UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
RENATA KELLY PEREIRA DA SILVA
PRODUÇÃO DE LIPASE POR Candida tropicalis URM 7057 UTILIZANDO BIORREATOR TANQUE AGITADO
FORTALEZA 2019
PRODUÇÃO DE LIPASE POR Candida tropicalis URM 7057 UTILIZANDO BIORREATOR TANQUE AGITADO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Engenharia Química. Área de concentração: Processos Químicos e Bioquímicos.
Orientadora: Prof.ª Dra. Luciana Rocha Barros Gonçalves.
Coorientador: Prof. Dr. André Casimiro de Macedo.
FORTALEZA 2019
Universidade Federal do Ceará Biblioteca Universitária
Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
S583p Silva, Renata Kelly Pereira da.
Produção de lipase por Candida tropicalis URM 7057 utilizando biorreator tanque agitado / Renata Kelly Pereira da Silva. – 2019.
109 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Fortaleza, 2019.
Orientação: Profa. Dra. Luciana Rocha Barros Gonçalves. Coorientação: Prof. Dr. André Casimiro de Macedo.
1. Lipase. 2. Aeração. 3. Biorreator. I. Título.
PRODUÇÃO DE LIPASE POR Candida tropicalis URM 7057 UTILIZANDO BIORREATOR TANQUE AGITADO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Engenharia Química. Área de concentração: processos químicos e bioquímicos.
Aprovada em: _26_/_02_/_2019_.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Prof.ª Dra. Luciana Rocha Barros Gonçalves (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Dr. André Casimiro de Macedo (Coorientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof.ª Dra. Maria Valderez Ponte Rocha
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Dr. Gilvan Pessoa Furtado
Aos meus pais, Elizabeth Jane e José Pereira. Obrigado por existirem e agigantarem meu desejo de viver e vencer. Amo vocês!
À Deus por todos os momentos.
O presente trabalho foi realizado com apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ).
À Universidade Federal do Ceará e ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, pela oportunidade em realizar o Mestrado e por possibilitarem meu amadurecimento profissional e pessoal.
À minha família, em especial meus pais, pelo incentivo, confiança, dedicação, amor e carinho. Todo meu amor e gratidão não são suficientes para agradecer tudo que fazem por mim.
À Professora Dra. Luciana Gonçalves, com seu carisma, delicadeza, gentileza, compreensão, dedicação, atenção e carinho, sempre com muita paciência e disposição para esclarecer dúvidas e auxiliar no que fosse preciso. Muito obrigada pela oportunidade.
Ao Professor Dr. André Casimiro, por estar sempre pronto a ajudar e transmitir seus conhecimentos.
À Professora Dra. Sueli Rodrigues, por ceder o microrganismo, objeto desse estudo.
Às Professoras Dra. Maria Valderez Ponte Rocha e Dra. Ana Iraidy Santa Brigida que muito contribuíram na finalização deste trabalho com dicas, sugestões e muitas aprendizagens.
Às minhas queridas Professoras Dra. Sharline Florentino de Melo Santos e Dra. Andrea Farias de Almeida, minhas orientadoras da graduação e especialização, que me fizeram seguir o mundo da microbiologia. Seus ensinamentos serão eternos.
Agradeço aos membros da banca, por terem aceitado o convite para discutir este trabalho, pelo tempo dispensado às correções e sugestões.
À Usina Japungu e ao Willyan Costa, pelo fornecimento do subproduto melaço.
Aos meus irmãos Ricardo, Roberto e Rodrigo pela confiança, admiração e torcida fiel. A toda a minha família, avôs, tios, primos, todos.
À Thayza, amiga e cunhada, pelo companheirismo e conselhos.
À Bruna, sempre presente na minha vida, que acompanhou as ansiedades, dificuldades e sucesso, me apoiando nos momentos mais difíceis;
À Roxana Fernandes, por me dizer o que eu precisava ouvir em muitos momentos difíceis e também nos momentos felizes.
Aos amigos, Evanice Medeiros, Amanda Girard, Isabela Nunes, Mariana Freitas, Diego Amorim, Denis Caballero, que nunca me abandonaram e que agradeço por todo o carinho e apoio que eu sempre recebi.
À Dr.ª. Maria de Fátima Matos e Guilherme Ruben pela amizade, contribuição para a realização deste trabalho e também por nunca medir esforços para me ajudar.
A Dayana do Labiotec por todo o apoio, ajuda ao tirar minhas dúvidas. À Ravena, Juliana, Layanne, Ticiane e Edvan, muito bom ter estado com vocês, meus fiéis escudeiros, agradeço a paciência, a dedicação, o carinho, o amor e a companhia que não me faltaram.
À família GPBio Gabriel, Bruna, Nathalia, Marcia, Eva, Ítalo, Raíssa, Davi, Carla, Maysa, Rayanne, Kimberly, Marylanne, Lorena pelos ensinamentos, auxílios, amizade e carinho. Vocês tornam a rotina no laboratório leve e agradável.
Aos amigos de mestrado, por todos os momentos que marcaram essa passagem. Em especial à Darlysson, Raquel, Virgínia, Renato, Jorge, Silvia, Lianna e Karol.
A Wesley Dayvisson, que me ajudou na realização desse trabalho, principalmente nos momentos mais delicados. Obrigada pelo amor, carinho, apoio, atenção, força e pelos vários momentos de alegria e por suportar a minha ausência e correria durante esses dois anos.
A todos os amigos e familiares que contribuíram para a concretização desse sonho.
“ Faça o teu melhor, na condição que você tem, enquanto você não tem condições melhores, para fazer melhor ainda. ” Mario Sergio Cortella
RESUMO
As enzimas Lipases (triacilglicerol-hidrolases, E.C. 3.1.1.3) são ubíquas, possuem significância fisiológica considerável e potencial industrial. Estas moléculas são os biocatalisadores mais utilizados na síntese orgânica, por não serem, nem ambientalmente perigosos, nem tóxicos na natureza, elas fornecem soluções mais limpas e mais adequadas para a síntese de produtos químicos em comparação a catalisadores de origem química. Os elevados custos dos extratos enzimáticos comerciais, intensificam os estudos visando o barateando da produção, a partir da otimização da produção enzimática a fim de aumentar a competitividade com os catalisadores químicos. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi maximizar a produção da enzima lipase utilizando fontes alternativas de carbono, nitrogênio e indutor, e como diferencial, a partir do cultivo aerado em biorreator tanque agitado em batelada e batelada alimentada. Cultivos utilizando a Candida tropicalis URM 7057 foram realizados em biorreator de 5 L cujo meio de cultivo consistia em 5,0 g L-1 de glicose do melaço de cana, fonte de carbono, 6,0 g L-1 de proteína da água de maceração de milho (CSL), fonte de nitrogênio, 0,5% v/v de águas residuais das usinas de azeite (OMW), indutor, 0,5 g L-1 de sulfato de amônio e 3,0 g L-1 de peptona em tampão de fosfato de potássio a pH 7,0 a 30 ºC e 300 rpm por 72 horas, avaliando o tempo de inóculo (4 e 24 horas), os diferentes fluxos de transferências de oxigênio (sem aeração forçada, 0,25 e 0,75 vvm), o efeito da concentração inicial de glicose (2,5 e 5,0 g L-1) além da produção em batelada alimentada a partir da adição do indutor, águas residuais das usinas de azeite . Ao transferir o inóculo ainda na fase exponencial de crescimento, houve uma maior produção da enzima em menor tempo de cultivo. A partir dos diferentes fluxos de transferência de oxigênio o resultado mais expressivo foi encontrado na condição de 0,75 vvm resultando em 2062,48 ± 163,41 U L-1 em 60 h de cultivo. A concentração de glicose (2,5 g L-1) restringiu a produção de lipase no ensaio. No cultivo em batelada alimentada houve um aumento no crescimento celular e atividade total máxima 2724,48 ± 70,11 U L-1 em 120 h de cultura. Com o estudo foi obtido o aumento da atividade enzimática da lipase a partir das novas perspectivas e estratégias utilizadas.
The enzymes Lipases (triacylglycerol hydrolases, EC 3.1.1.3) are ubiquitous, have considerable physiological significance and industrial potential, are the most used biocatalysts in organic synthesis, because they are neither environmentally hazardous nor toxic in nature, they provide more solutions clean and more suitable for the synthesis of chemicals compared to catalysts of chemical origin. The high costs of the commercial enzymatic extracts intensify the studies aiming at cheapening the production, from the optimization of the enzymatic production in order to increase the competitiveness with the chemical catalysts. Thus, the objective of this study was to maximize lipase enzyme production using alternative sources of carbon, nitrogen and inducer, and as a differential, from the aerated culture in agitated tank bioradulator in batch and fed batch. Cultures using Candida tropicalis URM 7057 were carried out in a 5 L bioreactor whose culture medium consisted of 5.0 g L -1 sugar cane molasses, carbon source, 6.0 g L-1 protein maize maceration water (CSL), nitrogen source, 0.5% v / v olive oil (OMW) waste water, inducer, 0.5 g L-1 ammonium sulfate and 3.0 g L -1 of peptone in potassium phosphate buffer at pH 7.0 at 30 ° C and 300 rpm for 72 hours, evaluating the inoculum time (4 and 24 hours), the different oxygen transfer fluxes (without forced aeration, 0.25 and 0.75 vvm), the effect of the initial glucose concentration (2.5 and 5.0 g L-1) in addition to the batch production fed from the addition of the inductor, wastewater from the olive oil mills. When transferring the inoculum still in the exponential phase of growth, there was a greater production of the enzyme in less time of culture. From the different oxygen transfer fluxes the most expressive result was found in the condition of 0.75 vvm resulting in 2062.48 ± 163.41 U L-1 in 60 h of culture. Glucose concentration (2.5 g L-1) restricted lipase production. In the batch fed there was an increase in cell growth and maximum total activity 2724.48 ± 70.11 U L-1 in 120 h of culture. With the study, the enzymatic activity of lipase was increased from the new perspectives and strategies used.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Algumas reações catalisadas por lipases ... 21 FIGURA 2 - Mercado global de enzimas... 38 FIGURA 3 - Fluxograma seguido para a execução da pesquisa... 41 FIGURA 4 - Biorreator utilizado na produção da lipase: (a) antes da
inoculação (b) durante o processo de cultivo... 45 FIGURA 5 - Cinética de crescimento da levedura Candida tropicalis em
mesa agitadora... 53 FIGURA 6 - Fotomicrografias das células de Candida tropicalis URM 7057
a 40x... 54 FIGURA 7 - Produção de lipase em diferentes tempos de inóculo: atividade
extracelular. As médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de tukey a 5% de probabilidade (■) 4h (fase de crescimento exponencial), (□) 24 h (fase de declínio ou morte)... 56 FIGURA 8 - Evolução temporal da produção de biomassa. Os valores em
barra são as médias de experimentos independentes. (■) 0,0 vvm, (●) 0,25 vvm e (▲) 0,75 vvm... 58 FIGURA 9 - Evolução temporal da atividade extracelular no estudo da
aeração. Os valores em barra são as médias de dois experimentos independentes. (■) 0,0 vvm, (●) 0,25 vvm e (▲) 0,75 vvm... 59 FIGURA 10 - Evolução temporal da atividade intracelular. Os valores em
barra são as médias de dois experimentos independentes. (■) 0,0 vvm, (●) 0,25 vvm e (▲) 0,75 vvm... 60 FIGURA 11 - Evolução temporal do consumo de glicose no estudo da
aeração. Os valores em barra são as médias de dois experimentos independentes. (■) 0,0 vvm, (●) 0,25 vvm e (▲) 0,75 vvm... 61 FIGURA 12 - Evolução temporal do pH no estudo das diferentes aerações.
vvm... FIGURA 13 - Evolução temporal da concentração celular no estudo da concentração inicial de substrato. (a), atividade extracelular (c) e intracelular (e), pH (b), concentração de glicose (d) por C.
Tropicalis URM 7057 cultivada em str. Os valores são as
médias dos dois experimentos independentes e as barras, o erro. (●) 2,5 g L-1 de glicose inicial e (■) 5,0 g L-1 de glicose inicial a 0,75 vvm... 68 FIGURA 14 - Produção de lipase em biorreator em batelada alimentada com
indutor (omw) sob taxa de aeração controlada (0,25 vvm). (■) glicose (g L-1), (■) concentração celular (UFC mL-1) e (▲) atividade extracelular (UL-1)... 73 FIGURA 15 - Perfil temporal da atividade extracelular e pH. (■) atividade
extracelular (U L-1), (∆) pH... 74 FIGURA 16 - Atividade enzimática intra e extracelular no ensaio com
aeração 0,25 vvm em batelada alimentada. (■) atividade extracelular (U L-1 ), ( □ ) atividade intracelular (U L-1)... 75 FIGURA 17 - Velocidade específica de crescimento na fase exponencial
para o ensaio de crescimento celular em mesa agitadora a 170 rpm... 91 FIGURA 18 - Velocidade específica de crescimento na fase exponencial
para o ensaio de aeração 0 vvm em biorreator a 300 rpm... 91 FIGURA 19 - Velocidade específica de crescimento na fase exponencial
para o ensaio de aeração 0,25 vvm em biorreator a 300 rpm... 91 FIGURA 20 - Velocidade específica de crescimento na fase exponencial
para o ensaio de aeração 0,75 vvm em biorreator a 300 rpm... 92 FIGURA 21 - Velocidade específica de crescimento na fase exponencial
para o ensaio de aeração 0,75 vvm e concentração inicial de 2,5 g L-1 de glicose em biorreator a 300 rpm... 92
FIGURA 22 - Velocidade específica de crescimento na fase exponencial para o ensaio de aeração 0,25 vvm e batelada alimentada em biorreator a 300 rpm... 92 FIGURA 23 - Produção de lipase em biorreator sob taxa de aeração
controlada (0 vvm). (●) glicose (g L-1), (■) concentração celular (UFC mL-1) e (▲) atividade extracelular (U L-1)... 93 FIGURA 24 - Atividade lipolítica, pH e oxigênio dissolvido durante o tempo
de fermentação com 0 vvm de aeração: (●) pH, (■) atividade extracelular (U L-1)... 93 FIGURA 25 - Atividade enzimática total no ensaio com aeração 0 vvm. (■)
atividade extracelular (U L-1), (□) atividade intracelular (U L
-1)... 93 FIGURA 26 - Produção de lipase em biorreator sob taxa de aeração
controlada (0,25 vvm). (●) glicose (g L-1), (■) concentração celular (UFC mL-1) e (▲) atividade extracelular (U L-1)... 94 FIGURA 27 - Atividade lipolítica, pH e oxigênio dissolvido durante o tempo
de fermentação com 0,25 vvm: (●) pH, (■) atividade extracelular (U L-1)... 94 FIGURA 28 - Atividade enzimática total no ensaio com aeração 0,25 vvm.
(■) atividade extracelular (U L-1), (□) atividade intracelular (U L
-1)... 94 FIGURA 29 - Produção de lipase em biorreator sob taxa de aeração
controlada (0,75 vvm). (●) glicose (g L-1), (■) concentração celular (UFC mL-1) e (▲) atividade extracelular (U L-1)... 95 FIGURA 30 - Atividade lipolítica, pH e oxigênio dissolvido durante o tempo
de fermentação com 0,75 vvm: (●) pH, (■) atividade extracelular (U L-1), (▲) concentração de oxigênio dissolvido (mg L-1)... 95 FIGURA 31 - Atividade enzimática total no ensaio com aeração 0,75 vvm.
(■) atividade extracelular (U L-1), (□) atividade intracelular (U L
-1)... 95 FIGURA 32 - Atividade lipolítica, pH e oxigênio dissolvido durante o tempo
dissolvido (mg L-1)... 96 FIGURA 33 - Atividade enzimática total no ensaio com aeração 0,75 vvm e
2,5 g L-1 de glicose. (■) atividade extracelular (U L-1), (□) atividade intracelular (U L-1)... 96 FIGURA 34 - Dados de conversão... 100 FIGURA 35 - Número de potência versus reynolds para diversos
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Cepas microbiológicas usadas em estudos recentes para a
produção das lipases... 23
TABELA 2 - ConFiguração de biorreatores utilizados para a produção de lipase... 33
TABELA 3 - Coeficiente global de transferência de oxigênio (kLa), taxa mínima de agitação (ncd) e flow number (FL) sob diferentes taxas de aeração em um fermentador com volume útil de 5 L a 300 rpm ou 5 rot s-1... 63 TABELA 4 - Efeito do fluxo de ar na produção de lipase obtida em biorreator. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si, minúscula na linha, pelo teste de tukey a 5% de probabilidade... 64
TABELA 5 - Influência da concentração inicial de glicose... 70
TABELA 6 - Parâmetros cinéticos do cultivo em batelada e batelada alimentada com aeração de 0,25 vvm... 75
TABELA 7 - Valores dos expoentes para biorreatores com tanque agitado.. 97
TABELA 8 - Valores de aerações convertidos para nm³ s-1... 99
TABELA 9 - Aerações transformadas de nm3 s-1 para m3 s-1... 100
TABELA 10 - Conversões obtidas para a aeração... 100
TABELA 11 - Dados requeridos para o cálculo do flow number... 101
TABELA 12 - Flow number para cada aeração utilizada no reator... 101
ATCC Coleção de cultura - American Type Culture Collection BBC Emissora - British Broadcasting Corporation
SL Água de maceração de milho
OD Oxigênio dissolvido
KLa Coeficiente global de transferência de oxigênio
MTCC Coleção de cultura - Microbial Type Culture Collection and Gene Bank NRRL Coleção de cultura - Northern Regional Research Laboratory
OMW Águas residuais das usinas de azeite pH Potencial Hidrogeniônico
SmF Cultivo em estado submerso SSF Cultivo em estado sólido STR Reator de tanque agitado
UFC Unidades Formadoras de Colônia
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 20
2 ESTADO DA ARTE ... 22
2.1 Enzimas ... 22
2.2 Aspectos gerais das lipases ... 23
2.3 Fontes de lipases ... 24
2.3.1 Lipases de Candida ... 27
2.4 Fatores que influenciam a produção das lipases ... 28
2.4.1 Meio de cultura ... 28
2.4.1.1. Efeito da fonte de carbono ... 30
2.4.1.2. Efeito da fonte de nitrogênio ... 31
2.4.1.3. Efeito dos íons metálicos ... 32
2.4.2 Parâmetros físicos ... 32
2.4.2.1. Efeito do pH e temperatura ... 32
2.4.2.2. Efeito da agitação e aeração ... 33
2.4.3 Produção de lipases em biorreatores ... 34
2.4.3.1. Modos de operação do biorreator... 35
2.4.3.2. Determinação de KLa durante um processo fermentativo ... 39
2.5 Aplicações das lipases ... 40
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 43
3.1 Fluxograma das etapas de estudo ... 43
3.2 Microrganismo ... 43
3.5 Preparação do Inóculo ... 45
3.6 Curva de crescimento ... 45
3.7 Produção da lipase em reator de mistura ... 45
3.8 Ensaio para determinação do tempo de incubação do inóculo ... 46
3.9 Ensaio para a determinação dos efeitos da aeração ... 47
3.10 Avaliação do estudo da concentração inicial de glicose na produção da lipase ... 47
3.11 Produção da enzima sob condição de batelada alimentada... 47
3.12 Métodos analíticos ... 47
3.12.3 Determinação do teor de açúcar redutor ... 48
3.12.4 Determinação do crescimento celular ... 48
3.12.5 Cálculo do número de células ... 49
3.12.6 Determinação da atividade enzimática ... 49
3.12.7 Determinação de oxigênio dissolvido (DO) ... 50
3.13 Respiração microbiana ... 50
3.14 . Cálculo do Número de fluxo (Fl) e taxa de agitação mínima (NCD) ... 51
3.15 Cálculo do coeficiente global de transferência de oxigênio (kLa) ... 51
3.16 Determinação dos Parâmetros Cinéticos ... 52
3.16.1 Velocidade Específica de Crescimento (µx,máx) ... 52
3.16.2 Fatores de conversão ... 53
3.16.3 Produtividade ... 53
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 55
4.1 Curva de crescimento ... 55
4.2 Avaliação do tempo de inóculo ... 57
4.3 Efeito da taxa de aeração na produção de lipase ... 60
4.4 Efeito da glicose na produção de lipase ... 69
4.5 Efeito da batelada alimentada na produção de lipase ... 73
5 CONCLUSÃO... 80
PERSPECTIVAS ... 81
REFERÊNCIAS ... 82
APÊNDICE A – VELOCIDADES ESPECÍFICAS DE CRESCIMENTO ... 96
APÊNDICE B – CINÉTICA DE PRODUÇÃO ENZIMÁTICA A 0 VVM ... 98
APÊNDICE C – CINÉTICA DE PRODUÇÃO ENZIMÁTICA A 0,25 VVM .... 99
APÊNDICE D – CINÉTICA DE PRODUÇÃO ENZIMÁTICA A 0,75 VVM .. 100
APÊNDICE E – CINÉTICA DE PRODUÇÃO ENZIMÁTICA A 0,75 VVM E 2,5 G L-1 DE GLICOSE ... 101
APÊNDICE F – CARACTERIZAÇÃO DOS PRODUTOS E SUBPRODUTOS AGROINDUSTRIAIS ... 102
APÊNDICE G – CORRELAÇÕES PARA O CÁLCULO DO COEFICIENTE DE TRANSFERÊNCIA DE OXIGENIO ... 103 APÊNDICE H – DETERMINAÇÃO DO KLA DO REATOR EPPENDORF . 105
1 INTRODUÇÃO
As enzimas hidrolíticas são as mais amplamente utilizadas na indústria, dentre as quais, destacam-se as enzimas lipases, utilizadas em diversas áreas.
Além de atuar na catálise da hidrólise de triglicerídeos para produzir ácidos graxos, as lipases podem realizar reações de síntese, tais como esterificação, interesterificação e transesterificação na presença de solventes orgânicos. Essa versatilidade a torna uma escolha para a indústria farmacêutica, de alimentos, têxtil e de cosméticos.
Por serem de natureza ubíqua, são encontradas em múltiplos organismos unicelulares e multicelulares. Por participarem de vias catabólicas são caracteristicamente induzíveis, ou seja, passam por um processo de ativação da expressão de genes em resposta a uma substância no ambiente (SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012). Para a produção das enzimas, há requisitos nutricionais dos microrganismos, além das fontes de carbono, nitrogênio e íons, devem-se adicionar uma fonte de gordura ou óleos com o intuito de suprir sua necessidade indutiva e assim, expressar a enzima requerida.
As tecnologias de processamento acabaram por impulsionar o interesse entre os pesquisadores a buscar por novas fontes viáveis de lipases estimulando a pesquisa através do isolamento, seleção de novas cepas e otimização da produção (LAI et al., 2018).
A partir da necessidade por novas estratégias para o desenvolvimento de bioprocessos que utilizem matérias-primas de baixo custo, o grupo de Pesquisa e Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos (GPBio) do Departamento de Engenharia Química (DEQ) da Universidade Federal do Ceará (UFC) vem desenvolvendo estratégias para produção de diversas enzimas ao longo dos anos, dentre elas, a lipase.
Em um trabalho pioneiro no GPBio, Freitas (2017) otimizou a produção de lipase por Candida tropicalis URM 7057 e Meyerozyma caribbica LABIOTEC 4 e as compararam com a levedura C. rugosa NRRL Y-95. Avaliou-se a produção de lipase a partir de meios sintéticos e alternativos, em mesa agitadora e em biorreator de 1L sem aeração forçada. A produção em biorreator tipo tanque agitado favoreceu a produção de lipases por C. rugosa, alcançando a maior atividade extracelular (600 U L-1) as atividades foram maiores que as produzidas em frascos (400 U L-1), após 48
agitadora (400 U L-1), em 48 horas.
Defranceschi Oliveira et al., (2012) otimizaram a produção de lipase através de delineamento experimental com o objetivo de imobilizar a enzima para a síntese de oleato de metila. A partir de um planejamento experimental para a produção de lipase, atingiu a produção de 25 U mL-1. As enzimas foram obtidas da levedura
Candida guillermondi (Candida tropicalis) isolada de folhas de mamona (Ricinus communis L.). As variáveis utilizadas no delineamento experimental foram os
componentes do meio de cultivo: Tween 80, glicerol, óleo de soja, sulfato de manganês, extrato de levedura de cerveja e sulfato de amônio, e foram realizados em mesa agitadora. Verificou-se que as maiores concentrações de óleo de soja e Tween 80 afetaram positivamente a produção de lipase.
Os trabalhos descritos anteriormente para a produção da lipase de Candida
tropicalis ou Candida Guillermondii foram realizados mesa agitadora, ou em biorreator
sem aeração forçada. Dentro deste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar a produção em biorreator tanque agitado, com e sem aeração forçada, da lipase pela linhagem Candida tropicalis URM 7057 a partir do meio alternativo proposto por Freitas (2017).
Avaliou-se o efeito da variação do tempo do inóculo na produção aerada da enzima, fluxos de transferências de oxigênio e concentrações iniciais da fonte de carbono (melaço de cana de açúcar) na síntese enzimática. Em seguida, comparou-se a produção aerada da enzima usando diferentes estratégias de condução dos bioprocessos: batelada e batelada alimentada com o indutor.
2 ESTADO DA ARTE
Neste capítulo será apresentado uma breve revisão bibliográfica com temas relevantes ao assunto com ênfase na produção e aplicação da lipase.
2.1 Enzimas
As enzimas são moléculas biológicas que agem como biocatalisadores poderosos, possuem a capacidade de converter um composto específico (como substrato) em produtos. Como qualquer catalisador, atuam aumentando a taxa de reação reduzindo a barreira energética das reações bioquímicas sem serem alteradas como consequência da reação que promoveram (BORZANI, 2001; BRAHMACHARI, 2016; ILLANES, 2008; MADHAVAN et al., 2017).
A catálise enzimática caracteriza-se por dois fatores principais: especificidade e aceleração da taxa de reação. Uma enzima geralmente catalisa uma única reação química ou um conjunto de reações estreitamente relacionadas. Nas reações catalisadas por enzimas, reações secundárias que conduzem à formação de subprodutos são raras, em contraste com as não catalisadas por enzimas (BERG; TYCOCZKO; STRYER, 2007; BRAHMACHARI, 2016; PANDEY et al., 1999).
As reações catalisadas por enzimas em meio aquoso são amplamente exploradas com aplicações na produção de alimentos, detergentes, couro e produtos farmacêuticos. Apesar de existirem algumas restrições referentes à sua estabilidade custo de pr*ocesso (GOP, 2017).
Os microrganismos constituem a principal fonte de enzimas à medida que produzem altas concentrações extracelularmente, sendo mais utilizados para sua produção as bactérias, fungos e arqueas (BRAHMACHARI, 2016; SALIHU; ALAM, 2015).
De acordo com a União Internacional de Bioquímica (IUB), e com base em sua natureza de reação, as enzimas são divididas em seis classes: oxidorredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases (BRAHMACHARI, 2016).
Lipases (hidrolases triacilglicerol, E.C. 3.1.1.3) são enzimas serina hidrolases, pertencem a superfamília de α/β-hidrolases, ubíquas, possuem significância fisiológica considerável e potencial industrial (KOURIST; HOLLMANN; NGUYEN, 2014; SHARMA et al., 2001). Podem ser definidas como carboxilesterases que catalisam a hidrólise de ésteres, particularmente triglicerídeos de cadeia longa, liberando ácidos graxos livres, di- e monoglicerídeos e glicerol (AEHLE, 2007; BRAHMACHARI,2016; HUANG et al., 2013; JAEGER; EGGERT, 2002).
O mecanismo de ação da lipase possui uma etapa chamada de ativação interfacial, que compreende duas conformações, uma aberta e ativa e outra, fechada e inativa (PALOMO et al., 2005). E sua estrutura catalítica inclui os resíduos da tríade catalítica (serina, histidina e ácido aspártico ou glutâmico) e o orifício de oxionona, uma bolsa no sítio ativo envolvido na catálise (BARRIUSO et al., 2016).
Algumas lipases têm afinidade por ácidos graxos de cadeia curta, ácidos graxos insaturados, enquanto muitas outras são inespecíficas. Os ésteres de ácidos graxos, bem como os álcoois, são hidrolisados, além da hidrólise, as lipases também podem catalisar esterificação, interesterificação e transesterificação em meios com pouca água (BRAHMACHARI, 2016; KAPOOR; GUPTA, 2012). Algumas reações genéricas catalisadas por lipases estão representadas na Figura 1.
As lipases possuem potencial industrial significativo devido a inúmeras vantagens, como a alta atividade catalítica, ampla aplicabilidade, condições de reações leves (necessárias para moléculas complexas e quimicamente instáveis), baixa carga de catalisador, reutilizável (quando imobilizada) e possibilidade de redução ou eliminação de subprodutos de reação (BRAHMACHARI, 2016; ILLANES, 2008; SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012)
Figura 1 – Algumas reações catalisadas por lipases
Fonte: Adaptado de Ghanem (2007).
2.3 Fontes de lipases
Embora as lipases sejam de ocorrência generalizada em toda a flora e fauna da Terra, as principais fontes consistem nos microrganismos devido a facilidade de manipulação genética, abundância natural, rica diversidade e sua produção não depender de condições geográficas e ambientais (PANDEY et al., 1999; HASAN; SHAH; HAMEED, 2006; KIELISZEK et al., 2017; MADHAVAN et al., 2017).
Microrganismos produtores de lipase estão sendo isolados de diversos hábitats como áreas contaminadas com óleo e produtos químicos (BHARATHI; RAJALAKSHMI; KOMATHI, 2018; XIE et al., 2016), de efluentes industriais (ERTUǦRUL; DÖNMEZ; TAKAÇ, 2007; MAFAKHER et al., 2010), de plantas
ambiente salino (AI; HUANG; WANG, 2018).
O desenvolvimento intensivo da biotecnologia resultou em um número cada vez maior de processos tecnológicos realizados com microrganismos (KIELISZEK et al., 2017). Por não possuírem natureza ambientalmente perigosa, nem tóxica, fornecem soluções "mais limpas" e adequadas para a síntese de produtos químicos e compostos a granel em comparação a outros catalisadores químicos ou sintéticos (JAVED et al., 2017; MADHAVAN et al., 2017).
Alguns exemplos de microrganismos que produzem a enzima lipase e foram estudados recentemente estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1 – Cepas microbiológicas usadas em estudos recentes para a produção das lipases
FONTE BACTÉRIAS
Bacillus sp Sharma et al. (2014)
Bacillus stratosphericus Gricajeva; Bendikienė; Kalėdienė (2016) Burkholderia cepacia Xie et al. (2016)
Burkholderia ubonensis Yang et al. (2016)
Geobacillus sp. Tayyab; Rashid; Akhtar (2011)
Geobacillus stearothermophilus Sifour et al. (2010)
Pseudomonas sp. Patel; Nambiar; Madamwar (2014)
Fungos
Aspergillus carbonarius Dobrev et al. (2015) Aspergillus ibericus Abrunhosa et al. (2013) Geotrichum candidum Maldonado et al. (2012)
Mucor geophillus S. H. Naqvi e M.Y. Khan (2012)
Penicillium camembertii Malilas et al. (2013)
Rhizopus delemar Açikel; Erşan; Saǧ Açikel (2010) Thermomyces lanuginosus Sreelatha et al. (2017)
Leveduras
Candida antarctica Liu; Zhang (2011)
Candida cylindracea Kuroiwa et al. (2016)
Candida rugosa Salehmin; Annuar; Chisti (2014)
Candida tropicalis Freitas (2017); Defranceschi et al. (2012) Debaryomyces hansenii Papagora; Roukas; Kotzekidou (2013) Candida viswanathii Gomes et al. (2018)
Galactomyces geotrichum Qiao et al. (2017) Rhodotorula glutinis Taskin et al. (2016) Yarrowia lipolytica Ping et al. (2018)
Alguns dos fungos filamentosos produtores de lipase comercialmente importantes são reconhecidos como pertencentes aos gêneros Rhizopus sp.,
Aspergillus sp., Penicillium sp., Geotrichum sp., Mucor sp. e Rhizomucor sp.
(TREICHEL et al., 2010)
A lipase produzida a partir de bactérias considera-se a mais adequada para resistir ao ambiente industrial resistente. Uma grande parte dos estudos sobre produção e caracterização de lipases foi focada em fontes bacterianas, dentre elas a
Bacillus pumilus, Bacillus cereus, Burkholderia cepacia, Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e Streptomyces lividans (JAVED et al.,
2017).
Existem vários tipos de leveduras que produzem lipases, algumas fontes importantes são Candida rugosa, Candida antarctica, Candida cylindracea,
Galactomyces geotricum, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Rhodotorula mucilaginosa e Aureobasidium pullulans (GUPTA et al., 2015; TREICHEL et al., 2010)
Com um vasto potencial prático em biotecnologia, as leveduras de Candida também são utilizadas como fonte de proteínas microbianas, polissacarídeos, além disso, age na biossíntese de outros metabólitos, tais como xilitol, eritritol, ácido cítrico, etanol e biocatalisadores, como as lipases (KIELISZEK et al., 2017).
2.3.1 Lipases de Candida
O gênero Candida é filogeneticamente heterogêneo e abrange 314 espécies. As colônias de Candida são um tipo de creme amarelado. Se reproduzem em até três dias possuem textura que pode ser pastosa, lisa, brilhante ou seca, enrugada e opaca. Dependendo da espécie, a reprodução procede por brotamento holoblástico e seu interesse grande comercial engloba as enzimas extracelulares, como pectinases, ß-glicosidases, proteases, invertases, amilases e lipases (HOMMEL, 2014).
Dentro da biocatálise, as lipases de Candida rugosa foram primeiramente descritas já nos anos 60 (DOMÍNGUEZ DE MARÍA et al., 2006). A Candida rugosa é uma levedura pseudofilamentosa, unicelular e não patogênica, é geralmente considerada segura (FERRER et al., 2001).
Diversas pesquisas estão relatando diferentes pespectivas sobre lipases da C. rugosa na última década sugerindo que esta levedura de 40 anos ainda tem muitas surpresas para mostrar (BENJAMIN; PANDEY, 1998; DOMÍNGUEZ DE MARÍA et al., 2006; FERRER et al., 2001; GEOFFRY; ACHUR, 2018; KIELISZEK et al., 2017).
Outras lipases do gênero Candida têm sido estudadas quanto a sua produção e aplicação, entre elas se destacam C. lipolytica (ALI; RAFI; IKRAM-UL-HAQ, 2010), C. rugosa (CAVALCANTI et al., 2018; DALMAU et al., 2000; OBRADORS et al., 1993), C. cylindracea (KIM; HOU, 2006; SALIHU et al., 2011), C. antarctica (LI et al., 2018; LIU; ZHANG, 2011), C. viswanathii (ALMEIDA et al., 2018; DE ALMEIDA; TAULK-TORNISIELO; CARMONA, 2013) e C. tropicalis (TAKAHASHI et al., 1998; Freitas, 2017).
Atualmente, as lipases de C. cylindracea, C. rugosa, C.antarctica, são comercializadas por várias empresas como Atlus Biologics, Amano, Meito Sangyo, Boehringer Mannheim, Biocatalysts, Novozymes e Nova-nordisk (SINGH;
MUKHOPADHYAY, 2012).
2.4 Fatores que influenciam a produção das lipases
As lipases microbianas são produzidas principalmente por fermentação submersa, de maioria extracelular, excretada através da membrana celular no meio de cultivo (GHOSH et al., 1996; ILLANES, 2008; TREICHEL et al., 2010).
O processo de produção da enzima lipase por cultivo microbiano depende da composição do meio de cultivo: fonte de nitrogênio, carbono e lipídios, concentração de sais inorgânicos; além de fatores como pH, temperatura, volume de inoculação, período de incubação, concentração de oxigênio dissolvido, agitação, e também relacionados ao design do biorreator, como a conFiguração e diâmetro do impulsor (ARPIGNY; JAEGER, 1999; MALDONADO et al., 2012; PUTHLI; RATHOD; PANDIT, 2006; TREICHEL et al., 2010).
2.4.1 Meio de cultura
Os requisitos nutricionais para o crescimento microbiano são cumpridos baseados em compostos definidos (meio sintético) como açúcares, óleos e
componentes complexos como por exemplo, peptona, extrato de levedura, extratos de malte e também resíduos agroindustriais contendo todos os componentes necessários para desenvolvimento dos microrganismos (TREICHEL et al., 2010).
O custo com o meio de cultura constitui aproximadamente de 25 a 50% do custo de produção total. Geralmente, a alta produtividade é alcançada pela otimização do meio de cultura. A otimização da concentração de cada composto que constitui um meio de cultivo geralmente é um procedimento demorado, mas é de fundamental importância (MALDONADO et al., 2012; TREICHEL et al., 2010).
Os custos da produção enzimática são amplamente estudados devido à sua importância e potencial para uso em bioprocessos, e nesse contexto, os substratos agroindustriais (resíduos e subprodutos) têm mostrado acessibilidade, baixos custo, apelo ambiental, além da sua composição de nutrientes contendo carbono, nitrogênio e minerais (SALIHU et al., 2012). O que pode torná-los competitivos com a de origem formulada (MIRANDA et al., 1999).
A este respeito, o uso de vários substratos agroindustriais, tais como águas residuais das usinas de azeite, o OMW (BROZZOLI et al., 2009), resíduos da indústria de óleo de palma (SILVEIRA; TARDIOLI; FARINAS, 2016) e melaço (S. H. NAQVI, M.Y. KHAN, 2012) foram estudados e permitiram a produção de quantidades significativas de lipase.
As lipases são, em geral, enzimas induzíveis e geralmente produzidas na presença de uma fonte lipídica, embora o principal fator para a expressão da atividade seja o carbono, no entanto, fontes de nitrogênio e micronutrientes essenciais também devem ser cuidadosamente consideradas (GUPTA; GUPTA; RATHI, 2004; TREICHEL et al., 2010). Poucos pesquisadores obtiveram bons rendimentos na ausência de fonte lipídica (SHARMA et al., 2001; SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012).
Estimulada por lipídios e geralmente coordenada com a disponibilidade de triglicerídeos, certos indutores também têm efeito, incluindo os ácidos graxos livres, ésteres hidrolisáveis, tweens, sais biliares e glicerol (GHOSH et al., 1996; GUPTA; GUPTA; RATHI, 2004; MALDONADO et al., 2012).
A seleção de um microrganismo lipolítico adequado (de preferência que produza uma enzima extracelular para evitar etapas de purificação), juntamente com um indutor de baixo custo e que permita alta produção, é necessária para avançar o desenvolvimento de bioprocessos para aplicações industriais de grande porte (SILVEIRA; TARDIOLI; FARINAS, 2016).
2.4.1.1. Efeito da fonte de carbono
Fontes de carbono são os açúcares, álcool de açúcar, soro, polissacarídeos, ácidos casamino e outras fontes complexas (GUPTA; GUPTA; RATHI, 2004; ILLANES, 2008).
DALMAU et al. (2000) testaram nove diferentes fontes de carbono, glicose, galactose, manitol, glicerol, lactato de sódio, ácido palmítico, ácido oleico, trioleína e
Tween 80 na produção de lipase por Candida rugosa. Utilizando cultura em batelada,
obteve os maiores rendimentos quando lipídios ou ácidos graxos eram utilizados como fontes de carbono.
Nos países mediterrâneos mais de 30 milhões demetros cúbicos de águas residuais das usinas de azeite (OMW’s) são produzidos anualmente (BARBERA et al., 2013). Seu descarte é um problema ambiental em larga escala que afeta o solo e a água subterrânea com seu conteúdo fenólico e carga orgânica devem ser adequadamente gerenciadas para evitar impactos ambientais negativos (BARBERA et al., 2013; ERTUǦRUL; DÖNMEZ; TAKAÇ, 2007).
Alguns estudos utilizando OMW, como parte do meio de cultivo, foram capazes de crescer e produzir quantidades significativas de lipase com diferentes cepas.
D’Annibale et al. (2006) investigaram a aplicação da OMW não diluída por seu uso como possível meio de crescimento e produção da lipase extracelular em
Geotrichum candidum, Rhizopus arrhizus, Rhizopus oryzae, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Candida cylindracea e Penicillium citrinum com destaque para a C. cylindracea que alcançou 9,23 IU mL-1.
Brozzoli et al. (2009) estudaram a adequação do OMW para a produção de lipase a partir da Candida cylindracea suplementando com cloreto de amônio e azeite de oliva. Diversas fontes de nitrogênio foram testadas, mas não afetaram a produção enzimática e a boa produção de lipase alcançou 21,6 U mL-1.
Abrunhosa et al. (2013) avaliaram a cepa Aspergillus ibericus, isolada do vinho de uva para a produção de lipase utilizando OMW sem diluição, com adição de alguns nutrientes minerais e obteve em biorreator de 2 L a atividade máxima de lipase de 8,319 U mL-1.
Conhecendo a necessidade da presença de indutores ao meio para a produção de lipase, López et al. (2010) testaram diferentes óleos (girassol, milho e de
oliva), ácido oleico, tributirina e surfactantes para verificar o possível papel indutor na produção da lipase, havendo um destaque para o surfactante Triton X-100 utilizado.
Sachan e Singh (2017) estudaram a concentração ideal de torta de sementes de Nim azadirachta indica e otimizaram as condições para produção máxima de lipase extracelular por P. aeruginosa JCM5962, através da fermentação semi-sólida a produção máxima de lipase ocorreu após 96 horas de incubação a 37 ºC.
Em relação à fonte de carbono, em geral, utiliza-se sempre algum tipo de óleo vegetal ou resíduo do processo de refino destes óleos. Para a execução desse trabalho, escolheu o melaço de cana de açúcar como fonte de carbono e águas russas como indutor na produção de lipase por apresentar um baixo custo e ter uma ampla produção no cenário mundial e também no Brasil.
2.4.1.2. Efeito da fonte de nitrogênio
Fontes de nitrogênio desempenham um papel importante na síntese biológica da lipase por microrganismos (DHEEMAN; FRIAS; HENEHAN, 2010).
As fontes inorgânicas de nitrogênio podem ser usadas rapidamente, enquanto as fontes de nitrogênio orgânico fornecem fatores de crescimento celular e aminoácidos, que são necessários para o metabolismo celular e síntese enzimática fornecendo altos rendimentos de lipase (TAN et al., 2004).
Diversos trabalhos que avaliaram a produção de lipase utilizando como fonte de nitrogênio a água de maceração de milho (CSL) apontaram a viabilidade do ponto de vista econômico (subproduto de baixo custo) e do ponto de vista bioquímico (boa produtividade da lipase).
Burkert, Maugeri e Rodrigues (2004) utilizaram a metodologia de superfície de resposta para estudar os efeitos da fonte de carbono (óleo de soja, óleo de oliva e glicose) e nitrogênio (CSL e nitrato de amônio) na produção de lipase por Geotrichum
sp. A composição ótima do meio para produção de lipase por Geotrichum sp. foi nitrato
de amônio, CSL e óleo de soja como fonte de carbono, o que levou a uma atividade de lipase de cerca de 20 U mL-1.
Maldonado et al. (2014) avaliaram a produção de lipase extracelular usando CSL no cultivo de Geotrichum candidum NRRLY-552, os resultados obtidos
mostraram que o CSL leva a uma produtividade similar em comparação com a peptona usando o mesmo microrganismo sob condições similares.
Por sua vez, a escolha do CSL nessa pesquisa veio do baixo custo deste produto e também da necessidade de promover um reaproveitamento deste material, que é uma fonte rica em nitrogênio já testada com sucesso.
2.4.1.3. Efeito dos íons metálicos
O requisito de íons metálicos varia com o microrganismo (GUPTA; GUPTA; RATHI, 2004).
Acredita-se que os íons metálicos influenciam a síntese enzimática por
Penicillium camembertii Thom PG, os íons Ca2+ e Fe2+ inibiram a produção de lipase,
talvez esses íons tenham formado complexos com ácido graxo ionizado e então, alterando sua solubilidade, comportamento nas interfaces óleo-água e, logo, a síntese da lipase (TAN et al., 2004).
Rahman, Baharum, Salleh e Basri (2006) avaliaram os efeitos de uma variedade de sais inorgânicos na produção de lipase por P. aeruginosa S5 e, concluíram que Ca2+, Mn2+, Ba2+, Zn2+, Fe2+ e Cu2+ exerceram efeitos inibidores, e quando suplementado o meio peptonado com Na2+ houve um aumento da produção extracelular.
Yang, He, Xu, Zhang e Yan (2016) investigaram os efeitos de diferentes íons metálicos na produção de lipase por Burkholderia ubonensis SL-4. A produção foi influenciada positivamente pelos íons Ca2+ e Mn2+ e negativamente, reduzindo ligeiramente a atividade, os íons Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+ e Zn2+.
2.4.2 Parâmetros físicos
2.4.2.1. Efeito do pH e temperatura
O pH inicial do meio de crescimento é importante para a produção de lipase. Em grande parte, preferem pH neutro (GUPTA; GUPTA; RATHI, 2004).
A temperatura ideal para a produção de lipase corresponde à temperatura de crescimento do respectivo microrganismo. Em geral, está na faixa de temperatura 20 - 45 °C (GHOSH et al., 1996; GUPTA; GUPTA; RATHI, 2004; ILLANES, 2008).
Ali Rafi e Ikram-Ul-Haq (2010) estudaram a produção de lipase extracelular pela levedura C. lipolytica NRRL-Y-1095, e alcançaram um aumento de 2,8 vezes ao otimizar a temperatura (24 – 36 ºC), pH inicial (4 - 7). Foram avaliaram diferentes fontes de carbono (glicose, azeite, Tween-80, óleo de milho e glicerol) e de nitrogênio (peptona, extrato de levedura, extrato de carne, ureia e triptona).
2.4.2.2. Efeito da agitação e aeração
A agitação nos processos de fermentação é necessária para evitar a estratificação, manter a uniformidade do pH, aumentar o contato íntimo entre a alimentação e a cultura microbiana, e evitar a incrustação (AL-MASHHADANI; WILKINSON; ZIMMERMAN, 2015)
A aeração tem um efeito variável na produção de lipases por diferentes organismos. O grau de aeração parece ser crítico em alguns casos, uma vez que as culturas de camada superficial (aeração moderada) produzem muito mais lipase do que as culturas sob agitação (aeração alta) (GHOSH et al., 1996).
Potumarthi et al. (2008) estudaram a influência dos parâmetros de processo, a aeração (1, 2 e 3 vvm) e agitação (100, 200 e 300 rpm), para produção de lipase usando Rhodotorula mucilaginosa MTCC 8737. A atividade máxima de lipase de 72 U mL-1 foi obtida durante 96 horas de fermentação a 2 vvm, 200 rpm, pH 7 e temperatura de 25 ± 2 °C.
Salihu et al. (2011) avaliaram a influência dos parâmetros do processo (aeração, temperatura e agitação) na produção de lipase em biorreator de tanque agitado por Candida cylindracea ATCC 14830 em meio contendo o efluente de moinho de óleo de palma (POME). Uma atividade lipase máxima de 41,46 U mL-1 foi obtido durante 36 horas de fermentação a 1 vvm, 400 rpm e 30 °C, nessas condições o tempo de fermentação foi reduzido significativamente.
Sharma et al. (2014) isolaram estirpes bacterianas produtoras de lipase de amostras de solo contaminadas com óleo, e selecionou Bacillus sp. KS4 por possuir a atividade máxima de lipase extracelular. Para a produção máxima de lipase pela cepa selecionada, vários parâmetros de meio de cultura, como temperatura de incubação, pH, fonte de carbono, fonte de nitrogênio, surfactante e íon metálico. A otimização do meio de produção levou a um aumento da atividade enzimática de 0,612
U mL-1 para 2,17 U mL-1 apresentando um aumento de 3,54 vezes na produção de lipase.
2.4.3 Produção de lipases em biorreatores
O modo de operação é, comumente ditado pelas características do produto de interesse (TREICHEL et al., 2010).
As espécies de fungos são de preferência cultivadas sob fermentação em estado sólido (SSF) apresentando como vantagem a recuperação de produtos mais concentrados, a partir da geração de menos resíduos e o consumo reduzido de água (DUTRA et al., 2008; TREICHEL et al., 2010). A fermentação em estado sólido pode ser usada para produzir enzimas embora haja limitações de transferência de calor e massa dificultam o controle da temperatura dentro do biorreator (PITOL et al., 2016).
A produção de lipase por SSF sob diferentes condições de processo, com diferentes microrganismos como Aspergillus niger (DUTRA et al., 2008), Candida
rugosa (RAE; JAYARAMAN; LAKSHMANAN, 1993), Penicillium restrictum
(CASTILHO et al., 2000), Rhizomucor miehei (AGUIEIRAS et al., 2019).
As bactérias e leveduras são frequentemente cultivadas em fermentação submersa (SmF) devido à alta atividade de água requerida pelos microrganismos, sendo superior a 0,9 (TREICHEL et al., 2010).
Uma comparação quantitativa entre SmF e SSF é difícil devido à diferença nos métodos utilizados para determinar a atividade da lipase (TREICHEL et al., 2010). O tanque cilíndrico, agitado ou não agitado, é o reator mais comum no bioprocessamento (DORAN, 1995). Apesar do desenvolvimento acelerado de biorreatores devido ao seu uso generalizado, ainda existem dificuldades em manter a estabilidade e as taxas no bioprocessos (AL-MASHHADANI; WILKINSON; ZIMMERMAN, 2015).
As lipases microbianas são produzidas principalmente por batelada utilizando reatores onde substratos e microrganismos são misturados e agitados sob temperatura controlada e, geralmente, a lipase é secretada pela célula para o ambiente extracelular (RASTALL, 2007; SALEHMIN; ANNUAR; CHISTI, 2013).
A maioria dos biorreatores se enquadra em uma das seguintes categorias; vasos agitados, colunas de bolhas, reatores de membrana, leitos fluidizados ou fixo.
Os tipos de reatores diferem principalmente em relação ao modo de agitação e aeração (DORAN, 1995).
Nos processos de engenharia bioquímica, a medição do oxigênio dissolvido (OD) é essencial (NAJAFPOUR, 2007). Além de ser um substrato chave, nos bioprocessos aeróbicos, e devido à sua baixa solubilidade em soluções aquosas é necessário o seu fornecimento de modo contínuo (GARCIA-OCHOA; GOMEZ, 2009). A falta de oxigênio no caldo de fermentação pode restringir ou aumentar a formação de metabólitos através da mudança das vias metabólicas, além de afetar outras variáveis do processo, como concentrações de substrato e produto (NAJAFPOUR, 2007; TAKAÇ; ÜNLÜ; ERDEM, 2010).
Diversos estudos relataram que os principais fatores considerados na escolha do biorreator incluem sua geometria, seu sistema de agitação e aeração, a facilidade de operação e controle, a capacidade de separar o produto do meio ou dos subprodutos, a energia consumida e, sua relativa facilidade de limpeza pós-processo (JESUS; MOREIRA NETO; MACIEL FILHO, 2017).
2.4.3.1. Modos de operação do biorreator
Em geral, os reatores de tanque agitado (STR) são usados quando as condições ideais do processo devem ser controladas e mantidas com precisão durante todo o processo de batelada, por exemplo, mistura, pH e controle de temperatura no qual a concentração de nutrientes, células e produtos variam com o tempo à medida que o crescimento das células avança (BRAHMACHARI, 2016; NAJAFPOUR, 2007).
O método em batelada é o bioprocesso mais aplicado em enzimas solúveis ou imobilizadas aplicadas como biocatalisantes (BRAHMACHARI, 2016).
Existem três maneiras principais de cultivar os microrganismos na SmF. A Tabela 2 resume as diferentes formas de produção e conFigurações de biorreatores empregados para a produção de lipase.
Tabela 2 – Configuração de biorreatores utilizados para a produção de lipase
CULTURA
SUBMERSA BIORREATOR REFERÊNCIA
Batelada
STR
Bajaj e Singhal (2010); Bussamara et al. (2010); Deive, Sanromán, Longo (2010); Salehmin, Annuar e
Chisti, (2014)
Airlift
Burkert et al. (2005); Deive, Sanromán e Longo (2010);
Maldonado et al. (2015)
Batelada alimentada STR
Kim e hou (2006); Salehmin, Annuar e Chisti (2014)
Batelada repetida STR
Benjamin e Pandey (1997); Pfeffer et al. (2006); Yang et al. (2005)
Contínua STR
Becker et al. (1997); Deive, Sanromán e Longo (2010); Montesinos et al. (1997) Fonte: Elaborado pelo autor.
A fermentação em batelada é usada principalmente para os estudos preliminares do desenvolvimento do processo, tais como seleção e otimização da composição do meio e outras condições de cultura física (NELOFER et al., 2013). O
processo em batelada, os microrganismos são inoculados em volume fixo de meio e caracterizada pela ausência de adição e retirada da cultura de biomassa, meio nutriente fresco e meio de cultura (BRAHMACHARI, 2016; CINAR et al., 2003).
Colangiuli et al. (2018) produziram halolipases a partir de Halomonas sp. Cultura LM1C em um biorreator de tanque agitado mecanicamente com 1,5 L de volume de trabalho e equipado com um impulsor tipo Rushton duplo. Para otimizar a produção da enzima a taxa de aeração (0,25 – 0,75 vvm) e a velocidade de agitação (300 – 700 rpm) foram variadas. A operação em baixas aerações (0,25 vvm) e taxas moderadas de agitação (583 rpm) levaram a níveis de atividade próximos a 8000 U L -1, superando os valores típicos detectados para outras enzimas extremofílicas.
Zhou et al. (2018) estudaram os efeitos da temperatura, agitação e aeração na produção de glicoproteína GP-1 por Streptomyces kanasenisi ZX01 em biorreatores quádruplos de 5 L com 3,5 L de volume por 7 dias visando um aumento de escala. A produção final máxima de GP-1 foi alcançada a 200 rpm, 2,0 vvm a 30 °C. O aumento de escala foi realizado com base no coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio foi escalonada com sucesso de 5 L para 15 L, 70 L e 500 L, resultando em produções de 3,92, 4,03, 3,82 e 4,20 mg L-1, respectivamente. Manter o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio ao aumentar a escala foi apropriado e essa estratégia alcançou 100 vezes da escala de bancada para piloto.
A cultura batelada alimentada é caracterizada pela adição de porções concentradas de nutrientes que são gradualmente adicionados à cultura descontínua, permitindo a variação temporal no suprimento de nutrientes, permitindo assim o controle mais rígido de vários processos celulares, como o crescimento celular, a absorção de nutrientes e a produção de metabólitos-alvo (BRAHMACHARI, 2016; CINAR et al., 2003).
Os métodos de alimentação podem ser classificados em dois tipos: aqueles sem controle feedback que utiliza uma maneira predeterminada de taxa de alimentação e aqueles que confiam em algum tipo de mecanismo de controle de feedback, ou seja, usa uma variável de fermentação medida online para controlar a alimentação (CINAR et al., 2003; SALEHMIN; ANNUAR; CHISTI, 2013). Variando em complexidade, confiabilidade e custo.
A taxa de alimentação constante, a alimentação exponencial (também conhecida como operação específica de controle da taxa de crescimento) e os métodos de alimentação baseados na medição da concentração de oxigênio
dissolvido estão entre os mais fáceis de implementar e confiáveis (SALEHMIN; ANNUAR; CHISTI, 2013).
Uma operação de batelada com alimentação é geralmente precedida por uma operação em batelada, sendo que essa sequência pode ser repetida muitas vezes, levando a uma operação em batelada com alimentação em série (ou repetida) (CINAR et al., 2003).
Bioprocessos em batelada alimentada têm extensas aplicações na indústriapara fermentações de biomassa de alta densidade e a produção de fermento de panificação, produtos farmacêuticos e vários compostos bioquímicos (HOCALAR; TÜRKER, 2014).
Na operação de cultura contínua, os nutrientes essenciais para o crescimento são continuamente alimentados e uma parte da cultura é continuamente retirada. O cultivo contínuo dá um crescimento quase equilibrado, com pouca flutuação dos nutrientes, metabólitos, número de células ou biomassa. Uma cultura contínua é geralmente precedida por uma cultura em lote ou em lote alimentado. (BRAHMACHARI, 2016; CINAR et al., 2003)
Ao contrário da operação de processos contínuos empregados para a formação de produtos químicos, a operação de longo prazo de culturas contínuas está sujeita a muitas dificuldades operacionais, incluindo riscos de contaminação e perda de produtividade devido ao esgotamento das células (CINAR et al., 2003).
A taxa de cisalhamento em vasos agitados está longe de ser uniforme, sendo fortemente dependente da distância do impulsor, já que a energia necessária para o movimento dos fluidos é introduzida focalmente, uma vez que o momento é transferido diretamente para o fluido, o qual, por sua vez, transfere essa energia para elementos mais lentos e distantes do fluido (DORAN, 1995; MERCHUK, 1990). O problema do cisalhamento em tanques agitados decorre da necessidade de aumentar as taxas de transferência de oxigênio (KUMAR; PATEL; RAO, 2011; MERCHUK, 1990).
Diferentes tipos de células (mamíferos, insetos e plantas) exibem diferentes níveis de sensibilidade ao cisalhamento. A ruptura celular é um resultado óbvio de altas forças de cisalhamento (DORAN, 1995; KUMAR; PATEL; RAO, 2011). No entanto, mudanças mais sutis, como atraso no crescimento e síntese do produto, desnaturação de proteínas extracelulares, alteração na morfologia e espessamento da parede celular também podem ocorrer (DORAN, 1995).
Independentemente do modo de operação em relação à cultura, os biorreatores são sempre operados em modo contínuo com relação à fase gasosa, entrando e saindo continuamente do reator (CINAR et al., 2003).
2.4.3.2. Determinação de KLa durante um processo fermentativo
Nos sistemas de produção em reator, um grande número de variáveis afetam a transferência e a mistura de massa, as mais importantes é a velocidade do agitador, o tipo e o número de agitadores e a taxa de fluxo de gás usada (GARCIA-OCHOA; GOMEZ, 2009). Além dos requisitos de transferência de oxigênio, um biorreator deve ter uma boa capacidade de mistura para obter uma distribuição homogênea dos nutrientes e do oxigênio no fluido, sendo a transferência de massa, calor e momento fortemente influenciada pelas condições hidrodinâmicas dos biorreatores (CHISTI, 1989; GARCIA-OCHOA; GOMEZ, 2009).
Por isso, entender o comportamento hidrodinâmico do reator é muito importante, necessário para entender os fenômenos de transporte envolvidos em sua operação (CHRISTI, 1989; JESUS; MOREIRA NETO; MACIEL FILHO, 2017).
O coeficiente global de transferência de massa de oxigênio (KLa) é frequentemente usado como fator de aumento de escala dos sistemas de fermentação. No escalonamento de fermentadores é desejável alcançar os mesmos valores de kLa em escala maior do que aquele que foram obtidos em menor escala durante o estágio de desenvolvimento (PATEL; THIBAULT, 2009).
Um dos métodos mais empregados na determinação do kLa é o método dinâmico, que utiliza uma mudança na concentração do gás dissolvido no meio (DORAN, 1995). Este método consiste no sistema ser levado a uma condição inicial de estado estacionário, em seguida a mudança da etapa de entrada de gás é iniciada e a mudança na concentração de gás dissolvido é registrada, a concentração de gás é reduzida a um ponto logo acima da concentração de gás crítica necessária para prevenir a morte celular e/ou uma mudança irreversível no comportamento celular. Após um período de tempo, a concentração de gás de entrada é retornada ao seu estado original e a alteração na concentração de gás é registrada conforme o sistema retorna à condição de estado estacionário original (GARCIA-OCHOA; GOMEZ, 2009; KADIC, E., & HEINDEL, 2014).
Essa queda abrupta no fornecimento e na diminuição da concentração de oxigênio para os microrganismos podem afetá-los, para tanto, há um outro método, chamado método estático. Neste método são empregadas correlações, que envolvem equações dimensionais e adimensionais. No entanto, existem problemas consideráveis em relação à precisão da estimativa de kLa, e discrepâncias frequentes principalmente quando kLa para caldos reais são estimados a partir de equações propostas para soluções aquosas(GARCIA-OCHOA; GOMEZ, 2009).
Os dados para o cálculo do kLa são correlacionados separadamente para cada rotor em termos de PG VL-1 e velocidade superficial do gás vG, de acordo com a conhecida Equação (1): KLa = C (PVG L) A (vG)B (1) sendo:
KLa - coeficiente global de transferência de oxigênio gás-líquido (s-1); PG - potência dissipada pelo agitador (W);
VL - volume de fluido (m³);
vG - velocidade superficial do gás (m s-1).
Os valores dos parâmetros A, B e C são fornecidos de acordo com a correlação ideal para o sistema estudado. No anexo G estão inseridas algumas correlações e suas especificidades.
2.5 Aplicações das lipases
Recentemente, a pesquisa para a síntese de produtos químicos de alto valor segue para tecnologias cada vez mais limpas. O uso de enzimas é uma dessas alternativas (MADHAVAN et al., 2017; YVERGNAUX, 2017)
As enzimas indústrias de origem microbiana são responsáveis por 90% do mercado global, seus produtores estão localizados principalmente na Europa e na Ásia em que a Novozymes, Dupont e DSM representam mais de 75% do negócio global de enzimas, outros fornecedores de enzimas são AB Enzymes, BASF, Chr.
Hansen, Kerry e Soufflet Biotechnologies, Ajinomoto, Amano, Nagase e Shin Nihon (GUERRAND, 2017).
No relatório recente publicado pela British Broadcasting Corporation, BBC
Research & Development, (2017) afirma que o mercado global de enzimas industriais
espera um aumento de US$ 5,0 bilhões em 2016 para US$ 6,3 bilhões em 2021, como apresentado na Figura 3. Na área de alimentos, espera-se que mercado de enzimas cresça de quase US$ 1,5 bilhão em 2016 para US$ 1,9 bilhão em 2021 (Figura 2) .
Figura 2 – Mercado global de enzimas
Fonte: Adaptado de BBC Research, 2017.
Entre as enzimas industriais, as lipases ocupam o terceiro lugar nas vendas após as proteases e as enzimas de processamento de carboidratos (SALEHMIN; ANNUAR; CHISTI, 2013). Além do seu significado biológico, as lipases têm um enorme potencial em aplicações industriais como aditivos de alimentos (modificação de sabor), formulações de detergentes (hidrólise de gorduras), cosméticos (remoção de lipídios), tratamento de águas residuais (decomposição e remoção de substâncias oleosas), produtos farmacêuticos (digestão de óleo e gorduras nos alimentos) e síntese de produtos químicos orgânicos (BURKERT; MAUGERI; RODRIGUES, 2004; HASAN; SHAH; HAMEED, 2006; PANDEY et al., 1999; SHARMA et al., 2001).
Na indústria têxtil, as lipases são usadas para a remoção de gorduras, ceras e lubrificantes, o que aumenta a capacidade de absorção de tecidos para o nivelamento no tingimento. Nos sistemas de abrasão denim (matéria prima do jeans), é usado para diminuir a frequência de fissuras (BRAHMACHARI, 2016; KARMAKAR, 1999) 0 400 800 1200 1600 2000 2014 2015 2016 2021 US $ m il h õ e s
Na indústria farmacêutica, são utilizadas como uma ferramenta de rotina para a preparação de fármacos quirais. Houve uma crescente conscientização sobre o enorme potencial de microrganismos e enzimas para a transformação de produtos químicos sintéticos fornecendo produtos com alto rendimento e pureza (GOTOR-FERNÁNDEZ; BRIEVA; GOTOR, 2006). Além de oferecer várias vantagens que incluem realizar processos enzimáticos em condições suaves que evitam reações de isomerização, epimerização, racemização e rearranjo, enantio e regioseletividade, reutilização da lipase imobilizada, superexpressão da lipase, economia do processo, mutagênese da lipase para funções específicas (BANSODE; RATHOD, 2017; GOTOR-FERNÁNDEZ; BRIEVA; GOTOR, 2006; SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012).
Na indústria de cosméticos, a posse de um cabelo saudável e abundante ao longo da vida é a ambição da maioria dos seres humanos. Diversas patentes surgiram, aplicando as lipases, com o objetivo de tratar a seborreia ou acelerar o crescimento do cabelo (YOSHIZUMI et al., 1988; BALDO, NGUYEN e PHAM, 2009; MIYAZAKI e FUJIKAWA, 2009).
As lipases são rotineiramente usadas na produção de uma variedade de produtos, que vão desde sucos de frutas, alimentos cozidos e fermentações de vegetais. É necessário um controle preciso da concentração desta enzima, do pH, da temperatura, do teor de emulsão para maximizar a produção de sabor e fragrância (BRAHMACHARI, 2016).
Algumas gorduras são muito mais valiosas que outras devido à sua estrutura, dessa forma, utilizam-se da lipase para a modificação e quebra do biomaterial, permitindo alterar a localização das cadeias de ácidos graxos no glicerídeo e substituindo um ou mais dos ácidos graxos (BRAHMACHARI, 2016;
GUPTA et al., 2015; HASAN; SHAH; HAMEED, 2006; SHARMA et al., 2001; SINGH; MUKHOPADHYAY, 2012).
As enzimas são consideradas como ingredientes chave dos detergentes, sendo um dos campos de aplicação mais comercialmente importante para lipases hidrolíticas (ILLANES; ALTAMIRANO, 2008; BRAHMACHARI, 2016). A aplicação de enzimas em detergentes aumenta a capacidade de remoção de manchas gordurosas, como batom, gorduras fritas, manteiga, molhos e manchas difíceis em golas e punhos (BRAHMACHARI, 2016).
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Nesta etapa serão descritas as metodologias empregadas nos ensaios realizados no estudo da produção da enzima lipase por Candida tropicalis URM 7057.
3.1 Fluxograma das etapas de estudo
O fluxograma apresentado na Figura 3 exibe, de forma esquemática, os estudos realizados durante este trabalho.
Figura 3 – Fluxograma seguido para a execução da pesquisa
Fonte: Elaborado pelo autor.
3.2 Microrganismo
A levedura Candida tropicalis URM 7057 foi isolada, por Holanda (2015), do bagaço de caju e gentilmente cedida pelo Laboratório de Biotecnologia (LABIOTEC) da Universidade Federal do Ceará.
1° Etapa - Estudo das condições de obtenção do
inóculo Influência do tempo de inóculo
2° Etapa - Produção da enzima em reator tanque
agitado em batelada
Influência da aeração (sem aeração forçada; 0,25 e 0,75 vvm) para produção de lipase
3° Etapa - Estudo da influência da glicose
Influência do efeito da
concentração inicial da glicose para a produção da enzima
4° Etapa - Produção da enzima em batelada
alimentada
Influência na produção da lipase com a alimentação do indutor
