MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - UAECIA ESCOLA AGRÍCOLA DE JUNDIAÍ - EAJ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS
ANÁLISE DA BIOMASSA E EXTRATOS TANANTES DE Protium Heptaphyllum (Aubl.) March, UMA ESPÉCIE COM PROPRIEDADES MEDICINAIS
AGEU DA SILVA MONTEIRO FREIRE
Macaíba/RN Janeiro de 2020
ii AGEU DA SILVA MONTEIRO FREIRE
ANÁLISE DA BIOMASSA E EXTRATOS TANANTES DE Protium Heptaphyllum (Aubl.) March, UMA ESPÉCIE COM PROPRIEDADES MEDICINAIS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais (Área de Concentração em Ciências Florestais - Tecnologia e Utilização de Produtos Florestais).
Orientador: Profª. Dra. Renata Martins Braga
Coorientador: Profª. Dra. Tatiane Kelly Barbosa de Azevêdo
Macaíba/RN Janeiro de 2020
iii Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Rodolfo Helinski - Escola Agrícola de Jundiaí - EAJ
Freire, Ageu da Silva Monteiro.
Análise da biomassa e extratos tanantes de Protium Heptaphyllum (Aubl.) March, uma espécie com propriedades medicinais / Ageu da Silva Monteiro Freire. - 2020. 59f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais, Macaíba, RN. 2020.
Orientador: Dra. Renata Martins Braga.
Coorientador: Dra. Tatiane Kelly Barbosa de Azevêdo.
1. Burseraceae -Dissertação. 2. Taninos - Dissertação. 3. Farmacologia - Dissertação. 4. Espectroscopia - Dissertação. 5. Toxicidade - Dissertação. I. Braga, Renata Martins. II. Azevêdo, Tatiane Kelly Barbosa de. III. Título.
RN/UF/BSPRH CDU 620.95
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ANÁLISE DA BIOMASSA E EXTRATOS TANANTES DE Protium Heptaphyllum (Aubl.) March, UMA ESPÉCIE COM PROPRIEDADES MEDICINAIS
Ageu da Silva Monteiro Freire
Dissertação julgada para obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais (Área de Concentração em Ciências Florestais - Tecnologia e Utilização de Produtos Florestais) e aprovada pela banca examinadora em 23 de janeiro de 2020.
Macaíba/RN Janeiro de 2020
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Aos meus pais Antonio e Rejane e a todos que lutam por uma educação pública de qualidade.
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AGRADECIMENTOS
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Neste espaço em que redijo em primeira pessoa, com palavras tão especiais de gratidão, começo agradecendo a Deus pela saúde e todas conquistas alcançadas.
Aos meus Pais Antonio e Rejane, a quem dedico tudo em minha vida. Obrigado por me mostrarem que a educação é a principal ferramenta para se vencer na vida e que mesmo diante das dificuldades sempre me proporcionaram o melhor.
À minha irmã Adjane, especialmente por ter colocado nesse mundo minhas queridas sobrinhas Ana Clara, Helena e Isabele, que me presenteiam com sorrisos e alegrias. Amo muito vocês e desejo muitas conquistas nessa vida.
Às minhas avós Dalvanira e Maria, mulheres batalhadoras, que enfrentaram tantos obstáculos e hoje são orgulho e admiração na vida de tanta gente.
À toda minha grande família. Não cabe aqui dizer o nome de todos tios e tias e primos e primas, sempre ao meu lado, nos momentos bons ou ruins.
À minha orientadora Renata Braga, a quem admiro como pessoa e profissional. Muito obrigado pelos ensinamentos e paciência ao longo desse percurso.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, antes um sonho, hoje uma realidade. Levarei cada momento, desde a aprovação do vestibular até o fim desta etapa.
À Escola Agrícola de Jundiaí, onde conheci pessoas especiais e vivi muitos momentos bons. Ficará para sempre na lembrança esse lugar que foi a minha segunda casa.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte pela oportunidade de crescimento profissional.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de bolsa para a realização deste trabalho.
Aos professores e professoras que passaram em minha vida, da infância até os dias de hoje. Vocês são fundamentais na vida de muita gente.
Aos professores Fábio Vieira e Cristiane Fajardo e aos amigos que fiz Laboratório de Genética e Melhoramento Florestal. Obrigado pela convivência e companheirismo.
A professora Tatiane Azevêdo pelo apoio e incentivo na realização deste trabalho. Ao Laboratório de Tecnologia da Madeira, pelo apoio nos trabalhos, especialmente a João Paulo que me guiou nos trabalhos iniciais.
Ao Laboratório de isolamento e síntese de compostos orgânicos pelo apoio nos trabalhos, especialmente a professora Renata Mendonça pela solicitude e, Sarah dos Santos e Janine que foram excepcional na paciência e ensinamentos.
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Aos laboratórios de Nutrição Animal e Laboratório de Tecnologia Ambiental, por contribuir na realização deste trabalho.
Ao Professor Guilherme de Medeiros e Alexsandra, por me guiarem e apoiarem nos trabalhos de toxicidade.
À Kyvia Pontes, minha grande amiga, companheira de trabalhos, de aventuras e da vida. Você é um dos maiores exemplos de pessoa e profissional. Obrigado por tudo.
À Luciana Pinheiro e Fernanda Moura, por todo apoio e amizade imensurável. Vocês são inspiração na minha vida e de muitas outras pessoas.
Aos meus amigos de graduação, especialmente ao #PartiudeAnna, que sempre tornaram tudo mais leve. Obrigado a minha dupla Anna Luiza e, a Adriana, Márcia e Izadora, por serem essas pessoas divertidas e alegres. Vocês fazem parte dessa história.
À Amanda Brito, pela companhia desde a graduação, sempre com disposição para ajudar e conversar.
Aos meus amigos tão especiais, Talvanis e Yasmim. Obrigado pela confiança e por fortalecer a amizade ao longo desses anos, estando comigo em momentos tão importantes e compartilhando as mesmas situações, sempre com perseverança e união. Contem sempre comigo.
À Maila, por ser essa pessoa extrovertida e sempre de bem com a vida. Siga a vida sempre assim, com essa felicidade radiante, alegrando a todos.
À Fabiana, pessoa especial e esforçada. Obrigado pela amizade e tenha certeza que você brilhará aonde chegar.
À minha turma do mestrado. Levarei momentos com cada um, especialmente Sarah, Jackson e Leoclécio que compartilharam comigo muitas conversas e palavras de motivação.
Aos meus amigos do IFRN, Antônio, Ana Paula, Adna e Monara por essa amizade tão inesperada e maravilhosa.
À Jennifer Guimarães, Jennifer Valeska e Daíse pelo incentivo e amizade. Que nunca percamos a essência da vida da nossa época de adolescentes.
Ao meu grande amigo Alexandre Sena, por ser essa pessoa especial e que tanto admiro. Obrigado pelas motivações e atenção.
A quem luta por uma sociedade justa e igualitária, defendendo uma educação pública de qualidade e acessível a todos e, a todos que passaram pela minha vida e contribuíram de alguma forma para eu chegar até aqui.
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“Não é possível refazer este país, democratizá-lo, humanizá-lo, torná-lo sério, com adolescentes brincando de matar gente, ofendendo a vida, destruindo o sonho, inviabilizando
o amor.
Se a educação sozinha não transforma a sociedade sem ela tampouco a sociedade muda. Se a nossa opção é progressista, se estamos a favor da vida e não da morte, da equidade e não da injustiça, do direito e não do arbítrio, da convivência com o diferente e não de sua negação,
não temos outro caminho senão viver plenamente a nossa opção.
Encarná-la, diminuindo assim a distância entre o que dizemos e o que fazemos. Desrespeitando os fracos, enganando os incautos, ofendendo a vida, explorando os outros, discriminando o índio, o negro, a mulher não estarei ajudando meus filhos a ser sérios, justos
e amorosos da vida e dos outros."
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RESUMO GERAL
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ANÁLISE DA BIOMASSA E EXTRATOS TANANTES DE Protium Heptaphyllum (Aubl.) March, UMA ESPÉCIE COM PROPRIEDADES MEDICINAIS
Protium heptaphyllum é uma espécie arbórea de potencial farmacológico, devido suas propriedades medicinais com compostos de interesse para indústria farmacêutica, sendo relevantes os estudos sobre seus compostos. Este trabalho tem como objetivo a caracterização da casca, da folha e do fruto com sementes da espécie, bem como a obtenção de extratos tanantes, quantificação de taninos e avaliação da composição química, para aplicação em fins farmacológicos. A composição da biomassa das três estruturas foi realizada pelo teor de umidade, teor de cinzas, teor de voláteis e carbono fixo, como também, quantidade de proteína bruta, hemicelulose, lignina e celulose. Para cada estrutura foi quantificado o teor de taninos condensados pelo método de Stiasny, sendo observado também a quantidade de extratos tanantes e a de compostos que não são taninos. A análise termogravimétrica foi realizada para avaliar os comportamentos térmicos e faixa de degradação e, a espectroscopia de infravermelho avaliou quimicamente os grupos funcionais presentes nas macromoléculas. Um teste de toxicidade foi realizado em microcrustáceos Mysidopsis juniae para observar se os extratos tanantes das três estruturas possuem atividade tóxica. A casca, a folha e o fruto de P. heptaphyllum apresentaram diferentes características em sua composição e as mesmas possuem relação com a produção de extrativos na espécie. A quantidade de extratos tanantes, taninos condensados e de não taninos foi, respectivamente, 32,20%, 13,27%, 18,93% no fruto, 15,53%, 9,40% e 6,13% na folha e 8,20%,5,10% e 3,10% na casca. O índice de Stiasny indicou valores de 60,42% na casca, 63,62% na folha e 41,63% no fruto. As três estruturas apresentaram quantidades de taninos próximas ou superiores a de outras espécies com propriedades medicinais, tais como algumas descritas na Farmacopeia Brasileira. A biomassa e os extratos tanantes das três estruturas apresentaram grupos funcionais hidroxila, ligação C-H e ligação C=O, similares aos identificados em espectros da resina da espécie. Os extratos tanantes das três estruturas apresentaram toxicidade em todas as concentrações, com exceção da casca na menor concentração, mostrando que não deve existir o uso indiscriminado deles e, esse efeito também é de interesse para estudos farmacológicos, contribuindo para agregar valor a mais um subproduto da espécie.
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GENERALABSTRACT
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BIOMASS AND TANNIC EXTRACTS ANALYSIS OF Protium Heptaphyllum (Aubl.) March, A SPECIES WITH MEDICAL PROPERTIES
Protium heptaphyllum is a tree species with pharmacological potential, due to its medicinal properties with compounds of interest to the pharmaceutical industry, and studies on its compounds are relevant. This work aims to characterize the bark, leaf and fruit with seeds of the species, as well as obtaining tannic extracts, quantifying tannins and evaluating the chemical composition, for application in pharmacological purposes. The biomass composition of the three structures was carried out by moisture content, ash content, volatile and fixed carbon content, as well as the amount of crude protein, hemicellulose, lignin and cellulose. For each structure, the content of condensed tannins was quantified by the Stiasny method, also observing the amount of tannic extracts and that of compounds that are not tannins. Thermogravimetric analysis was performed to evaluate thermal behavior and degradation range, and infrared spectroscopy chemically evaluated the functional groups present in macromolecules. A toxicity test was carried out on microcrustaceans Mysidopsis juniae to see if the tannic extracts of the three structures have toxic activity. The bark, leaf and fruit of P. heptaphyllum showed different characteristics in their composition and they are related to the production of extracts in the species. The amount of tanning extracts, condensed tannins and non-tannins was 32.20%, 13.27%, 18.93%, respectively, in the fruit, 15.53%, 9.40% and 6.13% in the leaf and 8.20%, 5.10% and 3.10% in the bark. The Stiasny index indicated values of 60.42% on the bark, 63.62% on the leaf and 41.63% on the fruit. The three structures showed amounts of tannins close to or greater than those of other species with medicinal properties, such as some described in the Brazilian Pharmacopoeia. The biomass and tannic extracts of the three structures showed hydroxyl functional groups, C-H bond and C = O bond, similar to those identified in spectra of the species resin. The tannic extracts of the three structures showed toxicity in all concentrations, with the exception of the bark in the lowest concentration, showing that there should be no indiscriminate use of them, and this effect is also of interest for pharmacological studies, contributing to add value to yet another by-product of the species.
xi SUMÁRIO __________________________________________________________________________ Página 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ... 3
2.1. Produtos florestais não madeireiros ... 3
2.2. Extratos tanantes e Taninos vegetais ... 5
2.3. Potencial farmacológico dos taninos ... 7
2.4. Bioma Mata Atlântica ... 9
2.5. Protium heptaphyllum (Aubl.) March... 10
2.6. Potencial farmacológico de Protium heptaphyllum (Aubl.) March. ... 12
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 15
3.1. Coleta e beneficiamento dos materiais vegetais ... 15
3.2. Caracterização da biomassa ... 16
3.3. Análise composicional da biomassa ... 18
3.4. Remoção de extratos tanantes e quantificação de taninos ... 20
3.5. Análise termogravimétrica de biomassa e extratos tanantes. ... 22
3.6. Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) de biomassa e extratos tanantes. ... 22
3.7. Fracionamento cromatográfico do extrato tanante do fruto ... 23
3.8. Teste de toxidade frente a Mysidopsis juniae. ... 24
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 25
4.1. Caracterização da biomassa ... 25
4.2. Análise composicional da biomassa ... 26
4.3. Quantidade de taninos e sólidos totais ... 28
4.4. Análise termogravimétrica da biomassa e extratos tanantes ... 31
4.5. Espectros de infravermelho da biomassa e extratos tanantes. ... 34
4.6. Espectros de infravermelho da subfração do extrato tanante do fruto... 37
3.7. Toxicidade frente a Mysidopsis juniae... 38
4. CONCLUSÕES ... 40
xii
LISTA DE FIGURAS
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Figura 1. Estrutura de tanino condensado hipotético ... 06 Figura 2. Protium heptaphyllum em fragmento de Mata Atlântica (A); Botões florais (B), flores
(C) e frutos da espécie (D). ... 11
Figura 3. Localização geográfica e imagem aérea do fragmento de Mata Atlântica ... 15 Figura 4. Demonstração em fluxograma da coleta e beneficiamento dos materiais vegetais de
Protium heptaphyllum ... 16
Figura 5. Demonstração em fluxograma do processo de remoção dos extratos tanantes de
Protium heptaphyllum. ... 20
Figura 6. Demonstração dos sólidos totais, taninos condensados e não taninos na planta. .... 22 Figura 7. Demonstração em fluxograma do processo de fracionamento do extrato tanante do
de fruto de Protium heptaphyllum. ... 23
Figura 8. Teste de toxicidade dos extratos tanantes da casca, folha e fruto de Protium
heptaphyllum. ... 24
Figura 9. Análise termogravimétrica da biomassa da casca (A), folha (C) e fruto (E) e extrato
tanante da casca (B), folha (D) e fruto (F) de Protium heptaphyllum. ... 32
Figura 10. Espectros de FTIR da biomassa e extratos tanantes de Protium heptaphyllum... 35 Figura 11. Espectros de FTIR da resina natural (A) e resina purificada (B) de Protium
heptaphyllum ... 37
Figura 12. Espectros de FTIR da subfração do extrato tanante do fruto de Protium
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LISTA DE TABELAS
__________________________________________________________________________
Tabela 1. Teor de umidade in natura e Teor de umidade, cinzas, voláteis e carbono fixo da
biomassa da casca, folha e fruto de Protium heptaphyllum ... 25
Tabela 2. Matéria seca, proteína bruta, hemicelulose, celulose e lignina da casca, folha e fruto
de Protium heptaphyllum ... 27
Tabela 3. Teor de sólidos totais, índice de Stiasny, teor de taninos condensados e teor de não
taninos da casca, folha e fruto de Protium heptaphyllum ... 28
Tabela 4. Perda de massa (%) da biomassa e extratos tanantes da casca, folha e fruto de Protium
heptaphyllum em função das faixas de temperaturas. ... 33
Tabela 5. Frequências espectrais vibracionais e grupos funcionais da biomassa e extratos
tanantes de Protium heptaphyllum. ... 35
Tabela 6. Média de microcrustáceos Mysidopsis juniae mortos em diferentes concentrações de
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
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ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária CCD – Cromatografia em Camada Delgada
FAO - Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação FDA - fibra em detergente ácido
FDN - fibra em detergente neutro
FTIR - Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier PFNM - Produtos florestais não madeireiros
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1. INTRODUÇÃOGERAL
__________________________________________________________________________ Protium heptaphyllum (AUBL.) March é uma espécie pertencente à família Burseraceae, conhecida popularmente dentre tantos nomes por breu, amescla e almecegueira. A espécie é nativa e não endêmica do Brasil, estando presente nos domínios fitogeográficos Amazônia, Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica, com ampla distribuição no país (DALY, 2015). Além disso, a planta tem utilidades na medicina popular, como analgésico, cicatrizante e expectorante, também sendo usada na indústria de verniz, na calafetagem de embarcações e como incenso em rituais religiosos (MAIA et al., 2000).
Na literatura, a maioria dos estudos com a espécie são relacionados à composição química e ao seu potencial uso farmacêutico, como o óleo essencial das folhas, que contém substâncias com propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas, inseticidas e algumas que são utilizadas na perfumaria, como o limoneno, trans-β-ocimeno, eucaliptol e P-cimeno (CITÓ et al., 2006; MOBIN et al., 2016). Os resultados de pesquisas com a resina obtida do caule, mostram atuação da espécie como promotora de cicatrização com propriedades anti-inflamatórias e analgésicas e diversos estudos relatam que a substância alfa, beta-amirina encontrada na resina da planta é útil na redução da obesidade (CARVALHO et al., 2017; CARVALHO et al., 2015; SANTOS et al., 2012).
Apesar da sua comprovada ação terapêutica, não há estudos na literatura relacionados à quantificação de taninos da espécie P. heptaphyllum. Os extratos tanantes são provenientes de plantas, possuindo em sua composição taninos e outros compostos. Os taninos são substâncias que têm a característica de se associar com proteínas e certos polióis, sendo classificados conforme a estrutura química como hidrolisáveis e condensados (PIZZI, 1993). Além disso, eles estão presentes na maioria dos vegetais, onde a concentração varia conforme idade, parte da planta, período e local de coleta (SARTORI et al., 2014).
Plantas com altos teores de taninos possuem, geralmente, atividade terapêutica e podem ser empregadas na medicina tradicional para o tratamento de várias doenças (DIAS et al., 2011). Entretanto, apesar de serem encontradas grandes quantidades de substâncias tânicas em plantas com utilidades terapêuticas, ainda são escassos os estudos que avaliem o isolamento e o potencial medicinal destes compostos (MONTEIRO et al., 2005).
Diante disto, é importante ter maior conhecimento das propriedades químicas das espécies em ambientes naturais, de recursos florestais não madeireiros com potencial para indústria, como os taninos, que podem ser extraídos de espécies florestais. No entanto, poucos
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estudos apresentam resultados significativos sobre características técnicas de produção e rendimento em espécies nativas (MEUNIER e FERREIRA, 2015). Também, P. heptaphyllum está situado em diversos ambientes naturais, podendo contribuir para desenvolvimento sustentável no local com retorno socioeconômico positivo.
Assim, frente ao potencial farmacológico de P. heptaphyllum, como também as propriedades farmacológicas e medicinais dos taninos, este trabalho tem como objetivo a caracterização da casca, folha e fruto da espécie, bem como a obtenção de extratos tanantes, quantificação de taninos e avaliação da composição química, para aplicação em fins farmacológicos.
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2. REVISÃODELITERATURA
__________________________________________________________________________ 2.1. Produtos florestais não madeireiros
O conceito de produtos florestais não madeireiros (PFNM) está atrelado ao seu nome, indicando que são todos produtos oriundos da floresta que não sejam madeira, como folhas, frutos, flores, sementes e resinas (MACHADO, 2008; WONG et al., 2001), sendo recursos disponíveis na natureza, mas com limitações quando comparados aos produtos agrícolas (VANTOMME, 2001). Os PFNM de origem vegetal são divididos em dois grandes grupos, os que para sua exploração não precisam da supressão dos indivíduos produtivos e os que precisam da supressão, sendo conhecidos também como grupos de coleta não destrutiva e destrutiva, respectivamente (MACHADO, 2008).
Conforme a FAO (Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação), aproximadamente 80% das pessoas de países em desenvolvimento utilizam os PFNM para complementar suas rendas e suprir suas necessidades nutricionais (FAO, 1995). Além de possuir outras utilidades, como produção de medicamentos, usos em cosméticos, construção de moradias e tecnologias tradicionais (MACHADO, 2008). Nos países em desenvolvimento, a demanda por esses produtos tem aumentado, onde eles possuem na maioria das vezes importância cultural, relacionando-se com remédios e estilos de vida alternativos, despertando o interesse em alimentos, fibras, plantas medicinais e ingredientes botânicos de produtos cosméticos (SHANLEY et al., 2005).
A característica sustentável dos PFNM é maior quando comparada aos produtos madeireiros, pois na exploração não há retirada total do indivíduo, ocasionando na manutenção da estrutura florestal na área manejada. Atualmente, é uma alternativa para diminuir os impactos ambientais, principalmente com as preocupações relacionadas ao aquecimento global e o desmatamento das florestas (FIEDLER et al., 2010). Além disso, deve-se procurar técnicas silviculturais e de manejo que sejam eficientes para reduzir impactos negativos nas espécies, sempre relacionando os PFNM com o histórico das plantas e os efeitos da sua exploração (CAMACHO, 2008). No país, é vantajosa a utilização dos PFNM, ocasionando um desenvolvimento regional atrelado à conservação dos recursos florestais, onde a maior parte da extração desses produtos é feita em plantios de pequena escala por famílias que vendem em comércios locais (BALZON, 2005; ELIAS e SANTOS, 2016; SANTOS et al., 2014).
Em 2016 no Brasil, os PFNM geraram um valor de exportação equivalente a US$ 341.995.464, onde a castanha do caju foi o que obteve maior valor de exportação e a Erva-mate
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o que teve a maior quantidade; também, os extratos tanantes tiveram um valor de US$ 31.278 e os taninos de US$1.653.593 (BRASIL, 2018). A extração de recursos florestais no Brasil, ainda se dá na maior parte por famílias que se situam próximas a reservas extrativistas, em que na maioria das vezes, passam por dificuldades de manter as atividades com os PFNM, levando-as levando-as atividades predatórilevando-as, que podem oclevando-asionar desflorestamentos (MACIEL et al., 2010). A maior estratégia de venda dos produtos está em cooperativas e associações comunitárias, fornecendo uma alternativa para a geração de renda, principalmente com os recursos em áreas de reserva legal (BENTES-GAMA, 2005).
Um dos usos mais comuns de PFNM no Brasil é na medicina popular, o qual as pessoas os utilizam ao invés de fármacos sintéticos (SOARES et al., 2008). Na Mata Atlântica, já se conhece muitas espécies nativas com o uso medicinal e potencial farmacológico, pois a ANVISA as regulamentam como drogas vegetais para uso, acarretando em um maior consumo pela população e na necessidade de mais pesquisas (MING et al., 2012). Ademais, apesar do bioma ter uma escassez de estudos sobre esses produtos e ter sofrido forte degradação, restando apenas poucos resquícios da grande diversidade original, os PFNM no bioma Mata Atlântica são importantes para a conservação da biodiversidade, desenvolvimento rural e geração de renda (FARIAS, 2009).
A legislação vem se mostrando incentivadora na exploração PFNM, mostrando que, de forma sustentável, arrenda o aumento da economia sem comprometer o meio ambiente. Como pode ser visto na Lei 11.284 de 2006 (BRASIL, 2006), que explica que o manejo florestal sustentável é de grande importância na gestão das florestas para a obtenção de benefícios econômicos, sendo por meio dele realizadas as atividades extrativistas dos produtos e subprodutos não madeireiros. Além do mais, toda comercialização de matéria-prima florestal nativa depende de autorização de órgão competente, sendo proibida a exploração de espécies nativas ameaçadas de extinção (BRASIL, 2008).
A Lei 11.428 de 2006 (BRASIL, 2006), mostra que a exploração sustentável tende a garantir a permanência dos recursos ambientais renováveis e dos processos ecológicos, sempre de forma socialmente justa e economicamente viável, demonstrando o ponto de partida para a exploração dos PFNM, tanto para as comunidade e famílias, como para empresas. Na Mata Atlântica, por exemplo, pode ocorrer livremente a coleta de subprodutos florestais, tais como frutos, folhas ou sementes, porém, sem colocar em risco as espécies da fauna e flora e sempre em apoio às leis referentes ao patrimônio genético, à proteção ao conhecimento tradicional associado e de biossegurança (BRASIL, 2006).
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2.2. Extratos tanantes e taninos vegetais
Os extratos tanantes são provenientes de vegetais que possuem além do tanino outras substâncias, em que o uso é decorrente da atuação dos taninos, que é o composto que age nas diversas finalidades dos extratos. O termo "taninos" significa carvalho e foi usado pela primeira vez em 1976 em curtumes (KY et al., 2016), sendo que a técnica no curtimento de peles tem sido usada há séculos. O curtimento consiste na ligação dos taninos em moléculas de colágeno da pele de animais, ocasionando no aumento da resistência ao calor, a água e aos microrganismos (TAIZ e ZEIGER, 2009). Os métodos de extração de taninos são relativamente recentes, iniciando no século XIX com a necessidade de corantes negros para roupas de seda e depois outras aplicabilidades foram buscadas devido à queda de vendas de taninos para o curtimento de couro nas décadas de 60 e 70 (PIZZI, 2008). Ademais, é relatado que os taninos podem ser benéficos como também prejudiciais, possuindo atividades hepatotóxica, antinutritional, carcinogênica, antimutagênica, anticarcinogênica, antimicrobiana e de imunomodulação (CHUNG et al., 1998).
Os taninos vegetais são compostos polifenólicos naturais extraídos de diferentes tecidos vegetais (BERTOLDI et al., 2014), sendo eles os metabólitos secundários mais abundantes produzidos pelas plantas (BARBEHENN e CONSTABEL, 2011), repelindo outros organismos devido a sua adstringência (RAVEN et al., 2007), atuando consideravelmente na defesa delas (NABORS, 2012). Os polifenóis são metabólitos secundários encontrados nas plantas, que podem ter propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, ajudando a proteger contra doenças crônicas, como câncer e doenças cardiometabólicas (BARRETT et al., 2018).
Conforme a composição química, os taninos são classificados em condensados e hidrolisáveis, os primeiros consistiam em 90% da produção mundial de taninos comerciais na década de 80 (HERGET, 1989). Os taninos hidrolisáveis consistem em poliésteres da glicose e são classificados conforme o ácido formado de sua hidrólise e os condensados são formados por monômeros do tipo catequina, sendo conhecidos por flavonóides (PIZZI, 1980). A Figura 1 mostra o tanino com quatro unidades poliméricas, apresentando as unidades de extensão catequina, epicatequina e epigalocatequina (SILVA, 2013).
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Figura 1 - Estrutura de tanino condensado hipotético (Fonte: (SILVA, 2013))
Os taninos condensados estão associados à dinâmica da decomposição, na qual seus efeitos negativos em raízes finas podem ter grandes impactos nos processos biológicos do solo (DIXON et al., 2013) e também possuem toxidade para insetos, defendendo a planta contra seus ataques (BARBEHENN e CONSTABEL, 2011). Na natureza, a quantidade de taninos nas plantas varia conforme suas fenofases, havendo diminuição dessa quantidade quando as plantas investem em flores e frutos (AZEVÊDO et al., 2017). Também, as diferentes partes das plantas possuem quantidades diferentes de taninos, pois uma parte pode ser viável para a extração e comercialização e outras não (AZEVÊDO et al., 2017; PAES et al., 2010). Estudos com espécies do Semiárido Nordestino já demonstram o potencial e a viabilidade de taninos para o curtimento de pele, como também outros usos, demonstrando que são necessárias mais pesquisas na área (PAES et al., 2006)
Na indústria alimentar, os taninos são principalmente utilizados como aromatizantes e ingredientes alimentares, enquanto na vinificação são classificados como agentes de clarificação para estabilização de proteínas do vinho (BERTOLDI et al., 2014). Além disso, eles também têm utilização na fabricação de espumas para horticultura e hidroponia, mostrando-se com desempenhos comparáveis ou superiores a espumas fenólicas sintéticas. Meikleham e Pizzi, (1994) encontraram vantagens em espumas provenientes de taninos, uma
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vez que elas podem ser usadas na maioria das aplicações nas quais espumas à base de fenol são utilizadas (TONDI e PIZZI, 2009; TONDI, et al., 2009).
Entre outras aplicabilidades, os taninos podem ser usados como bioadesivos para cirurgias, de baixo custo com grande atividade antimicrobiana (GUO et al., 2018), e também podem ser utilizados na confecção de filmes bio-híbridos, com capacidade antioxidante e de proteção UV (LI et al., 2019). Ainda, por serem naturais, os taninos podem ser utilizados como agentes anti-incrustantes em ambientes marinhos e, por não ter metais em sua composição, podem eliminar a liberação de metais e outros biocidas tóxicos (PERES et al., 2015). Pesquisas mostram que os taninos também têm atuação na remoção de metais como o cobre e ferro (SARQUÍS et al., 2014), mostrando ser uma fonte de novos adsorventes, com capacidade semelhante ou superior ao carvão ativado e outros materiais adsorventes (SÁNCHEZ-MARTÍN et al., 2011).
Os resíduos florestais também possuem quantidades de taninos que podem ser bastante utilizados, pois espécies comerciais como o Eucalyptus apresentam quantidade viável de taninos (Trugilho et al., 2003). Aires et al., (2016) encontraram alto teor de taninos em resíduos de castanha portuguesa, que aplicaram como substitutos do fenol na formulação de adesivos, podendo ser aplicados também como suplementos antioxidantes em formulações alimentares, cosméticas ou farmacêuticas. Além disso, taninos provenientes de resíduos de plantas para a produção de adesivos e outros produtos comerciais, agregam valor à espécie (ATHOMO et al., 2018; PIZZI, 1980), sendo vantajoso substituir partículas naturais por partículas inorgânicas que possuem alto valor (TOMAK et al., 2018).
Estudos comprovam o quanto os taninos são promissores na indústria madeireira, sendo aplicados na formação de adesivos de madeira de alta resistência (LI et al., 2004), aumentando a hidrofobicidade da superfície da madeira, o que resulta em menor absorção de água (LIU et al., 2017; FILGUEIRA et al., 2017; PING et al., 2011), e consequentemente na diminuição de formações de fissuras (TOMAK et al., 2018). Do mesmo modo, Kemppainen et al., (2014) mostraram o potencial das cascas de Picea abies para produção de taninos em grandes quantidades, explicando seu potencial para diversas aplicabilidades, como na formação de adesivos.
2.3. Potencial farmacológico dos taninos
Muitos estudos com taninos têm sido desenvolvidos para sua aplicabilidade na medicina veterinária e produção animal, onde resultados já mostram sua eficácia na prevenção de doenças
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causadas por Clostridium perfringens em ruminantes e outras espécies de animais (ELIZONDO et al., 2010), sendo eles eficientes na substituição de antibióticos (HUANG et al., 2017). Plantas ricas em taninos também tem seu efeito sobre nematóides em ruminantes, podendo agir através de atividade antiparasitária direta, ou indiretamente, aumentando a resistência do hospedeiro (HOSTE et al., 2006; NOVOBILSKÝ et al., 2011). Além disso, os ruminantes são mais tolerantes a alimentação rica em taninos, ocasionando maior eficiência no trato digestivo (MCSWEENEY et al., 2001).
Taninos de espécies florestais da Caatinga têm mostrado resultados satisfatórios, como exemplo de Thomas e Filho (1985), que já na década de 1980 encontraram atividade antiinflamatória de taninos provenientes de cascas de Anacardium occidentale. Estudos vêm sendo desenvolvidos contra patógenos em animais, como Dantas et al., (2016) que encontraram atividade antimicrobiana dos taninos da casca de Piptadenia stipulacea sobre cepas clínicas de Staphylococcus aureus. Semelhantemente, taninos provenientes das cascas de Anacardium occidentale (PEREIRA et al., 2015), Mimosa arenosa (HIGINO et al., 2015) e Mimosa tenuiflora (PEREIRA et al., 2015) inibiram o crescimento de bactérias que são sensíveis ou resistentes a antibióticos sintéticos, demonstrando o potencial para o uso terapêutico na Medicina Veterinária, e a indicação de produtos antibacterianos naturais em fármacos.
Mesmo sendo observado o efeito dos taninos sobre Staphylococcus aureus resistentes a antibióticos (HATANO et al., 2005), algumas bactérias ainda são resistentes a eles, pois nos animais que ingerem plantas com alto teor de taninos, o número de bactérias pode aumentar (KRAUSE et al., 2005), sendo eficaz para diminuir o inchaço espumoso e melhorar o desempenho dos animais sem efeitos negativos (MIN et al., 2012). Já um estudo sobre taninos contra a bactéria Clostridium perfringens, mostrou que ela não oferece resistência aos taninos, sendo eles eficientes na atuação antibacteriana (REDONDO et al., 2015).
Os principais efeitos biológicos e farmacológicos relatados para taninos condensados podem ser classificados em atividades antibacterianas, antivirais, inibição enzimática, efeitos anti-oxidantes, antimutagênicos e propriedades antitumorais. Taninos possuem um potencial antiviral, como os obtidos pelos frutos de Terminalia chebula que inibiram o vírus da hepatite C (AJALA et al., 2014). Ainda, taninos possuem efeitos antibacterianos (SRISOD et al., 2018), como relatado por Carvalho et al., (2018) que o extrato da raiz de Cochlospermum regium enriquecido em taninos teve ação contra várias bactérias, mostrando o potencial da espécie na produção de bioativos. Do mesmo modo, esse potencial antibacteriano já é relatado para microrganismos cariogênicos, comprovando cada vez mais que os taninos podem ser uma alternativa fitoterápica eficaz (ARAÚJO et al., 2018).
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Os taninos possuem efeito antifúngico, tendo potencial no tratamento de doenças como a candidíase (FREITAS et al., 2018). Romani et al. (2006) encontraram ampla atividade antimicótica dos taninos em espécies de leveduras de interesse biomédico e Santos et al. (2017) também encontraram aumento da atividade antimicrobiana do tanino contra fungos filamentosos e leveduras. Há também estudos que mostram o potencial de taninos em complicações diabéticas, sendo necessárias mais pesquisas que promovam o desenvolvimento de novas drogas por meio deles (LADDHA e KULKARNI, 2018).
Deng et al., (2016) em estudo sobre taninos de folhas de Ficus altíssima, observaram atividade antioxidante, mostrando que eles podem ser uma boa fonte de proantocianidinas com atividade biológica. Inclusive, há anos já se sabe da sua atividade antitumoral, mostrando seu potencial contra células cancerígenas (FONG et al., 1972; KANDIL e NASSAR, 1997), pois já foi descoberta atividade citotóxica para células de câncer de mama humano (ZARIN et al., 2016).
2.4. Bioma Mata Atlântica
O bioma Mata Atlântica abriga grande diversidade biológica no Brasil, abrangendo uma área correspondente a 13% do território nacional, estando atualmente bastante fragmentada (SFB, 2013). O bioma é um dos hotspots mundiais de biodiversidade, significando que tem prioridade de conservação em todo planeta (MYERS et al., 2000). De acordo com a Lei 11.428 de 2006 (BRASIL, 2006), as formações florestais nativas e ecossistemas associados que integram a Mata Atlântica são Floresta Ombrófila Densa; Floresta Ombrófila Mista, também denominada de Mata de Araucárias; Floresta Ombrófila Aberta; Floresta Estacional Semidecidual; e Floresta Estacional Decidual, bem como os manguezais, as vegetações de restingas, campos de altitude, brejos interioranos e encraves florestais do Nordeste.
Hoje, a Mata Atlântica é composta por algumas unidades de conservação e pequenos remanescentes, que ao longo dos anos foi altamente afetada pela perda e fragmentação do habitat (PERES et al., 2013), acarretando no isolamento dos remanescentes e prejudicando a conservação da biodiversidade (ARAÚJO et al., 2015; MEDEIROS-FILHO et al., 2018). Todo processo de fragmentação da Mata Atlântica ocorre desde a colonização do Brasil (BARBOSA, 2017), em consequência dos processos de urbanização, industrialização e expansão da agricultura (PINTO et al., 2014; SCARANO e CEOTTO, 2015), sendo hoje o bioma brasileiro com a maior quantidade de espécies de plantas ameaçada (MARTINELLI, 2013).
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Os remanescentes ainda são prejudicados pela pressão antrópica, ocasionada pela exploração de recursos da biodiversidade (CUNHA, 2012) e por estarem inseridos em áreas com grande densidade populacional, como as metrópoles Rio de Janeiro e São Paulo (LAURANCE, 2009; SCARANO e CEOTTO, 2015). Assim sendo, mesmo com poucos resquícios da floresta original, a legislação brasileira ainda não tem sido suficiente para a conservação do bioma, podendo causar custos inaceitáveis no futuro, porque os governantes ainda ignoram os impactos a longo prazo (ALARCON et al., 2015).
Nos últimos anos têm se buscado métodos para recuperar áreas de Mata Atlântica degradadas, sendo a silvicultura intensiva para a restauração florestal um mecanismo altamente viável para alcançar altas taxas de sequestro de carbono e a restauração local (FEREZ et al., 2015). Tabarelli et al. (2005) explicam que para implementar uma rede de paisagens sustentáveis no bioma, o planejamento de ações de conservação deve ser realizado com base em fronteiras naturais ao invés de limites políticos. As entidades governamentais devem colaborar, devem existir corredores de vegetação ligando áreas protegidas, fazer restauração de matas de galeria e monitoramento com utilização dos melhores indicadores referentes a aspectos biológicos, sociais e econômicos, garantindo a efetivação do uso dos recursos naturais
(TABARELLI et al., 2005).
Conjuntamente, na Mata atlântica já se tem informações a respeito de algumas espécies com potencial farmacológico, principalmente pelas diversas aplicações na medicina popular (SANTANA et al., 2016), exigindo cada vez mais a conservação das plantas que pode ser uma alternativa econômica para as comunidades em geral (PINTO et al., 2006). Ademais, a medicina popular no bioma é uma das mais importantes fontes de atenção à saúde, devido ao uso contínuo das plantas medicinais, merecendo mais estudos, especialmente em um bioma em situação de risco e com carência de informações, o que contribui também para a conservação das espécies (TRIBESS, et al., 2015).
2.5. Protium heptaphyllum (Aubl.) March.
Com cerca de 19 gêneros e 615 espécies pantropicais (CHRISTENHUSZ e BYNG, 2016), a família Burseraceae está situada em todas as regiões do Brasil, apresentando sete gêneros e 104 espécies no país (DALY, 2015). Além disso, maior parte das espécies da família é nativa da Amazônia, onde são comumente conhecidas por suas estruturas aromáticas (BARROSO et al., 1991; SOUZA e LORENZI, 2012), não apresentando importância
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econômica na madeira, mas sim na resina em abundância que muitas delas produzem (LEENHOUTS, 1956).
Na família Burseraceae o gênero Protium é o que possui maior distribuição no Brasil (SOUZA e LORENZI, 2012) e, devido às semelhanças entre as espécies, é necessário observar detalhes para saber as diferenças entre elas (BARROSO et al., 1991). Uma das características marcantes nas espécies do gênero é o aroma emitido pelas suas estruturas; Piva et al. (2019) analisaram as emissões de monoterpenos voláteis da resina de 15 espécies do gênero, para diferenciá-las e identificá-las por meio desses compostos químicos, servindo como uma “impressão digital” para as espécies.
Entre as espécies do gênero está o Protium heptaphyllum (Aubl.) March. que dentre tantos nomes populares é conhecida como breu, amescla e almecegueira (Figura 2), sendo descrita por ser aromática (RAMOS et al., 2008; SILVA et al., 1977). A espécie é nativa do Brasil e localiza-se nos domínios fitogeográficos Amazônia, Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica, apresentando ampla distribuição em todas regiões do país (DALY, 2015).
Figura 2 – Aspectos morfológicos de Protium heptaphyllum em fragmento de Mata Atlântica (A); Botões florais (B), flores (C) e frutos da espécie (D). (Fonte: Ageu Freire)
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A espécie fica inserida em terrenos arenosos, tanto úmidos como secos (LORENZI, 1992) e principalmente em locais alagados, como ambiente de nascentes (PINTO et al., 2005). Os frutos da espécie são drupas globosas e avermelhadas, com cerca de 1,3 a 1,5 cm, possuindo arilo carnoso de 2 mm de espessura (SILVA et al., 2007). Há uma forte relação entre a espécie e o sistema de galerias subterrâneas da formiga Atta sexdens L. (Hymenoptera: Formicidae), onde as galerias ficam distribuídas de acordo com a distribuição das árvores (SILVA et al., 2012). As formigas além de coletarem as sementes, fazem dispersão a curta distância, aumentam o padrão de agregação das sementes e reduzem a sobrevivência das plântulas embaixo das plantas-mãe (SILVA et al., 2007).
Os subprodutos de P. heptaphyllum são empregados na medicina popular, como analgésico, cicatrizante e expectorante, bem como são utilizados na indústria de verniz, na calafetagem de embarcações e como incenso em rituais religiosos (MAIA et al., 2000). Além disso, o 3-careno e canfeno, dois monoterpenos encontrados na resina, mostraram-se únicos para a espécie, servindo como uma “impressão digital” e, devido a essa exclusividade e importância, contribui para outros estudos relacionados à interação das plantas com outros organismos, filogenia, interações climáticas, uso de resinas e também para conservação, manejo e uso sustentável (PIVA et al., 2019). A espécie é classificada como não ameaçada de extinção, sendo de interesse para pesquisa e conservação (MARTINELLI e MORAES, 2013) devido à pouca informação que se tem sobre ela, sendo necessários mais estudos, principalmente por ela estar bem adaptada a diferentes regiões do Brasil e apresentar potencial para extração de bioprodutos.
2.6. Potencial farmacológico de Protium heptaphyllum (Aubl.) March.
Estudos para observar o potencial farmacêutico de P. heptaphyllum vêm sendo desenvolvidos durante os últimos anos, mas há bastante tempo já se tem conhecimento da atuação da espécie na medicina popular. Mota e Scheel-Ybert (2019), em estudo do uso de paisagem e da lenha na Toca do Boqueirão da Pedra Furada no Piauí, durante o início e meio do Holoceno, encontraram evidências do uso de espécies do gênero Protium por volta de 7000 a 8000 anos atrás, comparando-o com P. heptaphyllum existente no local e seu uso na medicina popular.
Brandão et al. (2008), listaram 203 espécies em estudo de verificação de plantas medicinais brasileiras no século XIX, encontradas por naturalistas europeus e pela Farmacopeia Oficial, entre elas o P. heptaphyllum foi apontada por possuir resina com atividade
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inflamatória. A espécie também foi descrita na Amazônia, no século XIX, pelo botânico alemão Carl Friedrich Philipp von Martius, sendo relatado que na medicina popular era utilizado como remédio um bálsamo seco proveniente das plantas da espécie (BREITBACH et al., 2013). Chaves et al. (2015) fizeram um estudo sobre a utilização de plantas brasileiras descritas pelo escritor naturalista João Guimarães Rosa, no qual foram encontrados 964 nomes populares de plantas e, 57 tendo seu uso descrito pelo escritor, estando P. heptaphyllum entre as 13 espécies com ação medicinal.
A eficiência do P. heptaplyllum na medicina popular tem sido descrita na literatura, relacionando-a com os estudos científicos para mostrar o quanto a espécie é promissora no tratamento de doenças. Foi observado em estudo com os “caboclos ribeirinhos” do Rio Unini no estado do Amazonas, que eles utilizam a resina da espécie como remédio para dor de cabeça, derrame e doenças respiratórias (LAGO et al., 2016). Semelhantemente, foi realizado um levantamento etnofarmacológico na Amazônia, no qual foram listadas 122 plantas, das quais 58 com utilização na medicina popular, e que P. heptaphyllum é uma das espécies mais citadas (SANTOS et al., 2013), corroborando com outros estudos que a resina é utilizada em doenças como derrame e problemas respiratórios, comprovados pela atuação de vários componentes químicos (DUTRA et al., 2016).
A resina de P. heptaphyllum consiste no produto florestal não madeireiro mais estudado da espécie, sendo descrita como a mais comercializada da família Burseraceae (HERNÁNDEZ-VÁZQUEZ et al., 2010). Estudos como o de Albino et al., (2017), encontrou diferenças na composição da resina fresca e envelhecida, sendo encontrada na primeira o componente terpinoleno e na segunda, componentes como o p-cymeno, e p-cymen-8-ol. Oliveira et al. (2003), observaram efeito gastroprotetor e antinflamatório da resina sobre úlcera gástrica, apoiando ainda mais seu uso popular em desordens gastrointestinais. Diversos estudos com os componentes químicos da resina da espécie em ratos, vem mostrando o apoio da utilização da espécie na medicina tradicional e sua atuação no tratamento de doenças, como pruridos na pele (OLIVEIRA, et al., 2004), distúrbios hepáticos (OLIVEIRA et al., 2005) e dor aguda e visceral (OLIVEIRA, et al., 2005).
Os óleos essenciais da espécie podem ser uma ferramenta farmacológica muito útil (SIANE et al., 1999), pois vários estudos mostram componentes químicos com potencial farmacêutico. Amaral et al. (2009) encontraram no óleo essencial da resina constituintes como o limoneno, trans-β-ocimeno, eucaliptol e P-cimeno, os quais possuem atividade anti-inflamatória. No óleo essencial das folhas, Citó el al (2006) encontraram dez substâncias com propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas, inseticidas e algumas que são utilizadas na
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perfumaria, com maior quantidade no trans-β-ocimeno (15,74%), β-cariofileno (32,08%), ledeno (14,58%) e germacreno-B (16,71%).
Dentre os estudos relacionados à aplicação dos compostos químicos da espécie, os triterpenos ganham destaque por estar em maior quantidade (SUSUNAGA et al., 2001). Melo et al. (2011) afirmam que esses componentes, existentes na resina obtida no caule, atuam como agente de cicatrização com propriedades anti-inflamatórias e analgésicas, e diversos estudos relatam que a alfa, beta-amirina encontrada na espécie é útil na redução da obesidade (CARVALHO et al., 2017; CARVALHO et al., 2015; MELO et al., 2019; SANTOS et al., 2012) e também tem potencial no tratamento de dores neuropáticas (SINGH, 2017) e dores orofaciais (SIQUEIRA-LIMA et al., 2016).
Os triterpenos em espécies do gênero Protium também podem ter propriedades ansiolíticas, pois um estudo sobre o incenso sagrado Maia proveniente da resina, mostrou efeitos calmantes em experimentos com ratos (MERALI et al. 2018). Aragão et al. (2006) avaliaram os efeitos ansiolíticos e antidepressivos da alfa, beta-amirina obtidos da casca de P. heptaphyllum, obtendo resultados positivos e evidenciando o potencial clínico desses componentes, sendo também observado efeito anticonvulsivante (ARAGÃO et al., 2014).
Outros estudos indicam o potencial da espécie no tratamento do câncer, como Barros et al., (2011) que observaram que a citoxidade de derivados da alfa, beta-amirina provenientes da resina induziram a morte por apoptose de células cancerígenas causadoras da leucemia e os resultados também mostraram essa citoxidade e um efeito antiproliferativo em células promotoras do câncer de mama (LIMA et al., 2014). Também já foi observado que componentes das folhas de outra espécie do gênero têm efeito antiproliferativo nas células do câncer cervical (ROSALEM et al., 2017).
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3. MATERIALEMÉTODOS
__________________________________________________________________________ 3.1. Coleta e beneficiamento dos materiais vegetais
Coletou-se cascas, folhas e frutos imaturos com sementes em uma população natural de P. heptaphyllum, situada em um fragmento de Mata Atlântica no município de Macaíba, no estado do Rio Grande do Norte (Figura 3). O fragmento situa-se em altitude média de 50 m, apresentando vegetação classificada como Floresta Estacional Semidecidual de Terras Baixas (IBGE, 1992), com clima sendo uma transição entre os tipos As’ e BSh’ conforme a classificação de Köppen, com temperaturas elevadas ao longo de todo o ano e estação chuvosa de outono a inverno (CESTARO, 2002). O local apresenta precipitação média anual de 1.086,1 mm (EMPARN, 2017).
Figura 3 - Localização geográfica e imagem aérea da área de estudo. Fonte: Google Earth (2017) adaptado.
A planta foi coletada e registrada no Herbário da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, com número de registro 26577 e, o trabalho está cadastrado no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado – SISBIO com código AF83CE4. Foi selecionado aleatoriamente um indivíduo de P. heptaphyllum em bom estado de conservação para a retirada das cascas e folhas, em um período em que não havia evento reprodutivo e na época de frutificação para retirada dos frutos imaturos com sementes (Figura 4). Todo material coletado foi armazenado em sacos plásticos para que não ocorresse a perda da umidade. A partir de uma amostra, foi determinado o teor de umidade dos materiais vegetais in natura em estufa a 103 °C ± 2 °C por 48 h.
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As cascas foram cortadas com faca em fragmentos de menor dimensão, as folhas e frutos foram lavados com água corrente e os frutos com sementes, por serem imaturos, foram postos para secar durante 24 h à temperatura ambiente. Todos materiais vegetais foram mantidos em estufa a 103 °C ± 2 °C por 48 h e triturados em moinho do tipo Willey com peneira de abertura 16 mesh (1,00 mm), para alcançar menor granulometria no material. Posteriormente, os materiais foram separados por faixa granulométrica e armazenados para posteriores análises, sendo utilizada a fração passante na peneira de 16 “mesh” (1,00 mm) e retida na de 60 “mesh” (0,25 mm).
Figura 4 – Demonstração em fluxograma da coleta e beneficiamento dos materiais vegetais de Protium heptaphyllum.
3.2. Caracterização da biomassa
O teor de umidade foi realizado conforme a ASTM E871-82, consistindo na perda de massa de uma amostra quando aquecida sob condições de temperatura, tempo e pressão controladas. A análise foi feita em triplicata, no qual foi realizada a pesagem inicial dos cadinhos vazios e depois foram inseridos 2 g de amostra de casca em cada um dos recipientes, registrando a massa inicial, posteriormente os cadinhos com amostra foram inseridos em estufa por 16 h a 103 ± 1 °C.
Os cadinhos com amostra foram retirados e esfriados em dessecador à temperatura ambiente por 4 min, sendo retirados do dessecador e pesados imediatamente para registro da massa. Os cadinhos com amostra retornavam para a estufa, repetindo o procedimento anterior, sendo registrada a massa a cada 30 min, até a variação consistir em menos de 0,2%. Para o cálculo do percentual de umidade, a seguinte equação (1) foi utilizada:
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O teor de cinzas seguiu a norma ASTM 1755-01 (reaprovada em 2015), consistindo em uma medida aproximada do conteúdo mineral e outros materiais inorgânicos na biomassa, sendo, juntamente com outros ensaios, determinada a composição total das amostras de biomassa. O experimento foi realizado com os cadinhos com amostra do teor de umidade, onde foram colocados na mufla à 575 °C ± 25 °C, em um passo de 10 °C/min com permanência nessa temperatura por 3 h. Depois, os cadinhos foram retirados e inseridos em dessecador para atingir temperatura ambiente e posteriormente pesados e registrados os valores. Para o cálculo do percentual de cinzas foi utilizada a seguinte equação (2):
O método para obter o teor de voláteis seguiu a norma ASTM E872-82, determinando o teor percentual de vapores liberados na decomposição da amostra de biomassa. Primeiramente foi pesado o cadinho para registrar a massa do recipiente. Depois foi inserido 1 g de amostra no cadinho, registrando a massa inicial. Posteriormente deixou-se o forno atingir 750 °C, inserindo o cadinho com amostra, deixando-o 7 min dentro dele. Depois, o cadinho foi retirado e inserido em dessecador, esperando esfriar por cerca de 30 min. Para o cálculo do percentual de perda de massa foi utilizada a seguinte equação (3):
Como a amostra foi inserida diretamente na estufa, utilizou-se o valor da amostra final e subtraiu-se do valor da umidade da amostra, das cinzas e voláteis. O método para determinar o carbono fixo foi baseado na norma ASTM 3172-89 (reaprovada em 2002), com base no seguinte cálculo (4):
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3.3. Análise composicional da biomassa
Todas as análises seguiram metodologia de Detmann et al., (2012). Para determinar a porcentagem de matéria seca das amostras, subtraiu-se o teor de umidade de 100. Determinou-se a fibra em detergente neutro (FDN) para ocorrer a Determinou-separação das fibras insolúveis no meio, onde essas fibras são constituídas basicamente de celulose, hemicelulose, lignina e proteína lignificada. A solução era composta por sulfato láurico de sódio, EDTA sal dissódico, tetraborato de sódio decahidratado, fosfato de sódio dibásico anidro, etilenoglicol e água destilada. Também, foi determinado a fibra em detergente ácido (FDA), em que foi usado detergente ácido específico para que ocorresse a solubilização do conteúdo celular e hemicelulose, onde a solução era constituída de CTAB (Brometo de cetil trimetilamônio), ácido sulfúrico e água destilada.
As análises foram feitas em triplicata, sendo pesados sacos vazios de tecido não tecido (TNT), e inserido neles 0,55 g da biomassa. Os sacos foram selados e colocados em potes com 60 mL de solução FDN e FDA, inserindo-os em autoclave por 1 h, retirando-os e lavando-os com água destilada quente por 3 vezes. Por fim, foram lavados com acetona. Em seguida, colocou-se em estufa a 105 °C por 4 h e em dessecador por 30 min para posterior pesagem. Foram utilizadas as equações 5 e 6 para obter os valores referentes a FDN e FDA:
Posteriormente, realizou-se a análise da quantidade de lignina, sendo inserido 0,55 g da biomassa em sacos de tecido não tecido (TNT), colocando-os em potes com 60 mL de detergente ácido. Os potes foram colocados em autoclave a 105 °C por 1 h, para que ocorresse
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a extração de todos componentes solúveis em detergente ácido. Os sacos foram lavados com água destilada quente 3 vezes e depois com acetona por 2 minutos, sendo secados em estufa a 105 °C por 16 h e pesados. Por fim, os sacos foram submetidos à solução de ácido sulfúrico 72% durante 3 h, com agitação a cada 1 h, sendo depois lavados com água destilada fria 3 vezes e lavados posteriormente com acetona para total remoção do ácido, sendo secos na estufa a 105 °C por 16 h e pesados para obtenção do valor do saco corrigido. Para obter o valor da lignina foi utilizada a seguinte equação (7):
Depois, para obter os valores referentes à quantidade de celulose e hemicelulose, utilizou-se as equações 8 e 9:
A análise de proteína bruta (PB) ocorreu em duplicata, seguindo o método de Kjedahl, analisando a concentração de nitrogênio no material. Foram inseridos 200 mg de biomassa em tubos de digestão, sendo adicionados neles 2 g de mistura digestora composta por Sulfato de cobre, Sulfato de potássio e 7 mL de ácido sulfúrico. Inseriu-se os tubos em bloco digestor com aquecimento progressivo até alcançar a temperatura de 400 °C, deixando-os nesta temperatura até que a solução ficasse translúcida. Depois, os tubos foram retirados e, ao atingirem temperatura inferior a 100 °C, foi adicionado 20 mL de água destilada para homogeneização.
Posteriormente, foi inserido em Erlenmeyer, 20 mL de solução de ácido bórico 40 g/L, sendo adaptado ao conjunto de destilação para receber toda amônia destilada e, os tubos digestores com as amostras digeridas foram transferidos também para o conjunto de destilação,
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no qual foram adicionados 25 mL de Hidróxido de sódio 500 g/L. Por fim, ocorreu destilação por arraste até o volume total atingir 75 mL, sendo retirado o Erlenmeyer e titulado com Ácido clorídrico até a mudança de cor. A equação (10) utilizada para determinar a porcentagem de proteína bruta foi a seguinte:
3.4. Remoção de extratos tanantes e quantificação de taninos
A metodologia de remoção de extratos tanantes da casca, folha e fruto foi baseada em outros trabalhos já desenvolvidos (AZEVÊDO et al., 2017; PAES et al., 2010). A remoção dos extratos tanantes ocorreu em água destilada (Figura 5), sendo utilizadas três amostras de 25 g em base seca da biomassa da casca, folha e fruto. Depois, as amostras foram realocadas para balões de fundo chato com capacidade de 500 mL, onde foram inseridos 250 mL de água destilada (relação 1:10 p/v), ocorrendo fervura sob refluxo, por 2 h. Foram realizadas duas sequências de extrações para as amostras, com a finalidade de remover uma quantidade máxima de extrativos presentes.
Figura 5 – Demonstração em fluxograma do processo de remoção dos extratos tanantes de Protium heptaphyllum.
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Posteriormente, para que as partículas fossem retidas, o material passou por uma peneira de 60 “mesh” (0,105 mm) e por um tecido de flanela. Depois de obter o extrato, foi feita a homogeneização e filtração em funil de vidro sinterizado de porosidade 2 (Ø 28 mm). Em aparelho tipo Soxhlet, o material foi concentrado para 250 mL pela evaporação da água e, em seguida, três alíquotas de 50 mL foram retiradas de cada extrato. Foram utilizadas duas alícotas para determinar o teor de taninos condensados (TTC) e uma foi evaporada em estufa a 103 ± 2 ºC por 48 h. Para determinação da porcentagem de teor de sólidos totais (TST), que é a mesma coisa que a porcentagem de extrato tanante, foi utilizada a seguinte equação (11):
O TTC de cada amostra foi determinado pelo método de Stiasny, descrito por Guangcheng et al. (1991), com algumas modificações. Foram colocados 4 mL de formaldeído (37% m/m) e 1 mL de HCl concentrado em 50 mL do extrato bruto e cada mistura foi fervida sob refluxo por 30 min. Assim, para a separação dos complexos insolúveis dos taninos, foi realizada uma filtragem simples, com filtro de papel colocado em funil de Büchner de 10 cm de diâmetro e 4 cm de profundidade. Em seguida, todo material recluso no filtro foi seco em estufa a 103 °C ± 2 °C por 24 h, calculando-se o índice de Stiasny conforme a equação (12) abaixo:
Para obter a quantidade de taninos presente em cada amostra, foi realizada a equação (13) abaixo, usando o índice de Stiasny e o teor de sólidos totais:
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Para obter o teor de não taninos, foi realizada a diferença entre o teor de sólidos totais e o teor de taninos condensados obtido de cada amostra. Conforme a Figura 6, os sólidos totais correspondem ao extrato tanante, em que o índice de Stiasny compreende a porcentagem de taninos existentes dentro desse extrato. No fim, os dados obtidos da caracterização e análise composicional da biomassa, como também da extração e quantificação dos taninos, foram analisados e submetidos à Análise de Variância e Teste de Tukey no programa estatístico BioEstat 5.0 ® (AYRES, 2007).
Figura 6 – Demonstração dos sólidos totais, taninos condensados e não taninos na planta. 3.5. Análise termogravimétrica de biomassa e extratos tanantes
Foram realizadas análises termogravimétricas da biomassa e extratos tanantes da casca, folhas e frutos, com objetivo de avaliar os seus comportamentos térmicos e faixa de degradação. Utilizou-se a balança termogravimétrica TGA/DTA, Q600 da TA Instruments. Realizou-se as análises com taxa de aquecimento de 10 oC min-1, da temperatura ambiente até 900 oC, sendo
utilizado atmosfera dinâmica de ar sintético (a), na vazão de 100 mL min-1. Utilizou-se cadinhos
de alumina de 70 L em todas análises e uma massa de amostra de aproximadamente 15 mg.
3.6. Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) de biomassa e extratos tanantes
Adquiriu-se os espectros de infravermelho em um espectrofotômetro de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier da shimadzu, modelo IR Prestige-21, utilizando brometo de potássio (KBr) como agente dispersante. Preparou-se as pastilhas pela
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mistura de cerca de 0,7 mg de amostras de biomassa e taninos em forma de pó com uma quantidade suficiente de KBr para se atingir a concentração de 1% em massa da amostra. Depois, homogeneizou-se a mistura em um almofariz de ágata, onde foi transferida para o pastilhador e submetida a uma pressão de 8,0 t cm-2, formando uma pastilha fina e translúcida,
em que no fim, os espectros foram obtidos na região de 4000 a 400 cm-1, no modo transmitância.
3.7. Fracionamento cromatográfico do extrato tanante do fruto
Para fracionar o extrato tanante (Figura 7), uma massa de 5,08 g foi aquecida por 24 h e solubilizada com 80 ml de 30% MeOH/H2O, sendo depois realizada rotaevaporação para
concentrar. Posteriormente, filtrou-se em papel filme, em que foi retido 4,87 g e obtido 0,20 g que foi disposto em cromatografia de exclusão molecular em coluna de Φ 5,0 cm, empacotada em gel dextrana sephadex LH-20 (h= 30 cm). Coletou-se 50 frações que foram analisadas por Cromatografia de Camada delgada – CCD para reunir de acordo com a semelhança, dando origem a oito subfrações. Foi escolhida a fração purificada, sendo diluída em dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo – DMSO para análises de FTIR.
Figura 7 – Demonstração em fluxograma do processo de fracionamento do extrato tanante do de fruto de Protium heptaphyllum.
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Para a realização do experimento foram feitos seis tratamentos com diferentes concentrações dos extratos tanantes da casca, folha e fruto, inseridos em Becker com 300 ml de água do mar com salinidade de 35 ppm (Figura 8). Os tratamentos foram distribuídos da seguinte forma: T1= Tratamento controle (Sem extrato tanante); T2= 10 mg; T3= 25 mg; T4= 50 mg; T5= 75 mg; T6= 100 mg.
Figura 8 – Teste de toxicidade dos extratos tanantes da casca, folha e fruto de Protium heptaphyllum.
O ensaio foi realizado em triplicata, totalizando 18 amostras, cada uma com 10 indivíduos de Mysidopsis juniae, que eram alimentados diariamente com náuplios de Artêmias sp. Os Beckers foram protegidos com papel filme em sala climatizada a uma temperatura de 24ºC e, o teste teve duração de quatro dias, onde todos os dias eram contabilizados os indivíduos mortos. No fim, os dados foram submetidos à Análise de Variância e Teste de Tukey no programa estatístico BioEstat 5.0 ® (AYRES, 2007).
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4. RESULTADOSEDISCUSSÃO
__________________________________________________________________________ 4.1. Caracterização da biomassa
O teor de umidade dos materiais vegetais in natura e da biomassa (Tabela 1) foi maior na casca, seguida da folha e do fruto. A casca apresentou em sua biomassa 16,92% de cinzas, sendo a estrutura da planta com maior quantidade e, folha e fruto apresentaram valores estatisticamente iguais. Com relação ao teor de voláteis, a folha mostrou maior quantidade, seguida do fruto e da casca. Em sequência, a biomassa do fruto foi a que apresentou maior quantidade de carbono fixo, seguida da folha e da casca.
Tabela 1 - Teor de umidade in natura e teor de umidade, cinzas, voláteis e carbono fixo da biomassa da casca, folha e fruto de Protium heptaphyllum.
Casca Folha Fruto
Teor de umidade in natura (%) 91,53 75,00 25,95
Teor de umidade (%) 9,13a ± 0,05 08,57b ± 0,09 4,85c ± 0,10
Teor de cinzas (%) 16,92a ± 0,21 5,88b ± 0,11 5,97b ± 0,31
Teor de voláteis (%) 72,29c ± 0,91 82,79a ± 0,21 77,67b ± 0,61
Carbono fixo (%) 1,66% 2,76% 11,51%
Médias seguidas da mesma letra entre linhas não diferem estatisticamente. ( ± Desvio-padrão).
A caracterização das estruturas de plantas medicinais é importante para o conhecimento das espécies frente as suas utilizações, visto que há séculos o uso dessas plantas é comum no Brasil, como P. heptaphyllum, cujo uso foi verificado desde o século XIX (BRANDÃO et al., 2008). A umidade nas estruturas da espécie demonstra a importância da água como substância essencial para a ocorrência dos processos metabólicos, em que ela constitui 80 a 90% da massa de plantas em crescimento, 35 a 75% em tecidos lenhosos e 5 a 15% em sementes secas (KERBAUY, 2008).
A casca in natura assim como sua biomassa, apresentaram maiores valores de umidade, ocorrendo por ter na sua constituição tecidos vasculares, que translocam a seiva e tem a água como sua substância mais abundante (TAIZ e ZEIGER, 2009). As folhas apresentam maior taxa de transpiração, liberando grande quantidade de água e os frutos, quando maduros, diminuem a concentração de água, por isto a umidade foi menor nessas estruturas. Corrêa Junior e Scheffer (2013) mostram que após a secagem, plantas medicinais devem atingir até 12% de umidade, expressando que todas estruturas deste estudo possuíram valores esperados. Após a coleta dos
