Avaliação da resposta celular a biomateriais para fins de regeneração óssea

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA CELULAR A BIOMATERIAIS PARA FINS DE REGENERAÇÃO ÓSSEA

JANA DARA FREIRES DE QUEIROZ

NATAL/RN 2018

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AVALIAÇÃO DA RESPOSTA CELULAR A BIOMATERIAIS PARA FINS DE REGENERAÇÃO ÓSSEA.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. Orientador: Silvia Regina Batistuzzo de Medeiro

Co-orientador: Maria Helena Raposo Fernandes

NATAL/RN 2018

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Queiroz, Jana Dara Freires de.

Avaliação da resposta celular a biomateriais para fins de regeneração óssea / Jana Dara Freires de Queiroz. - 2018. 148f.: il.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Nata, RN, 2018.

Orientador: Silvia Regina Batistuzzo de Medeiroz.

1. Materiais Biocompatíveis - Tese. 2. Biomateriais - Tese. 3. Células-tronco mesenquimais humanas - Tese. 4. Genotoxicidade - Tese. I. Medeiroz, Silvia Regina Batistuzzo de. II. Título. RN/UF/BS-CCS CDU 616-77

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Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito

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JANA DARA FREIRES DE QUEIROZ

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA CELULAR A BIOMATERIAIS PARA FINS DE REGENERAÇÃO ÓSSEA.

Aprovada em 27 de abril de 2018

Banca examinadora:

Presidente da Banca: Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros Departamento de Biologia Celular e Genética - UFRN

Membros da Banca:

Membro interno - Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas - UFRN

Membro interno - Carlos Augusto Galvão Barboza Departamento de Morfologia - UFRN

Membro externo - Melissa Camassola Universidade Luterana do Brasil – ULBRA

Membro externo - Alexandre Malta Rossi Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas - CBPF

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“Importante não é ver o que ninguém nunca viu, mas sim, pensar o que ninguém nunca pensou sobre algo que todo mundo vê.”

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AGRADECIMENTOS

Durante o período de desenvolvimento dessa pesquisa passei em um concurso e ao assumir o cargo o tempo que dispunha para realizar experimentos ficou reduzido. Sem a ajuda de pessoas muito especiais fornecendo suporte esse trabalho não seria possível. Agradeço a Felipe (MF, Felipete, Lagui) por sempre me escutar, por estar sempre presente e disposto a me ajudar em finais de semana, feriados e horários não convencionais. Por ser o “IC” mais qualificado que eu tive. Por ser meu melhor amigo e primeiro padrinho de casamento a ser convidado pelo “noivo”. Agradeço a Elo, noiva de Felipe, por entender o auxílio que ele me deu, dá e sempre dará e por se juntar a nós nos finais de semana no laboratório. Não poderia deixar de agradecer a Gildácio, para mim Dacinho, cuja sua vontade de aprender, seu fascínio por ciência e entusiasmo me empurraram a seguir adiante quando eu estava esmurecida. Por ser esse cientista espetacular que além de lidar com o próprio projeto se dispôs a me auxiliar. Muitos desses resultados não seriam possíveis sem seu apoio. Agradeço imensamente a Susana, pela profissional XPTO que eres, por permitir que seu aluno me auxilásse, por ela mesma me ajudar na bancada, pelo seu ombro, por seus ouvidos, por me dares puxões de orelha, pela sua amizade, minha mademoseile. Enfim muito obrigada por tudo que tu eres até o mau feitio. Ainda no meio acadêmico, agradeço pela fortificação e consolidação dos laços de amizade a Lelinha, Amanda, Geka, Sinara, Fabrícia, Ritinha, Aquiles, Danizinha, Anilina, Lucas, Lázaro e até mesmo Berg por permitirem que eu fizesse parte do círculo de amizade. A todos do grupo da professora Silva jovem guarda e velha guarda, a técnica do Lama Mayara. Enfim a TODOS que fazem parte do LAMA/LBMG e do departamento de genética que sempre me auxiliaram quando eu precisei, compartilhando idéias científicas, sonhos e com certeza muitas risadas.

A todos os professores do Centro de Biociências que contribuíram com minha formação pessoal e profissional. Aos colegas do programa de pós-graduação em Ciências da Saúde em especial a Danizinha e Marcelino. Por mais almoços como aqueles. As meninas da secretaria do programa Kaliene e Alana por sempre me atenderem com gentileza e calma nos momentos de turbulência.

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trabalho na maternidade que sempre me incentivaram. Um agradecimento especial a minha orientadora Prof.a Silvia Regina B. de Medeiros pela atenção e dedicação durante todo tempo de orientação e principalmente pela paciência que teve comigo nessa reta final. Sei que não segui o caminho “sonhado” e que não rendi como o esperado demorando mais tempo que o “normal” para finalizar meus deadlines. Agradeço também a minha co-orientadora professora Maria Helena por se dispor a me atender via Skype nas vezes que foram necessárias e por entender a minha opção em assumir o concurso.

A Capes e ao CNPq pelo suporte financeiro destinado, sem o qual a realização desse trabalho não seria possível.

Por último, mas não menos importante gostaria de agradecer a minha família. A minha mãe Maria do Carmo, a personificação da mulher guerreira, pai e mãe ao mesmo tempo em grande parte da minha vida. “... Não há mãe melhor que a minha, porque ela é a Minha Mãe!”. A Neto, pelo abraço, pela palavra, por não revidar quando descontava nele as minhas “frustrações”, por me fazer ver além, por me cobrar mais que a minha orientadora, por aceitar passar os finais de semana e férias no laboratório e não se chatear quando dava errado. Por se importar ao ponto de ser meu personal programador e criar “um programinha” que facilitou o uso do CASP bugado. Por torcer por mim e principalmente por me permitir fazer parte da sua vida fazendo da minha vida mais feliz e tornando a nossa mais colorida.

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RESUMO

Diferentes tipos de biomateriais têm sido desenvolvidos ao longo dos anos com várias aplicações biomédicas principalmente para fins de regeneração óssea. A evolução tecnológica vem proporcionando o desenvolvimento de novos e melhores biomateriais. Dentre os diversos tipos de biomateriais existentes atualmente as superfícies nano e microestutradadas e materiais em escala nano e micrométrica têm ganhado destaque. O tratamento com feixe de LASER é uma abordagem controlável e flexível para modificar superfícies que cria uma topografia complexa nano e micro estruturada e graças as suas propriedades diversos tipos de partículas têm sido largamente desenvolvidos. Apesar de muitos estudos terem sido realizados para avaliar a resposta à diferenciação, pouca atenção foi dada ao potencial genotóxico durante esse processo. Portanto, ensaios para avaliar biocompatibilidade, incluindo estudos genotóxicos, devem ser realizados. O comportamento de células tronco mesenquimais humanas foi analisado após a exposição a discos de titânio modificados superficialmente a laser e partículas de hidroxiapatita. Os discos de titânio foram avaliados por microscopia eletrônica, difração de raio-x e medida do ângulo de contato. A superfície gerada pela fluência de 235 J/cm2_{foi utilizada}

nos ensaios biológicos: MTT, mineralização, atividade de fosfatase alcalina e qRT-PCR para marcadores osteogênicos. As nanopartículas (nanoXIM•HAp102®; Fluidinova, S. A.) e micropartículas (Plasma Biotal) de hidroxiapatita disponíveis comercialmente nas concentrações de 0.1, 1 e 10 µg/mL foram utilizadas e analisadas após 1, 3 e 7 dias. A análise dos dados do titânio modificado a laser um comportamento dependente do tipo celular reduzindo a proliferação das células tronco mesenquimais e aumentando a expressão dos marcadores osteogênicos e atividade da fosfatase alcalina nessas células. A avaliação das partículas demonstrou que essas não afetaram a viabilidade das hMSC (p <0.05), contudo, as concentrações mais altas utilizadas parecem induzir uma diferenciação osteogênica precoce. Isso foi evidenciado pela antecipação dos níveis máximos esperados da atividade da fosfatase alcalina (p <0.05) e mineralização da matriz extracelular (p <0.01). Nenhuma alteração significativa foi observada no estado oxidativo e no potencial genotóxico avaliado. Curiosamente, as freqüências de pontes nucleoplasmáticas

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Nossos achados mostram que o titânio irradiado com laser pode modular o comportamento celular de forma dependente do tipo de célula e estimular a diferenciação osteogênica. Além disso, os dados das partículas sugerem que a exposição induz uma resposta celular suficiente para prevenir a instabilidade genética e não ter efeitos genotóxicos prolongados durante a diferenciação osteogênica. Dessa forma, os biomateriais analisados demonstram potencial para seu uso em medicina regenerativa e no que diz respeito as partículas parece ser seguro em relação à genotoxicidade.

Palavras chave: Biomateriais, Células tronco mesenquimais humanas,

Osteoindução e Genotoxicidade.

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ABSTRACT

Different kinds of biomaterials have been developed over the years for many biomedical applications mainly for bone regeneration purposes. Technological evolution has led to the development of new and better biomaterials. Among the various materials currently, available, available nano-microstructured surfaces and nano and micro-scale materials stand out. Laser beam treatment is a controllable and flexible approach to modifying surfaces that creates a complex surface topography with micro- and nano-scaled patterns. Nano and micro hydroxyapatite (HA) particles are being largely developed due to its properties. Despite many studies carried out to assess differentiation response scant attention has been paid to genotoxic potential of these particles during this process. Therefore, assays to evaluate biocompatibility, including genotoxic studies, should be performed. The behavior of human mesenchymal stem cells (hMSC) during differentiation process was analyzed after exposure to modified laser surface and hydroxyapatite particles. The titanium discs were investigated by scanning electron microscopy, X-ray diffraction, and measurement of contact angles. The surface generated at a fluence of 235 J/cm2_{was used in the}

biological assays: MTT, mineralization, alkaline phosphatase activity and qRT-PCR for osteogenic markers. Hydroxyapatite nanoparticles (nanoXIM • HAp102®, Fluidinova, S.A.) and microparticles (Biotal Plasma) commercially available at concentrations of 0.1, 1 and 10 μg / ml were used and analyzed after 1, 3 and 7 days. Data analysis showed that laser-processed titanium surface increased the reduced the proliferation of mesenchymal stem cells, upregulated the expression of the osteogenic markers, and enhanced alkaline phosphatase activity. Particle evaluation showed that these did not affect hMSC viability of (p <0.05), however, higher concentrations used seem to induce an early osteogenic differentiation. This was evidenced by anticipation of maximum levels expected of alkaline phosphatase activity (p <0.05) and extracellular matrix mineralization (p <0.01). No significant changes were observed in the oxidative state and the evaluated genotoxic potential. Interestingly, the frequencies of nucleoplasmic bridges (NPB) and DNA damage by the comet test were higher after 7 days under control conditions, suggesting that these bridges are characteristic of isolated hMSCs and tends to disappear during the differentiation process. Our findings

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prevent genetic instability and not having in long-term genotoxic effect during osteogenic differentiation. Thus, the biomaterials studied demonstrate potential for its use in regenerative medicine and the particles seems to be safe concerning genotoxicity.

Keywords: Biomaterials, Human mesenchymal stem cells; Osteoinduction and

Genotoxicity.

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ALP - Fosfatase alcalina (Alkaline phosphatase);

BCA - Ácido bicinchonínico; CAT - Catalase;

CHO-k1 - Células de ovário do hamister chinês (Chinese hamster ovary cells); CPDS - Comitê para estudos de difração do pó (Committee for Powder Diffraction

Studies);

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico;

CO2 - Dióxido de carbono;

DMEM - Meio Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle’s

Medium);

DMSO - Dimetil sulfóxido;

DNPH - 2,4-dinitrofenilhidrazina;

EDTA - Ácido tetraacético etilenodiamina (Ethylenediamine tetraacetic acid); GAPDH - Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase);

GM-CSF - Fator estimulante de colônia granulócito-macrófago

(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor);

H2O2 -Peróxido de Hidrogênio;

hBM-MSC - Células tronco mesenquimais humanas da medula óssea (human

bone marrow mesenchymal stem cells);

hMSC - Células tronco mesenquimais humanas;

hUC-MSC - Células tronco mesenquimais humanas do cordão umbilical (human

umbilical cord mesenchymal stem cells);

IFN-y - Interferon gama; IL-2 - Interleucina 2; IL-4 - Interleucina 4; IL-6 - Interleucina 6; IL-8 - Interleucina 8; MB - Meio basal; MN - Micronúcleo; MTT - {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]}; NBud - Broto

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(quantitative real time polymerase chain reaction);

ROS - Espécies Reativas de Oxigênio (Reactive Oxygen Species) SDS - Dodecil Sulfato de Sódio

SEM - Microscopia eletrônica de varredura (Scanning electron microscopy); SFB - Soro fetal bovino;

SOD - Superóxido Dismutase

Superóxido - O2-.;

Ti - Titânio;

TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa XRD - Difração de raio-X (X-ray diffraction).

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Proliferação indireta decélulas tronco mesenquimais humanas após

exposição a nano e micropartículas de hidroxiapatita através do teste do MTT. O controle negativo (0ug/ml) correspondem as células crescidas sob o plástico da placa de cultura. Dados representam três experimentos independentes. p>0,05. ……….73

Figura 2: Diferenciação osteogênica de células tronco mesenquimais humanas

expostas a nano e micropartículas. Dados representam 3 experimentos independentes. *p<0.05, **p<0.01, *** p <0.001. ... 74

Figura 3: Atividade de fosfatase alcalina (ALP) após 7 e 14 dias de exposição a

0.1, 1 e 10ug/ml de nano e micropartículas em meio basal. Valores médios obtidos de pelo menos três experimentos independentes para cada condição teste. *p<0.05, **p<0.01. ... 75

Figura 4: Atividade de ALP nas células tronco mesenquimais após 3 (N=3), 7

(N=4) e 14 (N=3) dias de exposição com 10ug/ml de nano e micropartículas de hidroxiapatita em meio basal. *p<0.05, **p<0.01, *** p <0.001. ... 76

Figura 5: Avaliação do estresse oxidativo em células tronco mesenquimais

expostas a nanopartículas (A e B) e micropartículas de hidroxiapatita (C e D) através da atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superoxido dismutase (SOD). N=6 p > 0.05. ... 77

Figura 6: Quantificação das proteínas carboniladas em células tronco

mesenquimais expostas a 10ug/ml de nano e microparticulas de hidroxiapatita após 7 dias de crescimento. N=2 ... 78

Figura 7: Citocinas pró-inflamatórias mensuradas no meio de cultura basal das

células tronco mesenquimais expostas a 10ug/ml de nano e micropartículas de hidroxiapatita após 24 horas, 3 e 7 dias de crescimento. Dados representam valores médios e desvio padrão de 3 experimentos independentes ... 79

Figura 8: Citocinas anti-inflamatórias mensuradas no meio de cultura basal das

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Figura 9: Ensaio cometa: Mensuração do tail moment em células tronco

mesenquimais expostas a 10ug/ml de nano e microparticulas de hidroxiapatita após 24 horas e 3 dias de exposição: N=1. ... 81

Figura 10: Ensaio CBMN: As analises foram realizadas utilizando células tronco

mesenquimais expostas a 10ug/ml de nano e micropartículas durante 24 horas (A), 3 dias (B) e 7 dias (C) de crescimento em meio basal. Células cultivadas na ausência das partículas foram utilizadas como controle negativo...82

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SUMÁRIO

RESUMO... viii

ABSTRACT ... x

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... xii

LISTA DE FIGURAS ... xiv

1. INTRODUÇÃO ... 18

2. JUSTIFICATIVA ... 23

3. OBJETIVOS ... 24

3.1. Objetivos específicos ... 24

4. MÉTODOS ... 25

4.1. Extração e caracterização das células tronco mesenquimais humanas (hMSC) ... 25

4.2. Preparação dos discos de titânio ... 26

4.3. Caracterização das superfícies de titânio ... 26

4.3.1. Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) ... 26

4.3.2. Difração de raio X ... 26

4.3.3. Medida do ângulo de contato ... 27

4.4. Cultura de Células e exposição aos biomateriais ... 27

4.5. Proliferação indireta ... 28

4.6. Análise morfológica através de SEM... 28

4.7. Diferenciação osteogênica. ... 28

4.8. Diferenciação osteogênica após exposição ao titânio. ... 29

4.9. Atividade da fosfatase alcalina ... 29

4.10. Avaliação da expressão gênica por qRT-PCR ... 30

4.11. Avaliação do Estresse Oxidativo ... 30

4.11.1. Dosagem de enzimas antioxidantes ... 30

4.11.2. Carbonilação de proteínas ... 31 4.12. Dosagem de citocinas/quimiocinas ... 31 4.13. Avaliação da genotoxicidade ... 32 4.13.1. Ensaio Cometa ... 32 4.13.2. Ensaio CBMN ... 33 4.14. Análise estatística ... 34 5. ARTIGOS PRODUZIDOS ... 35

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6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES ... 84

6.1. Produção técnico-científica geradas do projeto de pesquisa ... 87

6.1.1. Participação em eventos, congressos, exposições e feiras ... 87

6.1.2. Resumos publicados em anais de congressos ... 87

6.1.3. Apresentações de Trabalho ... 88

6.1.4. Prêmios e títulos ... 88

6.2. Outras produções geradas não relacionadas ao projeto de pesquisa ... 89

 Artigo 3 ... 89

 Artigo 4 ... 91

 Artigo 5 ... 93

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 95

8. APÊNDICE ... 102

8.1. Stem Cell Research & Therapy - Guia para autores ... 103

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Jana Dara Freires de Queiroz Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde 18 INTRODUÇÃO Avaliação da resposta celular a biomateriais para fins

de regeneração óssea

1. INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, o campo de pesquisa sobre biomateriais experimentou uma crescente ascensão em parte devido a necessidade de desenvolvimento de materiais que aumentassem a longevidade de uma população com maior expectitativa de vida (1). Ao longo da história, diversos materiais têm sido utilizados como biomateriais, e graças à evolução tecnológica a procura por novos e melhores materiais com aplicação médica é crescente. Entretanto, a busca por um biomaterial ideal ainda persiste como um dos maiores desafios da área médica. No tocante a aplicação da medicina regenerativa, um arcabouço sintético não deve ser apenas biocompatível e biodegradável mas permitir a integração com o tecido nativo. A matriz extracelular é um arcabouço natural e mostra uma variedade de topografias em micro/nano escala (2).

Os nanomateriais incluem metais, cerâmicas, polímeros naturais e sintéticos, materiais orgânicos, nanotubos e nanofibras de carbono, substâncias de origem natural ou sintética que podem ser usados de forma isolada ou em compósitos como materiais convencionais ou microestruturados (3). Além disso, têm uma grande variabilidade de formas de apresentação, por exemplo, nanopartículas, nanoaglomerados, nanocristais, nanotubos, nanofibras, nanofilmes, superfícies e matrizes nanoestruturadas obtidas através de diversas abordagens (3). Superfícies de titânio nano-micro estruturadas têm sido desenvolvidas através de tratamento por ablação a LASER (Yb-YAG) que é uma abordagem flexível e controlável possibilitando diversos tipos de superfícies apenas alterando os parâmetros do LASER(4).

A hidroxiapatita (HA) [Ca10(PO4)6(OH)2] é um composto inorgânico cuja

composição química é semelhante à fase mineral do osso que aprasenta diversas aplicações nos campos biomédico e biotecnológico. É um material muito atraente para aplicações biomédicas, como um substituto ósseo ou como material de revestimento de implantes, incluindo nanopartículas, devido às suas excelentes propriedades como biocompatibilidade, bioatividade e osteoindução (5).

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Jana Dara Freires de Queiroz Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde

As propriedades dos materiais afetam diretamente o comportamento celular. Parâmetros críticos como a interação com fluidos corporais e propriedades físico químicas dos materiais são cruciais para a longevidade dos implantes (6). A adesão celular e o crescimento são principalmente associadas com a química do material e características da superfície como rugosidade, molhabilidade e energia da superfície dos materiais nano estruturados (7).

Para fins de regeneração óssea os nanomateriais podem ser aplicados localmente sendo utilizados como material de enchimento ou imobilizados e aplicados como revestimentos em superfícies de implantes. Outra abordagem utilizada consiste na utilização de biomateriais associados a células tronco. Esses materiais podem influenciar o comportamento celular direcionando e influenciando diversos processos celulares como a viabilidade e diferenciação.

Células tronco mesenquimais humanas (hMSCs) têm sido utilizadas em numerosos estudos, incluindo a regeneração óssea, onde apresentam papel fundamental em ambos os processos de regeneração e fixação do osso (8–11). Células tronco mesenquimais da medula óssea (hBM-MSC) são as mais comumente utilizadas, contudo seu protocolo de isolamento pode ser invasivo e sua capacidade de diferenciação diminui com a idade (2,12,13). Nesse contexto, os tecidos neo-natais, como o cordão umbilical, podem prover uma fonte de fácil acesso sem a utilização de técnicas invasivas. Além disso, são disponíveis em larga quantidade. É possível que hMSCs do cordão umbilical estejam em um estágio mais inicial de desenvolvimento do que as células da medula óssea (12) resultando em baixa imunogenicidade, aumento na taxa de proliferação e tempo de vida (2,12,13).

No que diz respeito a abordagens de regeneração tecidual, especificamente no tecido ósseo, as reações biológicas aos materiais são de extrema importância. O processo de regeneração óssea envolve o recrutamento de células tronco mesenquimais e a sua diferenciação em osteoblastos funcionais que sintetizam a matriz extracelular regulando a sua mineralização durante o processo de formação óssea. Dessa forma, a diferenciação osteogênica pode ser dividida em três grandes fases de acordo com os perfis de expressão gênica: uma fase inicial com intensa atividade proliferativa, uma

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segunda fase de maturação da matriz e a fase final de mineralização da matriz óssea secretada (14).

Os reguladores precoces da diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos incluem a sinalização Wnt/β-catenina, proteínas morfogenéticas (BMPs), proteínas hedgehog, hormônios endócrinos, reguladores epigenéticos e vários fatores de crescimento (15). O perfil da expressão gênica durante a esse processo é bem estabelicido, contudo os principais reguladores pelos quais o destino das células mesenquimais pode ser controlado não são inteiramente determinados (16). Sabe-se que muitos mecanismos epigenéticos estão envolvidos nesse processo incluindo hipo e hipermetilação de DNA, modificação de histonas e regulação por micro RNA (16–18).

O fator de transcrição 2 relacionado a Runt (Runx2) atua na indução da diferenciação osteogênica e na mudança do perfil de expressão gênica de genes que controlam deposição de matriz extracelular à base de colágeno tipo I (15,19). A atividade de Runx 2 é regulada por muitas vias de sinalização, incluindo as vias de sinalização Wnt, BMP e Notch (19). Uma vez comprometidas com a linhagem osteogênica, as células continuam a desenvolver o perfil genético e morfológico do osteoblasto expressando genes como a fosfatase alcalina, osteopontina, colágeno tipo I e posteriormente osteocalcina (15). A atividade da fostase alcalina é essencial para o ínicio da mineralização da matriz colágena (14). Já a osteopontina, também conhecida como a sialoproteina óssea, é responsável pelo início do processo de nucleação e deposição de hidroxiapatita na matriz óssea indicando seu papel nos estágios iniciais da mineralização. A osteocalcina é uma glicoproteína específica do tecido ósseo que atua promovendo a mineralização da matriz. Ela é expressa por osteoblastos e reflete o final da diferenciação e da maturação da matriz óssea sendo considerada o marcador tardio mais específico da diferenciação osteogênica.

O sistema de sinalização RANK/RANKL/OPG é responsável pelo controle da osteoclastogênese sendo determinante nos processos de formação e reabsorção óssea (20,21). Este receptor ativador do fator nuclear β ligante (RANKL) estimula a diferenciação, sobrevivência e ligação de precursores de osteoclastos, bem como ativa osteoclastos maduros e prolonga seu ciclo de vida.

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Todas essas funções resultam da interação RANKL com o receptor ativador do fator nuclear kappa β (RANK). A osteoprotegerina (OPG), uma proteína que inibe o desenvolvimento de osteoclastos, atua como um receptor chamariz sequestrando RANKL e inibindo a sinalização de RANK (21).

A regulação do sistema RANK/RANKL/OPG é mediada por muitos fatores, mas principalmente por 3 grupos de citocinas. As interleucinas (IL) 1 e 6 e TNF estimulam a diferenciação de osteoclastos aumentando a síntese de várias substâncias, incluindo RANKL, fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF) e fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos. IL-1, TNF, PTH e 1,25-dihidroxi-vitamina D3 estimulam a síntese de osteopontina e das integrinas, que participam da interação entre osteoblastos, células estromais e osteoclastos aumentando o número de citocinas secretadas. Outras citocinas com efeitos inibitórios sobre a osteoclastogênese são o interferon alfa (IFN-α), IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-18 e o fator de crescimento transformador beta (TGF-β) (21–23).

Dados recentes da literatura têm apresentado o impacto da cascata inflamatória na diferenciação osteogênica de células tronco mesenquimais monstrando grande potencial na regulação da diferenciação osteogênica dessas células (23). As citocinas pró-inflamatórias secretadas por monócitos e outros tipos de células desencadeiam cascatas de sinalização que podem influenciar as células mesenquimais a comprometer-se com a linhagem osteogênica (23,24).

Há evidência que as células mesenquimais podem endocitar diferentes tipos de nanopartículas em um processo dependente do seu perfil físico-químico (25). As partículas internalizadas ao serem degradadas com subsequente extravasamento dos seus componentes para o citoplasma podem ocasionar efeitos significativos no comportamento celular, afetando o potencial de proliferação e diferenciação osteogênica (3,25,26). No entanto, há uma grande variabilidade na resposta de células mesenquimais a nanomateriais (25).

As reações biológicas desfavoráveis aos materiais como a indução de estresse oxidativo contribuem para o desenvolvimento da degeneração tecidual

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levando a perda asséptica do implante (27,28). Citotoxicidade, inflamação e o aumento do estresse oxidativo através da formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) têm sido discutidos como fatores relevantes quanto à segurança dos materiais. Dados da literatura indicam que diferentes tamanhos e morfologias de partículas, incluindo nanopartículas de HA, têm o potencial de influenciar a interação com muitos tipos de biomoléculas incluindo citocromo, hemoglobina e DNA (5,29,30). Dessa forma um biomaterial além de não ser antigênico, carcinogênico, tóxico e mutagênico (28) não deve induzir estresse oxidativo. Os testes de biocompatibilidade realizados nas novas superfícies desenvolvidas a partir dos tratamentos superficiais incluem testes de sobrevivência, atividade intracelular (31,32) e potencial genotóxico, o qual é um fator de extrema relevância na avaliação de materiais implantados (33).

A possibilidade de modulação da proliferação e da diferenciação das células mesenquimais através da utilização de nanomateriais e matrizes nano-estruturadas apresenta um grande potencial de aplicação e avanço em medicina regenerativa. Dessa forma, a utilização desses materiais pode permitir a modulação do comportamento celular de modo a otimizar o processo de regeneração em diferentes cenários clínicos. Além disso, com o aumento das aplicações das partículas de HA, as preocupações a respeito de potenciais efeitos tóxicos sobre os seres humanos aumentaram (29).

Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de uma superfície nano- micro estruturada de titânio e de nano e micropartículas de hidroxipatita no comportamento de células tronco mensequimais. O potencial das nanopartículas e micropartículas de HA quanto à sua capacidade de causar genotoxicidade e geração de estresse oxidativo durante o processo de diferenciação osteogênica também foi avaliado.

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2. JUSTIFICATIVA

As células-tronco mesenquimais humanas são células-tronco adultas que podem ser isoladas de vários tecidos, como medula óssea e cordão umbilical (12). A regeneração óssea guiada é um exemplo do uso das células tronco em medicina regenerativa. O processo consiste em regenerar partes do osso através da implantação destas células no local afetado usando um biomaterial como veículo o qual pode servir também como arcabouço para armazenamento de fármacos e/ou biomoléculas visando aumentar o sucesso desse processo (9). São vários os trabalhos na literatura que relatam o uso de biomateriais com células e biomoléculas na indução da osteogênese (1,9,34–37).

Diversos tipos materiais vêm sendo utilizados com o propósito de favorecer o fenômeno da osseointegração. Contudo, reações biológicas desfavoráveis aos materiais como por exemplo a indução de estresse oxidativo contribuem para o desenvolvimento da degeneração tecidual ocasionando a perda asséptica do implante (27,28). Dessa forma, um biomaterial além de não ser antigênico, carcinogênico, tóxico e mutagênico (38), não deve induzir estresse oxidativo. Os testes de biocompatibilidade realizados nas novas superfícies desenvolvidas a partir dos tratamentos superficiais incluem testes de sobrevivência, atividade intracelular (31,32) e potencial genotóxico.

O aumento no número de pacientes que precisam reparar ou repor totalmente ou parcialmente do osso deve-se ao fato de os tecidos rígidos serem frequentemente danificados devido a acidentes, ao envelhecimento, e outras causas como doença degenerativa nas articulações (39,40). Além disso, a grande variabilidade nas respostas celulares aos materiais faz-se com que seja fundamental o desenvolvimento de novos materiais em medicina regenerativa que proporcionem melhor qualidade, durabilidade e estabilidade dos implantes (41).

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Jana Dara Freires de Queiroz Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde 24 OBJETIVOS Avaliação da resposta celular a biomateriais para fins

3. OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar o potencial ósseo-regenerativo da superfície de titânio nano-microestrututada modificada por feixe de LASER (Yb:YAG) e de nano e micropartículas de hidroxiapatita com intuito de contribuir para a compreensão das respostas celulares a esses biomateriais visando seu usoem medicina regenerativa para fins ósseos.

3.1. Objetivos específicos

• Modificar por ablação a laser superfícies de titânio comercialmente puro grau II;

• Determinar a viabilidade e proliferação de células tronco mesenquimais humanas após a exposição a superfície de titânio modificada a laser e as partículas de hidroxiapatita através do ensaio de MTT;

• Analisar a influência dessa superfície na capacidade osteogênica das células tronco;

• Analisar a influência das nano e micropartículas de hidroxiapatita partículas nos processos de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogência das células tronco;

• Avaliar o sistema antioxidante das células expostas as partículas;

• Avaliar a instabilidade genética das células expostas as partículas através de ensaios mutagênicos (CBMN) e genotóxicos (Ensaio cometa) durante a diferenciação osteogênica.

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4. MÉTODOS

4.1. Extração e caracterização das células tronco mesenquimais humanas (hMSC)

Os cordões umbilicais utilizados neste trabalho foram doados (com o consentimento livre e esclarecido das mães) para a realização da presente pesquisa. O material foi obtido de partos realizados na Maternidade Escola Januário Cicco (UFRN), Natal-RN. Cordões com cerca de 15 a 20 cm de comprimento foram colocadas em um frasco estéril contendo tampão de coleta estéril (solução PBS + 3% de solução de antibióticos e antimicótico) e encaminhadas imediatamente para o Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (LBMG) na UFRN. Os procedimentos realizados no presente trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN sob o protocolo n°. FR132464.

As células tronco mesenquimais humanas (hMSC) utilizadas foram extraídas e expandidas conforme descrito por Duarte et al. (42). Após a lavagem do cordão com solução de PBS + antibióticos/antimicótico a veia do cordão foi canulada e lavada internamente com PBS. Foram adicionados 10 mL de solução 0,5% de colagenase tipo IV (Worthington) dentro da veia por 40 minutos no banho-maria a 37 ºC. O cordão foi massageado e as células foram coletadas numa placa de Petri, transferidas para tubos de 15 mL e centrifugada. O sobrenadante foi descartado e o sedimento celular homogeneizado em α-MEM 10% e transferido para frascos de cultura e guardados a 37ºC em incubadora com 5% de CO2 por 48 horas para que as células aderissem. O restante do

material foi cortado em pequenos pedaços, coletados em tubos de 50 mL, lavados com PBS e centrifugado a 1200 rpm por 10 minutos. Os pedaços de tecido foram submetidos a um tratamento enzimático com 10 mL de solução 0,1% de colagenase tipo IV por 16 horas no banho-maria a 37 ºC. Após esse período o material foi centrifugado novamente, lavado com PBS, e acrescentado 10 mL de solução 0,25% de tripsina/EDTA por 15 minutos em temperatura ambiente. A suspensão celular obtida foi centrifugada, o sobrenadante descartado e o sedimento celular homogeneizado em α -MEM 10% e transferido para frascos de cultura e incubados a 37 °C com 5% de CO2 por 48 horas para

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Jana Dara Freires de Queiroz Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde 26

MÉTODOS Avaliação da resposta celular a biomateriais para fins

As células tronco obtidas foram caracterizadas fenotipicamente utilizando citômetria de fluxo. Para essa caracterização fenotípica e definir a pureza as células foram marcadas com anticorpos monoclonais para analisar a expressão de marcadores de superfície típicos. A imunofenotipagem foi realizada com o kit

Human MSC Analysis (562245) de acordo com as recomendações do fabricante

(Becton Dicksinson). Os marcadores presentes são: CD90- FITC, CD105- PerCP-Cy™5.5, CD73- APC, CD45- PE, CD34- PE, CD11b- PE, CD19- PE e HLA-DR- PE. Para cada teste um anticorpo monoclonal foi utilizado como controle de isotípico.

Além disso, para confirmar a natureza multipotente das células extraídas do cordão umbilical foi avaliada a capacidade dessas células de se diferenciarem em osteoblastos e adipócitos na presença de fatores indutores.

4.2. Preparação dos discos de titânio

As superfícies utilizadas foram obtidas a partir do titânio comercial puro grau II, resultando em discos, com diâmetro de 15 mm e espessura de 2 mm, lixados e polidos com lixa de granulação 600. Após o polimento, alguns discos foram submetidos a tratamentos adicionais por irradiação laser (Yb:YAG) usando o sistema de gravação a Laser OmniMark® com três parâmetros diferentes de fluências (132, 210 e 235 J/cm2_{). Dessa forma, diferentes tipos de discos de}

titânio, apresentando superfícies diferentes entre superfícies polidas (sem tratamento adicional) e superfícies porosas (tratadas a laser) foram obtidos.

4.3. Caracterização das superfícies de titânio

4.3.1. Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM)

As topografias dos discos de titânio foram analisadas através de microscopia eletrônica de varredura (JSM T330A scanning microscope).

4.3.2. Difração de raio X

A composição cristalina das superfícies de titânio, como por exemplo tipos e fases de óxidos formados foi analisada por difração de raio-X (XRD) utilizando o difratômero de raios X SIEMENS D5000 (Siemens, Munich, Germany), com escaneamento angular entre 10 e 80°. As camadas óxidas foram caracterizadas

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por comparação dos dados obtidos com os padrões da base de dados do Comitês de estudos de difração do pó (CPDS). A análise quantitativa das fases foi realizada utilizando o refinamento de Rietveld (43).

4.3.3. Medida do ângulo de contato

A molhabilidade das amostras foi avaliada pela medição do ângulo de contato (Ɵ) através do método da gota séssil usando o Sistema de ângulo de contato (OCA-15 video-based optical contact angle meter). O método da gota séssil foi realizado com água ultrapura e o ângulo de contato calculado pela equação de Laplace-Young (SCA 20 software; Dataphysics Instruments GmBh. Germany). As medições foram repetidas três vezes de cada amostra para obter o valor médio do ângulo de contato.

4.4. Cultura de Células e exposição aos biomateriais

Para os bioensaios deste trabalho foram utilizados discos de titânio tradados e não tratados por irradiação de feixe de LASER com fluência de 235 J/cm2_{produzidos pelo grupo de Biomateriais do Instituto de Química de}

Araraquara, coordenado pelo prof. Dr. Antônio Carlos Guastaldi. As partículas utilizadas foram nanopartículas (nanoXIM•HAp102®; Fluidinova, S. A.) e micropartículas de hidroxiapatita (Plasma Biotal) nas concentrações finais de 0.1, 1 e 10 µg/mL.

As células tronco mesenquimais humanas (hMSC) (6ª a 8ª passagens) foram cultivadas em meio α-Men, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100 U/mL de penicilina, 100 U/mL estreptomicina e 1% de L-glutamina. A cultura foi mantida a 37º C em atmosfera úmida com 5% de CO2 e o meio trocado a cada

3 dias. Para a exposição as partículas as células foram semeadas (104_células

por cm2_{) em placas de cultivo e após 24h de plaqueamento expostas as}

partículas. Já para a exposição ao titânio as células foram semeadas (104_células

por cm2_{) sobre os discos. O meio foi trocado 24 horas depois e as células}

mantidas em cultura até completarem 3 e 7 dias de tratamento. Para o tempo de 24 horas de exposição os ensaios foram realizados logo após o período de tratamento sem troca de meio.

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4.5. Proliferação indireta

A análise da proliferação celular após exposição as partículas foi realizada através do ensaio MTT (Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) (Molecular Probes™), conforme descrito por Queiroz et al. 2014 (44) com as modificação a seguir. A solução de MTT a 0,5 mg/mL foi preparada pela dissolução em meio D-MEM pobre sem fenol red. Após os períodos de exposição (3h, 1, 3 e 7 dias) a solução de MTT foi adicionada. O material foi incubado no escuro por 4h a 37°C em atmosfera úmida com 5% de CO2. A solução foi retirada

e os cristais de formazana foram solubilizados com DMSO. A placa foi mantida sob agitação constante durante cinco minutos em ambiente escuro e a densidade ótica foi medida em 570 nm de comprimento de onda, utilizando o leitor de microplaca µQuant (Biotek, EUA). As mesmas condições testadas nas células tronco mesenquimais também foram ensaiadas utilizando células CHO-k1 e discos de titânio.

4.6. Análise morfológica através de SEM

A adesão e morfologia das hUC-MSCs e células CHO-K1 crescidas nas superfícies de titânio após 24 h e 7 dias foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura no CETENE, PE. As amostras foram fixadas com 2.5% de glutaraldeído, tratadas com 1% de tetróxido de ósmio (OsO4) por 30 min, e desidratadas com soluções seriais de etanol (30, 50, 70, 90, e 100%). As amostras foram visualizadas com Quanta 200 SEM (FEI, OR, USA) após revestimento com ouro.

4.7. Diferenciação osteogênica.

A avaliação da diferenciação osteogênica foi realizada durante 7 e 14 dias após a exposição as partículas com e sem meio indutor. Após as primeiras 24h de tratamento com as nano e micropartículas parte da cultura foi incubada com meio basal (D-Mem + 10% SFB + 1% de L-glutamina e 1% de antibióticos) enquanto que a outra parte com meio indutor para osteogênese (Osteogenesis

Differentiation kit StemPro® - A10072-01).

Passados 7 e 14 dias o sobrenadante foi retirado e as células fixadas

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com vermelho de Alizarina. A análise morfológica foi realizada em microscópio ótico com 400 x de magnificação. A análise quantitativa foi realizada conforme descrito por Jaager et al. (45) através da eluição dos corantes seguida de leitura da densidade ótica utilizando o leitor de microplaca µQuant (Biotek, EUA).

4.8. Diferenciação osteogênica após exposição ao titânio.

A avaliação da diferenciação osteogênica nos discos de titânio foi realizada durante 7 e 14 dias após a exposição aos discos de titânio com e sem meio indutor. Após as primeiras 24h de exposição parte da cultura foi incubada com meio basal (MB) (D-MEM + 10% SFB + 1% de L-glutamina e 1% de antibióticos) enquanto que a outra parte com meio indutor (D-Mem completo + (10-7_{M dexametasona, 10 mM glicerofosfato e 0.2 mM ácido áscórbico).}

Após 7 e 14 dias o sobrenadante foi retirado e as células fixadas overnight com etanol 70% para a osteogênese. Após a fixação as células foram lavadas e coradas com vermelho de Alizarina. A análise morfológica foi realizada em microscópio ótico com 400 x de magnificação. A análise quantitativa foi realizada conforme descrito por Jaager et al. (45) através da eluição do corante seguida de leitura da densidade ótica utilizando o leitor de microplaca µQuant (Biotek, EUA).

4.9. Atividade da fosfatase alcalina

A atividade de fosfatase alcalina foi mensurada depois de 3 e 7 dias utilizando o kit para Atividade de fosfatase alcalina (Labtest Diagnostica LTDA; Minas Gerais, Brazil) de acordo com as instruções do fabricante para as células expostas ao titânio. A concentração proteica das amostras foi determinada pelo método de BCA e utilizada para normalizar a atividade enzimática detectada.

Já para as partículas, o extrato celular utilizado foi obtido através do rompimento celular com tampão de lise (0,1 M NaHCO3–Na2CO3, 0.1% Triton

X-100, 1.5 mM MgCl2). O material foi então incubado com o substrato p-nitrofenil

fosfato (1 mg/mL) em incubadora umidificada durante 1 hora a 37 ºC e 5% CO2.

Após esse período a absorbância foi medida em 405 nm utilizando leitor de microplaca.

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4.10. Avaliação da expressão gênica por qRT-PCR

RNA total foi extraído com PureLink® RNA mini kit (Thermo Fisher Scientific) e reversamente transcrito utilizando High Capacity cDNA Reverse

Transcription Kit (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante nas amostras

expostas aos discos de titânio. Três amostras de RNA, de cada condição teste, foram preparadas em dois experimentos independentes. A PCR em tempo real foi realizada com 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems) utilizando um painel de primers de marcadores osteogênicos. As diferenças na expressão gênica da superfície tradada foi analisada pelo método do ΔΔCt e normalizada através da expressão de GAPDH. Os dados foram apresentados como o fold change obtido em comparação com a superfície de titânio sem tratamento.

4.11. Avaliação do Estresse Oxidativo

4.11.1. Dosagem de enzimas antioxidantes

A atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) foi mensurada no extrato celular utilizando os kits: Catalase

Assay Kit 707002 e Superoxide Dismutase Assay Kit 706002 (Cayman Chemical,

Ann Arbor, MI) de acordo com as recomendações do fabricante. A concentração protéica das amostras foi determinada pelo método de BCA e utilizada para normalizar a atividade enzimática detectada.

O kit utilizado para catalase (Catalase Assay Kit) fundamenta-se na função peroxidática da catalase para a determinação da atividade enzimática. O método é baseado na reação da enzima com metanol, na presença de uma concentração ótima de H2O2. O metanol que serve de substrato para atividade

peroxidática da catalase não é utilizado por outras peroxidases. O formaldeído produzido é medido espectrofotometricamente utilizando-se o 4-amino-3-hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol (Purpald) como cromógeno. O Purpald reage especificamente com aldeídos e o produto dessa reação, ao sofrer oxidação, origina um produto de coloração roxa.

Para a dosagem dos níveis de SOD o kit utiliza um sal tetrazólio para a detecção de O2•– gerados pela xantina oxidase e hipoxantina, sendo uma

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unidade de SOD definida como a quantidade de enzima necessária para dismutar 50% do O2•–. O ensaio avalia todos os três tipos de SOD (Cu/Zn, Mn e FeSOD).

4.11.2. Carbonilação de proteínas

A carbonilação de proteínas foi mensurada para detectar dano oxidativo nas células expostas as partículas. O dano oxidativo em proteínas pode ocorrer devido ao ataque direto de espécies reativas ou indiretamente através da sua ligação com produtos finais de lipoperoxidação. O grupamento amina dos aminoácidos, ao ser atacado por espécies reativas, transforma-se em carbonil. A 2’,4’-dinitrofenilhidrazina (DNPH) liga-se a esse grupamento, gerando uma base de Schiff que produz uma hidrazona correspondente. Dessa forma, a carbonilação de proteínas pode ser avaliada colorimetricamente a 370 nm. O conteúdo de grupamentos carbonil é calculado usando o coeficiente de absorção molar para hidrazonas alifáticas, 22000 M-1cm-1, e expresso como nmol carbonil/mg de proteína.

Para este ensaio, foi utilizado o kit Protein carbonyl assay (Cayman), nos extratos proteicos após 7 dias de exposição as maiores concentrações de nano e micropartículas de hidroxiapatita (10ug/ul). Os extratos foram obtidos conforme proposto (46). As células foram retiradas das placas utilizando-se um raspador de células, recuperadas por centrifugação (2740 g a 4°C por 5 minutos) e incubadas por 20 minutos a 4°C em tampão de lise (1M Tris; 5M NaCl; 10%SDS; H2O ultrapura, inibidores de protease e benzonase). Os produtos da

lise foram centrifugados (16450 g a 4ºC por 30 minutos) e os sobrenadantes contendo o extrato de proteínas totais foram quantificados pelo método de BCA.

4.12. Dosagem de citocinas/quimiocinas

As dosagens foram realizadas utilizando o sobrenadante das culturas após 24h, 3 e 7 dias após a exposição as partículas em meio basal. Os níveis foram medidos pela metodologia xMAP (Bio-Plex 200) suspension array system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), utilizando o Bio-Plex Pro human cytokine (group

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citocinas/quimiocinas analizadas foram TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IFN-y e GM-CSF. As amostras foram dosadas em duplicata.

Resumidamente, uma mistura do padrão foi reconstituída em 0,25 mL de água deionizada, gerando uma concentração estoque de 10.000 pg/mL para cada marcador. O estoque padrão foi serialmente diluído no tampão de ensaio disponibilizado pelo kit gerando 6 pontos para a curva padrão, disponibilizando uma faixa de concentração para o ensaio entre 3.2-10.000 pg/mL. As amostras foram incubadas com o anticorpo acoplado a microesferas por 16 horas, a 4ºC. com agitação contínua. As microesferas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem para a remoção de proteínas e então incubadas com anticorpo específico ligado a biotina para detecção de cada citocina/quimiocina por 1h, em agitação continua. Em seguida foi adicionado estreptavidina-ficoeritina e incubado por 30 minutos. Após a incubação as microesferas foram lavadas e ressuspendidas com o líquido de circulação do equipamento. Todas as amostras foram submetidas ao Bio-Plex suspension array system, que identificou cada diferente microesfera e quantificou cada proteína marcada baseada na fluorescência da ficoeritina. As concentrações de citocinas foram calculadas automaticamente pelo software Bio-Plex Manager usando uma curva padrão derivada de citocinas recombinantes humana.

4.13. Avaliação da genotoxicidade

Para a avaliação da genotoxicidade as células foram tratadas apenas com a concentração de 10 ug/ul das partículas uma vez que nessa concentração foi observado indução de diferenciação osteogênica sem a presença de fatores indutores.

4.13.1. Ensaio Cometa

O ensaio cometa foi realizado conforme protocolo descrito por Tavares et al. 2009 com algumas modificações a seguir. 10 μL da suspensão celular (1x 106_{) crescidas após 24h, 3 e 7 dias de exposição a 10 ug/ul de nano e}

micropartículas de hidroxiapatita e o controle foram ressuspendidas em 75 μl de agarose Low Melting fundida e aplicada em lâminas microscópicas revestidas previamente com agarose normal 1,5%. Para expor os núcleos, as lâminas

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contendo as células foram incubadas em solução de lise (2,5 M NaCl; 10 mM Tris; 100 mM EDTA; 1%Triton X-100) a 4ºC, por 16hs. Posteriormente, as lâminas foram lavadas em PBS e incubadas em solução de eletroforese alcalina (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH > 13) por 25 minutos, período necessário para rompimento das pontes de hidrogênio e desnaturação do DNA, como também para conversão de sítios incompletamente reparados e sensíveis a álcalis em quebras simples fita. Em seguida, as lâminas foram submetidas à eletroforese 300mA, 25 V por 30 minutos. Após a eletroforese a neutralização foi realizada por lavagem com uma solução de 0.4 M Tris-HCl (pH 7,5). As lâminas foram fixadas com etanol gelado e reidratadas com água destilada gelada. Cada lâmina foi corada com 50 μL de brometo de etídio (20 µg/mL).

As lâminas foram analisadas em microscópio de fluorescência em aumento de 400 X. Foram analisadas 100 células para cada tratamento. A quantificação dos danos foi feita através da análise do “tail moment” (parâmetro calculado pelo sistema de análise computadorizada da imagem considerando a migração da cauda do cometa e a quantidade de DNA na cauda), utilizando o software CASP (http://www.casp.of.pl).

4.13.2. Ensaio CBMN

O ensaio CBMN foi realizado seguindo a metodologia descrita Cornélio et. al 2014 (47). Neste ensaio, foram analisadas células que completaram uma divisão celular após a exposição as partículas e que eram binucleadas. 8x104

células foram semeadas em cada garrafa T25, após 24 horas de exposição às partículas, o meio de cultura foi retirado, os frascos lavados com PBS e acrescentado novo meio com citocalasina-B (concentração 4,5 µg/mL) por 24 horas. Após o períodos de exposição às partículas (24h, 3 dias e 7 dias) as hMSC foram retiradas com tripsina/EDTA e transferidas para tubos de 15 mL. Foi acrescentado 200 µL de KCl a 75 mM durante 3 minutos. A hipotonização foi interrompida com 1 mL de fixador (9 metanol:1 ácido acético) homogeneizado lentamente com as células. Após a centrifugação por 6 minutos a 1200 rpm, a hipotônica foi descartada e colocou-se gota a gota o fixador, que agiu por no mínimo meia hora antes da primeira troca de fixador e preparo das lâminas. 20 µL do precipitado celular foi pingado sobre lâminas posicionadas em cima do banho-maria a 40 ºC. Depois que as lâminas secaram, elas foram coradas com

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giemsa por 10 minutos. As células foram analisadas em microscópio comum (OLYMPUS CX31) com a objetivas de 40 x e 100 x. No total de 2000 células foram analisados em cada grupo experimental. Os critérios utilizados para identificar micronúcleo (MN), ponte nucleoplasmática (NPB) e broto (NBud) em células binucleadas foram descritos por Fenech e colaboradores (2007) (48).

4.14. Análise estatística

Todos os ensaios foram realizados pelo menos em dois experimentos independentes com três replicatas técnicas. Os dados foram analisados por

one-way analysis of variance (ANOVA) (p<0.05) e teste de Tukey para comparações

múltiplas entres os grupos. Os dados foram apresentados como média e desvio padrão.

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ARTIGO 1

Participação como autor em artigo científico produto da tese:

Título: Laser-modified titanium surfaces enhance the osteogenic differentiation

of human mesenchymal stem cells.

Autores: Tatiana A. B. Bressel, Jana Dara Freires de Queiroz, Susana Margarida

Gomes Moreira, Jéssyca T. da Fonseca, Edson A. Filho, Antônio Carlos Guastaldi e Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros.

Revista: Stem Cell Research & Therapy Fator de Impacto: 4.211

Qualis CAPES: A1 MEDICINA II Status: Publicado

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R E S E A R C H Open Access

Laser-modified titanium surfaces enhance

the osteogenic differentiation of human

mesenchymal stem cells

Tatiana A. B. Bressel1†, Jana Dara Freires de Queiroz1,3†, Susana Margarida Gomes Moreira1, Jéssyca T. da Fonseca1, Edson A. Filho2, Antônio Carlos Guastaldi2and Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros1*

Abstract

Background: Titanium surfaces have been modified by various approaches with the aim of improving the

stimulation of osseointegration. Laser beam (Yb-YAG) treatment is a controllable and flexible approach to modifying surfaces. It creates a complex surface topography with micro and nano-scaled patterns, and an oxide layer that can improve the osseointegration of implants, increasing their usefulness as bone implant materials.

Methods: Laser beam irradiation at various fluences (132, 210, or 235 J/cm2) was used to treat commercially pure titanium discs to create complex surface topographies. The titanium discs were investigated by scanning electron microscopy, X-ray diffraction, and measurement of contact angles. The surface generated at a fluence of 235 J/cm2 was used in the biological assays. The behavior of mesenchymal stem cells from an umbilical cord vein was evaluated using a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, a mineralization assay, and an alkaline phosphatase activity assay and by carrying out a quantitative real-time polymerase chain reaction for osteogenic markers. CHO-k1 cells were also exposed to titanium discs in the MTT assay.

Results: The best titanium surface was that produced by laser beam irradiation at 235 J/cm2fluence. Cell proliferation analysis revealed that the CHO-k1 and mesenchymal stem cells behaved differently. The laser-processed titanium surface increased the proliferation of CHO-k1 cells, reduced the proliferation of mesenchymal stem cells, upregulated the expression of the osteogenic markers, and enhanced alkaline phosphatase activity.

Conclusions: The laser-treated titanium surface modulated cellular behavior depending on the cell type, and stimulated osteogenic differentiation. This evidence supports the potential use of laser-processed titanium surfaces as bone implant materials, and their use in regenerative medicine could promote better outcomes.

Keywords: Titanium, Laser beam (Yb-YAG), Surface modification, Human umbilical cord, Mesenchymal stem cells, Osteoinduction, Biocompatibility

Background

In recent decades, research into biomaterials has in-creased, in part to meet demands for materials that will extend the longevity of an ageing population [1]. Concern-ing the applications of regenerative medicine, a synthetic scaffold should not only be biocompatible and biodegrad-able to allow native tissue integration, but should also

mimic the hierarchical structure of the native tissue. The extracellular matrix is the natural cell scaffold, and it has a wide variety of topographies at the micro/nano scale [2].

Although diverse implantable biomaterials can be used in bone regenerative medicine [3], titanium (Ti) has long been the gold standard for orthopedic and dental ap-proaches [4]. However, several problems related to a loss of aseptic character and implant failure have been de-scribed [5]. Furthermore, several critical parameters, such as interactions with body fluids and the physico-chemical properties of the implants, are crucial for the longevity and load-bearing capacity of the materials [6].

* Correspondence:sbatistu@gmail.com;sbatistu@cb.ufrn.br †_{Equal contributors}

1_{Departamento de Biologia Celular e Genética, CB}_{—UFRN, Universidade}

Federal do Rio Grande do Norte, Campus Universitário, Lagoa Nova, 59072-970 Natal, RN, Brazil

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Bresselet al. Stem Cell Research & Therapy (2017) 8:269 DOI 10.1186/s13287-017-0717-9

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Cell attachment and cell growth are primarily associated with the chemistry of the material and surface characteris-tics such as roughness, wettability, and surface energy [7].

Titanium surfaces have been modified by various ap-proaches with the aim of improving the stimulation of osseointegration. Laser beam (Yb-YAG) treatment is a controllable and flexible approach to modifying surfaces, and it can be used in industrial applications [4, 8]. The technique produces a surface with nano-to-micro hybrid structures, high purity, increased surface area, corrosion resistance, biocompatibility owing to the formation of oxide layers, and an increase in bone–implant interac-tions [8, 9]. The laser irradiation parameters influence surface melting; therefore, it is possible to create differ-ent surfaces by simply changing those parameters [8]. It is theoretically possible to develop a surface with charac-teristics optimized for cell attachment, growth, and/or differentiation.

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) have been utilized in numerous studies, including those on bone repair, because they play a crucial role in bone regener-ation and fixregener-ation [3, 5, 10, 11]. Human bone marrow mesenchymal stem cells (hBM-MSCs) are the most commonly used cells. However, their isolation can be in-vasive, and their ability to differentiate decreases with age [2, 12, 13]. Neonatal tissues, such as those found in the umbilical cord, are an easily accessible source of hMSCs, and they can be obtained without resorting to painful or invasive techniques. Moreover, they are avail-able in relatively large quantities. It is possible that the hMSCs from umbilical cord tissue are at an earlier stage than cells from adult bone marrow [12]; they therefore have lower immunogenicity, an enhanced proliferation rate, and a greater lifespan [2, 12, 13].

Hybrid hMSC–biomaterial scaffolds therefore have po-tential for use in bone prosthetics. In situ, cells migrate off the scaffold and undergo differentiation leading to in-tegration of the device and regeneration of the damaged tissue. Furthermore, factors such as the physical proper-ties of the scaffold can stimulate and improve this process [2].

Based on a hybrid hMSC–biomaterial approach, the aim of the present study was to investigate the osteore-generative effect of a laser-modified nano-to-micro-scale hybrid surface on human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs).

Methods Titanium discs

The Ti discs were prepared at UNESP (Araraquara, Brazil). Commercially pure grade II Ti discs (diameter = 15 mm; thickness = 2 mm) were subjected to multipulse Yb:YAG laser irradiation treatment using an OmniMark machine (Omnitek Tecnologia). The Ti discs were polished with

abrasive grit (grades 240–600), then treated with laser radi-ation at various fluences (132, 210, or 235 J/cm2). Accord-ing to the characterization results, the laser-processed titanium (LPT) surface obtained at 235 J/cm2fluence was selected for the biological assays. Untreated Ti discs were used as controls. All of the discs were cleaned and sterilized with gamma radiation.

Sample characterization

The surface topographies of the Ti discs were investigated by scanning electron microscopy (SEM) (JSM T330A scanning microscope). The crystalline composition of the modified surfaces, such as the types and phases of oxides formed, were analyzed by X-ray diffraction (XRD) using a SIEMENS D5000 X-ray diffractometer (Siemens, Munich, Germany), with angular scanning between 10 and 80°.

The oxide layers were characterized by comparing the obtained data with the standard records in the Commit-tee for Powder Diffraction Studies (CPDS) database. Quantitative phase analysis was carried out using Rietveld refinements [14]. The phases considered are presented in Table 1. The wettability of the samples was evaluated by measuring the contact angle (Ɵ) at room temperature (sessile drop method) using an OCA Contact Angle Sys-tem (OCA-15 video-based optical contact angle meter). The sessile drop method was applied with ultrapure water and the contact angle was calculated by the Laplace– Young function (SCA 20 software; Dataphysics Instru-ments GmBh. Germany). The measurement was repeated three times for each sample to obtain the mean value of the contact angle (Ɵ) for the various surfaces (Table 2).

Cell culture

Human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) were isolated, characterized, and cultured as de-scribed previously [15], and following the Local Ethics Committee directions (FR132464). A Chinese hamster ovary cell line (CHO-k1, ATCC® CCL-61™), kindly pro-vided by Dr Carlos Menck, was cultured as described by de Queiroz et al. [16].

Table 1 Crystalline structures of identified phases obtained by laser ablation and percentage of oxide layer in the irradiated titanium surfaces

Phase Oxide layer (%)

132 J/cm2 _{210 J/cm}2 _{235 J/cm}2 α titanium (hexagonal) 47.1 42.2 43.5 β titanium (cubic) 11.2 9.4 5.9 TiO (rhombohedral) 5.3 6.4 11.4 Ti2O (rhombohedral) 27.7 38.5 7.3 Ti3O (rhombohedral) – 1.3 30.8 Ti6O (rhombohedral) 8.6 2.2 1.0