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Adulterações e Fraudes em Azeite de Oliva Extra Virgem
Leonardo Valderrama, Rhayanna Priscila Gonçalves, Paulo Henrique Março, Patrícia Valderrama* Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus Campo Mourão (UTFPR-CM), Paraná, Brasil; * patriciav@utfpr.edu.br
Resumo. O objetivo do trabalho foi propor uma metodologia para detecção de fraudes e adulterações no azeite de oliva extra virgem, visto que cada vez mais produtos vêm fraudando seus rótulos e agregando valor a sua mercadoria. A análise dessas fraudes é de interesse mútuo de fabricantes de produtos de qualidade assegurada e de consumidores, e vem chamando a atenção dos pesquisadores, que vem apresentando muitos métodos para este fim. O uso do espectroscopia na região do Ultravioleta-Visível (UV-Vis) ainda é pequeno devido a pouca seletividade da técnica, entretanto, a utilização de métodos quimiometricos de classificação supervisionada tais como o método de Mínimos Quadrados Parciais com Análise Discriminante (PLS-DA) pode tornar um método instrumental pouco seletivo em um método poderoso para discriminar amostras contaminadas ou adulteradas e ajudar no controle de fraudes de produtos com alto valor agregado, tais como os azeites de oliva extra virgem.
Palavras-chave: azeite de oliva, quimiometria, PLS-DA, UV-Vis
UV-Vis spectrum fingerprinting and chemometric method in the evaluation of extra virgin olive oil adulteration and fraud. This study aimed to propose a methodology to search for fraud and adulteration in extra virgin olive oil, since an increasing number of edible oil products have being adulterated its labels and consequently adding value to its fake product. The analysis of these frauds is of mutual interest of both manufacturers of products of assured quality and consumers, and has attracted the attention of researchers, which has been presenting many methods for this purpose. The use of UV-Visible (UV-Vis) spectroscopy is still small due to the low selectivity of the technique, however, the use of chemometric methods such as the supervised classification method of Partial Least Squares with Discriminant Analysis (PLS-DA ) can provide selectivity to discriminate contaminated or adulterated samples and help in fraud control products with high added value, such as extra virgin olive oil method.
Keywords: olive oil, chemometric, PLS-DA, UV-Vis
Recebido:14 de Novembro de 2014; aceito: 17 de Novembro de 2014, publicado: 01 de Dezembro de 2014. DOI: 10.14685/rebrapa.v5i2.171
INTRODUÇÃO
Fraudes em alimentos ocorrem principalmente em produtos com alto valor agregado e com características físicas e químicas que favoreçam as adulterações (TAVARES et al., 2012). Com o intuito de se detectar fraudes em azeites de oliva com outros óleos vegetais de composição química parecida, muitas técnicas analíticas vêm sendo empregadas isoladamente ou associadas a outras metodologias, visando complementar informações e elucidar a adulteração (BECKER et al., 2005). Nesse sentido, as técnicas instrumentais como a espectroscopia Raman (LÓPEZ-DÍEZ; BIANCHI; GOODACRE, 2003), ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono
(GARCÍA-GONZÁLES et al., 2004), a espectroscopia na região do infravermelho próximo (CHRISTY et al., 2004), fluorescência
molecular (SAYAGO; MORALES;
APARICIO, 2004) e cromatografia em fase gasosa (BECKER et al., 2005) já foram utilizadas em estudos de adulterações e fraudes em azeites de oliva.
As técnicas instrumentais espectroscópicas fornecem uma impressão digital (fingerprint) acerca de uma determinada amostra de alimento e, a espectroscopia na região do ultravioleta e visível (UV-Vis), apesar de pouco seletiva, pode trazer informações estrutural química e atuar na análise da composição de alimentos, encontrando aplicações na análise de aditivos,
33 pesticidas e resíduos de drogas veterinárias
(ZHANG et al., 2011).
Considerando que o poder de penetração da luz UV é fraco, torna-se necessário uma boa transparência das amostras (ZHANG et al., 2011) ou uso de estratégias para aumentar a sensibilidade da técnica, tal como a redução do percurso óptico (ROCHA; TEIXEIRA, 2004). Além disso, o fingerprint fornecido através da espectroscopia UV-Vis aliado a métodos quimiométricos de classificação supervisionada, tais como o método de Mínimos Quadrados Parciais com Análise Discriminante (PLS-DA) (BARKER; RAYENS, 2003), pode auxiliar nessa dificuldade para a análise qualitativa de amostras complexas.
Diante desse contexto, o objetivo do presente trabalho é propor uma metodologia para investigar fraudes e adulterações em azeite de oliva extra virgem através da espectroscopia na região do UV-Vis aliada ao método quimiométrico de classificação supervisionada, PLS-DA.
MATERIAIS E MÉTODOS Materiais
Óleos comestíveis de soja, milho, girassol, canola (Liza), azeites de oliva extra virgem (Cocinero e Picuarino – Argentina; Carbonell, La Española e Pons - Espanha, Galo e Quinta d'Aldeia - Portugal), azeites de oliva virgem (Quinta d 'Aldeia e Lisboa - Portugal) e óleos compostos (Maria e Salada - Brasil, 85% de óleos como o de soja e 15% de azeite de oliva) foram adquiridos no mercado brasileiro.
Métodos
Espectros na região do UV-Vis (300-540nm) forma coletados utilizando uma cubeta de quartzo de 1mm de caminho óptico. Para os óleos de soja, milho, girassol, canola, azeites de oliva extra virgem e azeites de oliva virgem foram obtidos espectros em temperatura ambiente (~25 ºC) e em temperatura de fritura (170 ºC) (RAMALHO; JORGE, 2006). Para os óleos compostos, as amostras foram aquecidas a partir de 30ºC até 170ºC, com coleta de espectros a cada 10ºC, sendo o primeiro
espectro obtido à temperatura ambiente (~25ºC). A variação da temperatura nas análises foi implementada visando avaliar possiveis variações envolvidas com processos oxidativos que ocorrem em óleos vegetais.
PLS-DA
O método PLS-DA foi implementado usando o software MATLAB R2007B com o auxílio das ferramentas do PLS-Toolbox 5.2. Para tal, os espectros foram separados em um conjunto de calibração contendo 20 amostras de óleos (soja, milho, girassol, canola, azeite de oliva extra virgem e azeite de oliva virgem) e um conjunto de validação externa contendo 6 amostras selecionadas através do algoritmo de Kennard-Stone (KENNARD; STONE, 1969). Um conjunto de previsão contendo as 32 amostras de óleos compostos em diferentes temperaturas foi testado.
O PLS-DA (do inglês, Partial Least Squares with Discriminant Analysis) (BARKER; RAYENS, 2003) tem seu fundamento baseado no método de regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS, do inglês Partial Least Squares) (GELADI; KOWALSKI, 1986) e este, por sua vez, é baseado no método de reconhecimento de padrões não supervisionado conhecido como Análise de Componentes Principais (PCA, do inglês Principal Component Analysis) (WOLD, 1987). O PLS-DA, o PLS e a PCA são métodos quimiométricos aplicáveis a dados de primeira ordem, ou seja, quando se tem um vetor de respostas instrumentais para cada amostra (VALDERRAMA; BRAGA; POPPI, 2009), como, por exemplo, um espectro na região do UV-Vis. Para a utilização de qualquer um dos métodos, os vetores de dados são organizados no formato de uma matriz, conforme Figura 1. Na PCA, a matriz X é decomposta em um produto de duas matrizes, uma matriz de scores (T) e uma matriz de loadings (P), conforme Equação (1) (WOLD, 1987).
X=TPT Eq.(1) O conjunto de scores e loadings é denominado de Componentes Principais (PCs) e a Figura 2 ilustra a decomposição da matriz X até ‘A’ PCs.
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Figura 1-Construção da matriz X (adaptado de VALDERRAMA, 2005).
Figura 2- Decomposição da matriz X em componentes principais por PCA (OTTO, 1999).
Figura 3- Decomposição das matrizes X e Y em variáveis latentes por PLS (OTTO, 1999).
A matriz de scores traz informações acerca das amostras na nova base vetorial, enquanto que a matriz de loadings carrega as informações das variáveis (nesse caso, absorbância nos diferentes comprimentos de onda).
A partir da PCA, originou-se o método de regressão PLS, que correlaciona, por mínimos quadrados, a matriz X com uma matriz Y contendo os valores de uma propriedade de interesse, como por exemplo, as concentrações de diferentes espécies ou analitos. Neste caso, as
matrizes X e Y são decompostas em scores e loadings simultaneamente, enquanto cada PC sofre uma pequena modificação para buscar a máxima covariância entre X e Y, assim, os PCs que são obrigatoriamente ortogonais, no método PLS recebe a terminologia de Variáveis Latentes (VLs) por perderem sua ortogonalidade (GELADI; KOWALSKI, 1986). A Figura 3 ilustra a decomposição das matrizes X e Y pelo método PLS.
35 Uma relação linear é estabelecida entre os
scores e loadings de X e os scores de Y no cálculo dos coeficientes de regressão do modelo (b), ressaltando que nesse caso será obtido um vetor de coeficientes de regressão, ou seja, um coeficiente de regressão para cada comprimento de onda utilizado na matriz X (GELADI; KOWALSKI, 1986).
No PLS-DA, a matriz Y contém informações acerca das classes de cada amostra e, por isso, o método de reconhecimento de padrões é dito supervisionado. A matriz Y assume valores iguais a 0 ou 1 indicando se a amostra pertence ou não à classe. Por exemplo, no caso de quatro classes e a amostra pertencendo à classe 2 o valor de y para esta amostra seriam y = {0 1 0 0} (BARKER; RAYENS, 2003). Os valores previstos pelo modelo PLS-DA serão idealmente os valores zero e um, entretanto, na prática estes valores se aproximam destes. É calculado um valor limite (threshold) entre os valores previstos onde valores acima deste valor limite indicam que a amostra pertence à classe modelada. Valores previstos abaixo deste limite indicam que a amostra não pertence à classe modelada (PATACA, 2006). Este método já foi empregado, por exemplo, para discriminar amostras de própolis (PATACA, 2006; PAGANOTTI, 2013), madeira (PASTORE et al., 2011), espécies comerciais de árvores (PEERBHAY; MUTANGA; ISMAIL, 2013), em análises farmacêuticas (FERNANDES et al., 2012; MALTAS et al., 2013), na autenticação de origem geográfica (BASSBASI et al., 2014), em análises forenses de documentoscopia (SILVA et al., 2014) e avaliação de notas falsificadas de Real (ALMEIDA et al., 2013). Na escolha adequada do número de variáveis latentes para composição do modelo, um procedimento de validação cruzada (Cross Validation) pode ser realizado (BRERETON, 2000). A validação cruzada se baseia na habilidade de previsão de um modelo construído por parte de um conjunto de dados seguido pela previsão do restante. Esse tipo de validação pode ser realizado em blocos contínuos, blocos randômicos ou ainda no modo “leave-one-out”. Neste último caso, uma amostra é deixada de fora no processo de construção do modelo e a seguir essa amostra é prevista pelo modelo construído. Esse processo se repete até que todas
as amostras tenham sido deixadas de fora e previstas. O número de variáveis latentes pode ser então escolhido com base no valor da raiz quadrada da soma do quadrado dos erros de validação cruzada (RMSECV, Root Mean Square Error of Cross Validation), como demonstrado na equação (2).
𝑅𝑀𝑆𝐸𝐶𝑉 = √∑𝑛𝑖=1(𝑦𝑖−𝑦̂𝑖)2
𝑛 Eq. (2)
Em que, yi é o valor de referência para a propriedade de interesse da amostra “i”, y^i é o valor da propriedade de interesse da amostra “i” previsto pelo modelo e n é o número de amostras previstas no processo de validação cruzada.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 4 apresenta os espectros obtidos para as amostras de óleo das diferentes classes. É possível observar que a distinção entre os espectros é extremamente complicada devido à sobreposição das bandas espectrais.
Figura 4- Espectro UV-Vis dos óleos de diferentes classes.
Para a construção dos modelos multivariados através do método PLS-DA os espectros foram centrados na média e uma matriz Y contendo a informação da classe pertencente de cada amostra foi construída atribuindo-se o número 0 a não pertencente à classe e o número 1 indicando que aquela amostra pertence à classe em questão. O modelo foi desenvolvido
36 utilizando 3 variáveis latentes, escolhidos de
acordo com os valores de RMSECV, através da validação cruzada leave-one-out.
Tabela 1 –Valores para erro médio quadrático
Parâmetro
Classe 1 (óleo de soja, canola,
milho e girassol)
Classe 2 (Azeite de oliva virgem)
Classe 3 (Azeite de oliva
extra-virgem)
RMSEC 0,307 0,204 0,174
RMSECV 0,367 0,243 0,210
Figura 5-Scores do modelo PLS-DA. ()) amostras de óleo de soja (1 e 2), canola (3 e 4), milho (5 e 6) e girassol (7 e 8). (○) amostra amostras de azeite de oliva extra-virgem. (*) amostras de óleo composto.
A Tabela 1 apresenta os valores para RMSECV e erro médio quadrático de calibração (RMSEC). Verifica-se que esses valores são muito próximos o que evidencia que a escolha do número de variáveis latentes foi correto, promovendo a construção de um modelo bem ajustado (Silva, Março e Valderrama, 2013). Para o modelo construído não foram identificadas amostras anômalas (outliers) de acordo com os valores de Q residuals (referente ao resíduo espectral) e de leverage (SILVA et al., 2014).
O gráfico dos scores para os modelos PLS-DA é apresentado na Figura 5. Como pode ser observado, o óleo de girassol (amostras 7 e 8) é o que apresenta comportamento mais semelhante ao do azeite de oliva extra-virgem (amostras 13 a 26), sendo estes óleos discriminados pela parte positiva da VL1. As amostras de óleos composto (amostras 27 a 58)
apresentam características similares às características do óleo de soja (amostras 1 e 2), canola (amostras 3 e 4) e azeite de oliva virgem (amostras 9 a 12) e são separadas pela parte negativa da primeira VL.
De posse da informação de que a primeira variável latente é a mais importante na discriminação das amostras pertencentes às diferentes classes de óleos vegetais, o gráfico dos loadings da primeira variável latente foi avaliado. Este gráfico é apresentado na Figura 6 e mostra que a região entre 300-360nm é importante na avaliação das amostras que apresentam um conteúdo inferior de antioxidante tocoferol enquanto que a região entre 360-520 nm tem mais importância na discriminação das amostras de azeite de oliva extra-virgem, incluindo o óleo de girassol que apresentam maior conteúdo de tocoferol, sendo, portanto, mais resistente aos processos oxidativos. Estes resultados estão de acordo
37 com os resultados alcançados em estudos
prévios acerca dos processos oxidativos que ocorrem em óleos vegetais (GONÇALVES;
MARÇO: VALDERRAMA, 2014;
VALDERRAMA et al., 2011).
Figura 6- Loadings da primeira variável latente do modelo PLS-DA.
Figura 7- Classificação das amostras de óleo composto pelo modelo PLS-DA.
Os resultados para a previsão das amostras de óleo composto utilizando o modelo PLS-DA estão apresentados na Figura 7. Como pode ser observado, as amostras de óleo composto e as amostras de azeite de oliva virgem encontram-se acima do valor limite (linha pontilhada), também chamado de threshold, estabelecido pelo modelo PLS-DA, demonstrando 100% de
previsão das amostras de óleo composto na classe dos azeites de oliva virgem. Este resultado comprova que o azeite de oliva utilizado na fabricação do óleo composto é um azeite de qualidade inferior.
A sensibilidade do modelo PLS-DA, que corresponde ao número de amostras previstas
38 como sendo da classe, dividido pelo número de
amostras presentes de fato na classe, e a especificidade do modelo, que corresponde ao número de amostras previstas como não sendo
da classe, dividido pelo número real de amostras que não são da classe, foram avaliadas em cada uma das etapas de construção e validação do
Tabela 2 –Sensibilidade e especificidade do modelo PLS-DA
Parâmetro
Classe 1 (óleo de soja, canola,
milho e girassol) Classe 2 (Azeite de oliva virgem) Classe 3 (Azeite de oliva extra-virgem) Sensibilidade (calibração) 1,000 1,000 1,000 Especificidade (calibração) 0,944 1,000 1,000 Sensibilidade (validação cruzada) 0,875 1,000 1,000 Especificidade (validação cruzada) 0,889 1,000 0,938
modelo PLS-DA. Como pode ser observado na Tabela 2, o modelo PLS-DA apresentou valores próximos ou iguais a 1 para a sensibilidade e especificidade, para as amostras das três classes avaliadas, com acertos de 100% na previsão das amostras de validação da classe 2.
CONCLUSÃO
O modelo quimiométrico PLS-DA é capaz de executar uma rápida discriminação das amostras em termos de sua composição. Assim, a metodologia proposta é rápida, possui baixo custo e pode ser utilizada em laboratórios de rotina para controle de qualidade de óleos vegetais. Além disso, a metodologia está de acordo com os princípios requeridos pela “química verde” como minimização no uso de reagentes e solventes e geração de resíduos.
AGRADECIMENTOS
À Fundação Araucária pela bolsa de iniciação científica do aluno Leonardo Valderrama e à Fundação Araucária Programa Primeiros Projetos 14/2011 pela bolsa da aluna Rhayanna P. Gonçalves.
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