UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
LUCAS JOSÉ MENDES DOS SANTOS
ASSOCIAÇÕES ENTRE PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL E MORFOLOGIA ESPERMÁTICA EM TOUROS DA RAÇA GIR LEITEIRO (BOS INDICUS)
FORTALEZA 2019
LUCAS JOSÉ MENDES DOS SANTOS
ASSOCIAÇÕES ENTRE PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL E MORFOLOGIA ESPERMÁTICA EM TOUROS DA RAÇA GIR LEITEIRO (BOS INDICUS)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, do Centro de Ciências Agrárias, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre em Zootecnia. Área de concentração: Produção e Melhoramento Animal.
Orientador: Prof. PhD. Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura.
Coorientadora: Dra. Maria Júlia Barbosa Bezerra.
FORTALEZA 2019
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
Biblioteca Universitária
Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
__________________________________________________________________________________________ S236a Santos, Lucas José Mendes dos.
Associações entre proteínas do plasma seminal e morfologia espermática em touros da raça gir leiteiro (bos indicus) / Lucas José Mendes dos Santos. – 2019.
27 f. : il.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, Fortaleza, 2019.
Orientação: Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura. Coorientação: Profa. Dra. Maria Júlia Barbosa Bezerra.
1. Andrologia. 2. Eletroforese. 3. Gir. I. Título.
CDD 636.08 __________________________________________________________________________________________
LUCAS JOSÉ MENDES DOS SANTOS
ASSOCIAÇÕES ENTRE PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL E MORFOLOGIA ESPERMÁTICA EM TOUROS DA RAÇA GIR LEITEIRO (BOS INDICUS)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, do Centro de Ciências Agrárias, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre em Zootecnia. Área de concentração: Produção e Melhoramento Animal.
Aprovada em: 30/08/2019.
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________ Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_______________________________________________________ Dra. Maria Júlia Barbosa Bezerra (Coorientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_______________________________________________________ Prof. Dr. Fagner Cavalcante Patrocínio dos Santos
AGRADECIMENTOS
A minha família, principalmente aos meus pais, que foram o pilar de sustentação que me permitiu chegar até aqui. Agradeço pelo amor incondicional mesmo me fazendo tão ausente.
A minha noiva Bruna, que esteve ao meu lado por mais essa jornada. Agradeço pelo companheirismo, pelo suporte e por compreender a minha ausência nos momentos em que não pude estar ao seu lado.
Ao meu orientador Prof. Dr. Arlindo Moura e à minha coorientadora Dra. Maria Júlia, pelos conhecimentos transmitidos, pela oportunidade de integrar sua equipe, pela orientação e pela paciência.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Fisiologia Animal, pela convivência e pelos conhecimentos compartilhados.
À Universidade Federal do Ceará, pela oportunidade, através do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, pela oportunidade de qualificação profissional e crescimento pessoal.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
RESUMO
As proteínas do plasma seminal apresentam funções diversas na fisiologia reprodutiva de animais de produção, as quais podem influenciar diretamente a fertilidade de reprodutores. Estudos realizados com animais ruminantes e não-ruminantes tem como objetivo identificar proteínas presentes no plasma seminal, assim como o seu grau de influência na fertilidade. Touros da raça Gir constituem uma das raças mais comuns no nordeste do Brasil, no entanto, conhecimentos sobre sua fisiologia reprodutiva ainda são limitados. Para a obtenção desses dados, a avaliação andrológica apresenta-se como um método eficiente para determinar o potencial de serviço de um reprodutor por meio de avaliação física e qualidade do sêmen, tais como a avaliação de espermatozoides morfologicamente normais e defeitos totais. Este estudo tem como objetivo identificar a associação entre o perfil eletroforético das proteínas do plasma seminal e a concentração de defeitos totais da célula espermática. Foram utilizadas amostras de plasma seminal de 14 touros da raça Gir Leiteiro coletadas a nível de central de inseminação artificial. Os animais foram divididos em dois grupos por meio do método Aglomerative Nesting; Grupo 1, contendo os animais com maior porcentagem de defeitos totais da célula espermática e o Grupo 2, contendo os animais com baixa porcentagem de defeitos totais da célula espermática. Dentre todas as características avaliadas no exame andrológico, os grupos apenas diferiram entre si na característica defeitos totais. Na avaliação do perfil eletroforérico do plasma seminal dos animais avaliados foram detectadas bandas diferencialmente expressas podendo-se concluir que existe associação entre a características defeitos totais e as bandas de peso molecular 94,5 kDa, 58,48 kDa e 14,1 kDa (correspondentes às bandas B5, B13 e B20 respectivamente) em touros da raça Gir Leiteiro.
ABSTRACT
Seminal plasma proteins have many roles in the reproductive physiology of dairy farm animals, which may directly influence the fertility of breeders. Studies conducted with ruminant and non-ruminant animals aim to identify proteins present in seminal plasma, as well as their degree of influence on fertility. Bulls from breed Gir are one of the most common breeds in northeastern Brazil, however knowledge about their reproductive physiology is still limited. To obtain these data, the andrological evaluation is an efficient method to determine a breeder's service potential through physical evaluation and semen quality, such as the evaluation of morphologically normal sperm and total defects. This study aims to identify the association between the electrophoretic profile of seminal plasma proteins and the concentration of total sperm cell defects. Seminal plasma samples from 14 dairy Gir bulls collected at artificial insemination plant level were used. The animals were divided into two groups by the Aglomerative Nesting method, Group 1 containing the animals with the highest percentage of total sperm cell defects and Group 2 containing the animals with the lowest percentage of sperm cell defects. Evaluated at the andrological examination, the groups differed only in the characteristic total defects. In the evaluation of the seminal plasma electrophoretic profile of the experimental animals, differentially expressed bands were detected and it can be concluded that there is an association between the total defects characteristics and the molecular weight bands 94.5 kDa, 58.48 kDa and 14.1 kDa (corresponding B5, B13 and B20 respectively) in dairy Gir bulls.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Dendrograma de agrupamento hierárquico obtido através do software R® representa o agrupamento dos animais experimentais em dois grupos distintos com base nas variáveis analisadas no exame andrológico ... 17 Figura 2 – Imagem do gel SDS-PAGE 12,5 % com amostras de plasma seminal ... 18 Figura 3 – Boxplots da comparação, entre o Grupos 1 e o Grupo 2, da intensidadede
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
µg Micrograma
µl Microlitro
APS Persulfato de amônio BSP Binding sperm protein kDa Kilodalton
Mmol Milimol
nm Nanômetro
PS Plasma seminal
SDS Dodecil-sulfato de sódio PAGE Gel de poliacrilamida
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 9
2 OBJETIVO ... 12
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 13
3.1 Coleta e análise das amostras de sêmen ... 13
3.2 Formação dos grupos experimentais. ... 14
3.3 Determinação da concentração de proteínas do plasma seminal ... 14
3.4 Eletroforese unidimensional ... 14
3.5 Coloração dos géis ... 15
3.6 Análise das imagens dos géis por meio do Software Quantity One ... 15
3.7 Análise estatística... 15
4 RESULTADOS ... 16
5 DISCUSSÃO ... 20
6 CONCLUSÕES... 23
9
1 INTRODUÇÃO
As raças zebuínas representam cerca de 80% do efetivo bovino nacional O Gir é uma raça zebuína de origem indiana, no qual os primeiros exemplares foram trazidos ao Brasil no início do século XX. Na década de 30, criadores observaram em seus plantéis a presença de exemplares que se destacavam por sua aptidão leiteira. Dessa forma, um esforço por parte de entidades governamentais juntamente com criadores da raça iniciou um trabalho visando o aprimoramento do Gir com ênfase à seleção para a produção de leite. Surge assim um novo grupo, especializado na produção leiteira, com parâmetros zootécnicos próprios, passíveis de aferição que o distingue dos demais (ASSOCIAÇÃO DO CRIADORES GAÚCHOS DE ZEBU, 2018). Diante de seus índices produtivos e rusticidade, a raça Gir – Leiteiro está em plena ascendência no Brasilestando presente em 80% dos rebanhos nacionais, principalmente em cruzamentos com a raça Holandês. A demanda pela raça é cada vez maior no mercado nacional, além disso, o mercado externo está despontando em ritmo acelerado, o que é comprovado pelas remessas cada vez maiores de doses de sêmen para paisés da América, que chegam a representar 80% das exportações (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DOS CRIADORES DE GIR LEITEIRO, 2019).
O Gir representa uma pequena parcela dos zebuínos importados na atualidade. Este fato somado à seleção feita de forma inadequada, muitas vezes usando touros não testados do próprio rebanho, aumenta a endogamia e consequentemente a homozigose de genes deletérios associdados à redução de fertilidade nos rebanhos (REIS FILHO, 2006).
A intensidade de uso dos reprodutores é muito superior quando comparado às fêmes, sendo o macho o principal responsável pela introdução e fixação de novas características no rebanho. Dessa forma as características reprodutivas nos touros são alvos de diversos estudos, sempre no intuito de identificar de forma precoce bons reprodutores (BARBOSA; MACHADO, 2005).
A avaliação andrológica de touros é uma abordagem capaz de determinar o potencial de serviço de um reprodutor por meio da avaliação física e aferição de parâmetros seminais determinantes da qualidade do sêmen (KASTELIC; THUNDATHIL, 2008). Dentre os parâmetros seminais avaliados, a morfologia espermática juntamente com a percentagem de acrossomas intactos representam um excelente fator de predição de fertilidade em touros, tendo sido descrita por Corbet et al. (2013) como a característica seminal de maior herdabilidade. A morofologia espermática é avaliada através de microscopia em lâmina úmida para que seja
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determinado o percentual de células normais ou defeituosas. As anormalidades identificadas são por sua vez classificadas como defeitos maiores ou menores (BLOM, 1973).
O plasma seminal é formado por fluidos oriundos dos testículos, epidídimos e glândulas sexuais acessórias, atuando como veículo para os espermatozoides, desde a ejaculação, transporte no trato genital feminino e fecundação. Estudos vem sendo realizados com o intuito de identificar proteínas presentes no plasma seminal bovinos (Bos taurus) e suas respesctivas funções (DRUART et al., 2013; KILLIAN; CHAPMAN; ROGOWSKI, 1993; MOURA; CHAPMAN; KILLIAN, 2007; MOURA et al., 2010). Nesse contexto, a proteômica entra como uma ferramenta fundamental no processo de identificação e compreensão das funções das proteínas relacionadas à reprodução, dentre elas, as que se encontram suspensas no plasma seminal (BREWIS; GADELHA, 2010). Dentre outras funções já identificadas, sabe-se que as proteínas suspensas no plasma seminal podem proteger os espermatozoides de ataques do sistema imunológico do trato genital feminino (KRAUS et al., 2005). Além disso, as proteínas do plasma seminal protegem a célula espermática de estresse oxidativo durante o período de armazenamento no epidídimo, além de dar suporte à motilidade através do fornecimento de enzimas e substratos (FINK et al., 1989; YANAGIMACHI, 1994). Além das funções já descritas, as proteínas do plasma seminal, uma vez no trato reprodutor feminino, interagem com a membrana da célula espermática e com o oviduto participando diretamente do processo de capacitação, interação com o oócito, reação acrossômica, fertilização e ativação embrionária (GWATHMEY et al., 2006; THERIEN; MOREAU; MANJUNATH, 1998).
A morfologia espermática é o estudo anatômico do gameta masculino. As centrais de inseminação artificial utilizam a morfologia como um dos parâmetros para decidir o destino do ejaculado. Tendo em vista que o espermatozoide é uma célula altamente diferenciada, sabe-se antes de fecundar o oócito e induzir o desabe-senvolvimento embrionário, passa por uma série de processos que começam desde a espermatogênese, nos túbulos seminíferos até o processo de maturação no epidídimo e capacitação quando entra em contato com os fluidos das glândulas acessórias. A espermatogênese é um processo delicado e qualquer fator capaz de promover alterações em alguma de suas etapas, pode comprometer a fecundação.
A avaliação da morfologia pode ser realizada através de diferentes técnicas laboratoriais, dentre elas a contagem em lâmina úmida sob microscopia, a mais utilizada para avaliação imediata de ejaculados (FRENEAU et al., 2010). Na avaliação morfológica, são identificadas as anomalias da célula espermática que, segundo a classificação de Blom (1973), podem ser divididas em duas categorias; Defeitos maiores e Defeitos menores. Os Defeitos
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maiores estão correlacionados à prejuízos de fertilidade associados ou não à condições patológicas de testículos e epidídimos. Já os Defeitos menores, são desvios na forma da célula espermática, que podem dificultar, mas não inviabilizam a fecundação pela célula espermática acometida.
A difusão de biotécnicas da reprodução aplicada aos rebanhos, principalmente a inseminação artificial, transferência de embriões e produção in-vitro de embriões tem permitido rápidos avanços nos programas de melhoramento dos rebanhos bovinos (HAFEZ, 2007).
A ferramenta principal que possibilitou o desenvolvimento dessas tecnologias foi o congelamento de sêmen. O Sêmen congelado bovino é utilizado e comercializado em larga escala e permitiu o melhor aproveitamento dos reprodutores além de propiciar um maior controle sanitário, reduzindo a propagação de doenças o (AMIRAT et al., 2004). O processo de congelamento e descongelamento influencia diretamente na qualidade do sêmen, podendo aumentar a frequência de defeitos, principalmente os relacionados à cauda e alterações acrossomais. Tendo em vista essa limitação, muitos estudos vêm sendo realizados ao longo dos anos com o objetivo de desenvolver crioprotetores capazes de reduzir os efeitos deletérios do processo de congelamento e descongelamento sobre a qualidade final do sêmen (WATSON, 2000).
Tendo em vista a importância da morfologia espermática como fator de predição de fertilidade e sua relação com as proteínas do plasma seminal, o presente estudo teve como objetivo identificar associações entre porcentagem de defeitos totais da célula espermática com as proteínas do plasma seminal em touros da raça Gir Leiteiro.
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2 OBJETIVO
Identificar se existem associações entre fenótipos de morfologia espermática (alta e baixa porcentagem de defeitos totais) e proteínas do plasma seminal em touros da raça Gir Leiteiro.
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3 MATERIAL E MÉTODOS
Utilizou-se no presente estudo, 28 touros da raça Gir Leiteiro presentes na fazenda-escola das Faculdades Associadas de Uberaba (FAZU), no município de Uberaba-MG. A área do pastejo era composta por capim Pannicum sp, manejado em sistema intensivo de pastejo com lotação rotacionada. A área de manutenção desses animais é composta por bebedouros, cocho coberto para suplementação mineral, cocho para suplementação com concentrados e área de sombreamento artificial (3m2/animal). Os animais receberam manejo alimentar similar com oferta de 4% MS/100kg PV durante o período experimental. A oferta de suplemento mineral foi à vontade no cocho saleiro, enquanto a suplementação concentrada foi controlada para manter o escore corporal adequado.
3.1 Coleta e análise das amostras de sêmen
Para a avaliação andrológica, os animais foram levados aos currais de manejo da fazenda-escola da FAZU, no qual receberam manejo de baixo estresse (manejo racional) para exame andrológico. A avaliação dos aspectos clínicos e andrológicos foi realizada pela ASBIA – Associação Brasileira de Inseminação Artificial, por meio de sua credenciada, a empresa Bio – Biotecnologia Animal.
Foi mensurada a circunferência escrotal nos animais com idades entre 24 e 30 meses, seguidos de coleta de sêmen por meio de eletroejaculação. Todas as amostras de sêmen foram avaliadas pelo mesmo avaliador através de microscópio de contraste de fase (x400), acoplado a uma placa aquecedora a 37ºC para determinação da porcentagem de espermatozoides com motilidade progressiva. Diluiu-se uma alíquota da amostra de sêmen em tampão fosfato-salino com 0,2% de gluteraldeído e foi avaliada a morfologia espermática por meio da contagem de 200 células por lâmina, em microscopia com uma lente objetiva de contraste de interferência diferencial. Foram identificados na avaliação os seguintes defeitos maiores; defeitos de acrossoma, gota citoplasmática proximal, cabeça estreita na base, cabeça piriforme, cabeça pequeña anormal, cabeça isolada anormal, cabeça com contorno anormal, cabeça com pouch formation, knobbed sperm, formas teratológicas, corkscrew defect, pseudo-gota, cauda fortemente dobrada, cauda enrolada na cabeça. Os defeitos menores avaliados foram; acrossoma desprendido, gota citoplasmática distal, cabeça delgada, cabeça gigante, cabeça isolada normal, implantação abaxial, cauda dobrada, cauda enrolada, defeito de peça
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intermediária. Após avaliações, o restante da amostra foi centrifugado à 700 x g por 10 minutos à 4ºC para separação dos espermatozoides do plasma seminal. As frações foram então aliquotadas e imediatamente congeladas à – 20ºC (REGO et al., 2014).
3.2 Formação dos grupos experimentais
Partiu-se de um N inicial de 28 animais, dos quais foram feitas duas coletas de sêmen. Os dados gerados à partir das coletas foram dispostos em planilha (circunferência escrotal, motilidade, vigor, contagem de defeitos) e então submetidos ao método estatístico agrupamento hierárquico, que forma grupos com base na semelhança entre cada um dos ítens avaliados. Os grupos são fundidos até formar agrupamentos homogêneos.
3.3 Determinação da concentração de proteínas do plasma seminal
As amostras de plasma seminal foram descongeladas e submetidas a uma nova centrifugação à 10.000 x g, durante 60 minutos à 4ºC (MOURA et al., 2006). Uma alíquota da amostra foi utilizada para determinação da proteína total por meio do método de Bradford (1976) e as demais alíquotas foram congeladas à – 20ºC. Logo, uma curva analítica de calibração foi obtida a partir de solução padrão de albumina sérica bovina, e as amostras foram mensuradas em triplicata depois de diluídas numa proporção 1:30. As amostras diluídas (5 µl) foram misturadas com 195 ul do reagente de Bradford (1976) e lidas após 10 minutos de agitação a 595 nm.
3.4 Eletroforese unidimensional
Para a eletroforese, foram utilizadas 20 µg de proteínas de 14 touros da raça Gir Leiteiro divididos em grupos de alta (n =7) e baixa fertilidade (n=7) adicionados ao tampão de corrida (0,125 Mmol Tris–HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20% (v/v) glicerol, 0,2 M DTT, 0,02% azul de bromofenol). As amostras foram aquecidas por 90 segundos, e pipetadas nos poços do gel de concentração (4% de acrilamida), colocado sobre um gel de corrida de 12,5% de acrilamida. Em um poço do gel de concentração foram colocados 10 µl de marcador molecular Protein Ladder Full-Range Molecular Weight (Thermo Fischer, USA) para estimar o peso molecular
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das proteínas nas bandas. Para a corrida eletroforética foi utilizado o seguinte padrão da eletroforese (SE600 Ruby, GE Healthcare): 500V, 25mA/gel, 90W.
3.5 Coloração dos géis
O gel foi corado com Coomassie Brilliant Blue (CBB-R250) “overnight” e descorado após lavagens com soluções contendo etanol (40%), ácido acético (10%) e água destilada (50%). Os géis foram digitalizados com o auxílio do ImageScaner (GE Healthcare, USA) a 300 dpi.
3.6 Análise das imagens dos géis por meio do Software Quantity One
Através do Software foi possível marcar e idendificar as bandas correspondentes. Feita essa correlação, foi possível obter informações como intensidade de expressão e peso molecular das proteínas presentes em cada banda. A partir daí, foi possível identificar as bandas diferencialmente expressas entre os grupos.
3.7 Análise estatística
As características coletadas no exame andrológico (CE, motilidade, vigor, defeitos totais) foram analisadas através do teste T com significância de 0,05. O pico de intensidade das bandas no gel de eletroforese foi avaliado entre os grupos por meio de método não paramétrico utilizando o teste U de Mann-Whitney através do software R®.
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4 RESULTADOS
Os animais foram divididos em dois grupos através do método estatístico agrupamento hierárquico, levando em consideração todas as variáveis analisadas no exame andrológico e espermograma, obtendo-se um coeficiente de aglomeração de 0,71 (Figura 1). Dos 28 animais, 7 destacaram-se pela maior porcentagem de defeitos totais (Grupo 1). Dentre os demais foram selecionados os sete que apresentaram a menor porcentagem de defeitos totais (Grupo 2). No Grupo 1 a média obtida da circunferência escrotal foi 34,07 cm; valores médios de 67,14% de motilidade progressiva; uma média de 13,42% de defeitos totais e uma concentração de proteínas totais de 36,31 µg/ µl (Tabela 1). No Grupo 2, a média obtida da circunferência escrotal foi 34,42 cm; valores médios de 67,14% de motilidade progressiva; uma média de 3 % de defeitos totais, vigor de 3,14 e uma concentração de proteínas totais de 37,54 µg/ µl (Tabela 1).
Tabela 1 – Estatística descritiva para 14 touros da raça Gir-Leiteiro dividos em dois grupos com alta e baixa porcentagem de defeitos totais da célula espermática
Fonte: elaborada pelo autor.
Nota: Estão descritos os valores de média ± desvio padrão para as características circunferência escrotal, motilidade progressiva, vigor, defeitos totais e concentração de proteínas no plasma seminal.
Analisando a imagem do gel de eletroforese em SDS-PAGE 12,5% foi possível identificar a presença de 20±2 bandas com uma média de 16 por amostra nos dois grupos. O peso molecular das proteínas variou de 14 a 200 kDa. As bandas expressas com maior intensidade de pixels foram as de baixo peso molecular, correspondendo às bandas cujos pesos moleculares teóricos variam entre 14 kDa e 30 kDa, estando elas presentes em 100% dos animais avaliados. As bandas B2 (197,40 kDa), B11 (64,34 kDa), B12 (59,37 kDa), B15 (31,64 kDa), B19 (16,09 kDa) e B20 (14,17 kDa) de ambos os grupos de alta e baixa fertilidade estavam presentes em todos animais e a banda B13 (58,48 kDa) estava presente somente no
Parâmetros Avaliados Grupo 1 Grupo 2
Circunferência escrotal (cm) 34,071 ± 3,22 34,42 ± 2,94
Motilidade progressiva (%) 67,14 ± 4,88 67,14 ± 4,87
Vigor 3,14 ± 0,89 3,42 ± 0,78
Defeitos totais (%) 13,42 ± 1,90 3 ± 1,63
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Grupo 1. Observou-se que mais de 50% do total de proteínas das amostras apresentam peso molecular abaixo de 30 kDa, sendo que as bandas 19 e 20 estão presentes em maior quantidade e juntas correspondem a 25,13% das proteínas totais no Grupo 1 e 32% no Grupo 2.
Figura 1 – Dendrograma de agrupamento hierárquico obtido através do software R® representa o agrupamento dos animais experimentais em dois grupos distintos com base nas variáveis analisadas no exame andrológico
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Figura 2 – Imagem do gel SDS-PAGE 12,5 % com amostras de plasma seminal
Fonte: elaborada pelo autor.
Nota: Á esquerda, coluna contendo marcador molecular. À direita estão dispostas as amostras de PS bovino de touros da raça Gir Leiteiro. O grupo 1 corresponde aos animais que apresentam maior porcentagem de defeitos totais quando comparados aos animais do grupo 2.
O pico de intensidade das bandas no gel de eletroforese foi avaliado entre os grupos por meio de método não paramétrico utilizando o teste U de Mann-Whitney através do software R®. As bandas diferencialmente expressas entre o Grupo 1 e o Grupo 2 foram B5 e B20
(p<0,05). As bandas B5 e B20 com proteínas de 94,5 e 14,1 kDa respectivamente foram expressas com maior intensidade no Grupo 2.
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Figura 3 – Boxplots da comparação, entre o Grupos 1 e o Grupo 2, da intensidade de expressão das bandas encontradas no gel de eletroforese
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5 DISCUSSÃO
A circunferência escrotal não diferiu entre os grupos (p < 0,05). O padrão esperado para touros Zebuínos na faixa etária de 24 a 30 meses é de 30 cm (CHACON et al., 1999) sendo que a média encontrada para circunferência escrotal (34 cm) dos animais experimentais foi semelhante a encontrada por Santana Júnior et al. (2010) em touros Gir que foi 35,26 cm. Já em touros com idade superior a 30 meses Martinez et al. (2000) observou circunferência escrotal média de 36,9 cm. A circunferência escrotal é uma característica comumente utilizada em associação com parâmetros seminais para predição de fertilidade (CARTER; WOOD; WRIGHT et al., 1980; QUIRINO et al., 1999). De acordo com a escala de avaliação proposta por Vale Filho, Valle e Nascimento (2011), todos os animais do presente estudo seriam classificados como excelentes no que diz respeito ao parâmetro circunferência escrotal pois apresentam 34 cm aos 24 meses de idade.
A característica de motilidade progressiva, aferida nos dois grupos, foi menor no Grupo 1. Apesar dessa constatação, ambos os grupos apresentaram motilidade superior à média da raça observada por Martinez et al. (2000) que foi de 59,3%.
O vigor não diferiu entre os grupos avaliados ficando com média 3 para os dois (Tabelas 1). O achado difere do relatado por outros autores que encontraram valores inferiores para a raça; Martinez et al. (1999), em experimento com 411 touros da raça Gir Leiteiro relatou vigor de 2,95. A diferença pode ser justificada pela escolha dos animais para o presente estudo que, por se tratarem de animais de central de inseminação artificial apresentam de forma geral, melhores parâmetros que a maioria dos exemplares da raça.
A concentração média de proteínas (Tabela 1) não diferiu entre os grupos em estudo sendo as médias 36,31 e 37,54 µg/µl dos grupos 1 e 2 respectivamente. O achado corrobora as observações de Romitto (2003) e Assumpção et al. (2005), que trabalhando com touros Bos
indicus relataram concentrações médias de proteína no plasma seminal superiores a 28 µg/µl.
O volume do ejaculado não apresentou diferença significativa entre os grupos. A característica volume, por sí só, não é um bom fator para predição de fertilidade (COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 1998). Deve-se avaliar juntamente com essa característica a concentração de espermatozoides.
A média contagem de defeitos totais (Tabela 1) diferiu cinco pontos percentuais entre os grupos estudados, tendo o Grupo 1 13% e o Grupo 2 3%. Segundo Freneau (2011), a morfologia espermática é o fator mais significativo na avaliação de rotina de touros destinados
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a reprodução por sua alta relação com a fertilidade. Os animais de ambos os grupos experimentais apresentam porcentagem de defeitos totais dentro do aceitável para reprodutores segundo as normas do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1998) que permite porcentagem máxima de 30% de defeitos totais para touros usados em monta natural.
Os resultados das análises do gel de eletroforese SDS-PAGE 12,5% (Figura 2) revelaram uma ampla gama de proteínas com pesos moleculares variando de 14 à 200 kDa, divididas em 20 bandas, os resultados se assemelham aos encontrados por Roncolleta (1999) e Welter (2006). A banda 13 (58,48 kDa) só esteve presente no grupo classificado de baixa fertilidade. Devido ao peso encontrado, é possível que essa banda seja referente à osteopontina, uma glicoproteína ácida que está envolvida em processos de adesão celular por meio de receptores celulares das famílias das integrinas e associada à fertilidade (KILLIAN; CHAPMAN; ROGOWSKI, 1993). Tais receptores desempenham papel importante na ligação do espermatozoide-oócito, e também nos processos de pré-implantação e implantação (VINATIER, 1995). Welter (2006) observou que quanto maior a concentração dessa proteína, maior o número de espermatozoides morfologicamente normais, dados que não corroboram com os resultados encontrados no presente estudo.
Corroborando os achados de Moura, Chapman e Killian (2007) e Manjunath et al. (1994), as proteínas mais abundantes de ambos os grupos foram supostamente as BSPs 1, 3 e 5, que juntas, corresponderam a mais de 50% das amostras. As mesmas apresentam peso molecular em torno de 15, 13 e 14 kDa respectivamente, estando próximas do peso molecular das Bandas B18, B19 e B20. As BSPs possuem a capacidade de ligar-se aos fosfolipídeos da membrana plasmática do espermatozoide após a ejaculação (DESNOYERS; MANJUNATH 1992) provocando alterações de permeabilidade e atuando diretamente no processo de capacitação. Além das propriedades já descritas, as BSPs atuam intermediando a interação da célula espermática com epitélio que reveste o trato genital feminino (THERIEN; MOREAU; MANJUNATH, 1998).
Trabalhando com eletroforese de plasma seminal de touros nelore, Welter (2006) constatou que houve correlação positiva entre a concentração espermática e proteínas de peso molecular de 95 kDa ao mesmo tempo que houve correlação negativa entre proteínas de 15 kDa, possivelmente BSPs (MANJUNATH et al., 1993) e a característica concentração espermática. Dessa forma, quanto maior for a concentração de células espermáticas no sêmen, menor será a porcentagem de fluidos das glândulas anexas e maior a porcentagem de produtos dos testículos e epidídimos. No entanto, diferente do observado por Welter (2006) que relatou
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correlação positiva entre defeitos totais e proteínas de 95 kDa, no presente estudo constatou-se que o Grupo 2 apresentou maior intensidade de expressão da banda B5 (94,5 kDa), sendo esse, o grupo com menor concentração de defeitos totais. É possível que hajam diferentes proteínas com peso molecular nessa faixa atuando em processos biológicos diferentes com potencial para ser biomarcadores associados à fertilidade.
A banda B20, expressa com maior intensidade no Grupo 2, apresenta peso molecular de 14,7 kDa. A literatura descreve como Spermadhesin (espermadesina) uma proteína presente no plasma seminal com peso molecular de 13 kDa (SCHÕNECK; BRAUN; EINSPANIER, 1996) da qual foi identificada uma isoforma de 28 kDa (MOURA et al., 2006). As espermadesinas atuam protegendo a célula espermática do estresse oxidativo, modulando o seu metabolismo e também atuam sobre a motilidade (SCHÕNECK; BRAUN; EINSPANIER, 1996), interagem com receptores da superfície celular e estão relacionadas com o processo de capacitação espermática, interação dos espermatozoides com o oviduto e também podem atuar como inibidores de proteinases e fosfolipídios (TÖPFER‐PETERSEN et al., 1998). Essas características sugerem, que a banda B20 pode conter principalmente espermadesinas, no entanto, é preciso ressaltar que altas concentrações de espermadesinas foram associadas com maior porcentagem de defeitos totais (KILLIAN et al., 1993; MOURA et al., 2006).
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6 CONCLUSÕES
Conclui-se que existe associação entre a características defeitos totais e as bandas de peso molecular 94,5 kDa, 58,48 kDa e 14,1 kDa (correspondentes às bandas B5, B13 e B20 respectivamente) em touros da raça Gir Leiteiro. O presente estudo gera base de conhecimento para investigação futura de possiveis biomarcadores de fertilidade.
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