Identificação de portadores de polipose colônica no Rio Grande do Norte

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS CURSO DE BIOMEDICINA. JESSICA DAYANNA LANDIVAR COUTINHO. IDENTIFICAÇÃO DE PORTADORES DE POLIPOSE COLÔNICA NO RIO GRANDE DO NORTE. Natal Novembro 2019.

(2) IDENTIFICAÇÃO DE PORTADORES DE POLIPOSE COLÔNICA NO RIO GRANDE DO NORTE. por. Jessica Dayanna Landivar Coutinho. Monografia Apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito Parcial à Obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina.. Orientadora: Prof. Dra. Tirzah Braz Petta Lajus. Natal Novembro 2019 2.

(3) UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS CURSO DE BIOMEDICINA. A monografia “Identificação de portadores de Polipose Colônica no Rio Grande do Norte” elaborada por Jessica Dayanna Landivar Coutinho, e aprovada por todos os membros da banca examinadora, foi aceita pelo curso de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de: BACHAREL EM BIOMEDICINA Natal, 13 de novembro de 2019.. BANCA EXAMINADORA. 3.

(4) 4.

(5) AGRADECIMENTOS Agradecer é antes de tudo, expressar o reconhecimento pela ajuda recebida. Ajuda essa manifestada em todos os momentos do desenvolvimento deste trabalho, tanto em cunho científico, como pessoal. Registro aqui os meus mais sinceros agradecimentos às instituições,. professores,. pesquisadores e amigos que. contribuíram ao longo do desenvolvimento deste trabalho, em especial: À UFRN e ao curso de Biomedicina, pelas oportunidades proporcionadas nestes últimos cinco anos, as quais me fizeram amadurecer como pessoa e profissional. Sou grata por cada ensinamento, cada profissional que tive a honra de conhecer e me inspirar diariamente e, não menos importantes, sou grata a todos os “sim” que recebi – monitoria, projeto de extensão, projeto de pesquisa, iniciação profissional na empresa júnior, estágios obrigatórios e extracurricular. A todos os professores que me inspiraram nessa jornada e, principalmente, àqueles que me fizeram me apaixonar cada vez mais pelo curso de Biomedicina. Não poderia deixar de agradecer àqueles que compartilharam o conhecimento e o amor pela ciência, seja ela exata, humana ou biológica, ainda no ensino fundamental e médio. Meu muito obrigada a eles que estiveram comigo compartilhando conhecimentos e incentivando meus sonhos desde a construção da base. Minha gratidão especial àquela que é um exemplo como profissional e pessoa. Àquela que confiou em mim para fazer parte do seu grupo de pesquisa - Oncologia Molecular. À minha orientadora, “mãe” na Liga Contra o Câncer ou alelo maior: Obrigada por toda atenção, apoio e confiança! Ao grupo Oncologia Molecular por compartilharem comigo momentos e muito aprendizado, e principalmente, a Drª Ana Rafaela Timóteo. A ela, meus sinceros “muito obrigada”, por toda atenção e paciência. Agradeço também ao professor Dr. Ermeton Duarte e o Dr. Irami Araújo por terem aceitado meu convite para participarem de um momento tão importante para mim, a banca examinadora. Agradeço pela disponibilidade, o tempo investido para avaliação e a valorosa contribuição para meu trabalho.. 5v.

(6) Este projeto não seria executado sem a colaboração dos pacientes e familiares, além do envolvimento de vários os profissionais da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, em especial a Ythalo Hugo da Silva Santos, pelo auxílio em toda parte estatística do estudo. Àqueles que acreditaram no nosso trabalho e auxiliaram na execução direta ou indiretamente: Muito obrigada! Gratidão eterna à minha mãe, o motivo de tudo que eu faço e almejo, e minha família, que sempre me apoiaram e confiaram em mim. Meu amor e gratidão a vocês é imensurável. E por último e mais importante, gratidão a Deus, por me proporcionar saúde, força e coragem para correr atrás dos meus sonhos. Obrigada por todos os erros e aprendizados, por cada oportunidade, pela minha família e pelos melhores amigos que alguém poderia ter. Gratidão pela vida.. 6vi.

(7) RESUMO Em 2002, uma nova síndrome autossômica recessiva foi descrita na literatura, envolvendo o gene MUTYH, sendo assim denominada polipose associada a MUTYH (MAP) OMIM: 604933. Análise molecular do gene demonstra que as mutações missense MUTYH c.536A>G (p.Y179C) e c.1187G>A (p.G396D), presentes em 80% dos portadores de MAP, são as duas mutações mais frequentes nos portadores com ascendência europeia. Mutações bialélicas herdadas de MUTYH são encontradas em 0,2-0,9% de todos os pacientes com câncer colorretal (CCR). Neste estudo, é proposto identificar a frequência da mutação do gene MUTYH_c.536A>G, de ancestralidade holandesa, estabelecida durante a colonização holandesa entre 1630 a 1654, na região do Seridó. Para isso, foi realizado o sequenciamento capilar buscando identificar a variante patogênica MUTYH_c.536A>G em 157 pacientes da região Seridó. O presente trabalho possibilitou a identificação de 63 portadores da mutação Y179C no RN. A variante foi detectada em 2,5% em homozigose e 37,6% em heterozigose. A mutação monoalélica e bialélica esteve presente em 50% e 20% dos pacientes acometidos por polipose colônica, respectivamente (P=0,012). A MAP associada a MUTYH_c.536A>G apresenta uma frequência de 0.0002, conforme o banco de dados 1000Genome, no entanto, na população do estudo pode-se observar que essa frequência é 0.24 devido a presença de mutação fundadora, isolamento geográfico e tradição de casamentos consanguíneos na região Seridó. Na população estudada foi avaliado que 42,5% dos probandos são portadores da mutação monoalélica e 0,8% da mutação bialélica são assintomáticos. O presente trabalho contribui com a literatura a nível epidemiológico, histórico e genético por meio da identificação de 45% (63⁄140) de portadores da mutação fundadora em MUTYHc.536A>G na região do Seridó, auxiliando na identificação do risco aumentado para câncer e aconselhamento genético em casamentos consanguíneos. Palavras Chaves: Pólipos colorretais, MUTYH associada a polipose, câncer colorretal, Sequenciamento Sanger.. vii 7.

(8) ABSTRACT In 2002 a new autosomal recessive syndrome was described in literature, involving the homologous MutY gene (MYH or MUTYH), thus being called MUTYH-associated polyposis (MAP) OMIM: 604933. Molecular analysis of the gene evidences that missense mutations MUTYH c.536G>A (p.Y179C) and c.1187G>A (p.G396D), present in 80% of patients with MAP, are the two most frequent mutations in carriers of European ancestry. Inherited biallelic mutations of MUTYH are found in 0.2-0.9% of all colorectal cancer (CRC) patients. In this study, it is proposed to identify the frequency of mutation of gene MUTYH_c.536G>A, of Dutch ancestry, established during the Dutch colonization between 1630 and 1654, in the region of Seridó, in Brazil. For this, capillary. sequencing. was. performed. to. identify. the. pathogenic. variant. MUTYH_c.536G>A from 157 patients in the region of Seridó. The current study made it possible to identify sixty-three carriers of the Y179C mutation in the state of Rio Grande do Norte. The variant was detected in 2.5% of homozygous carriers and 37.6% in heterozygous carriers. Monoallelic and biallelic mutations were present in 50% and 20% of patients with colonic polyposis, respectively (P = 0.012). The PAF associated with MUTYH_c.536A>G has a frequency of 0.0002, according to the 1000Genome database, meanwhile in the population of the study it can be observed that this frequency is 0.24 due to the founding mutation of Dutch origin and consanguineous marriages in the Seridó region. In the studied population it was evaluated that 42.5% of the probands carry the monoallelic mutation and 0.8% of the biallelic mutation are asymptomatic. The present work contributes to the epidemiological, historical and genetic literature by identifying 45% (63⁄140) of carriers of the found mutation in MUTYHc.536A> G in the Seridó region, assisting in identifying the increased risk for cancer and genetic counseling in inbreeding marriages.. Key words: Colorectal polyps, MUTYH associated with polyposis, colorectal cancer, Sanger sequencing.. viii 8.

(9) SUMÁRIO LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS, FÓRMULAS E SIGLAS .................................... 10 LISTAS DE TABELAS ........................................................................................................ 12 LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... 13 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 15 1.1 Câncer colorretal (CCR) relacionado a Polipose Adenomatosa Familiar (FAP .......... 15 1.1.1 Pólipos colorretais................................................................................................ 16 1.2 Polipose Adenomatosa Familiar (PAF) ...................................................................... 18 1.3 Polipose adenomatosa familiar associada ao MUTYH (MAP) ................................... 20 1.4 Gene MUTYH ............................................................................................................ 21 1.5 Carcinogenese nos portadores de mutação em MUTYH ........................................... 22 1.6 Mutação MUTYH_c.536A>G no Seridó ..................................................................... 24 2. OBJETIVOS.................................................................................................................... 29 2.1 Objetivos gerais......................................................................................................... 29 2.2 Objetivos específicos................................................................................................. 29 3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 30 3.1 Comitê de Ética ......................................................................................................... 30 3.2 Delineamento do Estudo ........................................................................................... 30 3.3 Ambulatório: Triagem de pacientes e coleta de amostras biológicas ......................... 30 4. RESULTADOS ............................................................................................................... 34 5. DISCUSSÃO................................................................................................................... 50 6. LIMITAÇÃO DO ESTUDO, SUGESTÕES E PERSPECTIVAS DE ESTUDO ................. 52 7. CONCLUSÃO ................................................................................................................. 53 8. REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 54 9. ANEXOS ......................................................................................................................... 58 9.1 APÊNDICE A - COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA EM SERES HUMANOS DA LIGA NORTE RIOGRANDENSE CONTRA O CÂNCER (CEP/LIGA) ....................................... 58 9.2 APÊNDICE B - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE) . 61. ix 9.

(10) LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS, FÓRMULAS E SIGLAS. 8-oxo-G – 8-oxo-guanina glicosilase APC – Adenomatous polyposis coli BER – Base excison repair CCR – Câncer colorretal CHRPE – Congenital hypertrophy of retinal pigment epithelium DNA – Desoxiribonucleic acid DSBR – Reparo de quebra de fita dupla EDTA – ácido etilenodiaminotetracético EROs – Espécies reativas de oxigênios GC/TA – Guanina-citosina/timina-adenina HhH - Helix-Hairpin-Helix HNPCC – Câncer colorretal hereditário não associado à polipose HR – Recombinação homóloga INCA – Instituto Nacional do Câncer LOVD - Leiden Open Variation Database MLH – MutL homolog NCCN – Nacional Comprehensive Cancer Network OMIM – Online Mendelian Inheritance in Man OGG1 – 8-oxoguanine DNA glycosylase PAF – Polipose adenomatosa familiar. 10.

(11) PAFA – Polipose adenomatosa familiar atenuada PAM – Polipose adenomatosa associada a MUTYH PB – Pares de bases PCR – Polimerase chain reaction RLO – Radicais livres de oxigênio RNA – Ribonucleic acid SPSS – Statistical Package for Social Sciences. 11.

(12) LISTAS DE TABELAS Tabela 1. Programação da amplificação Platinum® PCR SuperMix. .................................. 32 Tabela 2. Programação da amplificação BigDye Terminator. .............................................. 33 Tabela 3. Caracterização da amostra da população do estudo. .......................................... 34 Tabela 4. Caracterização clínica da população do estudo. ................................................. 36 Tabela 5. Relação entre portadores de variante patogênica com o fenótipo e o procedimento colonoscópico. Valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. ...... 39. 12.

(13) LISTA DE FIGURAS Figura 1. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes no Brasil estimados para 2018 por sexo, exceto pele não melanoma (INCA, 2019). ......................... 15 Figura 2. Diferenciação clínica dos genótipos⁄genótipos na Polipose Adenomatosa Familiar Clássica, Polipose Adenomatosa Familiar Atenuada, Polipose Adenomatosa Familiar associada a MUTYH e Câncer Colorretal Hereditário sem polipose.................................... 19 Figura 3. Frequências alélicas médias entre portadores de mutações na linha germinativa de MUTYH. N = Número de portadores de mutações na linha germinativa bialélica e monoalélica de MUTYH. Incluem-se mutações que se acredita serem de significância patogênica e que são encontradas com uma frequência alélica> 0,03 em portadores de mutações dos respectivos países (POULSEN et al, 2008)......................................................................... 24 Figura 4. Eletrofluorograma mostrando a mutação c.536A>G em pacientes normal, com a mutação em heterozigose e com mutação em homozigose. A) Indivíduo ausente da variante em MUTYH analisada – AA; B) Indivíduo com mutação MUTYH em heterozigose – AG; C) Indivíduo com mutação MUTYH em homozigose – GG. ..................................................... 35 Figura 5. Associação entre o genótipo⁄⁄fenótipo da amostra populacional do estudo. Valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. ........................................... 38 Figura 6. Associação da genotipagem e o diagnóstico de MAP. Valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. ...................................................................... 38 Figura 7. Heredograma da família 1. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda. ........................................................................................................................... 40 Figura 8. Heredograma da família 4. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda. ........................................................................................................................... 41 Figura 9. Heredograma da família 6. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda ............................................................................................................................ 42 Figura 10. Heredograma da família 7. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda. ........................................................................................................................... 43 Figura 11. Heredograma da família 10. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda. ........................................................................................................................... 44 Figura 12. Heredograma da família 12. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda. ........................................................................................................................... 44 Figura 13. Heredograma da família 14. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda. ........................................................................................................................... 45 Figura 14. Heredograma da família 15. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda. ........................................................................................................................... 46 Figura 15. Heredogramas dos pacientes sem variante patogênica MUTYH c.536A>G ou indivíduos não sequenciados. Pacientes diagnosticados com câncer destacados em preto, probando sem a variante pesquisada destacados com circulo verde. Os pacientes que apresentam número de estudo, porém não possuem as identificações anteriores, ainda aguardam sequenciados. A) Indivíduo #2, sem mutação; B) Indivíduo #3, sem mutação; C). 13.

(14) Família 5, sem mutação; D) Indivíduo #9, sem mutação; E) Família 13, aguardando sequenciamento; F) Indivíduo #19, sem mutação; G) Indivíduo #21, sem mutação. .......... 47 Figura 16. Heredogramas dos pacientes sem variante patogênica MUTYH c.536A>G ou indivíduos não sequenciados. Pacientes diagnosticados com câncer destacados em preto, probando sem a variante pesquisada destacados com circulo verde. Os pacientes que apresentam número de estudo, porém não possuem as identificações anteriores, ainda aguardam sequenciados. H) Indivíduo #16, aguardando sequenciamento; I) Indivíduo #18, sem mutação; J) Família 17, sem mutação; K) Indivíduo #22, sem mutação; L) Família 26, sem mutação. ..................................................................................................................... 48 Figura 17. Heredogramas dos pacientes sem variante patogênica MUTYH c.536A>G ou indivíduos não sequenciados. Pacientes diagnosticados com câncer destacados em preto, probando sem a variante pesquisada destacados com circulo verde. Os pacientes que apresentam número de estudo, porém não possuem as identificações anteriores, ainda aguardam sequenciados. M) Família 23, sem mutação; N) Indivíduo #24, sem mutação; O) Família 25, sem mutação; P) Indivíduo #20, aguardando sequenciamento......................... 49. 14.

(15) 1. INTRODUÇÃO 1.1 Câncer colorretal (CCR) relacionado a Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) O câncer colorretal abrange tumores que acometem o segmento do intestino grosso (o cólon), o reto e ânus. O Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima 17.380 casos novos de câncer de cólon e reto, em homens e, 18.980 em mulheres para cada ano do biênio 2018-2019 (Figura 1). Esses valores correspondem a um risco estimado de 16,83 novos casos a cada 100 mil homens e 17,90 para cada 100 mil mulheres. Sendo assim, o terceiro câncer mais frequente em homens e o segundo entre as mulheres. A região nordeste ocupa a 4ª posição com maior incidência de casos (7,98 para 100 mil homens) e a 3ª posição entre mulheres, 9,52 em 100 mil. O Rio Grande do Norte (RN), tem uma taxa estimada de 10,10 casos e 9,32 para cada 100 mil homens e mulheres, respectivamente (INCA, 2019).. Figura 1. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes no Brasil estimados para 2018 por sexo, exceto pele não melanoma (INCA, 2019).. Segundo o INCA, o câncer colorretal está fortemente associado a hábitos de alimentação, nutrição e atividade física. O consumo de carnes processadas e a ingestão excessiva de carne vermelha também aumentam o risco para este tipo de câncer. Durante o processamento, as carnes são submetidas a altas temperaturas, resultando na produção de aminas heterocíclicas e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos com potencial carcinogênico em pessoas com predisposição genética. Outros fatores relacionados à maior chance de desenvolvimento da doença são histórico familiar de câncer de intestino, histórico pessoal de câncer de intestino, ovário, útero ou mama. Doenças inflamatórias do intestino, como retocolite ulcerativa crônica e doença de Crohn, também aumentam o risco de câncer do intestino, bem. 15.

(16) como doenças hereditárias, como polipose adenomatosa familiar (FAP) e câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC). O rastreamento desse câncer é uma estratégia dirigida a um grupo populacional específico em que o balanço entre benefícios e riscos dessa prática é mais favorável, com maior impacto na redução da mortalidade. Os benefícios são o melhor prognóstico da doença, com tratamento mais efetivo e menor morbidade associada (INCA, 2019). Os tumores de cólon e reto podem ser detectados precocemente por meio de dois exames principais: pesquisa de sangue oculto nas fezes e endoscopias colonoscopia ou retossigmoidoscopia. Esses exames devem ser realizados em pacientes com sinais e sintomas sugestivos de câncer, visando seu diagnóstico precoce ou, como rastreamento, de pacientes assintomáticos, mas pertencentes a grupos de médio risco (indivíduos com ≥50 anos) e alto risco (sujeitos com histórico pessoal ou familiar deste câncer, de doenças inflamatórias do intestino ou síndromes genéticas) (INCA, 2019). 1.1.1 Pólipos colorretais Os pólipos do cólon e reto podem originar-se devido a inflamação, maturação anormal da mucosa, anormalidade da arquitetura ou proliferação e displasia. A maioria dos pólipos ocorre esporadicamente, mas uma pequena percentagem são manifestações de síndromes hereditárias, como a Polipose Adenomatosa Familiar, Síndrome de Gardner ou a Síndrome de Turcot (FELDMAN et al, 2010). A classificação dos pólipos é realizada de acordo com às suas dimensões, morfologia ou histologia. Sua importância está na avaliação, a qual permite prever quais os pólipos com maior potencial para progredir para carcinoma. As lesões neoplásicas precursoras de carcinoma são benignas, mas apresentam o potencial de evoluir. para. malignidade.. Podemos. dividi-las. essencialmente. em. pólipos. adenomatosos e pólipos serreados (GAGO et al, 2017). Os pólipos adenomatosos são os mais frequentes entre os pólipos neoplásicos e correspondem a cerca de 2/3 de todos os pólipos do cólon. Eles podem ser 16.

(17) classificados em 3 subtipos, com base na arquitetura epitelial. O primeiro subtipo são os adenomas tubulares, estes representam cerca de 80% de todos os adenomas e são caracterizados pela presença de glândulas tubulares em pelo menos 75% da sua arquitetura. O segundo subtipo consiste em adenomas vilosos, eles correspondem a 5 a 15% de todos os adenomas e apresentam glândulas com projeções vilosas em pelo menos 75% da sua arquitetura. Os últimos são os adenomas túbulo-vilosos, os quais correspondem a 5 a 15% dos adenomas e apresentam histologia mista com menos de 75% dos dois tipos de arquiteturas (FELDMAN et al, 2010). Os pólipos serreados representam um grupo heterogêneo com potencial maligno, sendo a arquitetura serreada ou configuração das criptas em “dentes de serra”. Este grupo inclui os pólipos/adenomas serreados sésseis (P/ASS), os adenomas serreados tradicionais (AST) e os pólipos hiperplásicos (PH). Estes são lesões não neoplásicas, os quais correspondem a 80 a 90% das lesões serreadas, e encontram-se em mais de 50% das pessoas com idade superior a 60 anos. Localizamse preferencialmente na sigmoide e no reto e macroscopicamente são lesões sésseis, esbranquiçadas, com um diâmetro geralmente inferior a 5 mm. A maioria dos PH não apresenta potencial de malignidade, no entanto, possam ser precursores de P/ASS, geralmente os de grandes dimensões ou quando localizados no cólon proximal. Desta forma, o risco de malignização não pode ser completamente ignorado. Os P/ASS são mais frequentes no cólon proximal, correspondem a 18 a 22% das lesões serreadas do cólon e representam entre 3% a 9% de todos os pólipos do cólon. Macroscopicamente têm geralmente mais de 5 mm, são habitualmente sésseis ou planos, macios e amarelados. Como os padrões de proliferação e diferenciação celular incluem expressão de muco, frequentemente estes pólipos estão cobertos por muco, dificultando a sua detecção. Os P/ASS não possuem displasia no estádio inicial de desenvolvimento, mas podem adquirir essa característica ao longo da progressão neoplásica, tratando-se, porém, de displasia citológica e associando-se, apenas esses, a um aumento do risco de adenocarcinoma serreado. Os AST podem ser encontrados em todo o cólon, mas predominam no cólon distal. Correspondem a 0,6 a 1,3% das lesões serreadas. Possuem habitualmente uma forma pediculada e dimensões superiores a 10 mm e apresentam aspecto macroscópico cerebriforme (SINGH et al, 2016).. 17.

(18) Estima-se que 70 a 80% dos CCR têm origem em pólipos adenomatosos, e 20 a 25% em adenomas serreados. A remoção endoscópica de pólipos adenomatosos reduz a mortalidade associada a CCR em cerca de 53%, durante os primeiros 10 anos após a colonoscopia (FERLITSCH et al, 2017). A colonoscopia é considerada a técnica padrão ouro na detecção de pólipos, especialmente devido proporcionar a imediata ressecção endoscópica. Assim, a colonoscopia promove o diagnóstico, permite a polipectomia com estudo histológico subsequente e a pesquisa de lesões síncronas e metacrónicas (GAGO et al, 2017). 1.2 Polipose Adenomatosa Familiar (PAF) A Polipose Ademomatosa Familiar (PAF), OMIM: 175100, também denominada polipose colônica, é uma síndrome hereditária caracterizada pelo desenvolvimento de centenas a milhares de adenomas no reto e no cólon durante a segunda década de vida. A síndrome causada pela mutação germinativa no gene APC (Adenomatous Polyposis Coli), OMIM: 611731, é responsável por apenas 1% dos casos de câncer colorretal (CCR) na população (HALF; BERCOVICH; ROZEN, 2009). A maioria dos indivíduos é assintomática durante anos até os adenomas serem grandes e numerosos, e causem hemorragia, anemia, ou até que se desenvolva câncer. Geralmente, o câncer começa a desenvolver uma década após o aparecimento dos pólipos. Os sintomas incluem obstipação ou diarreia, dor abdominal, massa abdominal palpável e perda de peso. A FAP pode ter manifestações extra-intestinais tais como osteomas, anomalias dentárias, hipertrofia congenita do epitélio pigmentar da retina (CHRPE), tumores desmóides e cânceres extracolónicos (tireóide, fígado, vias biliares e sistema nervoso central). Uma variante menos agressiva, a FAP atenuada (FAPA), tem menos pólipos adenomatosos colorretais, geralmente 10 a 100, idade mais tardia de aparecimento de adenomas e menor risco de câncer (Figura 2). Algumas lesões (osteomas do crânio e da mandíbula, anomalias dentárias, e fibromas no couro cabeludo, ombros, braços e costas) são indicativas da síndrome de Gardner, ao passo que a associação de FAP e meduloblastoma é referida como síndrome de Turcot (HALF; BERCOVICH; ROZEN, 2009).. 18.

(19) Figura 2. Diferenciação clínica dos genótipos⁄genótipos na Polipose Adenomatosa Familiar Clássica, Polipose Adenomatosa Familiar Atenuada, Polipose Adenomatosa Familiar associada a MUTYH e Câncer Colorretal Hereditário sem polipose.. As mutações na linha germinal da proteína APC foram descritas pela primeira vez em 1991, como causadoras de polipose adenomatosa familiar com um padrão de hereditariedade autossômico dominante (GOUVEIA, 2017). O gene APC é um onco-supressor que está localizado no braço longo cromossomo 5 (5q21q22). Este gene é constituído por 15 exões e o exon 15 possui mais de 75% da sequência de codificação da proteína APC (GenBank AH009132), correspondendo ao alvo mais comum tanto para as mutações germinativas como para as somáticas. A proteína codificada pelo gene APC é constituída por 2.843 aminoácidos (310KDa) e desempenha um papel fundamental na via de sinalização Wnt. A proteína multifuncional APC desempenha a sua função oncosupressora através da regulação negativa da onco-proteína β-catenina. A ativação da proteína APC leva à ubiquitinação e degradação da β-catenina, mantendo, deste modo, os seus níveis normais. Contudo na sua ausência ou na sua disfunção, este processo não ocorre e, consequentemente há uma acumulação de β-catenina ao nível do núcleo celular que, posteriormente, interage com fatores que promovem a transcrição de genes que estão envolvidos com a entrada da célula no ciclo celular, proliferação, migração, apoptose e progressão da célula. Esta proteína também está envolvida na estabilização dos microtúbulos, contribuindo para a estabilidade cromossômica. Assim 19.

(20) conclui-se que a disfunção da proteína APC leva a uma segregação cromossômica deficiente e a um processo mitótico aberrante (LEOZ et al., 2015). 1.3 Polipose adenomatosa familiar associada ao MUTYH (MAP) A mutação no gene MUTYH (OMIM: 604933) causa a condição de polipose conhecida como Polipose Adenomatosa Familiar associada a MUTYH (MAP). A MAP é uma herança autossômica recessiva causada por mutações bialélicas no gene MUTYH. Os indivíduos afetados podem ser homozigotos (GG) ou heterozigotos (AG) (PATEL et al, 2019). O fenótipo da MAP pode se sobrepor parcialmente à polipose adenomatosa familiar (PAF clássica), PAF atenuada (PAFA) e, mais raramente, síndrome de Lynch (LS). Quando comparados aos pacientes com PAF clássica, os pacientes com MAP tendem a desenvolver menos adenomas e com diagnóstico tardio, a maioria é diagnosticada com adenomas colorretais durante a quinta década de vida e cerca da metade deles também apresenta câncer colorretal no momento do diagnóstico sindrômico (Figura 2). Geralmente, os portadores de mutação bialélica de MUTYH têm 10–99 adenomas e, com menor frequência, desenvolvem mais de 100 adenomas (PITROSKI et al, 2011). A MAP é uma síndrome autossômica recessiva associada ao desenvolvimento de tumores colorretal e pólipos do cólon, predominantemente adenomatosos em idade precoce. Além disso, a MAP está associada a manifestações extracolônicas, incluindo polipose duodenal, e uma maior predisposição ao câncer de ovário, bexiga, pele e câncer de mama. Tumores cutâneos benignos também foram observados em pacientes com MAP, como adenomas e epiteliomas da glândula sebácea e lipomas subcutâneos (PITROSKI et al, 2011). A MAP apresenta uma frequência de portadores heterozigotos de 1-2% e a frequência de portadores de mutações bialélicas situa-se entre 1 por 10.000 e 40.000 nascimentos. A penetrância para pólipos do cólon é próxima de 100% e a mutação bialélica. de. MUTYH. os. portadores. geralmente. desenvolvem. 10-100. pólipos/adenomas adenomatosos do cólon e do reto (HALF; BERCOVICH; ROZEN, 2009). 20.

(21) 1.4 Gene MUTYH O gene MUTYH encontra-se no braço curto do cromossomo 1 (1p34.3-1p32.1) e contém 16 exões que codificam uma proteína com 535 aminoácidos (OMIM no. 604933, sequência de codificação: NM_001128425.1). Esta proteína, localizada no núcleo e nas mitocôndrias, faz parte do sistema de reparação do DNA por excisão de bases. Esse sistema contribui para a proteção celular contra os efeitos mutagênicos do metabolismo aeróbico, sobretudo a oxidação da guanina que leva à formação de 8-dihydro-8-oxoguanina (8-oxoG). A ativação deste sistema previne as mutações somáticas induzidas por 8-oxoG que possui uma grande afinidade para a adenina (YAMAGUCHI et al., 2014). A proteína traduzida pelo gene OGG1 (OMIM: 601982 UniProtKB: O15527) remove o complexo formado entre pareamento 8-oxo-dG:C na dupla fita do DNA. A proteína MUTYH (OMIM: 604933 UniProtKB: Q9UIF7) age removendo da fita de DNA a base adenina mal pareada a 8-oxo-guanina. A enzima 8-oxodGTPase traduzida pelo gene MTH1 (OMIM: 600312 UniProtKB: P36639) impede que ocorra a inserção de novas moléculas de 8-oxo-dG no DNA recém corrigido (ELLIS, 2008). O pareamento errôneo, caso não seja reparado, levará à formação de mutações por transversões de G:C para T:A. Por este motivo, tumores de pacientes MAP apresentam uma elevada taxa dessas transversões em genes comumente mutados em CCR, como APC (OMIM: 611731) e KRAS (OMIM: 190070) (AL-TASSAN et al. 2002). O mRNA transcrito tem 1.854 pb de comprimento e codifica uma proteína com 546 aminoácidos e um peso molecular de 52 kDa. A proteína contém vários domínios funcionais, incluindo: o domínio N-terminal 5 ', que contém a região catalítica e inclui uma hélice helicoidal (HhH), pseudo HhH e um motivo de loop de cluster de enxofre de ferro, que também são motivos comuns em outras glicosilases de BER; o domínio C-terminal 3' compartilha homologia com MTH1 (membro da família BER) e desempenha um papel no reconhecimento de 8-oxoG.. 21.

(22) 1.5 Carcinogenese nos portadores de mutação em MUTYH As bases nitrogenadas do DNA estão sempre expostas à ação nociva das espécies reativas de oxigênio (EROs).. As EROs são produzidos em grande. quantidade nos processos inflamatórios crônicos que acometem o epitélio intestinal. Esses radicais induzem dano persistente ao DNA e, caso não sejam prontamente neutralizados pelos sistemas antioxidantes, podem ocasionar mutações relacionadas ao desenvolvimento do câncer colorretal. Assim sendo, o DNA encontra-se permanentemente vulnerável a erros de pareamento durante sua replicação. Para que esses erros de pareamento não ocasionem aparecimento de mutações, as bases oxidadas devem ser prontamente removidas pelos diferentes sistemas de reparo do organismo. As bases oxidadas pela ação das EROs são corrigidas pelo mecanismo de reparo por excisão de bases (BER), conhecido por atuar, em particular, nos erros de pareamento decorrentes da ação das EROs. O mecanismo molecular do BER inicia-se pelo reconhecimento e pela excisão de bases danificadas pelas DNA-glicosilases, com ou sem atividade 3'AP-liase associada. A excisão da base resulta em um sítio abásico, apurínico ou apirimidínico, reconhecido por outro grupo de enzimas, as AP-endonucleases, que fazem a incisão na extremidade 3' ou 5' do sítio AP, gerando uma lacuna. Essa lacuna é então preenchida pela base correta e ligada por polimerização à sequência correta de nucleotídeos do DNA (NASCIMENTO, 2017). Quando o sistema BER encontra-se ineficiente, e, como no caso dos pacientes com mutações bialélicas em MUTYH, as adeninas mal pareadas levam ao acúmulo de transversões somáticas G:C → T:A em genes específicos da regulação do ciclo celular, tais como APC ou KRAS (JASS, 2008). Mutações bialélicas em MUTYH poderiam induzir a tumorigênese por duas vias conhecidas de CCR, principalmente inativando os genes APC e KRAS, e em alguns casos também hMLH1 e como consequência o sistema de genes de reparo (Mismatch repair genes - MMR) (LEFEVRE et al., 2006). Geralmente, as mutações no gene MUTYH são do tipo erros de pareamento, em que há substituição de um nucleotídeo, o que faz com que o códon resultante codifique um aminoácido a menos (NASCIMENTO, 2017). As consequências desse 22.

(23) tipo de mutação pontual podem variar segundo a intensidade com que afetam a funcionalidade da proteína traduzida. As duas mutações herdadas mais comuns que acometem o gene MUTYH Y179C (OMIM: 604933.0001) e G382D (OMIM: 604933.0002) ocorrem por esse tipo de mutação. Entretanto, alguns autores encontraram mutações do tipo frameshift em portadores de MAP (VENESIO et al, 2004). Nesse tipo de mutação, existe a alteração completa da leitura dos três nucleotídeos que formam um códon, resultando também na formação de um stop codon, com consequente interrupção da tradução proteica. Embora possam ocorrer variações no local da mutação, cerca de 70% dos pacientes com câncer colorretal associados à MAP apresenta mutação do tipo Y179C e G382D (PETERLONGO et al., 2005). Em 93% dos pacientes que apresentam mutações em ambos os alelos do gene MUTYH, pelo menos um desses códons nos quais as mutações incidem com maior frequência (hotspots) encontra-se mutado (VENESIO et al, 2004). Outro aspecto que também deve ser considerado no rastreamento do sítio da mutação no gene MUTYH é a etnia do paciente. Estudos demonstraram que a etnia e localização geográfica parecem estar relacionados a maior ou menor prevalência de certos tipos de mutações (ELLIS, 2008). Por tratar-se de uma síndrome com herança autossômica recessiva, a presença de consanguinidade na família, outros afetados na mesma geração e a ausência de transmissão vertical também podem auxiliar na suspeita diagnóstica da MAP. As mutações MUTYH_c.536A>G (p.Y179C) e c.1187G>A (p.G396D) são mais frequentes em pacientes com ascendência europeia (Figura 3), representando 53% e 32%, respectivamente, enquanto mutações nonsense tipo E466X e Y90X prevalecem entre indianos e paquistaneses (ALHOPURO et al., 2005). Populações de italianos carregam a mutação por deleção de três pares de bases no éxon 14 (1395delGGA) (GISMONDI et al., 2004).. 23.

(24) Figura 3. Frequências alélicas médias entre portadores de mutações na linha germinativa de MUTYH. N = Número de portadores de mutações na linha germinativa bialélica e monoalélica de MUTYH. Incluem-se mutações que se acredita serem de significância patogênica e que são encontradas com uma frequência alélica> 0,03 em portadores de mutações dos respectivos países (POULSEN et al, 2008).. 1.6 Mutação MUTYH_c.536A>G no Seridó Uma das características mais marcantes da população brasileira é sua heterogeneidade. Sua miscigenação caracteriza-se pela diversidade étnica, social e cultural. Além de populações nativas, os índios, do século XVI ao XIX, o Brasil recebeu imigrantes de diferentes países, incluindo uma importante contribuição de colonizadores da Europa, principalmente portugueses e espanhóis. A primeira metade do século XVI foi marcada pela presença africana no país. A imigração de povos de origens geográficas e étnicas muito diversas contribuiu para a formação do pool genético brasileiro contemporâneo, e a miscigenação observada em todo o território brasileiro. A colonização do Brasil, processo também conhecido como Brasil Colônia, ocorreu no período colonial entre os séculos XVI e XIX, em que o território brasileiro era uma colônia do império ultramarino português. Nos primeiros 30 anos não houve grande interesse dos portugueses pela nova terra, em razão dos altos lucros com o 24.

(25) comércio oriental de especiarias. Quando os lucros das especiarias começaram a ficar mais reduzidos por causa do aumento dos gastos para manter os domínios portugueses na África e na Ásia (naufrágios, estabelecimento de fortes e de feitorias, revoltas das populações locais, expulsão dos portugueses), Portugal sentiu-se mais interessado em colonizar a terra brasileira (FAUSTO, 2006). Na falta de metais preciosos, a solução para obter alguma forma de lucro no Brasil colônia, seria promover a produção de um gênero agrícola que tivesse grande aceitação e elevado preço no mercado europeu. O açúcar atendia perfeitamente essas exigências. Grandes quantidades de açúcar eram produzidas nos engenhos estabelecidos na região Nordeste (MELLO, 1998). O produto era exportado, principalmente para o mercado europeu, enriquecendo os senhores de engenho e os cofres da corte portuguesa. Contudo, a produção açucareira exigia uma complexa infraestrutura que envolvia o uso de grandes propriedades, a farta disponibilidade de mão de obra, manutenção de pastos para animais de tração, extração de madeira e a construção de instalações apropriadas para o beneficiamento da cana-de-açúcar. De fato, a empresa colonial exigia um alto investimento. Nesse sentido, os holandeses surgem como peça vital para viabilizar a empresa açucareira na colônia (FAUSTO, 2006). Em menos de 20 anos as plantações de cana se espalharam de tal forma pelo litoral, que por volta de 1550, o Brasil já era o maior produtor mundial de açúcar. No Nordeste, especialmente em Pernambuco, encontrou-se excelentes condições de clima e solo, instalando-se rapidamente dezenas de fazendas e engenhos (MACEDO, 1998). Desde o século XV, os holandeses já comercializavam o açúcar produzido pelos portugueses nas ilhas atlânticas. Apesar do bom relacionamento comercial que se desenvolvia entre Portugal e Holanda, essa parceria tomou outros rumos no final do século XVI. Nesse período, os reinos ibéricos passaram por diversas transformações. Em 1578, o trono português ficou vago mediante a existência de um herdeiro que pudesse assumir o cargo. Com isso, o rei espanhol Filipe II, neto do rei português Dom Manuel I, reivindicou o governo de Portugal, provocando a unificação das coroas portuguesa e espanhola (MELLO, 1998). Historicamente, o processo de formação do Estado holandês desenvolveu entre diversos confrontos contra o domínio político dos espanhóis naquela região. De 25.

(26) fato, em 1579 – um ano antes da unificação dos reinos ibéricos – os holandeses proclamaram a sua independência em relação ao trono espanhol. No ano seguinte, quando a Espanha assumiu o governo de Portugal, a Holanda perdeu automaticamente todos os direitos de participação na exploração da economia açucareira (BOXER, 1961). Após a União Ibérica (domínio da Espanha em Portugal entre os anos de 1580 e 1640), a Holanda resolveu enviar suas expedições militares para conquistarem a região nordeste brasileira (CASCUDO, 1955). O objetivo holandês era restabelecer o comércio do açúcar entre o Brasil e Holanda, proibido pela Espanha após a União Ibérica. O domínio holandês na capitania de Pernambuco - a qual o Rio Grande do Norte fazia parte, ocorreu durante 1630 a 1654. Em consequência das invasões ao nordeste do Brasil, o capital holandês passou a dominar todas as etapas da produção de açúcar, do plantio da cana-de-açúcar ao refino e distribuição (TAKEYA, 1994). Os 24 anos do domínio holandês deixou marcas na arquitetura, cultura e na heterogeneidade do nordeste brasileiro. O Seridó, exemplo dessa influência europeia, é uma região interestadual localizada no sertão da Região Nordeste do Brasil. Este abrange municípios dos estados do Rio Grande do Norte e da Paraíba, sendo dividida pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) em Seridó Ocidental Potiguar e Seridó Oriental Potiguar, Seridó Ocidental Paraibano e Seridó Oriental Paraibano. A região do Seridó Potiguar, está localizado no centro sul do Estado do Rio Grande do Norte, apresenta uma série de particularidades únicas se comparadas a outras porções do estado, tanto na cultura como na geografia. Seu território abrange as microrregiões do Seridó Ocidental, Seridó Oriental, Serra de Santana e parte da microrregião do Vale do Assú (IBGE, 1990). O Seridó Potiguar guarda detalhes bem mais particulares sobre seus habitantes do que a cultura e a gastronomia características da região. Nos séculos XVII e XVIII, o relevo acidentado restringiu o contato de povoados e das cidades do Seridó com o restante do território do RN, o isolamento natural que, somado à tradição dos casamentos consanguíneos, visando garantir que bens e propriedades permanecem na família, teve como consequência o surgimento de patologias de origem genética.. 26.

(27) Estima-se que as frequências de casamentos consanguíneos no Rio Grande do Norte variam de 9 a 32% (SANTOS et al, 2013). O efeito negativo de uniões consanguíneas consiste na expressão de alelos recessivos e raros herdados de um ancestral comum. Esses alelos raros podem aumentar sua frequência na população quando ocorrem eventos de deriva genética ou efeito de fundador. A consanguinidade ou parentesco genético pode ser medido por intermédio da probabilidade de indivíduos terem genes idênticos, herdados de um ancestral comum a ambos, independentemente de tais genes condicionarem fenótipos dominantes ou recessivos, normais ou anômalos (BEIGUELMAN, 2008). O gene MUTYH abriga uma heterogeneidade molecular significativa com cerca de 352 variantes de sequência diferentes identificadas até agora (MUTYH Leiden Open Variation Database). As mutações missense c.536A>G (p.Y179C) e c.1187G>A (p.G396D), presentes em 80% dos doentes com MAP, são as duas mutações mais. frequentes nos portadores com ascendência europeia (AL TASSAN et al., 2002; LIPTON e TOMLINSON, 2004). A mutação Y179C está localizada na extremidade Nterminal do MUTYH e faz parte do motivo pseudo-HhH na região catalítica do MUTYH. Ela desempenha um papel importante no reconhecimento da 8-oxoG e na ligação com a especificidade da má combinação da adenina, intercalação no duplex de DNA e estabilidade do complexo proteína-DNA. Estudos de mutações bialélicas Y179C em linhas de células humanas ilustram que a função defeituosa de MUTYH resulta de níveis significativamente reduzidos de proteína MUTYH (níveis de proteína de 5 a 10% em comparação com os níveis de MUTYH do tipo selvagem), bem como de capacidade reduzida de ligação e clivagem para os substratos mal pareados (PARKER, 2005). Foi observado também que combinação de mais de 15 adenomas colorretais síncronos e câncer colorretal (CCR) diagnosticados em pacientes com idade inferior a 50 anos se correlacionou com mutações bialélicas de MUTYH com sensibilidade de 75% e especificidade de 94%. No geral, estima-se que mutações bialélicas de MUTYH da linha germinativa ocorram em 0,2-0,9% de todos os pacientes com câncer colorretal (BALAGUER et al, 2007). A identificação de portadores da mutação em MUTYH é importante para direcionar as decisões de manejo clínico, considerando que em indivíduos positivos 27.

(28) para mutação bialélica, o acompanhamento colonoscópico deve começar entre 25 e 30 anos, a cada 1-2 anos, caso negativo. Caso pólipos sejam encontrados, deve-se seguir o protocolo clínico de acordo com a idade e tamanho, segundo o MAP-2 do Nacional. Comprehensive. acompanhamento. Cancer. gastroduodenal. Network. –. (endoscopia. NCCN. versão. 2019.2.. O. digestiva. alta),. incluindo. a. visualização completa da ampola de Vater, deve ser realizada a partir dos 30 a 35 anos. Além disso, a identificação de um portador bialélico geralmente está associada à segregação da mutação familiar (NCCN, 2019). Em caso de mutação monoalélica em MUTYH, para probandos não afetados pelo CCR com um parente de primeiro grau com CCR, deve-se realizar triagem por colonoscopia a cada 5 anos, a partir dos 40 anos, ou 10 anos antes da idade do parente de primeiro grau no diagnóstico do CCR (NCCN, 2019). É de extrema importância o aconselhamento genético dos familiares para rastreamento da variante patogênica e devida orientação e acompanhamento, conforme protocolos clínicos e científicos.. 28.

(29) 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivos gerais Identificação da frequência da mutação do gene MUTYH_c.536A>G (p.Tyr179Cys) em pacientes da região do Seridó. 2.2 Objetivos específicos ●. Identificar portadores da variante patogênica a partir da genotipagem da mutação MUTYH_c.536A>G;. ●. Realizar a segregação familiar dos portadores da mutação;. ●. Correlacionar fenótipo/genótipo para caracterização clínica dos portadores da variante.. 29.

(30) 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Comitê de Ética O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos (CEP) da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, CAAE 02090918.3.0000.5293, sob o parecer nº 3.097.916 (Apêndice A), no qual as pacientes só participaram do estudo ao assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), subjugado a este protocolo (Apêndice B). 3.2 Delineamento do Estudo Foi realizado um estudo clínico observacional aberto transversal para identificar indivíduos portadores das mutações germinativas c.536A>G, p.Tyr179Cys, com familiares de pacientes portadores de polipose colônica no Seridó. Os pacientes incluídos no estudo residem ou são de origem da região do Seridó, sem distinção de gênero, maiores que 18 anos, que concordaram em participar da pesquisa atendendo pelo menos um dos critérios abaixo: 1. Paciente e/ou familiar diagnosticado com mais de 100 adenomas; 2. Paciente e/ou familiar com diagnóstico clínico de polipose colônica, que tenha feito tratamento oncológico ou que ainda esteja em tratamento; 3. Histórico pessoal e/ou familiar de tumor desmoide, hepatoblastoma, câncer papilar de tireoide, ou alteração na pigmentação da retina bilateral/multifocal (CHRPE); 3.3 Ambulatório: Triagem de pacientes e coleta de amostras biológicas O estudo foi executado por uma equipe multidisciplinar LIGA-UFRN composta por Dra. Tirzah Braz Petta Lajus – Geneticista, Dra. Ana Rafaela de Souza Timoteo – Bióloga, Dr. Silvio Correia de Sales – oncologista, Ana Élida Menezes Magalhães Gonçalves – Psicóloga, realizando, a partir dos critérios de inclusão, a triagem, avaliação e acompanhamento dos pacientes.. 30.

(31) Ao atender os critérios de inclusão, o paciente é convidado para participar do ambulatório do estudo. Neste foi realizado o levantamento dos dados clínicos, dos quais foram coletadas as informações pessoais e clínicas do paciente. Nesse momento, foi realizado o heredograma manual do paciente. Em seguida, o paciente foi convidado para participar, como voluntário, da pesquisa. Após ser esclarecido sobre as informações e procedimentos do estudo, assinou o TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Por fim, foi coletada amostra de sangue periférico em. tubos. BD. Vacutainer®. contendo. 5,4. mg. de. anticoagulante. ácido. etilenodiaminotetracético (EDTA), em seguida, homogeneizado por inversão e armazenados à uma temperatura de 2 a 6 ºC até o momento da extração de DNA. A partir das informações obtidas durante o ambulatório foi possível elaborar os heredogramas das famílias. Para isto, foi utilizado o software Progeny disponível online e gratuitamente. As modificações foram realizadas no PowerPoint da Microsoft. As informações clínicas e atualizações do processamento da amostra (data de coleta, data de extração, responsável, quantificação de DNA, localização da amostra, dentre outras informações) foram adicionadas em uma planilha Excel no Drive compartilhada entre os membros do projeto de pesquisa. 3.4 Extração de DNA a partir de células do sangue Para a realização do estudo laboratorial foi utilizado o Laboratório de Biologia Molecular e Genética (LBMG), localizado no Centro de Biociências, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). A extração de DNA genômico foi realizada a partir do kit de purificação de DNA QIamp DNA Mini kit, seguindo instruções do fabricante. 3.5 Controle de qualidade: Quantificação do DNA O controle de qualidade das amostras de DNA extraído foi realizado a partir da quantificação das amostras de DNA extraídas por meio do NanoDrop™ 2000/2000c Spectrophotometers – Thermo Fisher Scientific, no LBMG-UFRN. 3.6 Reação da Cadeia da Polimerase (PCR). 31.

(32) Para o projeto de pesquisa foram feitas as PCRs a fim de amplificar a região específica, a partir do DNA genômico extraído das amostras. Os primers ou iniciadores utilizados na amplificação do fragmento de interesse foram: Primer Forward: CTGCCTGCCTGTGGCTATAGAAG Primer Reverse: TCCTCTACCACCTGATTGGAGT Os primers para MUTYH foram desenhados utilizando-se o Programa Primer3. O tamanho do produto amplificado corresponde à aproximadamente 300 pb. As condições de amplificação da sequência estão descritas na Tabela 1. Tabela 1. Programação da amplificação Platinum® PCR SuperMix.. Etapa Hold Denature Anneal Extend. Temperatura. Tempo. Ciclos. 94°C 94°C 55°C 62°C. 1 min 30 30 1 min. 35. Após a amplificação das regiões de interesse, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 2%. 3.7 Controle de Qualidade: Eletroforese em gel de agarose a 2% Os produtos da PCR foram analisados por meio da eletroforese em gel de agarose a 2% em Tris-acetato-EDTA (TAE), submetido a 80V durante 90 a 120 minutos. O agente intercalante utilizado para visualização foi Syber Green diluído em TAE (40mM Tris; 20mM Ácido Acético; 1 mMEDTA) na proporção 1:10.000 (v⁄v), conforme especificações do fabricante. O marcador de massa molecular aplicado foi o ladder 50 pb da Ludwig Biotec. A análise e leitura do gel de eletroforese foi realizada utilizando o ChemiDoc™ MP Imaging System da Bio Rad. 3.8 Sequenciamento capilar A presença ou ausência da mutação foi verificada por meio de sequenciamento automático bidirecional por eletroforese capilar na plataforma ABI 3500 (Applied Biosystems). Para a realização do sequenciamento capilar, utilizou-se o BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific), de acordo com as 32.

(33) instruções do fabricante. As sequências-alvo foram amplificadas por meio de uma reação de PCR no equipamento Mastercycler epgradient (Eppendorf), seguindo o programa de ciclagem de acordo com o manual do BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific), descrito na Tabela 2. Tabela 2. Programação da amplificação BigDye Terminator.. Estágio 25 ciclos Parâmetro Incubação Desnaturação Anelamento Extensão Rampa 33% = 1°C/s Temperatura 96°C 96°C 50°C 60°C Tempo (mm:ss) 01:00 00:10 00:05 04:00. Hold 4°C ∞. Para purificação das reações de sequenciamento, utilizou-se o BigDye XTerminator™ Purification Kit (Thermo Fisher Scientific), seguindo-se as instruções do fabricante. 3.9 Análise de dados O software SPSS 24 for Windows (Statistical Package for Social Sciences; IBM, USA) foi o recurso computacional utilizado para a análise estatística dos dados, em que foram realizadas análises exploratórias dos dados e teste de associação entre variáveis. As associações entre variáveis foram verificadas por meio do Teste Exato de Fisher, ao nível de confiança de 95%, considerando valores de P<0,05 estatisticamente significativos.. 33.

(34) 4. RESULTADOS 4.1 Caracterização da amostra A população estudada foi composta por 157 pacientes, residentes ou de origem das cidades de Acari/RN, Caicó/RN, Currais Novos/RN, Jardim de Piranhas/RN, Jardim do Seridó/RN, Natal/RN, Paraú/RN, Rafael Godeiro/RN, Serrinha dos Pintos/RN, Brejo do Cruz/PB e Juazeirinho/PB (Tabela 3). O grupo foi constituido por 62,4% mulheres e 37,6% homens, com a média de idade de 46 anos e mediana de 45 anos (Tabela 3). 4.2 Caracterização clínica dos indivíduos Cento e trinta e seis pacientes (86,6%) foram assintomáticos, dez pacientes (6,4%) apresentaram diagnóstico de polipose colônica, cinco indivíduos (3,2%) foram diagnosticados com câncer colorretal ou com câncer de tireóide, e um paciente (0,6%) com câncer de mama (Tabela 4). Como segundo diagnóstico foi observado câncer de tireóide (1,27%) e Doença de Chron (0,64%). Tabela 3. Caracterização da amostra da população do estudo.. Variáveis Sexo Masculino Feminino Genotipagem AA AG GG Não sequenciado Idade média Idade mediana Cidade Caicó – RN Acari – RN Jardim do Seridó – RN Jardim de Piranhas – RN Natal – RN Brejo do Cruz – PB Serrinha dos Pintos – RN Rafael Godeiro – RN Juazeirinho – PB. N. %. 59 37,6% 98 62,4% 77 49,0% 59 37,6% 4 2,5% 17 10,8% 46 anos 45 anos 130 8 8 3 2 1 1 1 1. 82,8% 5,1% 5,1% 1,9% 1,3% 0,6% 0,6% 0,6% 0,6% 34.

(35) Currais Novos – RN Paraú – RN. 1 1. 0,6% 0,6%. 4.3 Identificação da mutação MUTYH_c.536A>G (p.Tyr179Cys) A mutação MUTYH_c.536A>G foi detectada em quatro casos em homozigose e em cinquenta e nove casos em heterozigose. Dessa forma, observa-se que 2,5% (4/157) dos pacientes sequenciados apresentaram a mutação bialélica - GG, 37,6% (59/157) mutação monoalélica - AG, e 49% (77/157) dos indivíduos do estudo foram ausente desta variante patogênica – AA (Figura 4). Até o momento, dezessete indivíduos ainda não foram sequenciados.. Figura 4. Eletrofluorograma mostrando a mutação c.536A>G em pacientes normal, com a mutação em heterozigose e com mutação em homozigose. A) Indivíduo ausente da variante em MUTYH analisada – AA; B) Indivíduo com mutação MUTYH em heterozigose – AG; C) Indivíduo com mutação MUTYH em homozigose – GG.. A variante bialélica em MUTYH foi identificada em 2% dos indivíduos do sexo feminino (2⁄98) e 3,3% do sexo masculino (2⁄59). A mutação monoalélica foi observada em 34,6 pacientes do sexo feminino (34⁄98) e 42,4% do sexo masculino (25⁄59). O estudo identificou a mutação bialélica MUTYH_c.536A>G em três (75%) indivíduos nascidos e/ou residentes da cidade de Caicó/RN e um paciente (25%) de origem da cidade de Acari/RN. A presença de um alelo mutado foi observada em cinquenta e seis pacientes (95%) da cidade de Caicó e um (2%) das cidades de Acari, Natal/RN e Juazeiro/PB.. 35.

(36) Tabela 4. Caracterização clínica da população do estudo.. Variáveis Diagnóstico Sem diagnóstico Polipose colônica Câncer colorretal Câncer de mama Câncer de tireoide Polipose Colônica Sim Não Diagnóstico de câncer Sim Não Colonoscopia Sim Não Não informado. N. %. 136 10 5 1 5. 86,6% 6,4% 3,2% 0,6% 3,2%. 10 6,4 147 93,6 11 7,0% 146 93,0% 48 30,6% 56 35,7% 53 33,8%. 4.4 Relação genótipo/fenótipo dos portadores da variante patogênica A presença de pelo menos um alelo mutado foi observada em 70% dos dez pacientes com polipose colônica, destes 20% apresentaram a mutação bialélica. No geral, a mutação bialélica MUTYH_c.536A>G foi identificada em 20% pacientes diagnosticado com câncer colorretal e 20% portador bialélico assintomático (Tabela 4). Neste estudo, a mutação monoalélica foi identificada em cinco pacientes com polipose colônica e um paciente diagnosticado com câncer colorretal, câncer de mama ou câncer de tireóide. De modo geral, 86,4% (51 indivíduos) dos portadores da variante patogênica monoalélica eram assintomáticos. A ausência da variante esteve presente em 49% indivíduos (n=77). Destes, três pacientes (3/77; 3,9%) sequenciados apresentava polipose colônica, câncer colorretal ou câncer de tireóide. 4.5 Portadores da variante em MUTYH com a polipose colônica e a vigilância colonoscópica A vigilância colonoscópica, em particular das mucosas, é essencial para o rastreio da lesão displásica. A colonoscopia consiste em um procedimento endoscópico, o qual permite o diagnóstico e ressecção dos pólipos (polipectomia). Na 36.

(37) amostra do estudo foi avaliado a realização da colonoscopia como método de vigilância para pólipos colorretais (Tabela 4). A mutação bialélica MUTYH_c.536A>G foi identificada em dois pacientes diagnosticados com polipose colônica. A mesma condição esteve presente em cinco pacientes com essa variante monoalélica. A presença de pelo menos um alelo mutado foi observado em 37% indivíduos que realizaram colonoscopia, 3 portadores da variante bialélica e 20 portadores da variante monoalélica. A presença da mutação monoalélica foi identificada em 22,03% indivíduos que apresentam pólipos colorretais. A variante MUTYH_c.536A>G em homozigose e heterozigose, respectivamente, foI identificada em um indivíduo (25%) e dezessete pacientes (28,81%) que nunca realizaram procedimento endoscópico – colonoscopia. A partir da realização do Teste Exato de Fisher, nível de confiança 95% (P<0,05), a fim de verificar associação entre a genotipagem com o diagnóstico clínico (Figura 5), realização de colonoscopias e acometimento pela polipose colônica (Figura 6), observa-se que, há evidências para se afirmar que existe associação entre a genotipagem e o diagnóstico de polipose colônica. Essa associação pode ser melhor identificada ao observar a distribuição dos dados, em que os pacientes acometidos por polipose colônica apresentaram maior proporção da mutação monoalélica (50%; P=0,012), enquanto nos pacientes que não foram diagnosticados com polipose colônica foi observada uma maior proporção de ausência de mutação (56,9%). As demais associações não apresentaram evidências de significância estatística (Tabela 5).. 37.

(38) Valor P= 0,275. Figura 5. Associação entre o genótipo⁄⁄fenótipo da amostra populacional do estudo. Valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.. Valor P= 0,012. Figura 6. Associação da genotipagem e o diagnóstico de MAP. Valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.. 38.

(39) Tabela 5. Relação entre portadores de variante patogênica com o fenótipo e o procedimento colonoscópico. Valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.. Genotipagem. Variáveis Diagnóstico Sem diagnóstico Polipose colônica Câncer colorretal Câncer de mama Câncer de tireoide. AA. AG. GG. 0,298 68 3 3 0 3. 56,7% 30,0% 60,0% 0,0% 75,0%. 51 5 1 1 1. 42,5% 50,0% 20,0% 100,0% 25,0%. 1 2 1 0 0. 0,8% 20,0% 20,0% 0,0% 0,0% 0,693. Colonoscopia Sim Não Polipose Sim Não. p-valor. 30 62,5% 17 35,4% 1 2,1% 23 52,3% 20 45,5% 1 2,3% 0,012 3 30,0% 5 50,0% 2 20,0% 74 56,9% 54 41,5% 2 1,5%. 0,275 Diagnóstico de câncer Sim 6 60,0% 3 30,0% 1 10,0% 71 54,6% 56 43,1% 3 2,3% Não 4.6 Segregação familiar em portadores de variante monoalélica e bialélica Cento e cinquenta e sete indivíduos foram selecionados de acordo com os critérios mencionados anteriormente no projeto, sendo agrupados por famílias. Na primeira família sessenta e seis indivíduos foram incluídos no projeto (Figura 7). A partir da análise da mutação MUTYH c.536A>G, por meio do sequenciamento capilar, foram identificados três portadores da mutação bialélica. Destes três pacientes, um apresentava diagnóstico de câncer colorretal, aos 52 anos, e o outro acometido por pólipos colônicos aos 25 anos. A mutação monoalélica foi identificada em trinta e um indivíduos, destes, três apresentam polipose colônica e um paciente foi diagnosticado com câncer de mama, aos 32 anos. De modo geral, foi analisado que trinta indivíduos da família 1 não apresentam a mutação em MUTYH, destes dois pacientes são acometidos com pólipos colorretais e um com câncer de tireóide. Dois indivíduos ainda não foram sequenciados. Com isso, é observado que 52% das mutações monoalélicas (n=59) e 75% das variantes bialélicas (n=4) identificadas do estudo esteve presente nesta família. 39.

(40) Figura 7. Heredograma da família 1. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda.. 40.

(41) Onze indivíduos da família 4 foram selecionados para o estudo. Nessa família foi identificado três pacientes portadores de mutação monoalélica, um acometido por polipose colônica. Seis indivíduos não apresentaram a variante analisada e dois ainda não foram genotipados (Figura 8).. Figura 8. Heredograma da família 4. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda.. A família número 6 foi inclusa no estudo com nove probandos, deste, três foram sequenciados, um indivíduo desistiu e cinco ainda aguardam sequenciamento. Dos três pacientes sequenciados, foi identificado a mutação bialélica em um indivíduo acometido com polipose colônica; a mutação monoalélica foi identificada em um paciente com câncer de tireóide e o último não apresenta a mutação MUTYH_c.536A>G. A família apresenta histórico familiar de câncer intestinal, mama, gástico e câncer de tireóide (Figura 9).. 41.

(42) Figura 9. Heredograma da família 6. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda.. Dez pacientes da família 7 foram selecionadas para o estudo (Figura 10). Seis foram identificados com a variante em heterozigose, sendo um portador de polipose colônica. Quatro pacientes não apresentaram a mutação pesquisada, destes um é portador de câncer de tireóide e apresentou como segundo diagnóstico Doença de Crohn.. 42.

(43) Figura 10. Heredograma da família 7. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda.. A identificação da variante em MUTYH na família 10 avaliou seis indivíduos. Como resultado, foi observado um paciente com mutação monoalélica e cinco sem a variante patogênica MUTYH c.536A>G. Todos os indivíduos avaliados dessa família nunca apresentaram diagnóstico de polipose colônica e/ou câncer. Na família número 10 pode ser observado casamentos consanguíneos, além de histórico familiar de câncer intestinal (Figura 11). A família 12 participou do projeto visando a segregação da mutação familiar em dezessete participantes. Dos pacientes sequenciados, foi identificado em dez indivíduos a variante patogênica MUTYH c.536A>G, destes apenas um paciente apresenta diagnóstico de câncer colorretal. Sete indivíduos não apresentaram a mutação pesquisada em MUTYH (Figura 12).. 43.

(44) Figura 11. Heredograma da família 10. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda.. Figura 12. Heredograma da família 12. Os portadores da mutação estão destacados conforme a legenda.. 44.