II
© Autorizada a reprodução parcial desta dissertação (condicionada à autorização das editoras das revistas onde os artigos foram publicados) apenas para efeitos de investigação, mediante declaração escrita do interessado, que a tal se compromete.
A realização deste trabalho foi possível graças à concessão de uma Bolsa de Doutoramento (SFRH/BD/47200/2008) pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), financiada pelo Programa Operacional Potencial Humano (POPH) - Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN) - Tipologia 4.1 - Formação Avançada, comparticipado pelo Fundo Social Europeu (FSE) e por Fundos Nacionais do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES). Em associação à Bolsa de Doutoramento, a candidata contou ainda com subsídios para a realização de trabalho no estrangeiro e para deslocamento a congressos internacionais.
Os estudos apresentados nesta dissertação foram realizados no Laboratório Grupo de Reação e Análise Química (GRAQ) do Instituto Superior de Engenharia do Porto do Instituto Politécnico do Porto, no Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, no Grupo de Química dos Alimentos (Linha 2), e no grupo de Residue Chemistry and Predictive Microbiology,
V
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer à Fundação para a Ciência e Tecnologia pela concessão da bolsa de doutoramento (SFRH/BD/47200/2008), pelo apoio para a deslocação aos EUA e aos encontros científicos. De igual forma agradeço aos grupos de investigação onde estive inserida por todo o apoio financeiro.
Um agradecimento especial aos meus orientadores: professora Doutora Valentina Domingues, professora Doutora Cristina Delerue-Matos e ao professor Doutor Nuno Mateus. O meu sincero agradecimento porque estiveram sempre presentes e deram todo, mesmo todo o apoio para a concretização deste trabalho.
Ao Steven Lehotay, por me receber no Departamento de Agricultura dos Estados Unidos da América (USDA), e ter proporcionado uma experiência científica muito gratificante, e apesar de pouco tempo foi sem dúvida muito marcante neste percurso.
Ao Doutor Luís Silva pela colaboração na elaboração do trabalho estatístico.
Ao professor Doutor Victor Freitas pela simpatia e todo apoio prestado.
Aos meus colegas do GRAQ/ISEP e CIQ/FCUP, pelo companheirismo e os bons momentos que passamos juntos.
Não posso deixar de fazer um agradecimento à Paulinha, pelas palavras amigas e acolhedoras.
A todos os alunos que trabalharam comigo no laboratório de cromatografia gasosa, juntos aprendemos a trabalhar em equipa e com inter-ajuda.
Às visiting scientists da USDA, Lucia Geis e Hyeyoung, por todo o apoio no laboratório. Sem esse apoio seria impossível atingir os objetivos propostos na minha visita à USDA.
VI
Um agradecimento muito muito especial, à minha família e aproveitar para dizer que gosto muito de vocês.
O agradecimento mais profundo é para o meu Floriano, ele foi a pessoa com quem eu partilhei todas as milestones deste projeto científico e sempre se mostrou muito interessado, preocupado, paciente, motivador…é com ele que quero continuar a partilhar esta vida.
VII
RESUMO
A agricultura atua sobre o meio alterando as relações entre os seres vivos e permitindo a obtenção de recursos. Esta alteração, levada a cabo pelo Homem, pode ser feita de forma mais ou menos intensiva, com maior ou menor respeito pelos equilíbrios naturais. Face às novas tecnologias e ao uso de pesticidas e fertilizantes, conseguiram-se obter grandes produções agrícolas através de um cultivo intensivo, com elevados consumos de recursos e sem limitações nos impactos ambientais. Estes métodos correspondentes a uma agricultura designada de convencional provocaram reações resultando em alternativa a agricultura de proteção integrada (IPM) e a agricultura biológica (OF). Sendo o solo de cultivo a base de todo o processo produtivo, a sua qualidade é motivo de preocupação para mais tratando-se um recurso escasso.
Vários estudos comprovam que os produtos biológicos (POF) são mais seguros para os consumidores, apresentam melhores características em termos de análise sensorial, constituintes nutricionais e composição polifenólica. Esta opinião não é partilhada por todos existindo estudos que contrariam essa evidência e apontam para a presença de resíduos de produtos químicos, como são exemplo os pesticidas.
Um dos POF com grande interesse para a população é o morango, pela alteração/intensificação do sabor quando comparado com morangos de cultivo convencional. O facto de ser um fruto sem casca, não possibilitando por isso a eliminação de pesticidas por essa via, torna este fruto de relevante importância para o controlo destes contaminantes. O morango apresenta um importante valor nutricional, contém várias substâncias necessárias ao nosso organismo, e é considerado um alimento que pode ajudar na prevenção de diversas doenças. Este fruto é frequentemente utilizado na nossa dieta, como fruta fresca bem como em alimentos processados. A produção de morangos em Portugal utiliza estes dois tipos de agricultura OF e de IPM. No entanto ainda não existem dados que permitam identificar efeitos benéficos para a saúde humana da OF relativamente à IPM, considerando as propriedades do morango no que se refere, por exemplo, à capacidade antioxidante, nem em relação ao estado de contaminação por pesticidas. E consequentemente, é desconhecida qual a contaminação por pesticidas dos alimentos processados à base de morangos.
Neste trabalho de investigação, os principais objetivos consistiram em efetuar uma caracterização polifenólica dos morangos de OF e IPM e avaliar a presença de pesticidas pertencentes a diferentes classes, no fruto e respetivo solo de cultivo e
VIII
também em compotas de morango. Para o controlo dos pesticidas nas amostras foi necessário desenvolver diversos métodos cromatográficos (cromatografia gasosa com deteção de espectrometria de massa (GC-MS) e captura de eletrões (GC-ECD); cromatografia gasosa de baixa pressão de espectrometria de massa em modo tandem (LP-GC-MS/MS); cromatografia gasosa bidimensional de espectrometria de massa por tempo de voo (GCxGC-TOF/MS); cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa em modo tandem (LC-MS/MS).
O trabalho teve início na otimização dos parâmetros instrumentais (IT, EV, ET, fator q e IMW) da técnica analítica GC-IT-MS/MS. Uma análise estatística dos resultados experimentais permitiu obter uma combinação de parâmetros ótimos para cada pesticida em estudo. Na sequência do trabalho foram desenvolvidas e validadas duas metodologias baseadas em microextração em gota (SDME) e num método designado por “quick, easy, cheap, effective, rugged and safe” (QuEChERS), para a extração de pesticidas das amostras de morangos, compotas de morango e solos. Os valores dos limites de deteção (LOD) variaram entre 0,7 - 11,5 µg/kg para os morangos, 0,8 - 8,9 µg/kg para compotas e 2,9 - 7,3 µg/kg para solos utilizando a metodologia QuEChERS e limpeza em fase sólida dispersiva (d-SPE). Foram obtidos LODs semelhantes para a extração realizada com QuEChERS e limpeza com pontas de pipeta descartáveis (DPX) para morangos e solos. Relativamente à SDME os LODs obtidos para os pesticidas organoclorados foram mais baixos (0,003 - 0,12 µg/kg) para todas as amostras em estudo. Estes métodos analíticos foram aplicados a 45 amostras recolhidas ao longo do tempo, tendo sido avaliada a exposição do consumidor a estes pesticidas. Os pesticidas encontrados nos morangos foram o lindano, β-endossulfão, fludioxinil, iprodiona, bifentrina, mepanipirim, tolilfluanida, malatião, tetraconazol, fenexamida, fluazifope-p-butilo, oxifluorfena e ciprodinil. Os pesticidas detetados nos solos de cultivo foram os identificados nos respetivos morangos. Nas amostras provenientes de agricultura biológica apenas foram identificados os pesticidas organoclorados (lindano e β-endossulfão).
Na última parte deste trabalho, procedeu-se ainda à avaliação de algumas propriedades antioxidantes dos mesmos morangos nomeadamente a capacidade antiradicalar e o poder redutor recorrendo a métodos espectrofotométricos como o método do DPPH e FRAP e à caracterização polifenólica através do método Folin-Ciocalteu. Verificou-se que os morangos biológicos apresentam uma maior capacidade antiradicalar (44% superior). Este resultado deverá estar relacionado com o teor em antocianinas que nestes morangos é superior.
O estudo realizado sugere que os teores de pesticidas presentes nas amostras analisadas não representam risco para saúde humana, exceto no caso em que foi
IX
detetado lindano (13 - 27 µg/kg) acima do limite máximo de resíduo (LMR) estabelecido para os morangos. É importante salientar que estes pesticidas organoclorados foram identificados em amostras de ambas as práticas agrícolas. Ao mesmo tempo podemos afirmar que os morangos produzidos por OF apresentam propriedades antioxidantes significativamente superiores quando comparados com os morangos IPM.
Palavras-chave: morango, solo, compota, agricultura biológica, QuEChERS, SDME,
X
ABSTRACT
Agriculture actions on the environment change the relationships between living beings and at the same time giving us some resources. This amendment, carried out by humans, can be made more or less intensive, more or less respect for the natural balances. With the new technologies, it was possible to obtain bigger yields and high resources consumption, without limitations on negative impacts. In order to oppose this production type, agriculture emerged integrated pest management (IPM) and organic farming (OF), as alternatives to conventional methods. The agricultural soils are the base of production process and this resource is a major concern in farming. Several studies have demonstrated that organic products (POF) are safer, better in terms of sensory analysis, nutritional and polyphenolic composition. However, other studies showed the presence of chemical residues.
One of POF with greater interest is the strawberry. The change/enhancement of flavor when compared to conventionally grown strawberries. The strawberry has an important nutritional value, contains several required substances and that can help to prevent several diseases. This fruit is widely used in our food, like fresh fruit and processed food. These two agricultural practices are being applied in the production of strawberries in Portugal, but still do not have data about a beneficial effect on human health, including the antioxidant capacity or pesticide contamination. Consequently, pesticide contamination of processed food like strawberry jam as it is also unknown. In this research work, the main objectives were to make a polyphenolic characterization of strawberries from OF and IPM and confirm the presence of pollutants such as pesticides from different classes in fruit, their soil and also in strawberry jam.
It was also aim of this study to monitor a wide range of pesticides using several chromatographic methods (gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), gas chromatography with electron capture detection (GC-ECD), low-pressure gas chromatography triple quadrupole tandem mass spectrometry (LP-GC-MS/MS); two-dimensional gas chromatography and time-of-flight mass spectrometry (GCxGC-TOF/MS); liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).
This work started by developing a study on optimization the instrumental GC-IT-MS/MS parameters (IT, IV, ET, q factor IMW). An experimental study coupled with statistical analysis afforded a combination of optimal parameters for each pesticide. In the next stage of the work, methodologies based on SDME and a method called "quick, easy, cheap, effective, rugged and safe" (QuEChERS) for the extraction of pesticides from samples of strawberries, strawberry jam and soils were developed and validated.
XI
The values of detection limits ranged from 0.7 to 11.5 µg/kg for strawberries, 0.8 to 8.9 µg/kg for jams and 2.9 to 7.3 µg/kg for soils using QuEChERS and dispersive solid phase extraction (d-SPE) methodology. LODs obtained from extraction performed with QuEChERS and disposable pipette tips (DPX) cleanup for strawberries and soils were similar. The LODs obtained for OCP with SDME were considerably lower (0.003 to 0.12 µg/kg) for all samples analyzed. These analytical methods were applied to 45 samples collected over time and pesticide exposures were evaluated. Pesticides found in strawberries were lindane, β-endosulfan, fludioxinil, iprodione, bifenthrin, mepanipirim, tolylfluanid, malathion, tetraconazole, fenhexamid, fluazifop-p-butyl, oxyfluorfen and cyprodinil. The pesticides detected in soil were also identified on the related strawberries. In samples from OF, only OCP were identified (lindane and β-endosulfan).
The last part of this work was the evaluation of some antioxidant properties of these strawberries from the different agricultural practices. The antiradical and reducing properties were assessed using spectrophotometric methods such as FRAP and DPPH. The polyphenolic characterization was evaluated using the Folin- Ciocalteu method. It was found that the OF strawberries presented a higher antiradical capacity (40% more). This increase should be related to the anthocyanin content.
This study suggests that the pesticide levels detected in samples present no risk to human health, except in case of strawberries with lindane (13 - 27 µg/kg) above MRL. Remarkably, these OCPs were identified in samples from both agricultural practices. OF strawberries have significantly higher antioxidant capacity when compared with IPM strawberries.
XII
TRABALHOS
(PUBLICAÇÕES
E
COMUNICAÇÕES)
DESENVOLVIDOS
NO
ÂMBITO
DO
PROJETO
DE
DOUTORAMENTO
Publicações de artigos em revistas de circulação internacional com arbitragem científica referenciadas no Journal Citation Reports da ISI Web of Knowledge:
1. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Determination of pesticides in fruits and juices. An overview,
Journal of Chromatographic Science 49 (9) (2011) 715-730 (DOI:
10.1093/chrsci/49.9.715).
2. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Organochlorine Pesticides Residues in Strawberries from Integrated Pest Management and Organic Farming, Journal of Agricultural
and Food Chemistry 59 (14) (2011) 7582-7591 (DOI: 10.1021/jf103899r).
3. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Analysing organochlorine pesticides in strawberry jams using GC-ECD, GC-MS/MS and QuEChERS Sample Preparation, Food Additives
and Contaminants Part A-Chemistry Analysis Control Exposure & Risk Assessment 29 (7) (2012) 1074-1084 (DOI:10.1080/19440049.2012.682319).
4. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Victor de Freitas, Cristina F. Delerue-Matos, Nuno Mateus. Strawberries from integrated pest management and organic farming: phenolic composition and antioxidant properties, Food
chemistry 134 (4) (2012) 1926-1931 (DOI: 10.1016/j.foodchem.2012.03.130).
5. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Pesticides residues in Portuguese strawberries grown in 2009-2010 using Integrated Pest Management and Organic Farming, Environmental
Science and Pollution Research 19 (9) (2012) 4184-4192 (DOI:
10.1007/s11356-012-0934-9).
6. Virgínia C. Fernandes, Viswanathan Subramanian, Nuno Mateus, Valentina F. Domingues, Cristina Delerue-Matos. The development and optimization of a
XIII modified single-drop microextraction method for organochlorine pesticides determination by gas chromatography-tandem mass spectrometry,
Microchimica Acta 178 (1-2) (2012) 195-202. (DOI:
10.1007/s00604-012-0810-9).
7. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Mass spectrometry parameters optimization for the 46 multiclass pesticides determination in strawberries with gas chromatography ion-trap tandem mass spectrometry, Journal of The American Society for
Mass Spectrometry, (2012) in press.
8. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Multiresidue pesticides analysis in soils using modified QuEChERS with disposable pipette extraction and dispersive solid-phase extraction, Journal of Separation Science (2012) in press.
9. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Pesticide multiresidue analysis in strawberries using Quechers and disposable pipette extraction, (2012) submitted.
Publicações de artigos em revistas de circulação nacional:
1. Virgínia C. Fernandes, Viswanathan Subramanian, Nuno Mateus, Valentina F. Domingues Cristina Delerue-Matos. 2012. Determinação de pesticidas organoclorados em morangos por microextração em gota suspensa e cromatografia gasosa-espectrometria de massa, Revista de Ciências
Agrárias.
Comunicações em poster em encontros científicos internacionais:
1. Virgínia C. Fernandes, Anthony Dequeant, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Comparison of different QuEChERS for organochlorine pesticides: determination in strawberries, EUROanalysis XV, Innsbruck, Austria 6-10 September 2009.
XIV
2. Virgínia C. Fernandes, Valentina Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Organochlorine pesticides and bacteriologic evaluation in strawberries obtained from organic farming and integrated pest management farming, EFFoST
Conference: New Challenges in Food Preservation: Processing - Safety –
Sustainability, Budapest, Hungary 11-13 November 2009.
3. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus and Cristina Delerue-Matos. Optimization of GC-MS system parameters for the determination of organochlorine pesticides, HTC-11: Eleventh International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography and Hyphenated Chromatographic Analyzers, Bruges, Belgium 27-29 January 2010.
4. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus and Cristina Delerue-Matos. Determination of organochlorine pesticides from organic and integrated pest management (IPM) farming strawberries using QuEChERS, 47th
Annual Florida Pesticide Residue Workshop (FPRW), St. Pete Beach, Florida
18-21 July 2010.
5. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Evaluation of the QuEChERS sample preparation approach for the analysis of organochlorine pesticides in strawberry jams, XVI Encontro
Luso-Galego de Química, Aveiro, Portugal, 10-12 November 2010.
6. Virgínia C. Fernandes, Valentina Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Pesticides residues in strawberries grown using integrated pest management and organic farming, RAFA 2011 - 5th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis, Prague, Czech Republic, 1-4 November 2011.
7. Virgínia C. Fernandes, Steven Lehotay, Lucia Geis, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Multiclass detection of 177 pesticides in strawberries using QuEChERS by liquid chromatography mass spectrometry and low-pressure gas chromatography triple quadrupole tandem mass spectrometry,
HTC-12 and HTSP-2 - Twelfth International Symposium on Hyphenated
Techniques for Chromatography and Hyphenated chromatographic analyzers and Second International Symposium on Hyphenated Techniques for Sample Preparation, Bruges, Belgium, 31 January - 3 February 2012.
XV
8. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Pesticide multiresidue analysis in strawberries using QuEChERS and disposable pipette extraction, HTC-12 and HTSP-2 - Twelfth International Symposium on Hyphenated Techniques for Chromatography and Hyphenated chromatographic analyzers and Second International Symposium on Hyphenated Techniques for Sample Preparation, Bruges, Belgium, 31 January - 3 February 2012.
9. Virgínia C. Fernandes, Steven Lehotay, Lucia Geis-Asteggiante, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Multiclass method for determination of 27 pesticides in food and soil samples by LC-MS/MS, 8th LC-MS/MS Workshop on Environmental Applications and Food Safety,
Barcelona, Spain, 2-4 July 2012.
10. Virgínia C. Fernandes, Valentina F. Domingues, Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Multiresidue pesticides analysis in soils using modified quechers with disposable pipette extraction and dispersive solid-phase extraction, 7th European Conference on Pesticides and Related Organic Micropollutants in the
Environment” and 13th Symposium on Chemistry and Fate of Modern
Pesticides, Porto, Portugal, 7-10 October 2012.
Comunicação em poster em encontro científico nacional:
1. Virgínia C. Fernandes, Viswanathan Subramanian, Nuno Mateus, Valentina F. Domingues, Cristina Delerue-Matos. Determinação de pesticidas organoclorados em morangos por microextração em gota suspensa e cromatografia gasosa-espectrometria de massa, 9º Encontro Nacional de
Proteção Integrada, Viseu, Portugal 17 - 18 Novembro 2011.
Comunicação oral em encontro científico internacional:
1. Valentina F. Domingues, Virgínia C. Fernandes Nuno Mateus, Cristina Delerue-Matos. Organochlorine pesticides determination in strawberries and jam using QuEChERS extraction and GC-MS/MS, 47th Annual Florida Pesticide Residue Workshop (FPRW), St. Pete Beach, Florida 18-21 July 2010.
XVI
Comunicação oral em encontro científico nacional:
1. Virgínia C. Fernandes. Multiresidue analysis of pesticides using QuEChERS and gas chromatography tandem mass spectrometry. 7º Encontro Nacional
de Cromatografia realizado a 9 Janeiro de 2012 na Faculdade de Ciências da
Universidade do Porto, Portugal.
Comunicação oral em instituição internacional:
1. Virgínia C. Fernandes. Pesticides analysis of strawberries grown using integrated pest management or organic farming, USDA (United States
XVII
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS ... V RESUMO ... VII ABSTRACT... X TRABALHOS (PUBLICAÇÕES E COMUNICAÇÕES) DESENVOLVIDOS NO ÂMBITO DO PROJETO DE DOUTORAMENTO ... XII LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ... XIX ORGANIZAÇÃO E ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO ... XXIII
I. REVISÃO DO ESTADO DA ARTE ... 1
OBJETIVOS... 3
INTRODUÇÃO GERAL ... 5
Capítulo 1 – Pesticidas ... 5
1.1. Agricultura biológica, proteção integrada e convencional ... 7
1.2. Legislação ... 8 1.3. Métodos de extração ... 9 1.4. Análise cromatográfica ... 24 Capítulo 2 - Polifenóis ... 33 2.1. Polifenóis e a saúde ... 34 2.2. Stress Oxidativo... 34
2.3. Compostos flavonoides e não-flavonoides ... 35
2.4. Antocianinas ... 36
Enquadramento do trabalho ... 38
II. INVESTIGAÇÃO E DESENVOLVIMENTO ... 55
XVIII
3.1. Mass spectrometry parameters optimization for the 46 multiclass pesticides determination in strawberries with gas chromatography ion-trap tandem mass
spectrometry ... 57
Capítulo 4 - Desenvolvimento e otimização de técnicas de extração e quantificação de pesticidas ... 81
4.1. Organochlorine pesticides residues in strawberries from integrated pest
management and organic farming ... 83
4.2. Pesticide residues in Portuguese strawberries grown in 2009-2010 using
integrated pest management and organic farming ... 104
4.3. Pesticide multiresidue analysis in strawberries using QuEChERS, disposable pipette extraction and dispersive solid phase extraction ... 120
4.4. Analysing organochlorine pesticides in strawberry jams Using ECD,
GC-MS/MS and QuEChERS Sample Preparation ... 137
4.5. Multiresidue pesticides analysis in soils using modified QuEChERS with
disposable pipette extraction and dispersive solid-phase extraction ... 155
4.6. The development and optimization of a modified single-drop microextraction method for organochlorine pesticides determination by gas chromatography–tandem mass spectrometry... 174
4.7. Finding of pesticides in strawberry and soil samples by LP-GC-QqQ-MS/MS, LC-MS/MS and GCxGC-TOF-MS ... 195
Capítulo 5 - Teor polifenólico total e atividade antioxidante ... 218
5.1. Strawberries from integrated pest management and organic farming: phenolic composition and antioxidant properties ... 219
XIX
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Na lista apresentada constam termos em português e em inglês, consoante a língua em que são utilizados ao longo da dissertação.
ACN Acetonitrile
AED Detetor de emissão atómica ANOVA Analysis of variance
AOAC Association of Official Agricultural Chemists API Atmospheric pressure ionization
ASE Extração liquida acelerada
BIO Biológicos
C Concentration
C18 Octadecyl silica; octadecilsilica
CAR Carbowax CI Ionização química CV Coefficient of variation CW Carbowax Cy Cyanidin; Cianidina Cy-3-rut Cyanidin-3-glucoside
DAD Matriz de díodos
DDD Dichlorodiphenyldichloro-ethane
DDE 2,2-Bis(p-chlorophenyl)-1,1-dichloroethylene DDT 1,1,1 - Trichloro-2,2-bis- (p-chlorophenyl) ethane) Dp Delphinidin; Delfinidina
DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl; 2,2-Difenil-1-picrilhidrazilo DPX Disposable pipette tips
d-SPE Dispersive solid-phase extraction; extração em fase sólida dispersiva ECD Electron capture detector; detetor de captura eletrónica
EFSA European Food Safety Authority EI Electronic impact; Impacto eletrónico EPA Environmental Protection Agency EPC Control eletrónico pneumático
eq Equivalent; equivalentes
ESI Electrospray ionization
XX
EU European Union
EV Excitation voltage; voltage de excitação FAO Food and Agriculture Organization
FC Folin-Ciocalteu
FDA Food and Drug Administration
FID Flame ionization detection, detector de ionização de chama
FRAP Ferric reducing antioxidant power; Poder antioxidante de redução do ferro
FW Fresh weight
GA Gallic acid; ácido gálico GAE Gallic acid equivalents
GC Gas chromatography, cromatografia gasosa
GCxGC Comprehensive two-dimensional gas chromatography; cromatografia gasosa bidimensional
GPC Gel permeation chromatography
HCB Hexachlorobenzene
HCH Hexachlorocyclohexane
HLB Hydrophilic-lipophilic-balanced
HPLC High performance liquid chromatography, cromatografia liquida de alta eficiência
HS-SPME Headspace-solid-phase microextraction
IC Inorganic carbon
ID-SPME Imersão direta – microextracção em fase sólida IMW Isolation mass window; intervalo de massa IPM Integrated pest management; proteção integrada IT Ion trap; armadilha de iões
IT-MS Ion trap – mass spectrometry
LC Liquid chromatography
LLE Liquid liquid extraction LLME Liquid-liquid microextraction LMR Limites máximos de resíduos
LOD Limit of detection
LOQ Limit of quantification
LP-GC-MS/MS Low-pressure gas chromatography triple quadrupole tandem mass spectrometry
XXI
MAE Microwave-assisted extraction, extração assistida por microondas
Malv Malvidina
Malv-3-gluc Malvidine-3-glucoside
MeOH Methanol
MIP Polímeros molecularmente impressos
MRL Maximum residue limit
MRM Multiple reaction monitoring
MS Mass spectrometry, espectrometria de massa
MS/MS Tandem mass spectrometry; Espectrometria de massa em modo tandem
MSPD Matrix solid phase dispersion; dispersão da matriz em fase sólida MTBE Éter metil terc-butílico
MWCNs Multi-walled carbon nanotubes NCD Detetor de quimiluminescência ND, n.d. Not detected
NH2 Aminopropil
NPD Detetor de azoto e fósforo
OF Organic farming; agricultura biológica OMS Organização Mundial de Saúde
PA Poliacrilato PDMS Polidimetilsiloxano PDMS/DVB Polydimethylsiloxane/divinylbenzene PDMS-DVB Divinilbenzeno polidimetilsiloxano Pg Pelargonidina Plg-3-gluc Pelargonidin-3-glucoside Plg-3-rut Pelargonidin-3-rutinoside Pn Peonidina
POF Produtos de agricultura biológica PSA Amina primária e amina secundária
Pt Petunidina
QuEChERS Quick, easy, cheap, effective, rugged and safe
R Correlation coefficient
R2 Coeficient of determination
REF Referências
XXII
ROS Espécies reativas de oxigénio RSD Residual standard deviation
S/N Signal to noise
SAX Strong anion-exchanger
SBDE Stir-bar sorptive extraction; Extração por sorção em barra de agitação
SD Standard deviation
SDME Single drop microextration
SDME Single drop microextraction; microextração em gota SDS Dodecil sulfato de sódio
SFE Supercritical fluid extraction SFE Extração com fluido supercrítico SIM Selected ion monitoring
SPE Solid phase extraction SPME Solid-phase microextraction
TC Total carbon
TE Trolox equivalents
TOC Total soil organic carbon
TOF-MS Time-of-flight mass spectrometry; espectrometria de massa por tempo de voo;
TPTZ 2,4,6-tripyridyl-s-triazine
tR Retention time
Trolox 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid UPLC Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência
UV / VIS Ultraviolet-visible
v/v Volume/volume
XXIII
ORGANIZAÇÃO E ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO
A presente dissertação inclui todos os artigos científicos (8 publicados, 1 submetido e 1 em fase de preparação para publicação) resultantes do projeto de doutoramento, pretendendo-se assim que todos os trabalhos desenvolvidos tivessem já sido objeto de análise crítica por parte de diferentes revisores internacionais, especialistas na área de investigação em que se inserem, e selecionados de acordo com os critérios de cada revista em que o respectivo artigo foi publicado. A dissertação está organizada em três partes: a PARTE I corresponde à Revisão do Estado da Arte; a PARTE II é designada por Investigação e Desenvolvimento, onde se inclui toda a investigação desenvolvida ao longo dos quatro anos e PARTE III as considerações finais.
Assim, na PARTE I, com uma abordagem mais teórica, estão incluídos 2 capítulos. No capítulo 1 faz-se uma introdução geral ao tema “pesticidas”, com o objetivo de contextualizar o trabalho desenvolvido, abordando questões como a utilização de pesticidas e fazendo referência às diferentes práticas agrícolas e legislação. Neste primeiro capítulo ainda se inclui a revisão bibliográfica dos métodos de extração e de análise cromatográfica de pesticidas em frutos, tendo por base o artigo publicado no Journal Chromatographic Science (ver lista de publicações). No capítulo 2, é feita uma breve introdução aos polifenóis e suas propriedades antioxidantes.
A PARTE II da dissertação é constituída por 3 capítulos (capítulos 3,4 e 5). O
capítulo 3 integra 1 artigo científico correspondente à otimização dos parâmetros
IT-MS do GC-IT-MS/IT-MS para a seleção de 46 pesticidas. O capítulo 4 inclui 5 artigos publicados, 1 artigo submetido (subcapítulo 4.3) e 1 artigo em fase de preparação para publicação (subcapítulo 4.7). Estes artigos descrevem o desenvolvimento analítico de diferentes metodologias de extração e análise cromatográfica de pesticidas nas amostras em estudo: morangos, compotas de morango e solos.
O capítulo 5 corresponde ao artigo onde se descreve o perfil antioxidante das amostras de morango através da determinação do teor fenólico total, poder redutor e da atividade anti-radicalar. A dissertação termina com a PARTE III onde são apresentadas as Considerações Finais pretendendo-se que traduzam um conjunto de reflexões sobre o trabalho realizado, perspetivando projetos e atividades de investigação futuras.
1
I.
REVISÃO DO ESTADO DA ARTE
3
OBJETIVOS
Neste projeto pretende-se proceder ao controlo de resíduos de pesticidas em diferentes variedades de morangos e respetivos solos de cultivo, em modo de produção biológica e proteção integrada e ainda em compotas de morango, de forma a garantir a sua certificação de qualidade. Pretende-se ainda identificar, nos extratos de morango, compostos polifenólicos com atividade antioxidante de forma a valorizar este fruto de produção sazonal. Os objetivos específicos desta dissertação dividiram-se em 2 grupos e foram:
1. Desenvolvimento e validação de métodos para a análise de pesticidas
Desenvolver metodologias analíticas multi-resíduo baseadas em técnicas cromatográficas, incluindo cromatografia gasosa (GC) nomeadamente de captura eletrónica (ECD), espectrometria de massa (MS), baixa pressão de espectrometria de massa em modo tandem e cromatografia gasosa bidimensional de espectrometria de massa por tempo de voo. Foi também objetivo a análise de alguns pesticidas utilizando a cromatografia líquida com deteção por espectrometria de massa em modo tandem;
Desenvolver métodos de preparação de amostras com recurso a diferentes metodologias, nomeadamente, QuEChERS e microextração em gota suspensa (SDME);
Avaliar o teor de pesticidas emamostras de morango, solo de cultivo e compota de morango;
Comparar o estado de contaminação dos morangos de OF com os cultivados por técnicas de IPM;
Comparar o estado de contaminação dos solos de OF e IPM.
2. Caracterização polifenólica e atividade antioxidante do morango
Caracterizar quimicamente os extratos de morango no que respeita a compostos fenólicos por espectrometria de massa (ESI-MS) e por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-DAD);
4
Estudar as propriedades antioxidantes e antiradicalares dos compostos polifenólicos presentes nos diferentes extratos de morango.
5
INTRODUÇÃO GERAL
Capítulo 1 –
Pesticidas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Resumo de estudos publicados para determinação de diferentes classes de pesticidas em frutos utilizando a extração líquido-líquido. ...12 Tabela 2. Resumo de estudos publicados para determinação de diferentes classes de pesticidas em frutos utilizando a SPE. ...16 Tabela 3. Resumo de estudos publicados para determinação de diferentes classes de pesticidas em frutos utilizando a MSPD. ...18 Tabela 4. Resumo de estudos realizados para determinação de diferentes classes de pesticidas em frutos utilizando SPME. ...20 Tabela 5. Resumo de estudos realizados para determinação de diferentes classes de pesticidas em frutos utilizando SBSE. ...20 Tabela 6. Resumo de estudos publicados para determinação de diferentes classes de pesticidas em frutos utilizando a SFE. ...21 Tabela 7. Resumo de estudos realizados para determinação de diferentes classes de pesticidas em frutos utilizando os QuEChERS. ...23 Tabela 8. Resumo das condições cromatográficas usadas na quantificação de diferentes classes de pesticidas utilizando a cromatografia gasosa (GC). ...27 Tabela 9. Resumo das condições cromatográficas usadas na quantificação de diferentes classes de pesticidas utilizando a cromatografia líquida (LC). ...29
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema resumo dos métodos de extração e condições cromatográficas para análise de pesticidas em frutos. ...32
I. REVISÃO DO ESTADO DA ARTE
6
1. Pesticidas
A crescente contaminação do meio ambiente por agentes químicos tem vindo a exercer efeitos adversos nos organismos vivos e no funcionamento dos ecossistemas, com reflexos para a saúde humana.
A segurança e qualidade alimentar é um tema pertinente para a população em geral. Atualmente os consumidores procuram alimentos que têm um elevado valor nutritivo mas encontram-se isentos de contaminantes químicos.
A contaminação alimentar pode ter várias origens: acidental, a poluição, metabolitos tóxicos dos microrganismos e resíduos químicos de práticas agrícolas (pesticidas) (1-3).
De modo a prevenir e controlar a contaminação alimentar são necessárias algumas medidas, tais como (2):
- Monitorização sistemática dos alimentos e de amostras ambientais; - Identificação das fontes de contaminação;
- Legislação para estabelecer níveis seguros de presença de contaminantes.
O termo pesticida refere-se à substância ou mistura utilizada para prevenir, destruir ou controlar pragas, espécies de plantas ou animais indesejáveis passíveis de interferir com a produção, processamento, armazenamento ou venda de alimentos. O termo inclui substâncias reguladoras do crescimento da planta, desfolhantes, agentes controladores de tamanho de fruta ou agentes de prevenção da sua queda prematura, e substâncias aplicadas às plantações antes e após a colheita, de modo a prevenir deterioração durante o armazenamento e transporte (1, 2, 4).
Os pesticidas, quando são usados inadequadamente, podem contribuir para a degradação do meio ambiente. O solo é um alvo da aplicação de pesticidas, e estes podem-se distribuir de variadíssimas formas pelo meio ambiente. A interação pesticida-solo, pode ser explicada por fenómenos físico-químicos, que podem ser: a volatilização, a adsorção, infiltração, reações de degradação e fotodecomposição e biodegradação (5).
Na segunda metade do século XX houve um incremento na utilização de pesticidas que permitiu satisfazer parte das exigências propostas pelos consumidores a nível alimentar (6, 7). Tais exigências basearam-se na necessidade do controlo de pragas, que diminuíam a produção agrícola, bem como no aumento da qualidade dos alimentos (8).
A utilização dos pesticidas ao longo dos tempos foi caracterizada por várias fases. Nos anos 40, a descoberta do diclorodifeniltricloroetano (DDT) como potencial
INTRODUÇÃO GERAL
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pesticida, determinou uma nova era, traduzida pelo aumento na produção agrícola. Na década seguinte, surge um período de maior apreensão devido a pareceres que indicavam a não existência de evidência suficiente, relativamente à segurança da utilização deste composto e à necessidade de se proceder a uma maior regulamentação (9). Os anos 60 e 70 foram caracterizados pela existência de preocupações ambientais, com vista a proteger a saúde das pessoas. Contudo o aparecimento persistente de pestes secundárias levou à utilização de maior quantidade de pesticidas e de doses cada vez mais fortes. O DDT e alguns pesticidas organoclorados foram banidos em alguns países 30 anos após a sua introdução. A partir dos anos 80, são realizados estudos com o objetivo de maximizar os benefícios da utilização dos pesticidas e minimizar os seus riscos ao nível da saúde pública, de modo a conduzir a uma utilização mais racional e segura deste tipo de produtos.
Os pesticidas podem ser classificados de acordo com a composição química, função e modo de ação nos organismos. Quimicamente podem ser divididos em inorgânicos e orgânicos, de origem sintética ou natural, sendo a grande maioria constituída por misturas complexas de moléculas orgânicas (9-11). Os grupos de pesticidas mais importantes são: os inseticidas para proteger as plantas dos danos causados pelos insetos, os herbicidas para eliminação de ervas e os fungicidas para inibir o crescimento de fungos (2, 12). Para além destes, existem os grupos dos acaricidas, nematocidas, moluscidas, rodenticidas e reguladores de crescimento de plantas (2, 13).
A toxidade do pesticida para o homem é condicionada pela capacidade de interferir em sistemas vitais do organismo humano, pela via de exposição (oral, cutânea, inalação) e pela duração da exposição (toxidade aguda, a curto prazo, crónica). Relativamente à perigosidade dos pesticidas são consideradas, na base do Decreto-Lei 94/98 e da Portaria 732-A/96, 15 classes toxicológicas (14):
- muito tóxico, tóxico, nocivo;
- cancerígeno, teratogénico, mutagénico, tóxico para a reprodução, - tóxico para o sistema endócrino;
- corrosivo, irritante, sensibilizante;
- explosivo, altamente inflamável, inflamável.
1.1. Agricultura biológica, proteção integrada e convencional
Os mercados de produtos de agricultura biológica (POF) estão em expansão devido ao número crescente de consumidores que preferem os produtos biológicos. A procura destes produtos pelos consumidores é associado a que os POF são mais benéficos
I. REVISÃO DO ESTADO DA ARTE
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para a saúde humana e para o ambiente do que os seus homólogos cultivados convencionalmente (15, 16).
Esta agricultura biológica é uma alternativa recente, desenvolvida ao longo dos últimos 20 anos, com o objetivo de “preservar a terra, a água e os recursos genéticos vegetais e animais, não degradar o ambiente e ser tecnicamente apropriada, economicamente viável e socialmente aceitável”, de acordo com a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO) (17). Tanto a OF como a de IPM são duas modalidades de agricultura sustentável com objetivos comuns quanto à estabilidade dos ecossistemas, à biodiversidade, à fertilidade do solo, ao ciclo de nutrientes, ao bem bem-estar dos animais, aos parâmetros ecológicos da qualidade, aos níveis de produção, à poluição e à qualidade de vida e formação dos agricultores. Na OF atribuiu-se prioridade ao solo, por exemplo através do uso da compostagem para fertilização e a proibição do uso de adubos químicos e de pesticidas químicos, enquanto na IPM aceita-se o uso de adubos e pesticidas químicos, desde que haja evidência científica de não afetarem a saúde humana e o ambiente (17, 18). Existem estudos comparativos em solos de OF e agricultura convencional quanto às suas características na Austrália (19), Alemanha (20), Noruega (21), Suíça (22), Estados Unidos (23, 24).
Em Portugal, a agricultura biológica tem crescido desde 1985. Em 2010, cerca de 210 he de cultivo correspondem a produção biológica, este valor corresponde a 6% da área de cultivo nacional. O objetivo de cada prática agrícola (OF, IPM e convencional) varia muito no que diz respeito ao rendimento agrícola, aos solos e utilização de pesticidas, e ao impacto ambiental. Embora as práticas convencionais, resultem em produtos de higiene confiável, há preocupação quanto às consequências biológicas e ambientais assim como à sustentabilidade a longo prazo que lhes estão associados (15). Se por um lado existem dados a confirmar que os POF são melhores em termos de análise sensorial e em termos nutricionais (15), também existem estudos a confirmar a presença de resíduos de produtos químicos em POF (16). A presença de resíduos químicos nos POF pode ter origem no ambiente, com compostos persistentes ou então resultam de adulteração.
1.2. Legislação
A União Europeia (UE) adota um conjunto de medidas destinadas a reduzir os riscos da utilização de pesticidas para o ambiente e para a saúde humana e, mais genericamente, a conseguir uma utilização mais sustentável dos pesticidas e uma redução global significativa dos riscos e das utilizações desses produtos, sem perda
INTRODUÇÃO GERAL
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de rendimento por parte dos utilizadores profissionais. As medidas propostas incidem, nomeadamente, no reforço da vigilância e da investigação sobre os pesticidas, na formação e informação dos utilizadores e em medidas específicas ligadas à utilização dessas substâncias. Ao mesmo tempo, a legislação portuguesa, através da legislação comunitária da UE, define como limites máximo de resíduos (LMR), a quantidade de resíduo de pesticida presente nos alimentos, expressa em mg de substância por kg de amostra (25). Estes limites permitem garantir o consumo dos alimentos com segurança para a população e desta forma evitar problemas para a saúde (26).
O Codex Alimentarius (27) seguido pelos países da UE, é um programa internacional de normas alimentares criado pela FAO (28) e a Organização Mundial de Saúde (OMS) (29). Este programa tem o objetivo de proteger a saúde da população, assegurando práticas equitativas no comércio e no manuseamento regional e internacional de alimentos. Abrange milhares de normas, podendo ser generalistas ou especifica a determinado alimento.
Segundo o último relatório de controlo nacional de resíduos de pesticidas em produtos de origem vegetal de 2010, foram analisadas 715 amostras de frutos e hortícolas. Em 49% não foram detetados resíduos, em 48% os resíduos encontravam-se abaixo do LMR e em 3,8% os resíduos excederam o LMR. O relatório conclui que é neste grupo de produtos que ocorre o maior número de infrações (30).
1.3. Métodos de extração
A determinação de pesticidas consiste essencialmente em três passos: colheita, preparação e análise da amostra. No passo relativo à preparação de amostras, além da extração é frequentemente necessário um processo de limpeza. Nos últimos anos foram efetuados uma série de estudos que introduziram novas técnicas de análise reduzindo o tempo de preparação de amostra e o volume de solvente utilizado.
Os métodos convencionais de extração envolvem tempos de extração e volumes de solventes muito elevados, são muito trabalhosos, consomem muito tempo devido às várias etapas que estes métodos exigem sendo no final as recuperações geralmente baixas (31, 32). Para a deteção de quantidades vestigiais de pesticidas em frutos, a etapa de pré-concentração e purificação são muito demoradas neste tipo de extração (33).
A etapa de limpeza elimina os interferentes e permite muitas vezes boas recuperações a níveis baixos de fortificações (34). Esta etapa é assim necessária para baixar os limites de deteção dos métodos e eliminar os possíveis interferentes da matriz.
I. REVISÃO DO ESTADO DA ARTE
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As técnicas de limpeza incluem a cromatografia de permeação em gel, a partição líquido-líquido utilizando vários solventes orgânicos, extração em fase sólida (SPE), extração em fase sólida dispersiva (d-SPE), pontas de pipetas descartáveis (DPX), cromatografia de adsorção (em sílica, florisil, carbono, C18, alumina e PSA) (35, 36). Esta etapa de limpeza nem sempre é realizada, e em determinadas situações quando acoplada às etapas de extração pode alterar e muito em termos de eficiência, simplicidade e rapidez (37).
Nestes últimos anos, na análise de resíduos de pesticidas desenvolveram-se novas tecnologias de extração que minimizam a exposição a solventes e produtos tóxicos pelo operador e exigem um tratamento simples e rápido que pode ser facilmente implementado na rotina do laboratório (37). Atualmente, as extrações sólido-líquido e microextrações são a abordagem mais utilizada devido à simplicidade e robustez destes procedimentos, juntamente com o baixo consumo de solventes orgânicos. A preocupação com os riscos associados com: i) os solventes orgânicos, ii) custos, iii) perigos ambientais e iv) eliminação de resíduos levaram ao desenvolvimento de métodos alternativos, tais como a extração em fase sólida (SPE) (33, 38-49), extração em fase sólida dispersiva (MSPD) (32, 37, 50-54), microextração em fase sólida (SPME) (40-46, 48, 49), microextração com microgota (SDME) (55, 56) e extração sorptiva em barra de agitação (SBDE) (57, 58). Estas técnicas baseiam-se na extração de pesticidas em fase sólida permitindo a concentração do analito em adsorventes e posterior eluição ou dessorção. Ao procedimento de extração pode ou não estar associada a limpeza da amostra, em alguns casos, os pesticidas podem ser extraídos e injetados diretamente (33).
Outros novos procedimentos de extração têm sido desenvolvidos como a extração líquida acelerada (ASE) (59), extração com fluído supercrítico (SFE) (37, 59, 60), extração assistida por microondas (MAE) (61) e os QuEChERS (62-68). Os QuEChERS é um método que fornece resultados de qualidade com um número reduzido de etapas e um baixo consumo de solventes e material (66, 69-71).
A cromatografia é a forma de análise mais utilizada para a deteção de pesticidas. Desta forma os métodos cromatográficos apresentam um papel muito importante nestas análises permitindo a quantificação e confirmação de variadíssimos compostos. A análise de pesticidas por cromatografia envolve então uma série de processos físico-químicos de separação de misturas em função das características moleculares dos analitos e destaca-se pela facilidade em efetuar não apenas a separação, mas também identificação e quantificação das espécies químicas, sozinha ou combinada com outros métodos de análise. Um conjunto alargado de estudos de análise de pesticidas em cromatografia líquida (LC) (8, 53, 64, 67, 69, 72-86) e cromatografia
INTRODUÇÃO GERAL
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gasosa (GC) (32, 37, 38, 40, 42, 46, 50-52, 54, 57, 59, 62, 86-100) estão descritos na literatura.
1.3.1. Extração líquido-líquido
Os solventes utilizados numa extração líquido-líquido devem preencher os seguintes requisitos: baixa solubilidade em água, permitirem a obtenção de elevadas percentagens de recuperação e baixo nível de toxicidade. Esta escolha depende além da técnica de extração, da matriz e do tipo de resíduos a serem estudados (101).
Muitos autores têm descrito a eficiência de métodos de extração com diferentes solventes como o acetonitrilo (ACN) (74-76, 102), n-hexano (59, 78, 88, 101, 103-107), diclorometano (108-111), acetona (59, 79, 80, 88, 103, 104, 107, 109-111), éter de petróleo (109), acetado de etilo (82, 101, 103, 106, 109, 110, 112-116), cicloexano (115), tolueno (104), tetraclorometano, isoctano, metanol (MeOH) (74, 78, 80, 82, 83, 108, 111, 112, 114, 117), dodecil sulfato de sódio (SDS) (31) e éter metil terc-butílico (MTBE). Em muitos casos, estes solventes permitem obter boas recuperações para uma vasta gama de pesticidas. Diversos frutos e vários pesticidas foram testados por extração com solventes orgânicos. A tabela 1 resume estudos de determinação de pesticidas em frutos utilizando a extração líquido-líquido.
As principais desvantagens dos solventes são a falta de seletividade, resultante na co-extração de muitas substâncias lipofílicas, e a toxicidade de alguns solventes o que levou a regulamentos restritivos quanto ao seu uso e ao problema dos resíduos no produto final.
I. R E V IS Ã O D O E S T A D O D A A R T E 12 T a b e la 1 . R e s u m o d e e s tu d o s p u b li c a d o s p a ra d e te rm in a ç ã o d e d ife re n te s c la s s e s d e p e s ti c id a s e m fr u to s u ti li z a n d o a e x tr a ç ã o l íq u id o -l íq u id o . M a tr iz C la s s e /P e s ti c id a s Ex tra ç ã o L íq u id a R e c u p e ra ç ão % C o n c e n tr a ç ã o d e c o n ta m in a ç ã o L O D R e f la ra n ja c a rb a m a to d ic lo ro m e ta n o ; M e O H s u lf a to d e s ó d io a n id ro 62 -92 1 -10 µ g k g -1 0 ,7 -3, 0 µ g k g -1 (1 0 8 ) la ra n ja u v a c a rb a m a to n -h e x a n o ; M e O H s u lf a to d e s ó d io a n id ro 91 -1 0 3 0 ,1 -0, 5 m g k g -1 - (78 ) di ó s p ir o o rg a n o fo s fo ra d o AC N 97 -1 0 1 0, 05 -0 ,5 m g k g -1 0 ,0 0 6 -0, 0 1 3 m g k g -1 (1 0 2 ) m a n g a la ra n ja p a p a ia im id a z o l a c e to n a ; to lu e n o ; é te r d ie tí lic o : n -h e x a n o (1 :4 v /v ) c lo ri d ra to d e p iri d in a 82 -1 0 4 0 ,1 -0 ,2 m g k g -1 0 ,0 5 m g k g -1 (1 0 4 ) la ra n ja p iri m id in a , u re ia , p ir a z o l, b u p ro fe z in , p ir e tr ó id e a c e ta to d e e ti lo ; M e O H s u lf a to d e s ó d io a n id ro 69 -94 0 ,0 0 5 -2 ,0 0 ,5 -2 0 g k g -1 (1 1 2 ) la ra n ja li m ã o , u v a , li m a c a rb a m a to o rg a n o fo s fo ra d o s u lf a to d e s ó d io a n id ro n -h e x a n o 90 -1 1 9 0 ,1 -4 ,0 µ g g -1 0 ,0 0 1 -0 ,0 0 5 µ g g − 1 (1 0 5 ) m a ç ã p a p a ia m a n g a la ra n ja te tr a z in a h e x a n o : a c e ta to d e e ti lo ( 1 :1 , v /v ) s u lf a to d e s ó d io a n id ro 84 -96 0 ,1 -2 ,0 m g k g -1 0 ,0 5 m g k g -1 (1 0 6 ) to m a te m e la n c ia m e lã o p iri d in a , c a rb a m a to , b e n z im id a z o l, n e o n ic o ti n o id e , c im o x a n il, u re ia , m o rf o lin a , b e n z o ilu re ia , a z o l , p ir a z o l, t ia z o lid in a a c e ta to d e e ti lo ; M e O H s u lf a to d e s ó d io a n id ro - - - (82 ) m a ç ã la ra n ja o rg a n o fo s fo ra d o , c a rb a m a to , b e n z im id a z o l, h id ro x ia n ili n a , a z o l, u re ia , a n ili n o p iri m id in a a c e ta to d e a m ó n io : á c id o a c é ti c o (2 0 m M ) M e O H :á g u a d e s ti la d a (9 5 :5 ) 73 -1 2 6 0 ,02 -0 ,2 0 m g k g -1 0 ,0 0 2 -0 ,0 1 2 m g k g -1 (83 ) p ê s s e g o u v a o rg a n o fo s fo ra d o a c e ta to d e e ti lo s u lf a to d e s ó d io a n id ro c a rb o n a to d e s ó d io h id ro g e n a d o 70 -1 0 0 0 ,01 -0 ,1 0 m g k g -1 0 ,0 1 m g k g − 1 (1 1 3 ) la ra n ja b a n a n a tri a z o l a c e to n a ; a c e ta to d e e ti lo ; d ic lo ro m e ta n o ; é te r d e p e tr ó le o 83 -1 1 3 0 ,01 -4 ,0 0 m g k g -1 0 ,0 1 m g k g -1 (1 0 9 ) p e ra tri a z o l M e O H ; AC N 1 0 2 -82 0 ,0 0 5 -0 ,5 m g k g -1 0 ,7 µg k g -1 (74 ) to m a te o rg a n o c lo ra d o a c e ta to d e e ti lo ; n -h e x a n o s u lf a to d e s ó d io a n id ro L im p e z a : f lo ri s il; 1 % ( v /v ) é te r e tí lic o ; n -h e x a n e ; is o o c ta n o 95 -99 0 ,0 0 5 -0 ,0 2 µg g -1 0 ,0 0 4 -0 ,0 5 7 µ g g -1 (1 0 1 )
IN T R O D U Ç Ã O G E R A L 13 C o n t, M a tr iz C la s s e /P e s ti c id a s Ex tra ç ã o L íq u id a R e c u p e ra ç ão % C o n c e n tr a ç ã o d e c o n ta m in a ç ã o L O D R e f c le m e n ti n a b u p ro fe z in , p ir id a b e m , p ir a z o l c lo re to d e s ó d io a c e to n a ; a c e to n a : h e x a n o (5 0 /5 0 v /v ) 88 -1 2 4 0 ,01 -1 ,0 0 m g k g -1 - (88 ) k iw i o rg a n o fo s fo ra d o o rg a n o c lo ra d o c a rb o x a m id a a c e to n a ; n -h e x a n o c lo re to d e s ó d io a 1 0 % ; s u lf a to d e s ó d io a n id ro L im p e z a : SPE fl o ri s il 76 -1 2 7 0 ,1 -5 ,0 m g L -1 0 ,0 0 3 -0 ,0 1 3 m g L -1 (59 ) u v a e s tr o b ilu ri n a a c e to n a ; d ic lo ro m e ta n o ; N a C l L im p e z a : a c ti v e c h a rc o a l , s ili c a , s ili c o n e , fl o ri s il, s u lf a to d e s ó d io a n id ro 86 -1 0 3 10 -2 0 0 0 n g g -1 3 n g m L -1 (1 1 0 ) p ê s s e g o az a d ir a c ti n a c lo re to d e s ó d io ; AC N 86 -1 1 0 1 -2 0 0 µg k g -1 0 ,4 -8 ,0 µ g k g -1 (75 ) u v a g o ia b a o rg a n o c lo ra d o , p ir e tr ó id e , o rg a n o fo s fa to a c e ta to d e e ti lo ; a c e ta to d e e ti lo : h e x a n o (3 :7 v /v ); a c e to n a : h e x a n o ( 3 :7 v /v ) 75 –1 0 7 0 ,01 -0 ,5 0 μ g g − 1 0 ,0 0 1 -0 ,0 1 0 μ g g − 1 (1 0 3 ) la ra n ja , li m ã o , m a ç ã , m e lã o tri a z in a , n e o n ic o ti n o id e , la c to n a , b e n z im id a z o l, c a rb a m a to , m o rf o lin a , e s tr o b ilu ri n a , a z o l, b e n z o ilu re ia a c e ta to d e e ti lo ; M e O H h id ró x id o d e s ó d io ; s u lf a to d e s ó d io a n id ro - - 0 ,5 -1 0 µg k g -1 (1 1 4 ) to m a te m e la n c ia m e lã o o rg a n o fo s fo ra d o , o rg a n o c lo ra d o , a z o l, p iri m id in a , c a rb a m a to , b u p ro fe c in , fe n ila m id a , d ic a rb o x a m id a , p ir e tr ó id e , c lo ro d if e n ils u lf o n a d ic lo ro m e ta n o ; c ic lo h e x a n o s u lf a to d e s ó d io a n id ro - - - (89 ) m a ç ã p ê s s e g o o rg a n o fo s fo ra d o , c a rb a m a to , o rg a n o c lo ra d o , p ir e tr o íd e , d ic a rb o x a m id a , b e n z im id a z o l, ft a li m id a , p ro p a rg it e a c e ta to d e e ti lo ; c ic lo h e x a n o ; c ic lo h e x a n o : a c e ta to d e e ti lo (1 :1 ( v /v ); s u lf a to d e s ó d io a n id ro L im p e z a : c ro m a to g ra fi a d e a lt a e fi c ê n c ia d e p e rm e a ç ã o d e g e l (H PG PC ) - - - (1 1 5 ) to m a te c lo ro m e q u a to M e O H - - 0 ,59 -0 ,8 8 µ g k g -1 (1 1 7 ) a n a n á s u re ia , o rg a n o fo s fo ra d o , b e n z im id a z o l a c e to n a ; d ic lo ro m e ta n o ; M e O H ; c lo ro fó rm io ; M e O H :t a m p ã o f o s fa to ( 6 0 :4 0 ); t a m p ã o f o s fa to p e rm a n g a n a to d e p o tá s s io ; s u lf a to d e s ó d io a n id ro - - - (1 1 1 ) la ra n ja , p e ra m a ç ã m o ra n g o p ir e tr ó id e h e x a n o : a c e to n a (1 :1 , v /v ); h e x a n o : é te r é ti lic o (7 :3 , v /v ) s u lf a to d e s ó d io a n id ro ; L im p e z a : fl o ri s il 78 -1 0 8 0 ,5 -2 ,0 m g k g -1 0 ,1 m g k g -1 (1 0 7 ) m o ra n g o o rg a n o c lo ra d o a c e ta to d e e ti lo - - - (1 1 6 ) b a n a n a la ra n ja b e n z im id a z o l, a z o l, m o rf o lin a a c e to n a ; M e O H 75 -1 0 6 0 ,05 -1 ,0 0 m g k g -1 0 ,0 0 5 -0 ,0 2 5 m g k g -1 (8 0 )
I. REVISÃO DO ESTADO DA ARTE
14
1.3.2. Extração líquida acelerada (ASE) e Extração assistida por microondas (MAE)
A extração líquida acelerada é uma técnica analítica realizada a uma temperatura entre 40 e 200oC e pressões elevadas (1000-2500 psi). Durante a extração, à medida que a temperatura aumenta a velocidade de extração também aumenta devido à viscosidade e tensão superficial do solvente. Ao mesmo tempo, a solubilidade e a velocidade de difusão na amostra também aumenta. A pressão envolvida no processo de extração mantém a temperatura abaixo do ponto de ebulição do solvente, permitindo assim a sua penetração na amostra. A combinação de alta temperatura e pressão resulta numa melhor eficiência e maior rapidez no processo de extração (59).
A baixa solubilidade de alguns pesticidas em água, é uma condicionante no processo de extração de pesticidas em frutos, exigindo desta forma uma etapa preliminar com o objetivo de facilitar a transferência dos analitos para a solução de extração. A extração assistida por microondas é utilizada para este efeito (61, 118, 119). No entanto, a adição de solventes orgânicos é necessária para a extração de alguns compostos. As microondas aquecem diretamente a mistura amostra/solvente daí a maior rapidez conferida ao processo. Os parâmetros mais estudados para otimização do método são a natureza e o volume do solvente, tempo e temperatura de extração e as características da matriz.
Este tipo de extração tem vantagens relativamente às técnicas convencionais, tais como a rapidez, menor consumo de solventes, não degradação da amostra e seus constituintes e melhor resultado a nível de reprodutibilidade nas percentagens de recuperação dos compostos (90). Com esta técnica realizamos uma extração em condições homogéneas (120, 121).
A extração assistida por microondas e a extração líquida pressurizada são métodos de extração recentes que foram utilizados com sucesso nos últimos anos na análise de uma vasta gama de produtos químicos em várias matrizes.
1.3.3. Extração em fase sólida (SPE)
A extração em fase sólida é umas das técnicas de extração utilizada em frutos. É caracterizada pela sua rapidez e simplicidade de extração. A eficiência deste tipo de extração depende da escolha adequada do adsorvente normalmente condicionado em cartuchos/colunas (31). A SPE é utilizada também para eliminar interferências que poderão influenciar a pré-concentração da amostra e posteriormente toda a análise.
INTRODUÇÃO GERAL
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Os cartuchos SPE-C18 e de sílica são os mais utilizados. A afinidade destes SPE e a estabilidade das ligações de sílica e C18 aos compostos, são a grande vantagem associada a este método de extração. Outras vantagens como o bom desempenho, simplicidade e redução de resíduos tóxicos são mais-valias do processo. Outros adsorventes estão disponíveis no mercado com características diferentes como a polaridade e fase reversa.
Esta técnica tem vindo a ser muito utilizada, funcionando na maior parte das vezes como etapa de limpeza. A maioria dos estudos publicados sobre este método de extração de pesticidas em frutos, utiliza a combinação de uma ou mais colunas de SPE para limpeza em fase normal.
Os adsorventes utilizados na extração de pesticidas em frutos nos últimos estudos foram os octadecilsilica (C18) (87, 92, 122), aminopropril (NH2) (91, 122), adsorventes de troca aniónica (SAX- QMA) (91, 123), HLB (84, 124, 125) e carbono (87, 93, 126). Nos últimos anos, os nanotubos de carbono são estruturas que despertaram interesse devido às suas propriedades químicas, eletrónicas e mecânicas (47). O potencial de SPE com nanotubos de carbonos tem vindo a ser demonstrado recentemente na extração de alquilofenóis, ftalatos, compostos orgânicos voláteis e pesticidas (39).
A tabela 2 resume estudos de determinação de pesticidas em frutos utilizando a SPE.
Novos materiais têm vindo a ser desenvolvidos como os adsorventes com extração de imunoafinidade (ligações antigénio/anticorpo) e os polímeros molecularmente impressos (MIP) (122).
