta importante questão científica permanece aberta (Fiusa et al., 2015) (tabela 1).
Tabela 1 - Efeitos da modulação na coagulação: modelos animais de sepse
* Os efeitos sobre a hemostasia foram estimados com base no conhecimento atual da fisiologia deste sistema de forma livre pelos autores; ** Modelo consiste na instilação Modelo (alteração genética) Efeitos na hemostasia * Sepse/modelo de infecção Efeito da disseminação de patógenos/severidade da sepse Deficiência de 2-antiplasmina Melioidose **
↑ mortalidade, ↑ disseminação bacteriana(Kager et
al., 2013)
Deficiência t-PA Melioidose **
Peritonite septica
↓ mortalidade, ↓ disseminação bacteriana(Kager et
al., 2012) ↑ mortalidade, ↑ disseminação bacteriana(Renckens et al., 2006) Deficiência Factor XI Y. enterocolitica (ip) Sepse Peritoneal Listeriose Inalterado(Luo, 2011) ↓ mortalidade(Tucker et al., 2008)
↓ mortalidade, ↓disseminação bacteriana(Luo et al., 2012)
Deficiência Factor VIII Endotoxemia
E. coli (ip)
Inalterado(Vancine et al., 2011) ↑ crescimento bacteriano, ↔ sobrevida(Schoenmakers et al., 2005)
Deficiência Factor IX Endotoxemia Inalterado(Vancine et al., 2011)
Deficiência PAI-1
Melioidose ** H. influenza Klebsiella pneumonia
↑ mortalidade , ↑ crescimento bacteriano(Kager et
al., 2011)
↑ crescimento bacteriano(Lim et al., 2011) ↑ mortalidade , ↑ crescimento bacteriano(Renckens et al., 2007) Deficiência de fibrinogênio Y. enterocolitica (ip) Grupo A streptococci sepse Listeriose
↑ mortalidade , ↑ disseminação bacteriana(Luo, 2011)
↑ mortalidade(Sun et al., 2009) ↑ mortalidade , ↑ disseminação bacteriana(Mullarky et al., 2005)
Deficiência de Fator V Grupo A streptococci
sepse ↑ mortalidade(Sun et al., 2009) Deficiência fator tecidual S. aureus Y. enterocolitica (ip) Endotoxemia Endotoxemia inalterado(Flick et al., 2013) ↑ mortalidade(Vancine et al., 2011) ↓ inflamação(Schoenmakers et al., 2004) ↓ mortalidade , ↓ inflamação(Pawlinski et al.,
2004) Deficiência dupla
PAI-1 + TAFI Y. enterocolitica (ip) ↑ mortalidade(Vancine et al., 2011)
Deficiência Factor II S. aureus ↓ mortalidade(Flick et al., 2013)
Deficiência Factor XIII S. aureus
S. pyogenes (pele)
inalterado(Flick et al., 2013) ↑ disseminação bacteriana(Loof, 2011) Deficiência Protein C
(heterozigose) Endotoxemia ↑ mortalidade(Levi et al., 2003)
Deficiência TAFI E. coli (ip) transitória↑ crescimento bacteriano(Renckens et al.,
2005)
Deficiência Fator VII Endotoxemia ↓ mortalidade , ↓ inflamaçaõ(Xu et al., 2006)
Fator V Leiden Peritonite séptica
intranasal da bactéria Gram negativa Burkholderia pseudomallei. Tabela adaptada de Fiusa e colaboradores (Fiusa et al., 2015).
1.6.A inibição da ativação da hemostasia como fator de virulência de patógenos Conforme discutido no tópico anterior, a ativação da cascata de coagulação parece agir conjuntamente com o sistema imune inato para evitar a disseminação de patógenos no organismo do hospedeiro. No entanto algumas bactérias desenvolveram, durante o processo evolutivo, mecanismos de salvaguarda contra a ativação do sistema imune e a contenção hemostática. Um importante exemplo é o Streptococcus pyogenes. A estreptoquinase produzida pelo S. Pyogenes estimula a conversão de plasminogênio em plasmina, representando um potente agente trombolítico (Nitzsche et al., 2015). Outros fatores de virulência do S. pyogenes são a produção da exotoxina pirogênica B (speB), uma proteinase extracelular que cliva proteínas da matriz extracelular como a fibronectina (Kapur et al., 1993) e a proteína M, uma proteína de superfície que se liga ao fibrinogênio, inibindo sua conversão em fibrina (Yamaguchi et al., 2013). A interrupção da ligação entre fibrina e colágeno, o bloqueio da conversão do fibrinogênio em fibrina e a ativação do plasminogênio em plasmina funcionam como facilitadores da evasão bacteriana. Esse microorganismo também tem demonstrando habilidade de atrair plasminogênio do hospedeiro para a superfície bacteriana, onde é então convertido em plasmina, conferindo ao patógeno um mecanismo adicional de fibrinólise pericelular, incluindo degradação de componentes da matriz extracelular, o que permite a invasão tecidual, e em seguida a disseminação. Por fim, a plasmina que age na superfície bacteriana também demonstrou ser capaz de degradar alguns peptídeos antimicrobianos, como a catelicidina (Loof et al., 2014)
O fato de uma bactéria de alta patogenicidade como o S. pyogenes possuir a capacidade de degradar peptídeos antimicrobianos e lisar fibrina, facilitando a evasão da contenção hemostática, invasão tecidual e disseminação, serve como prova conceitual da importância da coagulação como sistema de defesa contra patógenos invasores.
1.7. Inibidores da Fibrinólise
Fármacos antifibrinolíticos são agentes capazes de inibir o processo natural de fibrinólise, responsável pela dissolução do coágulo de fibrina. Estes agentes são amplamente utilizados na clínica para tratamento de sangramentos em pacientes com coagulopatias de diversas naturezas. Por aumentarem a estabilidade dos coágulos de fibrina, estes agentes desequilibram o balanço hemostático em favor de um estado de hipercoagulabilidade, reduzindo o sangramento em condições como a deficiência do fator de Von Willebrand. Por outro lado, podem aumentar o risco de tromboses em pacientes com outros fatores de risco para estas complicações (Upadhyay et al., 2013; Nishihara e Hamada, 2015).
Dentre os agentes disponíveis no mercado, o trans-ácido 4-amino-metil-ciclohexano carboxílico (IUPAC), ou ácido tranexâmico (AcTnx) é uma substância sintética análoga ao aminoácido lisina. Durante a fibrinólise normal, o plasminogênio se liga à fibrina, e é ativado por seus ativadores em plasmina, enzima responsável pela degradação da fibrina e dissolução do coágulo. O AcTnx atua como inibidor competitivo da ligação do plasminogênio com a fibrina, impedindo sua ativação, resultando em hipofibrinólise (Alcock e Brainard, 2008) (Figura 3).
A relevância in vivo do efeito do AcTnx como promotor de um estado de hipercoagulabilidade já foi mostrada em estudos em modelos animais e em humanos. Estudos em modelos animais demonstraram que o uso do AcTnx na dose de 300mg/kg foi capaz de aumentar o peso de trombos venosos (Vancine et al., 2011). Em humanos, o AcTnx foi capaz de inibir o aumento da geração de plasmina, mensurado pela formação de complexo plasmina-antiplasmina, induzido pela infusão de endotoxina (Hanington e Zhang, 2016). Mais recentemente, um
estudo multicêntrico que incluiu mais de 10.000 pacientes em todo o mundo mostrou que o uso de 1g de AcTnx após a ocorrência de traumas reduz a mortalidade por sangramento (Yamaguchi et al., 2013). Por fim, o risco trombótico destes agentes ilustra de forma clara seu papel como indutor de um estado de hipercoagulabilidade(Upadhyay et al., 2013; Nishihara e Hamada, 2015).
Figura 3 – Representação esquemática do mecanismo de ação do ácido tranexâmico. A figura
mostra a ativação da fibrinólise normal (esquerda) e sua inibição por esse agente (direita). Reproduzido de 24
OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar o efeito da hipercoagulabilidade induzida pelo ácido tranexâmico no
desenvolvimento da sepse experimental murina.
2.2 Objetivos específicos
Determinar os seguintes parâmetros em camundongos com sepse experimental murina, expostos ao AcTnx:
o Marcadores de ativação da coagulação e da fibrinólise o Marcadores de lesão tecidual (bioquímicos e histológicos) o Sobrevida
o Clareamento bacteriano local e sistêmico o Marcadores de ativação inflamatória
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Aspectos éticosTodos os experimentos foram realizados de acordo com as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação em Animais da Unicamp, sob o parecer número 3432-1.
3.2. Modelo animal
A escolha do modelo animal para o estudo da sepse é complexa, na medida em que nenhum modelo se revela ideal, e há dúvidas sobre os que representam resultados obtidos em modelos animais, para a sepse em humanos (Loof et al., 2016). Dentre os modelos já descritos, a ligadura e punção cecal (CLP) e a endotoxemia são provavelmente os mais utilizados. O modelo de endotoxemia reproduz apenas os eventos celulares e moleculares desencadeados por um componente de bactérias Gram negativas. Já o CLP, que consiste na ligadura de uma porção variável do ceco seguida pela punção e extrusão de material fecal para a cavidade abdominal, mimetizando uma sepse polimicrobiana de foco intestinal, é o que reproduz dois tipos de lesão frequentemente presentes em pacientes com sepse: a resposta inflamatória à infecção e a resposta inflamatória à formação de tecido necrótico. De fato, é descrita a formação de um abcesso na região de tecido desvitalizado, que contribui para a gravidade do modelo (Fiusa et al., 2015). O CLP é considerado o padrão-ouro para estudos da sepse, tendo como vantagens adicionais a sua simplicidade e reprodutibilidade, quando utilizado de forma adequada. Por este motivo, selecionamos o modelo de CLP em nosso estudo, utilizando camundongos machos, da linhagem C57BL/6J, provenientes do Centro de Bioterismo da Unicamp (CEMIB-Unicamp) entre 8 e 12 semanas de vida.
3.3.Desenho geral do estudo
O efeito da hipercoagulabilidade, ou mais especificamente, da hipofibrinólise, na evolução da sepse experimental murina foi estudado utilizando o AcTnx no modelo de CLP. O grupo controle foi tratado apenas com o veículo usado para diluir o AcTnx (solução salina a 0,9%), e foi submetido aos mesmos
procedimentos cirúrgicos (indução de CLP). Camundongos do grupo tratado (expostos ao AcTn) e controles receberam a medicação ou o veículo por via intraperitoneal dois dias antes do procedimento de indução da sepse, e este tratamento foi mantido durante todo o período de observação. Os camundongos receberam reposição volêmica e analgésico, como parte do modelo experimental de sepse. A hipercoagulabilidade induzida pelo AcTnx foi confirmada através da mensuração do tempo de lise da euglobulina (TLE) e da dosagem de complexos trombina-antitrombina (TAT) após 24 horas após a indução da sepse. Diversos parâmetros clínicos e laboratoriais foram usados para avaliação do efeito da hipofibrinólise na sepse experimental, a saber: curva de sobrevida, marcadores séricos e histológicos de lesão tecidual, marcadores da atividade inflamatória, e parâmetros de disseminação bacteriana. Todos estes fatores parâmetros foram avaliados após 24 horas da indução da sepse, com exceção da curva de sobrevida, com duração de 7 dias. A seguir, estes métodos serão apresentados mais detalhadamente.
3.4. Indução da sepse
Os animais foram anestesiados com o uso de quetamina 80-100 mg.kg-1 +
xilazina 5-15 mg.kg-1por via subcutânea (sc), na região da prega do vazio. A
analgesia se deu pela aplicação de cloridrato de tramadol 0,05 mg.kg-1, SC,
conforme avaliação de resposta a dor (Fundação Oswaldo Cruz, 2008).
Descrição detalhada do procedimento: Para manter a temperatura corporal e o metabolismo próximos da normalidade o procedimento cirúrgico foi executado em mesa aquecida, também otimizando o pós operatório. Observados os procedimentos pré-operatórios, os animais foram sedados, de acordo com o protocolo supracitado, imobilizados e tricotomizados. Em seguida, realizamos laparotomia lateral esquerda, através de uma incisão perpendicular à linha alba com cerca de 25 mm. O ceco foi identificado e exteriorizado. Usamos fio de sutura seda 4.0 para ligar 30 a 50% da porção apical do ceco (conforme a severidade desejada), intencionando minimizar possíveis prejuízos ao peristaltismo. Finalmente, a região submetida à ligadura foi transfixada com agulha de calibre 30 e ordenhada suavemente para extrusão de material fecal. O ceco foi irrigado com salina aquecida e então recolocado na cavidade abdominal, buscando respeitar a
sintopia do órgão. Finalizada a síntese dos tecidos pela técnica de sutura reverdin, os camundongos receberam 0,5ml de solução salina aquecida por via subcutânea na região da prega dorsal e foram encaminhados para a cama aquecida, onde permaneceram até recuperação total. do estado de anestesia (Rittirsch et al., 2009). A figura 4 mostra de forma resumida algumas das etapas do CLP.
Figura 4 - Etapas do modelo CLP: 1. Anestesia, contenção e procedimentos pré-operatórios; 2. Incisão abdominal perpendicular à linha Alba; 3. Incisão abdominal; 4. Exposição do ceco; 5. Ligadura e transfixação da porção apical do ceco; 6. Síntese dos músculos e pele.
3.5. Coleta e processamento de amostras
Todas as coletas deste estudo foram terminais, e coletadas 24 horas após a indução da sepse (72h após o início da CLP). Para eutanásia, usamos o mesmo protocolo anestésico do CLP, porém os camundongos foram induzidos até o plano quatro na escala de Guedel. As amostras foram coletadas conforme descrito a seguir.
3.5.1. Sangue
A coleta de sangue total foi realizada na veia cava inferior ou caudal, considerada a forma mais indicada para coleta de amostras para testes de hemostasia, por estar relacionada a menor trauma. Para tal usamos seringa contendo citrato de sódio 3,8% na proporção de 1:9 e agulha calibre 22G. Quando indicado, o sangue total foi utilizado imediatamente. O plasma pobre em plaquetas
foi obtido através de centrifugação a 3000 rpm, 22º C, por 15 minutos. Alíquotas de 100µl foram armazenadas a 80oC até a análise.
3.5.2.Órgãos e tecidos
Para avaliação microbiológica do clareamento bacteriano, foram coletadas amostras de fígado, rim, sangue e líquido peritoneal. O lobo direito do fígado e o rim esquerdo foram somados a 1ml de solução salina 0,9%, macerados e utilizados imediatamente. Para a coleta de líquido peritoneal, a cavidade abdominal foi lavada com 0,5 ml de salina 0,9%.
Para avaliação histológica, pulmão, fígado e rim foram acondicionados em cassetes histológicos e fixados em formalina tamponada 10% (Sigma®). Após 24
horas os cassetes foram transferidos para solução de álcool70% até inclusão em resina Paraplast (Sigma®). Para confecção das lâminas, cortes seriados dos blocos
foram realizados no micrótomo e, após fixação, os tecidos foram corados com hematoxilina e eosina. As lâminas foram codificadas, para impossibilitar a identificação dos grupos, e a leitura das amostras foi realizada em microscópio binocular (Nikkon®modelo Eclipse E200).
3.6. Parâmetros hematológicos
Contagem de leucócitos totais e contagem de plaquetas foram realizadas em amostras de sangue total, em um analisador hematológico automático (CellDyn®)
utilizando 10µl da amostra.
3.7. Tempo de lise de euglobulina (TLE)
Métodos para avaliação global da fibrinólise baseiam-se em dois princípios: o uso de ativadores da fibrinólise como o tPA, ou a eliminação de inibidores naturais. Apenas com o uso destes recursos é possível acessar laboratorialmente o processo de fibrinólise utilizando métodos de leitura coagulométricos. O TLE se baseia na facilitação da fibrinólise pela eliminação de inibidores naturais da fibrinólise do plasma. A fração euglobulina é pobre nestes inibidores, o que permite a visualização da fibrinólise através da leitura seriada da estabilidade do coágulo. Um tempo de lise mais curto implica em hiperfibrinólise. Um tempo mais longo, em hipofibrinólise.
Uma alíquota de 100µl de plasma de camundongo foi diluída em 1,8ml de água destilada a 40C. Para precipitação da fração euglobulínica e estabelecimento
do pH 5,9; 150µl de ácido acético 0,25% (Merck®) foi adicionado e a solução
incubada por 30 minutos a 40C. Passado o período de incubação, os tubos foram
selados com Parafilm M® e centrifugados a 3000rpm por 10 minutos em centrífuga
(Eppendorf® modelo Centrifuge 5810R) refrigerada a 40C. O sobrenadante foi
desprezado por inversão e os tubos permaneceram vertidos em papel filtro por 2 minutos. Acondicionamos os tubos em isopor com gelo, então o precipitado foi ressuspendido com 200µl de tampão tris twin 80 a 0,1%. Após ressuspensão os tubos foram incubados em banho maria a 370C, passados 30 segundos
adicionamos 100µl de solução trombina bovina 10U (Hemosil®) e Cloreto de Cálcio
(Merck®0,0025M). Os tubos permaneceram em banho maria até dissolução do
coágulo, e o tempo de lise do coágulo da fração euglobulínica foi quantificado (Chakrabarti et al., 1968; Araújo, 2008).
3.8. Dosagem de complexos trombina-antitrombina (TAT)
A dosagem de TAT foi utilizada como um marcador indireto da geração de trombina (e da ativação da coagulação), e (Tucker et al., 2008) foi realizada em amostras de plasma de camundongo, por método imunoenzimático, conforme orientações do fabricante (TAT Complexes Mouse Elisa Kit, Abcam®).
3.9. Avaliação histológica de lesão tecidual
Dois observadores cegos para as lâminas alocadas por grupo experimental avaliaram a presença de microtrombos como marcador histológico de lesão tecidual e como indício de ocorrência de CIVD. Foram avaliadas a presença de microtrombos em lâminas de rim e pulmão de acordo com escore previamente descrito(Schoenmakers et al., 2005), e adaptado para esse estudo. Cinco cortes de cada tecido obtidos de forma seriada com intervalo de 100 µm foram analisados por varredura de modo que toda a extensão de cada lâmina foi avaliada. Foram considerados positivas aquelas amostras em que pelo menos dois trombos microvasculares foram observados no mesmo campo, em qualquer um dos cinco cortes. Antes da análise, os observadores foram treinados por um patologista para a identificação de trombos microvasculares.
3.10. Marcadores bioquímicos de lesão tecidual
Estes parâmetros foram avaliados utilizando métodos enzimáticos. De forma geral, em uma placa de 96 poços foram adicionados: calibrador em concentrações conhecidas de cada analito, um controle normal e um patológico contendo concentrações também conhecidas destes analitos, e 20µl das amostras de plasma murino. A estas amostras foram adicionados os reagentes específicos para cada análise, que em geral consistiam em substratos que desencadeiam reações enzimáticas na presença de cada analito. Imediatamente após pipetagem a placa foi inserida na leitora de microplacas Biotek® previamente aquecida a 370C. Após
um minuto foi realizada a leitura inicial, seguida de mais três leituras na faixa de absorbância determinada para cada reagente (340nm ou 510nm), com intervalo de um minuto entre cada leitura. Para obtermos os valores finais das amostras calculamos a média das absorbâncias de cada amostra. Os resultados obtidos a partir das médias dos deltas foram multiplicados pelo fator de calibração. Os seguintes parâmetros foram avalidados:
AST – aspartato aminotransferase
ALT – alanina aminotransferase
LDH - Desidrogenase lática Ureia
Creatinina
CK - Creatinoquinase 3.11. Curva de sobrevida
Os animais foram divididos em três grupos: controles, AcTnx 100mg/Kg ou AcTnx 600mg/Kg. Todos os animais foram tratados por via intraperitoneal, desde dois dias antes da indução da sepse até o final do experimento. O tratamento foi feito a cada 12 horas durante sete dias após o procedimento cirúrgico. Os sinais de resposta a dor também foram avaliados. Animais que apresentaram sinais de sofrimento evidente, ou que perderam o “righting reflex” (reflexo de corrigir a orientação do corpo quando ele é retirado do decúbito ventral) foram eutanasiados. Ao final dos sete dias os animais que sobreviveram foram eutanasiados.
3.12. Dosagem de mediadores inflamatórios
Para a dosagem de citocinas e mediadores inflamatórios, utilizamos amostras de plasma coletado em citrato, conforme previamente descrito. Citocinas inflamatórias foram mensuradas utilizando o Magnetic Luminex® Screening Assay
Mouse Premixed Multi-Analyte Kit. Esse método usa micropartículas magnéticas codificadas por cores, pré revestidas por anticorpos específicos para cada analito. Amostras de plasma e o padrão comercial foram pipetados nos poços e anticorpos imobilizados se ligavam aos analitos de interesse. Após lavar, para retirar substâncias não ligadas, anticorpos biotinilados específicos foram adicionados. Seguiu-se nova lavagem, para retirar qualquer anticorpo biotinilado não ligado. Em seguida, o conjugado estreptavidin-ficoeritrina, que se liga ao anticorpo biotinilado, foi adicionado. Uma última lavagem foi efetuada para remover este conjugado. As micropartículas foram ressuspendidas com solução tampão e a placa foi lida usando o Luminex MAGPIX analyser. Um imã capturava as micropartículas magnéticas numa monocamada. Dois diodos emissores de luz espectralmente distintintas (LED) iluminavam as micropartículas. Um LED identificava o analito que deveria ser detectado, o outro LED determinava a magnitude do sinal PE derivado, que é proporcional a quantidade de analitos ligados a ele. Cada poço foi fotografado com câmera CCD. Os ensaios foram realizados no Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho (Lactad) da Unicamp.
Os mediadores selecionados para obtenção de um perfil global de resposta inflamatória foram: citocina quimiotática de neutrófilo KC (CXCL1/KC), proteína quimiotática de monócitos (MCP-1/JE/CCL2), fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucina 1 (IL-1β), interleucina 6 (IL-6), interleucina 10 (IL-10). Como já destacado, estas coletas foram feitas 24 horas após a indução da sepse, que é um momento no qual a resposta inflamatória já se encontra bem estabelecida.
3.13. Avaliação do clearance bacteriano in vivo
Para avaliação do clearance bacteriano, utilizamos metodologias microbiológicas clássicas de cultura a partir de diferentes amostras obtidas 24 horas após a indução da sepse. Para análise do sangue total, 10µl de sangue foram diluídos em 1ml de salina. Em seguida, 5µl da solução foi semeada em ágar sangue
de carneiro 5% (PlastLabor®), incubado em estufa de cultura a 320C por 24h e
usado para avaliação quantitativa do crescimento bacteriano (realizada por contagem manual de colônias).
Fígado e rim foram macerados separadamente utilizando cadinho e pistilo. Após a homogeneização, 1 mL da solução foi diluída em salina 0,9% na proporção de 1:100. 5µl da solução 1:100 foi semeada em ágar sangue de carneiro 5% PlastLabor®, incubado em estufa de cultura a 320C por 24h. A avaliação quantitativa
do crescimento bacteriano foi realizada manualmente.
Para avaliação do líquido peritoneal realizamos laparotomia abdominal por meio de incisão no quadrante infra umbilical na posição medial, se estendendo para as laterais direita e esquerda. Em seguida as incisões foram extendidas cranialmente direita e esquerda alcançando o gradil costal, então pele e musculatura foram rebatidos cranialmente expondo a cavidade por completo. Essa foi lavada com 0,5ml de solução salina. Em seguida, 10µl desse lavado foi diluído em 1ml de solução salina 0,9%, e 5µl desta solução foram semeados em placa de ágar sangue de carneiro 5% (PlastLabor®). O crescimento bacteriano foi avaliado
por contagem manual, após 24h de incubação em estufa a 320C (figura 5). Os
dados foram transformados em logaritmo para a análise. Amostras de camundongos que não apresentaram crescimento bacteriano em líquido peritoneal, rins, fígado e sangue foram excluídas da análise.
Figura 5 - Esquema ilustrativo do método de avaliação do clearance bacteriano. Tecidos obtidos dos diferentes grupos experimentais foram diluídos de forma seriada (A) ou macerados (B) antes da diluição seriada em solução salina 0,9% (C). Em seguida estes materiais foram semeados em placa de ágar sangue de carneiro 5% levadas a uma estufa a 320C (D). A contagem de colônias foi realizada 24h após incubação (E). Figura 6:
Esquema ilustrativo do método de avaliação do impacto do AcTnx no crescimento microbiano in vitro. Preparo das soluções de plasma (A), semeadura de 2µl das soluções em placa de ágar sangue de carneiro 5% e incubação em estufa de CO2 (B). Em (C) as
soluções de plasma são acondicionadas em estufa a 320C. Duas horas após, 2µl das
soluções foram semeadas em placa de ágar sangue de carneiro 5%.. A contagem do
crescimento bacteriano foi realizada de forma manual 18h após incubação em estufa de CO2 (E).
3.14 . Análise estatística
Os dados foram apresentados como média, desvio-padrão, mediana, mínimo e máximo, de acordo com a distribuição e outras características das variáveis. Graficamente, os dados são apresentados sob a forma de box-plots, de modo a deixar claro a distribuição e a variância dos parâmetros representados Todas as análises e gráficos foram feitas no programa GraphPad Prism, versão 6.0. O nível de significância estatístico foi de 0,05.
RESULTADOS
3.1. Caracterização do modelo de hipofibrinólise e ativação da coagulação A primeira etapa do estudo foi a caracterização do modelo de hipofibrinólise e de ativação da coagulação murina induzida pelo AcTnx Devido ao número limitado de estudos utilizando AcTnx em camundongos, selecionamos arbitrariamente duas doses na mesma ordem de grandeza de publicações anteriores. Estes experimentos para caracterização do modelo consistiram na avaliação laboratorial de parâmetros hematológicos e da hemostasia em animais expostos a veículo, e ao AcTnx nas doses de 100mg/kg e 600mg/kg, 24 horas após indução da sepse. Embora seja sabido que a sepse seja por si só uma condição associada a ativação da coagulação, nosso objetivo foi avaliar o efeito do AcTnx nesta resposta.
Na tabela 2, são demonstradas as variáveis hematológicas dos animais tratados com AcTnx ou veículo. Observamos que não houve diferenças significativas nestes parâmetros entre os diferentes grupos.
Tabela 2 - Parâmetros hematológicos
Parâmetros Veículo 100mg/Kg 600mg/Kg *P
Hb (g/dL) 12,5 ± 1,8 12,5 ± 2,07 10,1 ± 1,8 0,38 Pqt (103/µL) 884 ± 289,1 1215 ± 273,2 914 ± 362,9 0,57 GB (103/µL) 3466,7 ± 835,9 5171,4 ± 3305,8 3640 ± 1062,1
0,67 Valores em 103/ul; média desvio-padrão. ** Teste de Krukall-Wallis ou Anova n= 6 – 7 por grupo; Hb: hemoglobina, Pqt: plaqueta; GB: leucócitos totais
Na figura 6 é demonstrado o efeito do AcTnx sobre a fibrinólise. Inicialmente, observamos que o uso deste agente de fato resultou em um estado de hipofibrinólise, mesmo no contexto da sepse, caracterizado por um prolongamento significativo dos tempos de lise da fração euglobulínica entre os grupos tratados, e o grupo controle.
Figura 6 - Tempo de lise da euglobulina (TLE): A figura demonstra o tempo, em minutos, de lise da fração euglobulínica do coágulo em plasma de camundongo nos grupos veículo, 100mg/Kg e 600mg/Kg. N= 6-11 por grupo. *Teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn.
Em relação à ativação da coagulação de forma mais geral, as dosagens de TAT (figura 7) mostram que houve diferença significativa na formação do complexo trombina-antitrombina entre o grupo que recebeu AcTnx 600mg/Kg e o grupo tratado com solução salina, sendo esta diferença evidente mesmo no contexto da sepse. 0 100 200 300
T
e
m
p
o
d
e
l
is
e
d
e
e
u
g
lo
b
u
li
n
a
(
m
in
)
Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg+
-+
-+
P = 0.09 P = 0.003Figura 7 - Geração complexo trombina-antitrombina (TAT): A figura demonstra as concentrações em ng/mL de complexos trombina-antitrombina em plasma de camundongo nos grupos veículo, 100mg/Kg e 600mg/Kg. N= 6-8 por grupo. *Teste de Kruskal-Wallis com pós teste de Dunn.
4.2. Impacto do AcTnx na sobrevida da sepse experimental murina
Em seguida, avaliamos o efeito do AcTnx sobre a sobrevida na sepse experimental murina, utilizando as mesmas doses usadas na etapa anterior. Conforme demonstrado na figura 8, o AcTnx na dose de 100mg/kg não modificou a sobrevida da sepse experimental murina.
0 5 10 15 15 20 25 30 T A T ( n g /m L ) Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg
+
-+
-+
P = 0.008 P = 0.03Figura 8 - Curva de sobrevida AcTnx 100mg/Kg - I: Curva de Kaplan-Meier mostrando a sobrevida em horas da sepse experimental murina de camundongos tratados com AcTnx ou veículo (n= 6-8 por grupo). A análise pelo teste de Mantel-Cox mostra que não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos.
Em seguida, com o objetivo de sensibilizar nosso modelo e confirmar que o AcTnx na dose de 100mg/kg não modificava a sobrevida na sepse experimental murina, realizamos mais um conjunto de experimentos de sobrevida, utilizando um modelo um pouco mais grave de CLP. Como demonstrado na figura 9, neste modelo (em que a área de ligadura cecal foi ampliada de 30 para 50%), a sobrevida em 7 dias no grupo controle foi inferior a 50%. Mesmo neste modelo mais grave, o AcTnx não resultou em melhora significativa da sobrevida em relação ao veículo (figura 9).
Figura 9 - Curva de sobrevida AcTnx 100mg/Kg- II: Curva de Kaplan-Meier mostrando a sobrevida em horas da sepse experimental murina de camundongos tratados com AcTnx ou veículo (n= 5 por grupo). A análise pelo teste de Mantel-Cox mostra uma sobrevida semelhante entre o grupo AcTnx e veículo, mesmo em um modelo mais agressivo de sepse experimental.
Já o AcTnx na dose de 600mg/kg resultou em redução significativa da sobrevida conforme demonstrado na figura 10. Como observado, a separação das curvas ocorre após 72 horas da indução da sepse. É interessante destacar ainda que este aumento ocorreu mesmo no contexto de uma sepse menos grave, como evidenciado pela mortalidade no grupo que recebeu apenas veículo.
Figura 10 - Curva de sobrevida AcTnx 600mg/Kg: Curva de Kaplan-Meier mostrando a sobrevida em horas da sepse experimental murina de camundongos tratados com AcTnx ou veículo (n=15-16 por grupo). A análise pelo teste de Mantel-Cox mostra uma redução significativa da sobrevida em camundongos tratados com AcTnx na dose de 600mg/kg.
4.3. Impacto do AcTnx na evolução clínica da sepse experimental murina
Na medida em que a sobrevida é um parâmetro clínico muito robusto, nós optamos por incluir em nosso estudo uma análise clínica da evolução da sepse, para verificar se o AcTnx na dose de 100mg/kg (que não induziu mudança na mortalidade) poderia apresentar algum efeito benéfico transitório na sepse experimental. Para tal, utilizamos o escore clínico M-CASS (Huet et al., 2013), previamente validado para este fim, e realizado diariamente durante os experimentos de sobrevida. Como poder ser observado na figura 11, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre animais tratados com veículo ou AcTnx 100mg/kg em nenhum dos dias de avaliação.
Figura 11 - Escore clínico da sepse: A figura demonstra os valores do escore clínico de sepse experimental murina obtidos diariamente nos animais tratados com veículo ou AcTnx 100mg/kg. A comparação entre os valores de cada dia pelo teste de Mann-Whitney entre os dois grupos não mostrou diferença estatisticamente significativa (P>0,05). N=14-15 por grupo..
4.3. Marcadores bioquímicos de lesão tecidual
A fim de avaliar se o AcTnx influenciaria em marcadores mais finos de lesão da sepse experimental, avaliamos alguns marcadores bioquímicos classicamente alterados na sepse, como demonstrado nas figuras 12 a 14. O uso do AcTnx não modificou significativamente nenhum dos marcadores de lesão tecidual avaliados. A média dos valores de de AST, creatinina e LDH no grupo veículo experimentais encontram-se cerca de 2, 4 e 3 vezes superiores à média do valor da normalidade em camundongos da mesma linhagem. Os valores de ALT, ureia e CK encontravam-se dentro da faixa de normalidade, de acordo com a mesma fonte de referência(Mazzaccara et al., 2008).
Figura 12 - Niveis das enzimas hepáticas nos grupos experimentais: A figura demonstra as concentrações de aspartato aminotransferase (AST) (a) e alanina aminotransferase (ALT) (b) no soro de camundongo nos grupos veículo, 100mg/Kg e 600mg/Kg. N= 9-12 por grupo. *Teste de Kruskal-Wallis.
0 50 100 150 A S T U /L Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg + -+ -+ P = 0,79 0 10 20 30 40 50 60 A L T U /L Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg + -+ -+ P = 0,51 (a) (b)
Figura 13 - Função renal nos grupos experimentais: A figura demonstra as concentrações de ureia (a) e creatinina (b) no soro de camundongo nos grupos veículo, 100mg/Kg e 600mg/Kg. N= 9-12 por grupo. *Teste de Kruskal-Wallis.
U re ia ( m g /d L ) 0 10 20 30 40 Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg + -+ -+ P = 0,10 C re a ti n in a ( m g /d L ) 0 1 2 3 4 Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg + -+ -+ P = 0,93 (a) (b)
Figura 14 - Níveis de LDH e creatina quinase: A figura demonstra as concentrações de lactato desidrogenase (LDH) (a) e creatina quinase (CK) (b) no soro de camundongo nos grupos veículo, 100mg/Kg e 600mg/Kg. N= 8-12 por grupo. *Teste de Kruskal-Wallis.
4.4. Mediadores inflamatórios no plasma
Os resultados dos níveis de mediadores inflamatórios no plasma dos camundongos tratados com AcTnx são mostrados nas figuras 15 e 16. Podemos observar que houve redução significativa dda IL-6 no grupo tratado com 600mg/Kg da droga quando comparado ao grupo controle. Também houve redução significativa do MCP-1 no grupo tratado com 100mg/Kg do AcTnx comparado ao grupo controle. Não houve diferença nos níveis de KC/CXCL-1, no entanto observamos uma tendência estatística a redução do TNFα no grupo tratado com 600mg/Kg do AcTnx, comparado ao grupo controle.
0 200 400 600 800 1000 L D H ( U /L ) Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg + -+ -+ P = 0,54 0 150 300 450 600 C re a ti n a q u in a s e ( U /L ) Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg + -+ -+ P = 0,66 (a) (b)
Figura 15 - Níveis de IL-6 e MCP-1. Em (a) podemos observar que o AcTnx na dose de 600mg/kg resultou em uma redução significativa de IL-6 em relação ao grupo controle. Em (b), podemos observar que o AcTnx na dose de 100mg/Kg também resultou em uma redução significativa dos níveis de MCP-1. N= 16-17 por grupo. *Teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn.
0 200 400 600 800 1000 18000 IL -6 ( p g /m l) P = 0.12 Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg + -+ -+ P = 0.04 0 150 300 450 600 1000 18000 M C P -1 (p g /m l) Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg + -+ -+ P = 0.04 P = 0.22 (a) (b)
Figura 16 - Níveis de KC/CXCL-1 e TNF: Em (a) podemos observar que os níveis de KC/CXCL-1 não se modificaram estatisticamente pelo uso do AcTnx. Em (b), podemos observar uma tendência a redução dos níveis de TNF no grupo tratado com AcTnx na dose de 600mg/kg N= 14-17 por grupo. *Teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn..
Os níveis de IL-1 e IL-10 foram avaliados, mas os valores observados
encontravam-se abaixo do limite de detecção em grande parte dos animais (dados não mostrados). Um fenômeno semelhante, porém em menor intensidade, também foi observado em relação ao TNF(figura 16).
0 1000 2000 3000 4000 5000 10000 20000 K C /C X C L -1 ( p g /m l) Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg + -+ -+ P = 0.33 P = 0.13 (a) 0 1 2 3 4 5 10 25 T N F a p g /m l Veículo (salina) AcTnx 100mg/Kg AcTnx 600mg/Kg + -+ -+ P = 0.78 P = 0.06 (b)
