Estudo retrospetivo sobre a brucelose dos pequenos ruminantes na área de intervenção da OPP Monção Melgaço

Estudo retrospetivo sobre a brucelose dos pequenos ruminantes na

área de intervenção da OPP Monção Melgaço

Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária

Luís Miguel Mendes Cunha

Orientadora

Professora Doutora Ana Cláudia Correia Coelho

Coorientador

Doutor Francisco Lopes Vaz

À Professora Doutora Ana Cláudia Correia Coelho, minha orientadora, pela amizade, disponibilidade, conhecimentos transmitidos e cooperação indispensável e à realização deste estudo.

Ao Doutor Francisco Lopes Vaz, meu coorientador, pela amizade, disponibilidade, conhecimentos transmitidos e cooperação indispensável à realização deste estudo.

A todos os Professores da minha vida académica o meu muito obrigado.

A todos os integrantes do Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, (professores, auxiliares, técnicos, e outros) pela amizade, disponibilidade e conhecimentos transmitidos.

À ARAP (Associação Raiana Agro-Pecuária de Monção e Melgaço) e a todos os seus colaboradores pela cooperação indispensável à realização deste estudo.

Aos médicos veterinários, enfermeiros veterinários e auxiliares de ação veterinária que acompanhei durante o estágio curricular, pela amizade, disponibilidade e conhecimentos transmitidos.

Aos Ninja Turtles, Gansos, Podhradova HM e aos MDD pela amizade infinita, sem vocês nunca teria sido possível.

A brucelose é uma doença que pode afetar vários animais incluindo o Homem, sendo, por isso, uma doença zoonótica. Neste momento, é uma das zoonoses com maior impacto em Portugal, existindo anualmente vários casos reportados em Humanos. A infeção é contraída maioritariamente por contacto com animais infetados ou com os seus produtos.

Hoje em dia, a brucelose encontra-se muito mais controlada do que no período anterior ao início dos planos de erradicação e controlo a nível mundial, nacional e local.

Com este trabalho, foi possível caraterizar a área de Monção e Melgaço no Norte de Portugal, calculando as prevalências animais e de rebanho da brucelose dos pequenos ruminantes, para cada ano.

No decorrer do estudo, foram observados vários comportamentos e fatores de risco existentes na área, que poderão, em caso de surto epidémico, levar a um aumento do número de casos quer em animais quer em Humanos.

Em termos retrospetivos, a área em estudo não é uma área problemática para a brucelose, sendo as prevalências analisadas num período de 11 anos sempre baixas (2004, 2009, 2010, 2013 e 2014) ou nulas (2005, 2006, 2007, 2008, 2011, 2012).

Brucellosis is a disease that can affect various animals including Humans. Therefore, is a zoonotic disease. Currently is one of the zoonosis with greatest impact in Portugal, registering annualy several cases in Humans. The infection is usually contracted by contact with infected animals or infected animal products .

Today, brucellosis is much more controlled locally, nationally and globally than in the period before the beginning of the erradication and control plans.

In this work the area of Monção and Melgaço in the North of Portugal was analyzed by calculating the individual and flock prevalence of brucellosis in small ruminants, for a period of eleven years.

During the study, several behavior and risk factors were observed in the area which can, in case of an epidemic outbreak, lead to an increase in the number of cases in animals and in humans.

Retrospectively the study area is not a problematic area for brucellosis, and the prevalence in the 11 years under review were low (2004, 2009, 2010, 2013 and 2014) or nule (2005, 2006, 2007, 2008, 2011, 2012).

Resumo ... iv Abstract ... v Índice de figuras ... ix Índice de tabelas ... ix Lista de Abreviaturas ... x 1.1. Introdução ... 12 1.2. Etiologia ... 12 1.3. Epidemiologia ... 13 1.4. Potencial Zoonótico ... 14 1.5. Distribuição... 15 1.5.1. Distribuição Mundial ... 15

1.5.1.1. Distribuição mundial de B.Mellitensis ... 15

1.5.2. Distribuição em Portugal ... 16

1.6. Brucelose dos pequenos ruminantes ... 17

1.6.1. Epidemiologia ... 17

1.6.2. Suscetibilidade ... 18

1.6.3. Patogenia ... 18

1.6.4. Quadro clínico e lesional ... 20

1.6.4.1. Quadro clínico ... 20

1.6.4.2. Lesões macroscópicas e microscópicas ... 22

1.6.4.2.1. Lesões causadas por B. melitensis ... 22

1.6.4.2.2. Lesões causadas por Brucella ovis ... 22

1.7. Diagnóstico ... 23

1.7.1. Cultura bacteriana ... 23

1.7.2. Métodos Indiretos de diagnostico laboratorial ... 24

1.7.2.1. Teste Rosa Bengala (RBT) ... 24

1.7.2.2. Teste de fixação de complemento (FC) ... 25

1.7.2.3. Teste de polarização de fluorescência (Fpa) ... 26

1.7.2.4. Ensaio imunoenzimático (ELISA) ... 26

1.7.2.5. Imunodifusão em gel de agar ... 27

1.7.3. Métodos diretos de diagnostico laboratorial ... 27

1.7.3.1. Reação em cadeia da polimerase (PCR) ... 27

1.8.2.1. Programa de vigilância ... 30

1.8.2.2. A melhoria das práticas na gestão de animais ... 30

1.8.2.3. Vacinas ... 31

1.8.2.3.1. A vacina clássica B. melitensis REV-1 ... 31

1.8.2.3.2. As vacinas inativadas ... 33

1.8.2.3.3. Vacinas vivas futuras ... 33

1.8.2.3.4. Programas vacinais ... 34

1.8.2.4. Implementação de programas sanitários ... 36

1.8.3. Plano de controlo e erradicação em Portugal ... 37

1.8.3.1. Designações gerais ... 37

1.8.3.2. Métodos serológicos a utilizar ... 39

1.8.3.2.1. Em efetivos infetados (B2.1) ... 40

1.8.3.2.2. Em efetivos não indemnes (B2) ... 40

1.8.3.2.3. Em efetivos indemnes (B3) e oficialmente indemnes (B4) ... 41

2. Objetivos ... 42

3.Materiais, métodos e caracterização da zona de intervenção ... 43

3.1. Materiais e Métodos ... 43

3.1.1. Materiais ... 43

3.1.2. Métodos ... 43

3.2. Caracterização da zona de intervenção da OPP Monção Melgaço ... 44

3.2.1. Caracterização geográfica e social ... 44

3.2.2. Caracterização do sistema de produção ... 44

3.2.3. Situação em Monção e Melgaço ... 45

3.2.4. Tamanho densidade média e tipologia das explorações animais ... 45

4. Resultados ... 48

4.1. Prevalência individual e de rebanho de brucelose dos pequenos ruminantes na área em estudo entre 2004 e 2014 ... 48

4.1.1. Prevalência individual de brucelose de pequenos ruminantes na área em estudo entre 2004 e 2014 48 4.1.2. Prevalência do rebanho de brucelose de pequenos ruminantes na área em estudo entre 2004 e 2014 ... 49

4.2. Análise dos resultados da serologia ... 51

Figura 1- Fluxograma de estatutos sanitários ... 39

Figura 2-Controlo serológico em efetivos B2.1 ... 40

Figura 3- Critério de decisão de abate para efetivos B2 ... 41

Figura 4- Critério de decisão de abate para efetivos B3 e B4 ... 41

Figura 5- Mapa da área em estudo ... 44

Figura 6- Número de animais por concelho entre 2004 e 2014... 46

Figura 7- Número de explorações por concelho entre 2004 e 2014... 46

Figura 8- Média de animais por exploração ... 47

Figura 9- Prevalências individuais de brucelose dos pequenos ruminantes na área em estudo, regional e nacional entre 2004 e 2014. ... 49

Figura 10- Prevalências em explorações de brucelose dos pequenos ruminantes na área em estudo Regionais e Nacionais, entre 2004 e 2014. ... 51

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 2- Prevalência individual de brucelose dos pequenos ruminantes na área em estudo entre 2004 e 2014 ... 50

LISTA DE ABREVIATURAS

AGID- Imunodifusão em Gel de Agar “Agar Gel Immunodiffusion” B.-Brucella

c-ELISA- Ensaio Imunoenzimático de competição “competitive enzyme-linked immunosorbent assay”

CMI-Imunidade Mediada por Células, “cell mediated imunity” CO2-Dióxido de Carbono

DGV- Direção Geral de Veterinária DIV-Divisão de Intervenção Veterinária DNA- Ácido Desoxirribonucléico

DSVRALG-Direção de Serviços Veterinários da Região do Algarve DSVR-Direção de Serviços Veterinários Regional

DSVRN-Direção de Serviços Veterinários da Região Norte

ELISA-Ensaio Imunoenzimático “enzyme-linked immunosorbent assay” EUA-Estados Unidos da América

EU-União Europeia

FC- Fixação do Complemento FPA-Polarização de Fluorescência IBM®- International Business Machines

i-ELISA- Ensaio Imunoenzimático indirecto “indirect enzyme-linked immunosorbent assay”

INRA- Institut National de la Recherche Agronomique LPS-lipossacáridos

OIE-Organização Internacional para a Saúde Animal “World Organisation for Animal Health”

OPP-Organização de Produtores Pecuários OPS-O-polissacárido

PCR-Reação em Cadeia da Polimerase, “polimerase chain reaction” PEBPR -Plano de Erradicação da Brucelose dos Pequenos Ruminantes

RID- Imunodifusão Radial “Radial Imunodiffusion”

SNIRA -Sistema Nacional de Informação e Registo Animal

1.1. INTRODUÇÃO

A brucelose é uma doença causada por bactérias do género Brucella, gram-negativas e intracelulares facultativas. Sendo uma zoonose, é um grave problema de Saúde Pública (Corbel, 2006).

A brucelose é uma doença de declaração obrigatória, fazendo parte do quadro nosológico anexo ao Decreto-Lei n.º 39209, de 13 de maio de 1953 (DGV, 2011).

A descoberta do agente causador da brucelose, "Micrococcus melitensis" (mais tarde denominada Brucella melitensis), deve-se aos britânicos Capitão David Bruce, à sua esposa Mary Elizabeth Steele e ao médico microbiologista maltês Giuseppe Caruana-Scicluna. Estes cientistas isolaram a bactéria a partir do fígado de soldados mortos na ilha mediterrânea de Malta em 1887. Após essa descoberta, o médico Maltês Fioravanti Temistocle Archimede Laurenzo Giuseppe Sammut, mais conhecido como "Temi Zammit", constatou que o agente causador da doença nos seres Humanos, era transmitido através de leite contaminado de cabras infetadas (Moreno, 2014).

A doença causada por bactérias do género Brucella tem como sinónimos: Febre de Malta, Febre Mediterrânea, Febre Cipriota, Febre Napolitana, Febre de Gibraltar, Febre da Crimeia, Febre de Cartagena, Febre de Rock, Febre de Barcelona, doença de Corps e Febre Ondulante (Moreno, 2014).

1.2. ETIOLOGIA

O género Brucella foi estabelecido em 1920 por Meyer & Shaw, com as espécies

Brucella melitensis, o agente da Febre de Malta e, Brucella abortus, responsável por abortos

em bovinos. Num espaço de 48 anos, quatro outras espécies de Brucella foram descritas:

Brucella suis, Brucella ovis, Brucella neotomae e Brucella canis. Após 40 anos, três outras

espécies adicionais foram descritas. Duas em mamíferos marinhos, Brucella pinnipedialis e

Brucella ceti e, outra, Brucella microti, isolada inicialmente em ratazanas comuns na

República Checa e, recentemente, também de raposas vermelhas na Baixa Áustria e diretamente do solo (Scholz et al., 2010).

Mais recentemente, foi descoberta uma nova espécie: Brucella inopinata, isolada de um implante mamário num humano com sinais clínicos de brucelose (Scholz et al., 2010).

Para além destas 10 espécies já identificadas, foram ainda isoladas novas estirpes tais como uma estirpe (BO2), isolada partir de uma biopsia pulmonar num Humano (Tiller et al., 2010b), uma estirpe isolada de babuínos (Schlabritz-Loutsevitch et al., 2009), estirpes isoladas de roedores selvagens na Austrália (Tiller et al., 2010a), estirpes isoladas de raposas na Áustria (Hofer et al., 2012) e estirpes isoladas a partir de sapos (Whatmore et al., 2015).

1.3. EPIDEMIOLOGIA

Para além do Homem (Corbel, 2006), o género Brucella também infeta as seguintes espécies: bovinos, ovinos, caprinos, suínos, cavalos, cães, gatos, coelhos, alces, búfalos, veados, corços, renas, lamas, javalis, cabras da montanha, raposas, doninhas, gazelas, lebres, ratos, hamsters, ursos, lobos, renas e um grande número de aves como perdizes, codornizes e espécies migratórias (Ocholi et al., 2004; Zarnke et al., 2006). Pode ainda infetar cetáceos (Guzmán-Verri et al., 2012) focas, leões-marinhos, morsas (Foster et al., 2007), dugongos e manatins (Godfroid et al., 2012).

Cada uma das espécies está adaptada ao seu hospedeiro mas não é exclusiva, podendo infetar outros animais (Corbel, 2006).

Os bovinos são o hospedeiro natural de B. abortus mas também são infetados por B.

melitensis e B. suis. Os canídeos e suínos, para além das suas espécies de Brucella

caraterísticas, podem também ser afetados por B. abortus e B. melitensis (Corbel, 2006). A transmissão entre animais ocorre, normalmente, por contacto direto e principalmente depois de um aborto de um animal infetado. Outros meios de transmissão são inalação, contacto através de feridas ou abrasões e ingestão de leite contaminado. A transmissão sexual não é um meio muito relevante em bovinos, mas deve ter-se em conta que a doença pode ser transmitida por inseminação artificial e, portanto, só devem ser usados para recolha de esperma em touros com estatuto sanitário conhecido. Nos pequenos ruminantes, a transmissão sexual adquire maior importância (Corbel, 2006).

Os carnívoros domésticos, bem como, os selvagens têm um papel importante na disseminação mecânica da doença, uma vez que podem transportar material infecioso como placentas e abortos (Cordero del Campillo, 1968; Samadi et al., 2010).

Os carnívoros selvagens são, por sua vez, excelentes animais sentinela (Nielsen e Duncan, 1990).

Os ungulados selvagens constituem um reservatório da doença para os animais domésticos, principalmente aqueles criados em regimes extensivos (Muñoz et al., 2010).

Alguns autores apontam a brucelose como uma das mais prováveis e viáveis armas de bioterrorismo (Kaufmann et al., 1997; G. Pappas et al., 2006).

1.4. POTENCIAL ZOONÓTICO

Os meios de transmissão ao ser humano são variados, destacando-se a ingestão de leite não pasteurizado e queijo fresco não curado, contacto direto com animais infetados através de feridas, cortes e secreções, manipulação dos produtos do parto. Os agricultores, médicos veterinários e magarefes são profissionais frequentemente expostos à doença. Finalmente, a brucelose pode ser contraída acidentalmente por trabalhadores de laboratório que manipulam culturas de Brucella ou amostras biológicas provenientes de animais contaminados (Maurin, 2005; Rodolakis, 2014). Em humanos, já foi reportada a transmissão entre humanos através de transplantes ou contacto sexual, mas é considerada insignificante (Corbel, 1997).

Os agentes bacterianos que causam brucelose nos humanos são, por ordem decrescente de importancia: Brucella melitensis, B. abortus, B. suis e B. canis (Roth et al., 2003).

A brucelose é uma doença multissistémica, que apresenta grande polimorfismo clínico, não sendo muitas vezes diagnosticada, pois mimetiza outras doenças multissistémicas. As suas principais manifestações clínicas são: febre, dor de cabeça, anorexia, fadiga, artrite, sinais de hepatoesplenomegália e sinais neurológicos. Isso pode progredir para uma situação subclínica, aguda, subaguda ou infeção crónica (Roth et al., 2003; Aypak et al., 2012).

A brucelose pode ter graves consequências para a saúde pública devido ao longo tratamento, recuperação lenta, e possíveis sequelas sérias no aparelho locomotor e sistema nervoso (Aypak et al., 2012).

A brucelose humana continua a ser a doença zoonótica mais comum em todo o mundo com mais de 500 000 novos casos por ano (Georgios Pappas et al., 2006).

Em Portugal, houve 296 casos de brucelose humana entre 2009 e 2012 (Direcção Geral da Saúde, 2014).

1.5. DISTRIBUIÇÃO

1.5.1. DISTRIBUIÇÃO MUNDIAL

A brucelose encontra-se presente nos cinco continentes (embora a sua presença seja mínima na Oceânia). Contudo, as informações sobre a distribuição da doença, que pertence à lista B de doenças da OIE (World Organisation for Animal Health),são bastante escassas em muitas partes do mundo, provavelmente, devido ao facto de muitos países com escassos recursos estarem a enfrentar outras doenças prioritárias, como a febre aftosa, a varíola ovina, a febre do vale do Rift, a peste dos pequenos ruminantes, em detrimento da brucelose (Benkirane, 2006).

1.5.1.1. DISTRIBUIÇÃO MUNDIAL DE

B.M

Entre 1996 e 2000, a doença foi relatada em vários países da África subsaariana tais como: Quénia e Somália (McDermott e Arimi, 2002).

Na Oceânia, os últimos focos de infeção por B. melitensis relatados foram em 1993 em Guam e, em 2000, na Polinésia Francesa. Outros países da Oceânia nunca relataram a infeção. No Sul da Ásia, a doença é endémica na Índia, Paquistão e Bangladesh. Alguns países do Sudeste da Ásia (Tailândia, Malásia e Mianmar) relataram a doença esporadicamente (Benkirane, 2006). Na Mongólia e países da estepe asiática, a infeção persiste de forma endémica (Moreno, 2014).

Na América do Norte, a infeção por B. melitensis provavelmente não existe, embora a doença tenha sido diagnosticada em áreas de fronteira dos Estados Unidos da América (EUA) com o México, no passado (Menzies, 2012).

Na União Europeia (UE), os seguintes Estados-Membros e regiões têm sido reconhecidos como oficialmente livres da infeção por B. Mellitensis: Bélgica, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Irlanda, Luxemburgo, Países Baixos, Suécia, Reino Unido, 17 departamentos da França e 2 províncias de Espanha. Vários esforços ocorrem na UE para erradicar a infeção por B. melitensis em cinco países, nomeadamente França, Espanha, Portugal, Itália e Grécia. À exceção de França, o objetivo está longe de ser alcançado nestes países. Além dos países da UE, a brucelose é prevalente na Albânia, Andorra, Arménia,

Azerbaijão, Bósnia e Herzegovina, na Sérvia e Montenegro (Taleski et al., 2002; Benkirane, 2006).

A doença é endémica em quase todos os países do norte de África e oeste da Ásia (Refai, 2002; Benkirane, 2006).

1.5.2. DISTRIBUIÇÃO EM PORTUGAL

Em Portugal, de acordo com os dados oficiais, a prevalência em rebanhos da brucelose em pequenos ruminantes diminuiu desde 2,29% em 2006 até 0,88% em 2014, enquanto a prevalência animal diminuiu desde 0,54% em 2006 até 0,226% em 2014 (Figura 1) (DGV, 2011, 2012, 2013a, 2014, 2015).

Trás-os-Montes e a região do Algarve apresentam elevadas prevalências de brucelose em pequenos ruminantes (Diéz, 2014), sendo que a prevalência nos rebanhos em 2006 era 16,99% e 3,91% e a prevalência animal 0,89% e 1,76% respetivamente. Em 2014, para as mesmas regiões, a prevalência nos rebanhos era 2,28% e 1,88% e a prevalência animal 0,421 e 0,124, respetivamente (DGV, 2011, 2015). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 Prevalencia em rebanhos Prevalencia animal

FIGURA 1PREVALÊNCIAS NACIONAIS DE BRUCELOSE DOS PEQUENOS RUMINANTES

FONTE, ADAPTADO DE:PISA.NET; RELATÓRIOS TÉCNICOS ANUAIS DE 2011,2012 E 2013 E

1.6. BRUCELOSE DOS PEQUENOS RUMINANTES

1.6.1. EPIDEMIOLOGIA

Na brucelose ovina e caprina, o agente etiológico é, normalmente, B. melitensis, mas, nos casos dos ovinos, pode também ser causada por B. ovis, ainda que em menor percentagem. São raros os casos de brucelose nos pequenos ruminantes causados por B.

abortus ou B. suis (Grilló et al., 1999).

Dos três biovares conhecidos de B. melitensis, o biovar 3 predomina quase exclusivamente nos países do Mediterrâneo e Médio Oriente, enquanto o biovar 1 parece predominar na América Latina. Os biovares 1 e 2 também têm sido relatados em alguns países do sul da Europa. No entanto, o reconhecimento preciso do biovar 3, especialmente a sua diferenciação do biovar 2, é, por vezes, difícil (Benkirane, 2006).

A transmissão entre animais ocorre quer horizontalmente quer verticalmente. A transmissão horizontal dá-se através do contacto com material biológico contaminado como placenta, líquidos fetais, corrimentos vaginais, o feto, o sangue, o leite, o sémen, a urina, as fezes e as secreções brônquicas (Vala e Esteves, 2000; Al-Majali, 2005; Maurin, 2005). O material biológico pode permanecer infetante durante cerca de 3 meses (Vala e Esteves, 2000).

A infeção ocorre por ingestão, mas a inalação, inoculação conjuntival, contaminação da pele, contaminação do úbere e contacto sexual também podem constituir vias de infeção (Corbel, 2006).

Embora tenha sido observada a sobrevivência de Brucella em ambientes abertos, a bactéria dificilmente se multiplica e, eventualmente morre. Da mesma forma, alguns vetores foram esporadicamente implicados na transmissão da brucelose, como, por exemplo, os insetos (Cordero del Campillo, 1968). No entanto, nenhum destes dois últimos eventos desempenham um papel importante na transmissão da brucelose e não apresentam importância epidemiológica (Moreno, 2014).

A transmissão entre rebanhos é facilitada pela existência de rebanhos comunitários, pela transumância, pela partilha de machos, a mistura de animais em mercados e feiras (Cordero del Campillo, 1968; Reviriego et al., 2000; Corbel, 2006).

A densidade animal elevada e a estabulação dos animais em espaços pequenos durante o Inverno também promovem a transmissão da doença (Corbel, 2006).

1.6.2. SUSCETIBILIDADE

Sabe-se que a brucelose é principalmente uma doença de animais sexualmente maduros, sendo estes, juntamente com os animais gestantes, mais suscetíveis à infeção do que animais sexualmente imaturos (Akhter et al., 2014).

As raças de ovinos nativas de Espanha e a raças derivadas da raça Merina são mais resistentes à infeção por Brucella ovis do que as outras raças europeias. Embora a resistência genética à doença possa ser importante, tem-se sugerido que a suscetibilidade possa também estar relacionada com a taxa de crescimento e precocidade sexual (Sergeant, 1994; Ficapal et al., 1998).

Nos borregos e cabritos, a maioria das infeções latentes por B. melitensis é adquirida a partir do colostro ou do leite. A ocorrência é rara, contudo é um grande entrave para os programas de erradicação da brucelose nestas espécies, já que os animais se mantêm serologicamente negativos até ao primeiro parto ou aborto (Grilló et al., 1999).

1.6.3. PATOGENIA

As espécies de Brucella são bactérias gram-negativas, facultativas, intracelulares, com marcado tropismo para o trato reprodutor gestante nas fêmeas e testículos no caso dos machos. Todas as espécies de Brucella estabelecem uma infeção persistente no sistema reticuloendotelial dos seus hospedeiros naturais. Os mecanismos da localização da placenta, tropismo trofoblástico e aborto são pouco compreendidos. Um quadro completo dos fatores e mecanismos do processo de inclusão celular começaram a surgir recentemente (Adams, 2002; Al-Majali, 2005; Poester et al., 2013).

Após um período de incubação variável, a brucelose caracteriza-se na sua fase aguda por uma septicemia de origem linfática durante a qual as bactérias colonizam o sistema reticuloendotelial. Esta fase manifesta-se por febre ondulante que corresponde a descarga bacteriana (Maurin, 2005).

No decorrer da infeção, podem distinguir-se quatro fases: 1) A penetração e migração local e regional; 2) disseminação septicémica; 3) fase secundária ou estado de adaptação e 4) fase de auto-cura, a doença latente ou persistência (Coelho et al., 2014).

Na primeira fase, os agentes bacterianos são transportados, livres ou no interior das células fagocíticas, para os nódulos linfáticos mais próximos do local de entrada, onde ocorre

a multiplicação. Nesta fase, inicia-se a infeção e a resposta imunitária, sendo a resposta serológica ausente ou muito fraca (Garin-Bastuji et al., 2006; Coelho et al., 2014).

Se o agente acantonar, provoca uma hiperplasia linfo-reticular, que se pode perpetuar durante semanas a meses. Se o agente não estiver acantonado nesta fase, é em primeiro lugar transportado por via linfática e de seguida por via hematógena (bacteriemia transitória), para quase todos os órgãos, incluindo o sistema de monócitos-macrófagos (fígado, baço, nódulos linfáticos e medula óssea) e órgãos reprodutores (útero grávido, testículos, vesículas seminais, glândulas mamárias, etc.), causando sucessivos episódios de septicemia coincidentes com períodos febris, que, nas fêmeas, está diretamente relacionado com a infeção placentária e fetal, causando muitas vezes aborto (Coelho et al., 2014; Kaltungo et al., 2014).

Nos animais grávidos, a invasão uteroplacentária e multiplicação é significativamente grande, considerando-se que este órgão não fornece a adequada resistência imunológica. A afinidade especial que B. melitensis tem com o endométrio grávido e a placenta fetal provoca a principal manifestação clínica da infeção em ovinos e caprinos: o aborto durante o último trimestre da gravidez ou o nascimento de fetos com baixa viabilidade (Coelho et al., 2014; Rodolakis, 2014).

Na terceira fase, a fase secundária ou fase de adaptação, a evolução da infeção é variável, dependendo da suscetibilidade do hospedeiro, sendo caracterizada pela presença em locais específicos de bactérias, que podem ser placenta, tecido mamário, testículos, articulações, etc., acompanhada por sintomatologia correspondente. Esta fase caracteriza-se pela eliminação de Brucella, ou, mais frequentemente, pela infeção persistente na glândula mamária, gânglios linfáticos supramamários e genitais com excreção constante ou intermitente de microrganismos nas secreções genitais e no leite (Coelho et al., 2014).

O controlo da brucelose é dificultado pelo período de incubação variável, pela inviabilidade de identificar animais que se irão tornar seropositivos e pela existência de infeções latentes (Nicoletti, 2010).

O principal mecanismo de defesa do hospedeiro contra Brucella é, tal como outras infeções intracelulares bacterianas, a imunidade mediada por células, envolvendo a cativação de macrófagos e a produção de linfócitos T citotóxicos, com a promoção da sua atividade bactericida através da libertação de citoquinas pelos linfócitos T helper (Cassataro et al., 2005; Coelho et al, 2014) .

Nos hospedeiros naturais, a infeção geralmente estabelece-se no trato reprodutor dos animais sexualmente maduros, sendo os sinais não específicos da brucelose, como o aborto (geralmente no último terço da gestação) ou parto prematuro e retenção placentária e placentite nas fêmeas, e orquite e epididimite nos machos (Coelho et al., 2014).

O agente pode ser encontrado nos tecidos e fluídos associados à gestação (principalmente no útero, que fica muitas vezes permanentemente infetado no caso das cabras), no úbere e nos linfonodos (supramamário, ilíaco interno e retro-faríngeo), resultando na excreção da bactéria em descargas genitais e no leite (que constitui a principal fonte de infeção par humanos) (Belal, 2015).

A produção de leite diminui devido à ocorrência de partos prematuros e infertilidade. Os problemas de fertilidade são, normalmente, temporários e as fêmeas abortam apenas uma vez ou podem nem abortar, no entanto a reinfeção do útero dá-se nas gestações seguintes. A artrite é uma complicação rara. A bacteriemia é intermitente e de curta duração (Corbel, 2006; Blasco, 2010; Coelho et al, 2014).

Nos pequenos ruminantes o período de infeção não é aparente, evoluindo para um período secundário com duas alternativas biológicas: infeção latente ou cura espontânea ou de auto-cura, que em ovinos e caprinos é comum até aos dois anos de idade, sendo este fenómeno discutível (Coelho et al., 2014).

1.6.4. QUADRO CLÍNICO E LESIONAL

1.6.4.1. QUADRO CLÍNICO

A brucelose é uma doença subaguda ou crónica que afeta várias espécies animais. Os sinais clínicos não são patognomónicos e o diagnóstico está dependente da demonstração da presença de Brucella spp. por isolamento da bactéria, deteção dos antigénios ou de material genético ou pela demonstração de resposta imunomediada celular ou por anticorpos específicos (Corbel, 2006).

Em caprinos e ovinos, a manifestação clínica mais frequente da infeção por B.

melitensis é o aborto (Borel et al., 2014), havendo também a diminuição da produção de leite

nas fêmeas e orquite nos machos. O sinal predominante de infeção aguda é a falha reprodutiva com o aborto e nascimento de crias com pouca viabilidade. Os abortos ocorrem principalmente durante os dois últimos meses de gestação (Xavier et al., 2009; Paolicchi et

al., 2013; Rodolakis, 2014). A artrite também pode ser um sinal raro da doença (Corbel, 2006).

Nos caprinos, aproximadamente dois terços das infeções naturais agudas que ocorrem durante a gravidez levam à infeção do úbere e excreção das bactérias na lactação seguinte. A infeção persistente do úbere é acompanhada por derramamento intermitente do agente no leite. A inflamação da glândula mamária reduz a produção de leite. No entanto, os sinais clínicos de mastite raramente são detetáveis em caprinos naturalmente infetados (Xavier et al., 2009; Paolicchi et al., 2013).

Alton et al. (1990) observaram que o aborto em cabras ocorre entre 3 e 4 semanas após a infeção experimental com elevadas doses de B. melitensis. No entanto, o aborto em ovelhas ocorre 4 a 12 semanas após a infeção experimental com o mesmo organismo, o qual é uma indicação de que as ovelhas são relativamente mais resistentes (Kaltungo et al., 2014).

Infeções por B. ovis ocorrem, na maioria das vezes, em regiões de criação de ovinos em todo o mundo (Xavier et al., 2009).

Brucella ovis causa epididimite principalmente em carneiros sexualmente maduros, e

ainda subfertilidade e infertilidade. Ocasionalmente, provoca aborto em ovelhas (Carvalho Júnior et al., 2012).

A fase aguda é caracterizada pela má qualidade do sémen e distensão do saco escrotal quer por exsudado hemorrágico ou exsudato fibrino-purulento. Os principais sinais clínicos são lesões palpáveis no epidídimo e túnicas. No entanto, as lesões costumam acontecer após a resolução da fase aguda e o período latente (Kaltungo et al., 2014).

Mais tarde, podem desenvolver lesões palpáveis no epidídimo e túnicas, que podem ser unilaterais ou, ocasionalmente, bilaterais. Em contrapartida, em alguns carneiros infetados não desenvolvem lesões palpáveis. Além disso, um número considerável de carneiros infetados pode excretar B. ovis no sémen por longos períodos, sem nenhum sinal clínico de infeção. Carneiros assintomáticos podem desenvolver apenas subfertilidade leve ou manter a fertilidade normal, aumentando assim o risco de propagação da infeção no rebanho. A transmissão pode ocorrer por contato direto entre carneiros mantidos nas mesmas instalações por períodos prolongados de tempo (Xavier et al., 2009).

Em ovelhas, B. ovis pode causar aborto associado a placentite que pode ter início aos 30 dias de gestação. As ovelhas infetadas podem parir cordeiros com baixa viabilidade com uma elevada taxa de mortalidade neonatal (Xavier et al., 2009).

1.6.4.2. LESÕES MACROSCÓPICAS E MICROSCÓPICAS

A brucelose é caracterizada por não apresentar lesões com caráter patognomónico (Coelho et al., 2014).

1.6.4.2.1.

LESÕES CAUSADAS POR

B.

Fetos abortados devido a B. melitensis geralmente apresentam um aspeto macroscópico normal. No entanto, pode existir broncopneumonia, fluido hemorrágico na cavidade torácica, gânglios linfáticos, fígado e baço aumentados (Corbel, 2006; Kaltungo et al., 2014).

São frequentemente encontradas nos animais adultos lesões inflamatórias granulomatosas em tecidos linfoides e órgãos como os órgãos reprodutivos, o úbere e linfonodos mamários. Também podem estar presentes nas articulações e membranas sinoviais. No entanto, estas lesões não são patognomónicas. Também pode haver uma mastite aguda com nódulos palpáveis e a produção de leite coagulado e aguado no úbere de animais infetados (Coelho et al., 2014; Kaltungo et al., 2014).

1.6.4.2.2.

LESÕES CAUSADAS POR

B

As lesões causadas por B. ovis são geralmente restritas ao epidídimo e glândulas sexuais acessórias. O alargamento do epidídimo pode ser unilateral ou bilateral sendo a cauda do epidídimo geralmente mais afetada. Geralmente, há uma atrofia fibrosa do testículo com espessamento da túnica vaginal, podendo tornar-se fibroso com aderências extensas. Sémen de carneiros infetados é geralmente de má qualidade, caracterizada pela diminuição da concentração de espermatozóides, e pela presença de células inflamatórias. Embora a placentite seja incomum, é ocasionalmente observada em ovelhas infetadas (Kaltungo et al., 2014).

Num estudo efetuado por Carvalho Júnior et al. (2011), sobre achados andrológicos, patológicos, morfométricos e ultrassonográficos em carneiros infetados experimentalmente com B. ovis, todos os animais possuíam neutrófilos e outras células inflamatórias no sémen, muitas vezes possuíam o agente no sémen. O processo inflamatório nas vesículas seminais

pode ser uma importante fonte de células inflamatórias no ejaculado (Carvalho Júnior et al., 2012).

As alterações patológicas observadas no epitélio seminífero são consistentes com um diagnóstico de degeneração testicular o que leva à diminuição da qualidade do esperma. Constatou-se ainda a presença de granulomas espermáticos (Carvalho Júnior et al., 2012).

1.7. DIAGNÓSTICO

As reações serológicas falso-positivas na brucelose animal estão amplamente documentadas nos países membros da UE virtualmente indemnes de brucelose animal e representam atualmente um dos principais problemas para as autoridades veterinárias (Godfroid and Käsbohrer, 2002).

Dada a inexistência de um teste com 100% de sensibilidade e de especificidade, está recomendada a realização de testes em série ou em paralelo (SANCO, 2009).

1.7.1. CULTURA BACTERIANA

O método mais confiável e o único método inequívoco para o diagnóstico de brucelose animal é o isolamento de Brucella spp. em cultura, por isso trata-se de um teste “Gold Standard” (Vicente et al., 2014). O diagnóstico bacteriológico de B. melitensis pode ser feito por meio do exame microscópico de esfregaços de secreções vaginais, ou placentas e fetos abortados (método de Stamp). No entanto, bactérias morfologicamente relacionadas, tais como Brucella ovis, Chlamydophila abortus ou Coxiella burnetii, podem causar diagnósticos errados. Assim, o isolamento de B. melitensis num meio de cultura apropriado é recomendado para um diagnóstico preciso. Contudo, este tipo de cultura apenas pode ser efetuado em laboratórios com nível de biossegurança 3. A excreção vaginal de B. melitensis é geralmente abundante e persiste por várias semanas após o aborto, como também persiste infeção do úbere. Assim, as secreções vaginais e amostras de leite são as melhores amostras para isolar B. melitensis de ovelhas e cabras. O baço e gânglios linfáticos (ilíaco, supramamários e précrural) são os melhores tecidos para a obtenção de amostras para isolamento durante o exame post mortem. B. melitensis não requer soro ou CO2 (dióxido de

carbono) para o seu crescimento e pode ser isolada a partir de um meio de rotina ordinário em condições aeróbias em 37ºC (Bricker, 2002; Garin-Bastuji et al., 2006).

No entanto, devido ao sobrecrescimento de microrganismos contaminantes geralmente presentes em amostras de campo, os meios seletivos são necessários para fins de isolamento. O meio seletivo de Farrell, desenvolvido para isolamento de B. abortus, é também recomendado para B. melitensis. No entanto, o ácido nalidíxico e bacitracina, nas concentrações utilizadas nesses meios, têm efeitos inibitórios em algumas estirpes de B.

melitensis e a taxa de isolamento aumenta significativamente quando se utiliza

simultaneamente o meio de Farrell e o meio modificado de Thayer-Martin. Embora a cultura seja um método específico, a sua sensibilidade depende da viabilidade da Brucella na amostra, o tipo de amostra e o número de estirpes testadas a partir do mesmo animal (Garin-Bastuji et al., 2006; Vicente et al., 2014).

1.7.2. MÉTODOS INDIRETOS DE DIAGNOSTICO LABORATORIAL

O método mais económico e eficiente para o diagnóstico da brucelose animal consiste no rastreio de todas as amostras utilizando testes de diagnóstico pouco dispendiosos, rápidos e com sensibilidade suficiente para detetar uma grande percentagem de animais infetados. As amostras positivas ao rastreio são depois testadas utilizando teses confirmatórios, mais sofisticados e específicos (Corbel, 2006).

Os testes de diagnóstico recomendados pela OIE, (2009) para pequenos ruminantes são o teste de Rosa de Bengala (RBT) e o teste de Fixação do Complemento (FC). O ensaio imunoenzimático (ELISA) e o ensaio com fluorescência polarizada (FPA) também podem ser utilizados como testes de rastreio. A análise do leite com a Prova do Anel, muito utilizado como teste de rastreio em bovinos, é ineficaz em pequenos ruminantes (OIE, 2009). Dada a inexistência de um teste com 100% de sensibilidade e de especificidade, está recomendada a realização de testes em série ou em paralelo (SANCO, 2009).

1.7.2.1. TESTE ROSA BENGALA (RBT)

Apesar da escassa informação disponível e às vezes contraditória, este teste é reconhecido internacionalmente como o de eleição para o rastreio de brucelose em pequenos ruminantes. Contudo, segundo Blasco et al. (1994) as condições adequadas para o diagnóstico em bovinos não são adequadas em ovinos e caprinos e é esperado que exista uma baixa sensibilidade dos antigénios do teste de RB em pequenos ruminantes juntamente com o

facto de uma proporção elevada de animais em áreas infetadas dar resultados negativos ao RBT, mas positiva no teste de FC, o que questiona a eficácia do RBT como um teste individual. A simples modificação de aumentar ligeiramente a quantidade de soro, da dose de teste de 25-30µL para a dose de 75-90 µL, no mesmo volume de antigénio (25-30 µL), aumenta significativamente a sensibilidade, sem afetar a especificidade (Garin-Bastuji et al., 2006).

1.7.2.2. TESTE DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO (FC)

A FC é o teste de confirmação mais utilizado. Apesar da sua complexidade e heterogeneidade das técnicas utilizadas nos diferentes países, há consenso que este teste é eficaz em pequenos ruminantes. No entanto, este carece de sensibilidade e não discrimina totalmente entre infeção e vacinação. Um estudo efetuado por Díaz-Aparicio et al. (1994) verificou que ao testar um número limitado de soros obtidos de culturas de Brucella

melitensis e de cabras livres de infeção, a FC fornece a mesma sensibilidade do que o RBT e

ELISA (Díaz-Aparicio et al., 1994).

Por outro lado, a FC tem muitas desvantagens, tais como a complexidade, variabilidade dos reagentes, fenómenos de pré zona, atividade anticomplementar dos soros, dificuldade para realizar com soro hemolisado e subjetividade para a interpretação de títulos baixos. Portanto, enquanto que a sensibilidade do RBT não modificado utilizado ao nível rebanho parece ser suficiente para a vigilância de áreas livres de doença, o RBT e a FC devem ser usados juntos em rebanhos infetados para obter uma sensibilidade individual mais elevada. No entanto, este procedimento pode levar a uma considerável falta de especificidade no caso de reações falso-positivas devido à reação cruzada com outros géneros de bactérias, um problema que também parece afetar ovinos e caprinos. Como referido anteriormente, a FC tem uma especificidade muito baixa ao testar soros de ovinos e caprinos vacinados por via subcutânea com Rev-1. No entanto, quando a vacina Rev-1 é administrada pela conjuntiva, o problema de interferências é significativamente reduzida em todos os testes serológicos, incluindo a FC (Garin-Bastuji et al., 2006).

1.7.2.3. TESTE DE POLARIZAÇÃO DE FLUORESCÊNCIA (FPA)

A base para o teste de polarização de fluorescência é simples. A taxa de rotação de uma molécula em solução é inversamente proporcional ao seu tamanho. Uma pequena molécula gira rapidamente, enquanto moléculas maiores giram mais devagar. Anexando uma molécula fluorescente a uma molécula de antigénio, a velocidade de rotação pode ser medida usando luz polarizada. O resultado é uma medida do tempo que leva para a molécula rodar através de um determinado ângulo. No caso da brucelose, uma subunidade de baixo peso molecular de OPS (O-polissacárido, extraído de B. abortus) é anexada com isotiocianato de fluoresceína e utilizado como o antigénio (Padilla Poester et al., 2010) .

O teste de polarização fluorescente é capaz de distinguir anticorpo vacinal na maioria dos animais vacinados e também pode eliminar algumas reações cruzadas (Padilla Poester et al., 2010).

Este teste, já considerado como um teste para o diagnóstico oficial da brucelose bovina pela OIE, está atualmente em fase de avaliação para o diagnóstico em ovinos e caprinos (Garin-Bastuji et al., 2006).

1.7.2.4. ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)

Foram obtidos em ovinos e caprinos bons resultados de diagnóstico com ELISA indireto (iELISA) ou, em menor escala, com ELISA de competição (cELISA) utilizando vários antigénios, mas, em geral, aqueles com um elevado teor de lipopolissacarídeos (LPS) lisos, são os mais fiáveis. Estes testes ELISA fornecem sensibilidades semelhantes ou maiores do que o RBT e a FC, mas mais elevado valor de especificidade. Contudo, tal como os testes serológicos clássicos, os testes ELISA são incapazes de diferenciar os animais infetados de animais vacinados recentemente ou animais infetados com bactérias com reação cruzada. Este problema impede atualmente o uso combinado dos programas de vacinação e rastreio e abate para a erradicação da brucelose (Jacques et al., 1998; Belal, 2015)

No entanto, a associação da vacinação por via conjuntival e a existência de um intervalo moderado após a vacinação minimiza ou anula os problemas de especificidade. Foi proposta uma técnica indireta semelhante para o diagnóstico de brucelose em ovinos em amostras de leite individuais ou agrupadas, mas o teste carece de sensibilidade quando comparado com testes sorológicos (Garin-Bastuji et al., 2006).

1.7.2.5.

No caso da vacinação recente com S19 (utilizada contra B. abortus), apenas a imunodifusão em gel (AGID) ou os testes de imunodifusão radial (RID), os testes com antigénio Hapteno nativo e o cELISA parecem ser úteis para o diagnóstico, permitindo a diferenciação de infeção por B. abortus da vacinação com S19. No entanto, apenas o teste de AGID com hapteno nativo foi capaz de discriminar, em um determinado momento depois de vacinação, as respostas imunitárias de ovinos infetados por B. melitensis de ovinos vacinados (Garin-Bastuji et al., 2006).

O teste de imunodifusão em gel de agar é utilizado em larga escala para o diagnóstico de B. ovis (Nielsen, 2002)

1.7.3. MÉTODOS DIRETOS DE DIAGNOSTICO LABORATORIAL

1.7.3.1. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

A PCR é útil para o rastreio em grandes populações de animais para identificação de indivíduos infetados e confirmação da presença do agente. Este teste é moroso, caro, e só pode ser utilizado quando o número de bactérias for razoavelmente elevado (mais de 105 células) (Qasem et al., 2015).

No entanto, é necessária uma atenção especial para evitar a contaminação, o método é muito confiável e, geralmente, altamente reprodutível em qualquer laboratório devidamente equipado (Bricker, 2002)

Não foram observados sinais de reatividade cruzada para amostras de DNA de espécies de bactérias que vivem naturalmente nos ovinos, à exceção das espécies de

Brucella, como Escherichia coli HB101, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Ochrobactrum anthropi, Pasteurella aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Serratia marcescens e Yersinia enterocolitica (Qasem et al., 2015).

Além disso, em comparação com os métodos de cultura de base, a PCR é mais seguro para os operadores envolvidos no diagnóstico. Estão em desenvolvimento kits de diagnóstico (Qasem et al., 2015).

1.7.3.2 DIAGNÓSTICO BASEADO EM IMUNIDADE MEDIADA POR CÉLULAS

(CMI)

Um teste de diagnóstico alternativo é o teste cutâneo da brucelina, que pode ser usada para o rastreio de rebanhos não vacinados, desde que seja utilizado um antigénio purificado (S-LPS livre) e padronizado. S-LPS não participa nas reações de hipersensibilidade do tipo retardado e pode provocar reações inflamatórias anticorpomediadas ou induzir anticorpos que vão interferir com a triagem serológica seguinte (Garin-Bastuji et al., 2006).

Existe uma preparação disponível comercialmente de brucelina INRA, preparada a partir de uma estirpe de B. melitensis (Garin-Bastuji et al., 2006).

O teste intradérmico de brucelina tem uma sensibilidade elevada e, na ausência de vacinação, é considerado um dos testes de diagnóstico mais específico. Este teste é particularmente valorizado para a interpretação de falsos positivos em testes serológicos devido a infeção com bactérias que provocam reação cruzada (os animais falsos positivos em testes serológicos são negativos no teste intradérmico), especialmente em áreas livres de brucelose (Garin-Bastuji et al., 2006).

Apesar de sua elevada sensibilidade, nem todos os animais infetados apresentam respostas positivas no teste intradérmico e, além disso, animais vacinados com Rev-1 podem reagir neste teste durante anos. Portanto, este teste não pode ser recomendado, quer como o único teste de diagnóstico quer para efeitos de comércio internacional. O método considerado mais eficiente e prático para ovinos e caprinos é a inoculação subcutânea na pálpebra inferior com leitura após 48 horas (Garin-Bastuji et al., 2006).

1.8. PREVENÇÃO E CONTROLO

1.8.1. PREVENÇÃO

É quase sempre mais económico e prático prevenir doenças do que tentar o seu controlo ou erradicação. Na brucelose, as medidas de prevenção incluem a seleção criteriosa de animais. Estes quer tenham sido comprados ou obtidos a partir do rebanho existente devem ser descendentes de animais livres de brucela. Os testes pré-compra são necessários, a não ser que os animais provenham de populações de áreas geográficas circunscritas que sejam livres da doença. Os animais comprados devem ser isolados por, pelo menos, 30 dias.

Adicionalmente, devem ser efetuados testes serológicos antes da colocação no rebanho (Corbel, 2006).

Deve-se evitar os contactos e mistura com rebanhos de estatuto desconhecido para a doença. Se possível, deve ser utilizada uma assistência técnica para diagnosticar a causa de abortos, partos prematuros e outros sinais clínicos. Animais suspeitos devem ser isolados até se chegar a um diagnóstico. Os rebanhos devem ser incluídos em planos de vigilância, tais como os da a testagem de animais abatidos com testes serológicos simples como o teste de Rosa Bengala (Corbel, 2006).

Deve efetuar-se a destruição adequada (enterro ou queima) de placentas e fetos não viáveis. E a desinfeção das áreas contaminadas deve ser feita cuidadosamente (Corbel, 2006). A cooperação com as autoridades de saúde pública para investigar os casos humanos deve ser feita, pois a brucelose animal, especialmente quando causada por B. melitensis, pode muitas vezes ser identificada a partir de investigações a partir de casos Humanos (Corbel, 2006).

1.8.2. CONTROLO

Controlo de uma zoonose é um termo geral que abrange todas as medidas destinadas a reduzir a incidência e prevalência da doença numa população animal para um nível definido como aceitável, para que o impacto da doença para a saúde humana e economia de uma região esteja num nível mínimo. No caso da brucelose, as medidas implementadas para o seu controle têm como metas, a prevenção da propagação da infeção, bem como, o acompanhamento dos rebanhos ou áreas livres de brucelose e da redução da taxa de infeção, aumentando a resistência dos animais (Minas, 2006).

Existem três métodos gerais para o controlo e erradicação da brucelose em animais: a implementação de medidas de higiene, a vacinação (descritas posteriormente) e o teste e abate dos animais seropositivos. Estas três medidas são mais eficazes quando combinadas (Nicoletti, 2010; Rodolakis, 2014).

O teste e abate dos animais seropositivos baseia-se na identificação de animais positivos através de testes serológicos, sendo o seu abate efetuado o mais rapidamente possível. Normalmente, é parte integral dos programas governamentais cujo objetivo é a erradicação da doença numa área ou país (Nicoletti, 2010).

Taleski et al. (2002) observaram que, numa região onde a brucelose é endémica, a implementação desta estratégia isoladamente não resulta na melhoria da situação durante muitos anos. Esta estratégia só é eficaz se a prevalência for menor que 2%; caso isto não se verifique, tem de ser complementada com vacinação dos animais (El Sherbini et al., 2005).

São poucos os países que conseguem suportar os custos elevados de um programa de “teste e abate”, pois o abate imediato dos animais seropositivos requer a cooperação dos proprietários dos animais (normalmente é necessário que haja indemnização financeira) (Corbel, 2006).

1.8.2.1. PROGRAMA DE VIGILÂNCIA

A vigilância é importante para determinar a prevalência e permitir, assim, o desenvolvimento de estratégias preventivas e medidas de controlo e eventual erradicação da brucelose nos animais. A brucelose é diagnosticada por testes serológicos e testes rápidos de rastreio (Islam et al., 2013).

1.8.2.2. A MELHORIA DAS PRÁTICAS NA GESTÃO DE ANIMAIS

A prática da mistura de animais, seja através de pastoreio ou partilha de pontos de água, é um fator de risco significativo para brucelose. Evitando a mistura de animais de substituição sem despistagem para a brucelose e promovendo o uso de unidades auto-suficientes em vez de instalações compartilhadas, poderia ajudar a controlar a brucelose. A utilização de maternidades para isolar animais durante e após o parto é fundamental, porque estes animais excretam em maior quantidade o agente. Isolamento de animais em pós-parto reduz a propagação da infeção para o resto do rebanho ou manada. No caso de aborto, o feto abortado deve ser devidamente eliminado sob medidas de biossegurança. Deve-se evitar enterrar os fetos infetados porque os cães e outros animais selvagens podem desenterrá-los e disseminar a doença. Qualquer entrada de acesso aos estábulos deveria possuir pedilúvios com desinfetante (Islam et al., 2013).

1.8.2.3. VACINAS

A brucelose é uma das poucas doenças bacterianas nas quais as vacinas vivas são eficientes (Moreno, 2014).

Uma vacina ideal tem duas características essenciais: a eficácia e a inofensividade. As vacinas devem ter as seguintes funções: evitar a infeção em ambos os sexos, evitar o aborto, uma só inoculação que previna a doença por um longo prazo, não deve contaminar o leite e carne e deve ser livre de reversão da virulência (Roushan et al., 2014).

A aplicação de um programa de "teste e abate" pode não ser realizada universalmente, visto que: (i) a prevalência da doença pode ser muito alta, (ii) as condições socioeconómicas dos países afetados podem não permitir a sua aplicação em termos de custo e (iii) a presença simultânea de ambas as circunstâncias acima mencionadas, o que é a situação mais vulgarmente encontrada em vários países. Assim, a aplicação de um programa de controlo baseado na vacinação, o que teria como objetivo reduzir a prevalência da doença para níveis aceitáveis, é essencial para controlar a brucelose dos pequenos ruminantes em muitos países. Uma vez que a doença tenha sido controlada, a erradicação, em seguida, pode ser exequível. É uma crença comum de que a erradicação e vacinação são incompatíveis e que os programas de erradicação têm que ser baseados, exclusivamente, em estratégias de teste e de abate. No entanto, a erradicação e vacinação são totalmente compatíveis e uma combinação de vacinação dos animais jovens de reposição e testes e abate dos adultos seropositivos é a estratégia mais prática e económica para erradicar B. melitensis em ovinos e caprinos (Blasco, 2006).

1.8.2.3.1.

A VACINA CLÁSSICA

B.

REV-1

Esta estirpe viva foi obtida pela atenuação de uma estirpe virulenta lisa de B.

melitensis na década de 1950. A imunização de animais jovens de reposição (3-6-meses de

idade) com esta vacina tem uma eficácia comprovada para o controlo da doença. Além disso, Rev-1 pode ser aplicada em animais adultos para acelerar o controlo da doença em regiões com elevada prevalência e poucos recursos técnicos e económicos. A elevada eficácia desta estirpe de vacina baseia-se na sua persistência em animais vacinados com a subsequente indução de uma resposta imunológica forte e durável, que pode interferir com os testes serológicos. Apesar da existência de métodos de vacinação e testes serológicos capazes de

ultrapassar este problema, a interferência no diagnóstico tem sido defendida como uma inconveniência, o que torna Rev-1 incompatível com a erradicação programas (Banai, 2002; Blasco, 2006; Meeusen et al., 2007).

Este argumento preconceituoso gerou uma forte corrente a favor do abandono das vacinas S clássicas (B. abortus S19 e B. melitensis Rev-1) ou, em alternativa, a sua substituição por outras vacinas rugosas (R) de nova geração aparentemente melhores, tal como B. abortus RB51, que não tem problemas de interferência, mas com eficácia questionável. Vacinação subcutânea com doses-padrão de Rev-1 produz uma infeção generalizada e persistente (2-3 meses) com a colonização ativa do baço e vários gânglios linfáticos, induzindo uma resposta serológica intensa e durável, que podem interferir nos testes de diagnóstico. Isso não deve ser relevante em situações epidemiológicas, onde a erradicação não é viável e o único objetivo é induzir o nível mais alto de imunidade no maior número de animais suscetíveis. O problema da interferência serológica só é importante, quando há a implementação de um programa combinado de vacinação e erradicação. No entanto, é possível utilizar testes de diagnóstico com uma especificidade razoável para discriminar as respostas serológicas devido à infeção daquelas devido à vacinação. Além disso, a vacinação conjuntival confere uma proteção adequada dos animais de substituição (3-6 meses de idade), minimizando as interferências serológicas (Blasco, 2006).

Visto que foi isolada de lesões testiculares de um veado e de um carneiro, a estirpe Rev-1 foi considerada perigosa para o sexo masculino. No entanto, estes são achados pouco frequentes e o padrão de infeção induzida após uma vacinação conjuntival ou subcutânea tanto em carneiros jovens como adultos é semelhante à induzida em ovelhas. A Rev-1 geralmente não coloniza os órgãos genitais e permanece restrita exclusivamente nos nódulos linfáticos e no baço. Assim, Rev-1 carece de efeitos secundários relevantes em carneiros, sendo a escolha não só para a profilaxia de B. melitensis mas também de B. ovis (Blasco, 2006). Por outro lado, ambas as doses padrão e reduzidas do Rev-1 induzem claramente abortos em ovinos e caprinos vacinados durante a gestação. No entanto, com o uso de doses padrão por via conjuntival e realizando a vacinação nos períodos de reprodução adequados, é possível minimizar ou praticamente eliminar o risco de abortos induzidos por REV-1, conferindo um nível adequado de proteção (Banai, 2002)

Rev-1 é resistente à estreptomicina (um dos antibióticos utilizados para o tratamento de brucelose) e existe um risco de infeção humana após a inoculação acidental (Meeusen et al., 2007). No entanto, se as devidas precauções forem tomadas, as infeções por Rev-1

provocadas pela ação humana, são um problema com pouca importância prática (Blasco, 2006).

Quando é usada em todo o rebanho em programas de vacinação bem conduzidos e repetidos no tempo, conduzem a uma grande diminuição na prevalência de brucelose na maioria das situações (Blasco, 2010) .

Esta vacina é a melhor disponível, mas não é isenta de inconvenientes (Blasco, 2006).

1.8.2.3.2.

AS VACINAS INATIVADAS

A vacina ideal para brucelose em ruminantes deve ter características relevantes, sendo a indução de imunidade sólida e durável a mais relevante. Esta habilidade especial nunca foi característica das vacinas inativadas clássicas (ou seja, a B. abortus 45/20 e B. melitensis 53H38) e é exclusiva de apenas boas vacinas vivas. Entre outros inconvenientes, esta é a principal razão que explica por que estas bacterinas clássicas foram abandonadas há muitos anos na profilaxia da brucelose de ruminantes. Apesar do aumento considerável do conhecimento dos epítopos relevantes envolvidos na imunidade protetora e o promissor desenvolvimento de adjuvantes de nova geração, nenhuma vacina inativada ou subcelular nova mostrou a mesma eficácia que a vacina viva Rev-1 (Blasco, 2006).

Apesar de não ser adequadamente considerada como uma vacina "inativada", a vacinação de DNA (utilizando DNA nu ou plasmídeos recombinantes, quer diretamente ou através de vetores virais ou bacterianos) é uma abordagem muito interessante e inovadora e que pode ser de interesse no desenvolvimento de uma nova geração de vacinas anti-brucelose num futuro próximo. No entanto, apesar do interesse potencial destas novas abordagens, não foram desenvolvidas vacinas à base de DNA para uso em pequenos ruminantes (Schurig et al., 2002; Blasco, 2006; Avila-Calderón et al., 2013).

1.8.2.3.3.

VACINAS VIVAS FUTURAS

A nova geração de vacinas vivas pode ser classificada dependendo do método de produção: por técnicas clássicas ou por engenharia genética. Entre as estirpes vivas rugosas de Brucella obtidas por métodos de atenuação clássicos, existe a vacina B. abortus RB51. Esta estirpe resistente à rifampicina tem sido relatada a ser tão eficaz como B. abortus S19 contra a brucelose em bovinos, sem a indução de anticorpos que interfiram nos testes

sorológicos. Em contrapartida, resultou em baixa eficácia em outros testes em bovinos e foi ineficaz contra a infeção por B. melitensis em ovinos ou caprinos (Schurig et al., 2002; Blasco, 2006).

1.8.2.3.4.

PROGRAMAS VACINAIS

O controlo da brucelose pode ser alcançado se a resistência da população à doença for aumentada através da vacinação. Aceita-se que a vacinação é mais aceitável e eficaz do que outros métodos aplicados para esta finalidade. Também as vacinas utilizadas praticamente eliminam os sinais clínicos de brucelose, de modo que a contaminação do meio ambiente e a exposição da população em risco pelo agente infecioso são reduzidas (Minas, 2006).

As campanhas iniciais de controlo da brucelose em pequenos ruminantes foram baseadas na vacinação de animais jovens de reposição com a vacina REV-1 administradas por via subcutânea. Esta abordagem foi baseada na hipótese de que a vacina REV-1 oferece imunidade ao longo da vida e que, depois da implementação do programa de vacinação de 5-7 anos (o tempo de vida produtiva média de ovinos e caprinos), toda a população estaria vacinada e totalmente protegida contra a brucelose. Esta estratégia de vacinação foi também recomendada, a fim de minimizar problemas de diagnóstico pós-vacinação e evitar abortos. Os resultados desta estratégia, em alguns casos, foram satisfatórios, mas, em muitos países, onde os animais eram mantidos em condições extensivas, o tipo de criação era nómada ou seminómade e onde a transumância era praticada, esta abordagem mostrou-se impraticável (Minas, 2006).

Esta estratégia também não conseguiu reduzir a incidência e prevalência da doença, porque o desenvolvimento da imunidade rebanho foi muito lento, e a cobertura de vacinação dos animais jovens não poderia atingir níveis elevados. Além disso, os animais adultos não vacinados permaneceram desprotegidos e suscetíveis, e a infeção manteve-se e disseminou-se. Devido a isto, caso a vacinação de animais jovens termine, a doença pode ser restabelecida num período muito curto de tempo (Minas, 2006).

Como uma alternativa para o controlo da brucelose, foi proposta a vacinação de todos os animais do rebanho: jovens e adultos. Esta estratégia foi aplicada com sucesso em muitos países sob diferentes condições socioeconómicas. Em geral, a imunização em massa é indicada onde a prevalência de animais infetados é elevada e a decisão para a sua implementação deve ser com base no conhecimento da taxa de infeção em animais. A

vacinação em massa ajuda a estabelecer um grupo relativamente imune no rebanho muito rapidamente, a redução de abortos e dos excretores de Brucella, que resulta na redução da contaminação do meio ambiente e da transmissão da infeção (Minas, 2006; Coelho et al., 2014).

A estratégia de vacinação do rebanho inteiro parece ser a única alternativa viável para o controlo da infeção por B. melitensis em áreas em que a doença é endémica e onde os animais são mantidos em condições de maneio extensivo, o que é muito comum em países de criação de ovinos. No entanto, a estratégia de vacinação em massa com REV-1 tem dois inconvenientes principais: (i) a vacinação dos animais grávidos com REV-1 administrada por via subcutânea tem como consequência o aborto induzido; (ii) a vacinação de animais adultos com doses padrão de REV-1 administrada por via subcutânea induz uma resposta serológica de longa duração, tornando-se difícil discriminar a resposta serológica quando estão implementados simultaneamente programas de erradicação de teste-e-abate (Minas, 2006).

Como a capacidade da estirpe REV-1 de induzir o aborto é um fenómeno que depende da dose e da fase da gravidez, a redução da dose aumenta o grau de segurança. Esta estratégia alternativa foi sugerida, mas verificou-se que a eficácia da vacinação é limitada, uma vez que o grau de proteção oferecido não é tão alto. Sob estas circunstâncias, a vacinação de animais adultos com uma dose reduzida da vacina REV-1 foi abandonada (Blasco, 2006; Minas, 2006; Rodolakis, 2014).

Com o objetivo geral de minimizar os efeitos adversos de vacinação com vacina REV-1, diferentes procedimentos para a sua administração têm sido estudados nas últimas décadas. Quando a vacina REV-1 é administrada em animais jovens por via conjuntival com a dose completa, a proteção que confere é semelhante à induzida pelo método subcutâneo clássico, mas a resposta serológica provocada é significativamente reduzida. Assim, esta via de administração é compatível com os programas de erradicação baseados em princípios de teste-e-abate (Minas, 2006).

No caso de ovelhas e cabras prenhes vacinadas por via conjuntival, resulta em menos abortos em comparação com a vacinação por via subcutânea. No entanto, uma proporção significativa de ovinos e caprinos vacinados por via conjuntival, abortam e a estirpe vacinal pode ser excretada após o aborto (Minas, 2006).

Sempre que a prevalência coletiva (percentagem de rebanhos infetados) numa unidade seja uniformemente muito baixa (sempre inferior a 1% de rebanhos infetados), uma estratégia baseada em um teste e programa de abate e proibição de vacinação pode ser

aplicado para erradicar a doença, a curto e médio prazo nessa unidade epidemiológica. No caso em que a prevalência é uniformemente moderada, um programa de erradicação combinada com base na aplicação simultânea de vacinas em animais de substituição (3-4 meses de idade) e um teste e abate de animais adultos poderá ser recomendado para erradicar a doença, a médio e longo prazo. No entanto, quando a doença é altamente prevalente (mais de 10% dos rebanhos estão infetados), apesar de a organização profissional e os recursos económicos serem totalmente adequados, a vacinação em massa (todo o rebanho) de todos os animais de todas as espécies animais envolvidos no ciclo epidemiológico é a única estratégia razoável que pode ser aplicada para controlar a doença (Banai, 2002; Minas et al., 2004; Blasco, 2010).

Para o sucesso da aplicação das duas últimas estratégias, a utilização de vacinas e procedimentos de vacinação adequados é de importância primordial (Blasco, 2010).

1.8.2.4. IMPLEMENTAÇÃO DE PROGRAMAS SANITÁRIOS

Um problema importante enfrentado pelas autoridades veterinárias em países afetados pela brucelose é selecionar a estratégia sanitária a ser aplicada contra a doença. Mesmo para a implementação da estratégia de controlo simples, os serviços veterinários envolvidos devem ter uma organização adequada para identificar todos os rebanhos presentes na área de intervenção e aplicar a vacina para toda a população em um intervalo de tempo muito curto. No caso onde a organização dos serviços veterinários é adequada, a estratégia a ser aplicada deve, então, ser decidida de acordo com os recursos económicos disponíveis, o grau do envolvimento dos agricultores, como a extensão e prevalência da doença (Blasco, 2010; Ali et al., 2015).

Os custos económicos de programas de erradicação são muitas vezes os elementos limitantes sendo necessário a análise prévia dos recursos financeiros para suportar o programa de erradicação. A experiência prática de muitos países que tiveram sucesso com a erradicação de B. melitensis também demonstra que compensações económicas devem ser fornecidas a agricultores afetados bem como devem existir campanhas de sensibilização para a doença (Blasco, 2010).

As espécies bacterianas e biovars envolvidos devem ser identificados com uma ativa pesquisa bacteriológica. A prevalência da doença deve ser determinada para as diferentes regiões do país pois a prevalência é raramente homogénea. Por conseguinte devem-se evitar