André Guilherme Kunitz
MELITINA PROVENIENTE DO VENENO DE ABELHA: Processo de Purificação, Aplicação e Avaliação Econômica
Orientadora: Profª. Drª. Cíntia Soares Coorientador: Prof. Dr. Ariovaldo Bolzan
Universidade Federal de Santa Catarina Centro Tecnológico
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
Florianópolis 2015
Dissertação de mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química – Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito à obtenção de grau de mestre em Engenharia Química.
RESUMO
As abelhas são conhecidas por suas ferroadas e produção melífera, mas raramente são reconhecidas por uma determinada proteína benevolente em seu veneno chamada melitina. A melitina é um peptídeo hemolítico antimicrobiano amplamente conhecido pelos seus efeitos terapêuticos. O interesse nas propriedades medicinais, especialmente na propriedade anticancerígena da melitina, tem aumentado consideravelmente nos últimos anos. Porém, visto que alguns dos constituintes do veneno de abelha podem apresentar ação deletéria, decorrente do seu potencial alergênico, faz-se necessária a obtenção de melitina com elevado grau de pureza para eficiente aplicação na área farmacêutica. O presente trabalho teve o objetivo principal de desenvolver um processo para obtenção de melitina em escala analítica visando a aplicação deste peptídeo em formulações farmacêuticas, produzindo, desta forma, produtos com elevada tecnologia e valor agregado. A utilização de técnicas robustas, como ultracentrifugação e filtração, permitiu eliminar a maioria dos componentes presentes no veneno, contendo, ao final, somente biomoléculas com propriedades físico-químicas semelhantes à melitina. A utilização destas técnicas, em conjunto com RP-HPLC, permitiu obter melitina com um alto grau de pureza em escala analítica. Dessa forma, foi elaborado um protocolo de purificação da melitina, alcançando-se uma pureza estimada maior que 85 %. A análise econômica do processo de purificação da melitina demonstrou a viabilidade econômica na implantação desta tecnologia. O menor custo específico ocorre com a ampliação da escala a partir de 100 vezes a escala analítica, no qual o custo encontrado, nas condições operacionais propostas, é inferior ao aplicado atualmente. Ainda, é possível otimizar o processo visando melhor rendimento. A elaboração de um sistema de entrega controlada da melitina a partir de nanopartículas lipídicas sólidas foi proposta neste trabalho. Os resultados obtidos até o momento mostram que é possível obter NLSs estáveis de ácido esteárico com potencial aplicabilidade para encapsulação de melitina. Para a comprovação de eficiência farmacológica desse sistema proposto, uma avaliação adequada é necessária.
Palavras-chave: apitoxina; melitina; separação cromatográfica; nanopartículas lipídicas sólidas (NLS).
ABSTRACT
Honeybees are famous for their stings and sugary residues, yet seldom do they gain recognition for a certain benevolent protein in their venom called melittin. Melittin is an antimicrobial hemolytic peptide widely known for its therapeutic remedies. Interest in the medicinal properties, especially the anticancer property of melittin, has increased tremendously in recent years. However, since some of bee venom constituents can have deleterious effects, because of its allergenic potential, it is necessary to obtain melittin with high purity for its effective application in the pharmaceutical field. This study had the main objective to develop a process for obtaining melittin in analytical scale aiming the pharmaceutical application of this peptide, producing thus products with high technology and added value. The use of robust techniques such as ultracentrifugation and filtration allowed to eliminate most of the components present in the venom, remaining in the sample after these steps, only biomolecules with similar features to melittin. The use of these techniques in conjunction with RP-HPLC allowed obtaining melittin with a high degree of purity on an analytical scale. Thus, we designed a purification protocol for melittin, achieving an estimated purity greater than 85 %. The economic analysis of the melittin purification process showed the economic viability of the implementation of this technology. The lower specific costs occur with the scale-up from 100 times the analytical scale, in which the costs found within the operating conditions proposed are lower than those currently marketed. It is still possible to optimize the process to better performance. The development of a delivery vehicle of melittin based on solid lipid nanoparticles was proposed in this paper. The results obtained so far show that it is possible to obtain stable NLSs of stearic acid with potential applicability for encapsulation of melittin. For demonstrating pharmacological effectiveness of this proposed system, more tests are needed.
Key-words: apitoxin, melittin, chromatographic separation, solid lipid nanoparticles (SLN).
AGRADECIMENTOS
Agradeço especialmente aos professores Cíntia Soares e Ariovaldo Bolzan pela oportunidade, amizade, orientação, paciência e ajudarem na minha formação profissional e pessoal;
À minha família, pelo apoio e confiança;
Aos colegas André Zibetti e Alexsandra Valério pela amizade, apoio e auxilio técnico para que este trabalho fosse desenvolvido;
Aos colegas do LCP como um todo, pelas grandes amizades e pelo ótimo ambiente de trabalho;
Agradeço a UFSC e CAPES pelo apoio financeiro;
E todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a conclusão deste trabalho.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Representação esquemática da sequência de aminoácidos da melitina. Os resíduos hidrofóbicos estão representados pelos círculos em branco, os resíduos polares estão indicados pelos círculos em cinza, enquanto que os resíduos carregados positivamente estão representados pelos círculos em vermelho. ... 32 Figura 2 - (a) Estrutura cristalina α-hélice da melitina; (b) Diagrama de roda helicoidal da melitina: aminoácidos polares e carregados positivamente estão representados em cinza e vermelho, respectivamente. ... 33 Figura 3 - Representação da melitina na forma de: (a) tetrâmero (ocorrência natural) e (b) monômero. ... 34 Figura 4 - Interação da melitina com eritrócitos. ... 35 Figura 5 - Fármacos biotecnológicos em desenvolvimento por categoria terapêutica. ... 45 Figura 6 - Cromatografia líquida em escala industrial. ... 49 Figura 7 - Fracionamento de proteínas por ultracentrifugação. ... 51 Figura 8 - Conceito da separação por cromatografia de permeação em gel ou exclusão de tamanho. ... 52 Figura 9 - Esquema de operação de uma cromatografia em leito móvel simulado (SMB). ... 62 Figura 10 - Representação dos gradientes de concentração em relação à posição da coluna. ... 63 Figura 11 - Comparação da zona de separação entre cromatografia de uma única coluna e cromatografia em SMB. ... 63 Figura 12 - Equipamento coletor de apitoxina composto de placas coletoras e gerador de pulsos. ... 66 Figura 13 – Metodologias desenvolvidas para purificação da melitina baseadas em diferentes gradientes de solvente. ... 69 Figura 14 - (a) fluxograma do processo e (b) esquema de preparação das nanopartículas lipídicas sólidas de ácido esteárico. ... 72 Figura 15 - Exemplo de três diferentes escalas de colunas utilizadas em desenvolvimento de processos de separação. ... 75 Figura 16 – Imagens (a), (b) e (c) demonstram o procedimento de coleta do veneno bruto utilizando-se estímulos elétricos (placa coletora). Imagens (d) e (e) são referentes ao procedimento de raspagem da apitoxina. Imagem (f) demonstra a apitoxina coletada armazenada. .... 81 Figura 17 – Espectro de massas MALDI-TOF do veneno bruto. ... 82 Figura 18 – Solução após a ultracentrifugação... 83
Figura 19 – a) Cromatograma obtido do fracionamento da apitoxina por meio da técnica de GPC (G1 = Fração 1; G2 = Fração 2; G3 = Fração 3). b) Frações obtidas do veneno de abelha bruto por meio de cromatografia de permeação em gel referente ao trabalho de CHEN et al. (2006). ... 84 Figura 20 – Varredura dos espectros UV-vis das frações G1, G2 e G3. 85 Figura 21 – Espetro de massas realizado em MALDI-TOF das frações G1 (a), G2 (b) e G3 (c). ... 85 Figura 22 - Cromatogramas (RP-HPLC) obtidos da análise do veneno bruto recém-coletado: (a) Método 1A; (b) reanálise da amostra após 4 dias utilizando o Método 1A; (c) Método 1B. ... 88 Figura 23 – Cromatogramas (RP-HPLC) obtidos da análise da apitoxina recém-coletada (melitina destacada em vermelho): (a) Método 2; (b) Método 3. ... 91 Figura 24 – Cromatogramas (RP-HPLC) obtidos da injeção do veneno bruto para as metodologias 4 (a), 5 (b) e 6 (c). ... 92 Figura 25 – Efeito da seletividade e eficiência sobre a resolução dos picos em RP-HPLC. ... 93 Figura 26 – (a) Cromatogramas obtidos das análises do padrão de melitina para os métodos 4 (vermelho), 5 (amarelo) e 6 (preto); (b) ampliação dos picos referentes a melitina obtidos pelas três metodologias. ... 94 Figura 27 – Frações coletadas da injeção de apitoxina utilizando o Método 6. ... 97 Figura 28 – Análise de espectrometria de massas MALDI-TOF das frações F1, F2, F3, F4. ... 98 Figura 29 – Comparação da análise de massas MALDI-TOF do padrão de melitina e da melitina obtida pelo método desenvolvido. ... 100 Figura 30 – Fluxograma do processo de purificação desenvolvido. ... 101 Figura 31 – Cromatogramas (RP-HPLC) da avalição da estabilidade da melitina frente ao aumento de temperatura: t0 (azul); t = 30 min (roxo) e t = 60 min (preto). (a) sobreposição dos cromatogramas t0, t1 e t2. (b) sobreposição dos dos cromatogramas t0, t1 e t2 referentes ao composto desconhecido. ... 103 Figura 32 - Cromatogramas (RP-HPLC) da avalição da estabilidade da melitina frente ao período de armazenagem. t0 (laranja); t1 = 15 dias (verde) e t2 = 30 dias (preto). (a) sobreposição dos cromatogramas t0, t1 e t2. (b) sobreposição dos dos cromatogramas t0, t1 e t2 referentes aos compostos desconhecidos. ... 104
Figura 33 – Obtenção da melitina através de seguidas injeções sobrecarregadas no RP-HPLC e subsequente liofilização. ... 105 Figura 34 - Gradiente de solvente e tempo de injeção utilizados para o scale-up. ... 108 Figura 35 - Comparação entre os COM estimados e o valor de melitina praticado no mercado. ... 111 Figura 36 - Distribuição dos custos integrantes no custo de manufatura da melitina pelas respectivas unidades de separação, onde FC é o custo fixo, GC são custos gerais, UC é o custo das utilidades, LC é custo da mão-de-obra, RMC é o custo da matéria-prima (solventes e fase estacionaria) e WTC é custo do tratamento de resíduos. ... 112
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Principais componentes da apitoxina e seus efeitos biológicos. ... 28 Tabela 2- Propriedades físicas e químicas exploradas nas técnicas utilizadas para purificação de proteínas. ... 49 Tabela 3 - Metodologias utilizadas no HPLC-analítico. ... 70 Tabela 4 - Colunas referentes a cada uma das escalas dos cenários avaliados. ... 75 Tabela 5 - Custos da fase estacionaria (C-18) para cada uma das escalas. ... 76 Tabela 6 - Número de pessoal para operação de cada unidade. ... 77 Tabela 7 - Custo de bombeamento. ... 77 Tabela 8 - Tomada de preço da apitoxina comercializada em diferentes locais. ... 79 Tabela 9 - Tempos de retenção (Rt) obtidos para os picos referentes ao composto melitina para cada uma das metodologias desenvolvidas. .... 93 Tabela 10 - Medida do tempo para eluição do corante do detector até o ponto de coleta para diferentes vazões. ... 96 Tabela 11 - Medidas de potencial zeta e diâmetros de partícula das nanopartículas de ácido esteárico. ... 105 Tabela 12 - Bases econômicas e condições do processo de separação. ... 109 Tabela 13 - Custos diretos do processo de separação nos diferentes cenários. ... 110
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES
Inglês Português
CEBIME Laboratório Central de
Biologia Molecular Estrutural COM Cost of Manufacturing custo de manufatura
COX Ciclo-oxigenase
Da Dalton Dalton
FCI Fixed capital investiment capital fixo de investimento
GPC Gel permeation
chromatography
Cromatografia de permeação em gel
HPLC High Pressure Liquid Chromatography
Cromatografia líquida de alta pressão
IgE Imunoglobulina E
IL Interleucinas
LC Labor Cost Custo operacional
LCP Laboratório de Controle de Processos MALDI-TOF MS Matrix-assisted laser/desorption ionization time-of-flight mass spectrometry
MCD Mast-cell-degranulating Desgranulador de matócitos
NLS Nanopartícula lipídica sólida
NO Nitric oxide Óxido nítrico
PLA2 Phospholipase A2 Fosfolipase A2
RCM Custo da matéria-prima
ROS Reactive oxygen species Espécies reativas e oxigênio RP-HPLC Reversed phase HPLC HPLC de fase reversa siRNA small interfering RNA
TNF-α Tumor necrosis factor alfa Fator de necrose tumoral alfa
WTC Waste Treatment Cost Custo do tratamento de resíduos
FPLC Fast protein liquid chromatography SMB
EC Eletroforese capilar
CERMAT Núcleo de Pesquisas em Materiais Cerâmicos e Compósitos
Dp Diâmetro médio da partícula
PDI Índice de Polidispersão
PZ Potencial Zeta α Seletividade N Eficiência k‟ Fator de retenção Rt Tempo de retenção Rs Resolução
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 21
1 OBJETIVOS ... 25
1.1 OBJETIVO GERAL ... 25
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 25
Dentre os objetivos específicos, destacam-se: ... 25
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 27
2.1 COMPONENTES DA APITOXINA ... 27
2.2 CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DA MELITINA ... 32
2.3 PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS E MECANISMOS DE AÇÃO DA MELITINA ... 34
2.3.1 Atividade lítica ... 34
2.3.2 Efeito anti-inflamatório, anestésico e nociceptivo ... 36
2.3.3 Influências sobre a pressão arterial ... 39
2.3.4 Atividade anticancerígena ... 40
2.3.5 Epilepsia ... 43
2.3.6 HIV ... 43
2.4 DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTÍCULAS PARA ENTREGA CONTROLADA DE FÁRMACOS CONTENDO MELITINA ... 45
2.5 PROTOCOLO PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS ... 48 2.5.1 Etapas preliminares ... 50 2.5.1.1 Extração ... 50 2.5.1.2 Precipitação ... 50 2.5.1.3 Ultracentrifugação ... 51 2.5.2 Estratégias de purificação ... 51
2.5.2.1 Cromatografia por exclusão de tamanho ... 52
2.5.2.2.1 Cromatografia de troca iônica ... 53
2.5.2.2.2 Cromatografia por afinidade ... 53
2.5.2.2.3 Cromatografia por imunoafinidade ... 54
2.5.2.2.4 Cromatografia líquida de fase reversa (RP-HPLC) ... 54
2.5.2.3 Liofilização ... 56
2.5.2.4 Ultrafiltração ... 57
2.6 SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA MELITINA ... 57
2.7 O PROCESSO DE LEITO MÓVEL SIMULADO (SMB) ... 60
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 65
3.1 PRIMEIRA ETAPA: DESENVOLVIMENTO DO PROCESSO DE OBTENÇÃO DE MELITINA PURIFICADA A PARTIR DA APITOXINA ... 65
3.1.1 Coleta do veneno bruto ... 65
3.1.2 Preparo de amostras ... 66
3.1.3 Caracterização da massa molecular por espectrometria MALDI-TOF ... 66
3.1.4 Cromatografia de permeação em gel (GPC) ... 67
3.1.5 Purificação da melitina em HPLC-analítico ... 67
3.1.5.1 Preparação das amostras para análise em HPLC-analítico ... 70
3.1.5.2 Coleta das frações encontradas em análise de HPLC-analítico ... 70
3.2 SEGUNDA ETAPA: ENCAPSULAMENTO DA MELITINA . 71 3.2.1 Preparação das nanopartículas lipídicas sólidas (NLSs) 71 3.2.2 Caracterização das nanopartículas ... 73
3.2.2.1 Diâmetro Médio (Dp) e Índice de Polidispersão (PDI) . 73 3.2.2.2 Potencial Zeta (PZ) ... 73
3.3 TERCEIRA ETAPA: AVALIAÇÃO ECONÔMICA DO PROCESSO DE PURIFICAÇÃO ... 73
3.3.2 Determinação do custo da fase estacionária ... 75
3.3.3 Determinação do custo de manufatura (COM) ... 76
3.3.3.1 Custos diretos ... 76
3.3.3.2 Custo operacional (LC) ... 76
3.3.3.3 Custo de utilidades (UC) ... 77
3.3.3.4 Custo da matéria-prima (RCM) ... 78
3.3.3.5 Custo do tratamento de resíduos (WTC) ... 78
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 81
4.1 PRIMEIRA ETAPA: DESENVOLVIMENTO DO PROCESSO DE OBTENÇÃO DE MELITINA PURIFICADA A PARTIR DA APITOXINA ... 81
4.1.1 Coleta do veneno ... 81
4.1.2 Caracterização do veneno bruto ... 81
4.1.3 Purificação do veneno bruto ... 83
4.1.3.1 Etapas inicias da purificação: preparação da amostra ... 83
4.1.3.2 Isolamento da melitina ... 83
4.1.3.3 Purificação refinada do veneno bruto utilizando equipamento de RP-HPLC ... 88
4.1.3.4 Avaliação da pureza da melitina obtida pelo Método 6 95 4.1.4 Considerações sobre a primeira etapa ... 101
4.2 SEGUNDA ETAPA: ENCAPSULAMENTO DA MELITINA 102 4.2.1 Avaliação da estabilidade da melitina ... 102
4.2.2 Produção de melitina em escala analítica ... 104
4.2.3 Preparação de NLSs contendo melitina ... 105
4.2.4 Considerações sobre a segunda etapa ... 106
4.3 TERCEIRA ETAPA: AVALIAÇÃO ECONÔMICA DO PROCESSO DE PURIFICAÇÃO ... 107
5 CONCLUSÃO ... 115
5.1 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 116
INTRODUÇÃO
A necessidade de medicamentos e tratamentos mais específicos e eficazes tem forçado os pesquisadores a procurar soluções alternativas em campos mais ortodoxos. Neste sentido, diversas pesquisas têm focado na produção de fármacos que utilizam como matéria-prima recursos biológicos. A investigação de compostos bioativos provenientes da natureza e a consequente formulação de novos produtos terapêuticos é uma atividade conhecida como bioprospecção e, segundo a Organização Mundial de Saúde, nos últimos anos resultou em diversos compostos farmacêuticos provenientes tanto de pesquisas com plantas, quanto de animais.
Toxinas de origem animal têm sido alvo de inúmeras pesquisas de bioprospecção pelo fato de que essas toxinas representam um recurso valioso e pouco explorado de componentes bioativos, os quais podem auxiliar na cura de doenças que não respondem às terapias atualmente disponíveis. Diversos organismos produzem toxinas como instrumento de defesa contra possíveis predadores. As ações fisiológicas são variadas, podendo imobilizar ou até matar a presa. Bem abaixo das doses agressivas, as toxinas podem ter ações fisiológicas desejáveis e até terapêuticas. Vários organismos venenosos do reino animal, os quais usam toxinas como instrumento de defesa, tais como répteis, peixes, anfíbios e mamíferos, estrelas do mar, ouriços do mar, caramujos, polvos, aracnídeos, insetos, miriápodes e alguns cnidários, são alvo de numerosos estudos em toxicologia pelo seu potencial biotecnológico e terapêutico. Nos EUA, dos 150 medicamentos vendidos sob prescrição médica atualmente em uso, 27 deles são de origem animal e suas respectivas comercializações geram bilhões de dólares anualmente (SANTOS et al., 2011).
A apitoxina, veneno produzido pela abelha Apis mellifera, é abundante em peptídeos biologicamente ativos. O uso da apitoxina com finalidades terapêuticas é muito antigo e veio da observação de que os apicultores recebiam muitas picadas e não apresentavam problemas de reumatismo. A utilização da picada deliberada de abelhas em humanos (chamado de apiterapia) é um método comumente empregado como terapia alternativa. De acordo com os praticantes da apiterapia, o veneno de abelha contém agentes anti-inflamatórios que aliviam a dor crônica e pode ser usado para tratar várias doenças, incluindo vários tipos de artrite, problemas neurológicos, tais como a esclerose múltipla, dor lombar, dor de cabeça e enxaqueca, e doenças da pele (tais como eczema, psoríase e herpes) (ACS, 2008). No entanto, a apiterapia possui
limitações devido a ação deletéria provocada por alguns componentes presentes na apitoxina, atribuídos, principalmente, às enzimas fosfolipase A2 (PLA2) e hialuronidase, podendo causar efeitos colaterais em pacientes alérgicos (ORSOLIC, 2012).
Nos últimos anos, devido à comprovação científica de alguns dos seus efeitos terapêuticos, atribuídos principalmente ao composto majoritário da apitoxina, a melitina, a procura por esse composto tem aumentado em diversos países, elevando a cotação da apitoxina no mercado internacional (MAIA, 2002). No entanto, apesar do porte do setor apícola nacional, a participação brasileira neste mercado tem-se mantido muito aquém de suas potencialidades.
Dentre os constituintes da apitoxina, a melitina (fração correspondente a aproximadamente 50 % em massa do veneno seco) tem atraído grande atenção devido ao seu potencial farmacológico comprovado ao longo dos anos. Algumas de suas propriedades medicinais relatadas são:
estimula a hipófise-adrenal na liberação catecolaminas e corticol, o que lhe confere efeito anti-inflamatório que alivia a dor crônica (LEE et al., 2005);
possui amplo espectro de atividade antimicrobiana, sendo capaz de combater diversos patógenos (WEINBERG, 2001);
age no sistema cardiovascular, provocando contração dos músculos lisos e do músculo cardíaco. Promove, deste modo, a contração dos capilares e diminuição da pressão arterial (MARSH e WHALER, 1980);
atua no sistema nervoso central, bloqueando a transmissão de impulsos nervosos, o que provoca um efeito anestésico (LEE et al., 2001);
tem sido aplicada na elaboração de formulações cosméticas destinadas à recuperação do tecido epidérmico, porém sem comprovação de sua eficácia. Suspeita-se que ela interaja sinergicamente com as fibras do colágeno. Desta forma, a melitina tem sido apontada como uma potencial substituta da toxina botulínica no tratamento cosmético facial (TRILIVAS, 2001);
inibe o crescimento tumoral via estimulação de resposta imunológica (ATTIA et al., 2008; LIU et al., 2008), bem como pela necrose de tecido tumoral e indução da apoptose (WANG et al., 2009). Diversos tipos de câncer, incluindo leucemia e câncer de rins, pulmões, fígado, próstata, mamas e bexiga, têm 22
sido identificados como alvos para ação da melitina (SON et al., 2007);
A melitina possui um grande potencial farmacológico. Porém, visto que os demais constituintes da apitoxina podem apresentar ação deletéria, decorrentes do seu potencial alergênico, faz-se necessária a obtenção de melitina com elevado grau de pureza para sua eficiente aplicação na área farmacêutica. Todos esses compostos bioativos estão presentes na forma de misturas complexas no veneno, sendo sua separação e purificação uma tarefa difícil e, por sua vez, dispendiosa. Este processo constitui um problema tecnológico importante, o qual deve ser superado de modo a viabilizar a aplicação técnica e econômica da melitina.
O interesse nas propriedades medicinais, especialmente na propriedade anticancerígena da apitoxina e de seu constituinte majoritário, a melitina, tem aumentado consideravelmente nos últimos anos. Isso se deve ao fato de que nas últimas décadas o número de pacientes diagnosticados com câncer e sua consequente mortalidade tiveram um aumento expressivo, criando, assim, enormes problemas de ordem clínica e econômica. A incidência crescente de tumores levou a necessidade de explorar novos fármacos e novas estratégias para o tratamento desta doença em particular. Atualmente, os cientistas estão somando esforços para encontrar uma cura para esta doença, pois, embora a terapia prescrita (sob a forma de cirurgia, radioterapia e quimioterapia) auxilie no combate da doença, os resultados ainda são pouco satisfatórios. O desenvolvimento de fármacos anticancerígenos eficientes bem como novas alternativas no tratamento de tumores são alguns dos principais desafios da ciência moderna (GAJSKI e GARAJ-VRHOVAC, 2013).
A melitina é um candidato em potencial para o desenvolvimento de novos fármacos devido ao seu amplo espectro de propriedades líticas. Embora citotóxica para um largo espectro de células tumorais, esse peptídeo também apresenta toxicidade para células normais. Portanto, o seu potencial terapêutico não pode ser alcançado sem um sistema de entrega adequado. Tal fato pode ser superado através de ensaios utilizando nanopartículas, as quais possuem a capacidade de fornecer de forma segura uma quantidade significativa de melitina por via intravenosa, possibilitando a destruição de células tumorais de forma seletiva (PAN et al., 2011).
Ainda que seja possível encontrar na literatura referências que relatam o processo de obtenção de melitina a partir da apitoxina (CHEN 23
et al., 2006; JI et al., 1996; YE et al., 2000), grande parte dos estudos publicados são pouco descritivos e visam, principalmente, a avaliação do perfil peptídico do veneno, o que acaba tornando o processo de separação lento e oneroso. Estudos acerca da eficiente obtenção de melitina a partir do veneno bruto para posteriores aplicações ainda são escassos. Há, também, falta de informação na literatura no que diz respeito a sistemas de armazenagem/liberação de melitina através de nanopartículas, sendo esta uma área recentemente explorada, com pouquíssimos trabalhos publicados (SOMAN et al., 2009; PAN et al., 2011; HOOD et al., 2013).
Esta pesquisa pauta-se na valorização da biodiversidade nacional para a obtenção de produtos com elevada tecnologia e valor agregado. Nesse sentido, o presente trabalho propõe a busca por novas estratégias de obtenção de melitina com elevada pureza a partir do veneno bruto da abelha visando viabilizar sua aplicação tecnológica. Cabe ressaltar que essa etapa é fundamental para proposta da pesquisa em um âmbito global: a obtenção de formulações que utilizem a melitina como princípio ativo para o tratamento de doenças, dadas as propriedades do bioativo extensivamente comprovadas, partindo do veneno de abelha bruto. Para isso, também foram realizados estudos de viabilidade econômica do processo produtivo desenvolvido e propostos sistemas de armazenagem para liberação controlada de melitina in vivo inéditos.
Deve-se salientar ainda que o projeto está inserido em um contexto estratégico para o país, somando esforços para o fortalecimento da indústria de bioprocessos nacional. Reconhecidamente, nosso país apresenta carência de recursos humanos qualificados, além de tecnologias próprias, para o processamento de bioativos amplamente disponíveis na nossa fauna e flora. Desta forma, constata-se a recorrente necessidade de importação de produtos processados, muitas vezes a partir dos nossos próprios recursos naturais, para a utilização em aplicações farmacêuticas e médicas, por exemplo. A presente proposta contribui, portanto, para que esse cenário possa ser modificado.
1 OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver um processo de obtenção de melitina a partir do veneno bruto da abelha Apis mellifera, com alto grau de pureza e economicamente atrativo, visando a preparação de nanopartículas lipídicas sólidas para liberação controlada deste peptídeo.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Dentre os objetivos específicos, destacam-se:
investigar as técnicas de fracionamento capazes de purificar com eficiência satisfatória a melitina obtida a partir do veneno bruto de abelha;
identificar as etapas relevantes e necessárias no processo de purificação da melitina;
avaliar e elaborar um protocolo de purificação da melitina em escala analítica rápido e simplificado;
obter melitina na forma sólida com elevado grau de pureza a partir do protocolo de purificação proposto para aplicar em pesquisas conseguintes;
realizar pesquisas envolvendo a melitina, obtida pelo processo de purificação proposto, no desenvolvimento de sistemas particulados de armazenagem e liberação de fármacos.
propor o escalonamento do processo desenvolvido;
verificar a viabilidade econômica da implementação de uma cadeia produtiva de melitina purificada em escalas piloto e comercial.
2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 COMPONENTES DA APITOXINA
A apitoxina, veneno produzido pela abelha Apis mellifera, compõe-se, principalmente, de peptídeos e enzimas, quase todos fisiologicamente ativos. A apitoxina é sintetizada na glândula de veneno das abelhas operárias e de abelhas-rainhas. A partir de uma mistura de secreções ácidas e básicas é formada uma secreção ácida com pH entre 4,5 e 5,5, a qual é armazenada em suas bolsas de veneno. Esse veneno é uma mistura complexa que contém moléculas orgânicas simples, proteínas, peptídeos e outros elementos bioativos, como carboidratos e lipídeos (ORSOLIC, 2012).
Por se tratar de um poderoso anti-inflamatório não-esteroidal, a apitoxina tem sido usada há séculos na medicina oriental para aliviar a dor e tratar doenças inflamatórias crônicas (ORSOLIC, 2012). Também tem sido usada em condições clínicas, tais como artrite, reumatismo e doenças de pele (eczema, psoríase e herpes) (ACS, 2008; SON et al., 2007). Recentemente, outras propriedades benéficas da apitoxina também foram descobertas, destacando-se: radioproteção (proteção contra os efeitos nocivos da radiação) (GAJSKI e GARAJ-VRHOVAC, 2009), antimutagênico (reduz a taxa de mutação) (VARANDA, MONTI e TAVARES, 1999), antinociceptiva (redução da capacidade de perceber a dor) (BEAK et al., 2006) e, nos últimos anos, efeitos anticancerígenos (GAJSKI e GARAJ-VRHOVAC, 2013). Logo, a apitoxina tem apresentado potencial como possível composto terapêutico.
Na Tabela 1 encontram-se relacionados seus principais componentes, agrupados por faixas de peso molecular e seus respectivos efeitos biológicos. Observa-se que os componentes com peso molecular abaixo de 1.000 Da consistem, principalmente, de pequenos peptídeos e monoaminas. Na faixa entre 1.000 e 10.000 Da encontram-se numerosos polipeptídeos, com amplo predomínio da melitina. Acima de 10.000 Da ocorrem diversas enzimas, com amplo predomínio da fosfolipase A2
1 (PLA2). No total, a apitoxina contém cerca de 20 substâncias ativas.
1
As fosfolipases pertencem a uma grande família de enzimas que realizam a clivagem de fosfolipídios da membrana celular em ácidos graxos e lisofosfolipídios. A fosfolipase A2 é uma enzima envolvida no processo inflamatório. A fosfolipase A2 catalisa a hidrolise do 2º ácido graxo do fosfolipídeo de membranas celulares, liberando ácido araquidônico e iniciando a via metabólica do ácido araquidônico, importantíssima no processo inflamatório.
Tabela 1 - Principais componentes da apitoxina e seus efeitos biológicos. Classe Componente Massa molar (Da) % do veneno seco Efeito fisiológico E nz im as Hiarulonidase 41000 2%
Ataca seletivamente polímeros do ácido hialurônico presente no tecido conjuntivo; aumenta a permeabilidade capilar; tem efeitos sobre a resposta imune e a difusão pelo tecido; antigênica; catalisa a hidrólise de proteínas, permitindo assim a penetração do veneno para o tecido; dilata os vasos sanguíneos e aumenta a sua permeabilidade, causando um aumento da circulação sanguínea; alergênico.
Fosfolipase A2 20000 12%
Citotóxica contra células cancerosas; efeitos inflamatórios; efeitos antitumorais; destrói fosfolípideos e dissolve a membrana celular; reduz a coagulação do sangue e a pressão sanguínea; é o alérgeno mais forte e, assim, o componente mais prejudicial do veneno.
P
eptí
de
os
Adolapina 11500 1%
Inibição da atividade da PLA2 e COX; atividade anti-inflamatória; inibe as enzimas específicas do cérebro ciclooxigenase e lipooxigenase; diminui inflamações de reumatismo, diminui a dor; inibe a agregação de eritrócitos; relativamente baixa toxicidade.
Melitina 2847 50%
Principal componente biologicamente ativo; aumenta a atividade de PLA2; citotóxica contra células cancerosas; efeitos anti-inflamatórios e antiartríticos; possui atividade sobre membranas, diminuindo a tensão superficial; anti-inflamatório em doses muito pequenas; estimula os músculos lisos; aumenta a permeabilidade capilar aumentando a circulação sanguínea e redução da pressão arterial, reduz a coagulação do sangue, imunoestimulante e imunossupressora; radioproteção influencia o sistema nervoso central; anticancerígena, antibacteriana, antifúngica, antiviral; doses mais elevadas são inflamatórias e hemolítica.
Peptídeo MCD 2500 3%
Efeito anti-inflamatório e analgésico; liberação de histamina (baixa dose); inibição da libertação de histamina (dose elevada); efeito antialérgico; ação lítica em mastócitos, liberando histamina, serotonina, e heparina; aumenta a permeabilidade capilar; estimula o sistema nervoso central.
Tertiapina 2500 0,1%
Peptídeos, com um papel incerto na ação fisiológica do veneno; efeitos antirradiação; cardiopep tem efeitos antiarrítmicos. Cardiopep 2500 <0,7%
Apamina 2027 3%
Inibição dos canais ativados por Ca2+ e K+; efeito citotóxico contra o câncer; efeito nociceptivo; propriedades anti-inflamatórias; estimula a liberação de cortisona, ação antiserotonina; imunossupressor, estimula o sistema nervoso central em doses muito pequenas; doses mais elevadas são neurotóxicas.
Aminas
Histamina, dopamina, noradrenalina, neurotransmissores
<500 <1%
Dilata os vasos sanguíneos, aumentando a permeabilidade dos capilares sanguíneos e aumenta a circulação sanguínea; estimula os músculos lisos; alergênicos.
Fonte: adaptado de ORSOLIC, 2012.
O conhecimento da composição e mecanismo de ação do veneno de abelha não havia sido estabelecido até os anos 1970 devido à indisponibilidade de métodos adequados de análise. Deste modo, até essa época, todos os efeitos da apitoxina haviam sido atribuídos à atividade da enzima fosfolipase. O desenvolvimento de técnicas, tais como eletroforese, cromatografia, filtração por permeação em gel, em combinação com análises farmacológicas e bioquímicas, permitiu a 28
identificação adequada de todos os componentes ativos do veneno de abelha (LIMA e BROCHETTO-BRAGA, 2003). A investigação dos componentes presentes na apitoxina tem sido realizada a bastante tempo, sendo o trabalho desenvolvido por Habermann (1972) um dos primeiros nessa linha. Desde então, diversos estudos têm sido realizados a respeito da caracterização dos componentes da apitoxina, bem como de seus mecanismos de ação (SON et al., 2007). Muitos destes componentes foram isolados e caracterizados e as suas estruturas primárias foram determinadas por técnicas bioquímicas (LIMA e BROCHETTO-BRAGA, 2003). Son et al. (2007) relataram que o veneno de abelha contém uma variedade de peptídeos, incluindo a melitina, a apamina, a adolapina e o peptídeo MCD, enzimas (PLA2 e hialuronidase), aminas biologicamente ativas (histamina e epinefrina) e componentes não peptídicos, os quais têm uma variedade de propriedades farmacêuticas.
O emprego da apitoxina na terapia alternativa como um potente anti-inflamatório se deve ao fato de que este composto pode modificar as funções do sistema imunológico do corpo e contribuir para o aumento da produção de cortisol, que por sua vez tem atividade anti-inflamatória. Esta estimulação da produção de cortisol é o que confere à apitoxina o potencial de tratamento para artrite e reumatismo (SON et al., 2007). Estudos recentes relataram uma variedade de mecanismos de funcionamento para o efeito antiartrítico e anti-inflamatório da apitoxina e seus constituintes. A diminuição da atividade das enzimas ciclo-oxigenase2(COX-2) e PLA2 e a diminuição dos níveis de interleucinas3 IL-1 e IL-6, óxido nítrico (NO), fator de necrose tumoral alfa4 (TNF-α) e espécies reativas e oxigênio5 (ROS) está associada com o efeito antiartrítico da melitina.
Além da melitina, outros componentes presentes na apitoxina possuem potencial terapêutico. A adolapina também apresenta propriedades anti-inflamatórias. Os efeitos de adolapina são devido, presumivelmente, à sua capacidade de inibir o sistema de síntese de
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Enzima responsável pela formação de importantes medidores biológicos chamados prostanóides. A inibição farmacológica da COX pode causar alívio aos sintomas da inflamação e da dor.
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As interleucinas possuem várias funções, a maioria delas está envolvida na ativação dos linfócitos e na indução da divisão de outras células.
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Citocinas capaz de provocar a morte de células (apoptose) tumorais e que possuem uma vasta gama de ações pró-inflamatórias.
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São compostos químicos resultantes da ativação ou redução do oxigênio molecular (O2,O2•-, H2O2,1O2,HO.).
prostaglandina por meio de propriedades inibitórias da COX. Esse peptídeo ainda apresenta efeitos analgésicos e antifebril (SON et al., 2007).
Em contraste à melitina, a apamina possui um modo de ação altamente específico. Esse peptídeo exerce influência sobre as membranas pós-sinápticas do sistema nervoso central e periférico. Mostrou-se que a apamina é um bloqueador de canais de Ca2+ e K+. Inibiu significativamente tanto a contração induzida da traqueia quanto a liberação de histamina a partir de tecidos pulmonares, sugerindo que este composto reduz a inflamação alérgica das vias respiratórias através de um efeito estabilizador dos mastócitos (SON et al., 2007).
O peptídeo desgranulador de mastócitos (MCD - mast-cell-degranulating) tem forte influência sobre as alergias, distúrbio este que afeta aproximadamente 20 % da população. A sua atividade biológica é variada. Em concentrações muito baixas, é o composto natural mais potente a promover a liberação de histamina através da desgranulação dos mastócitos. Por outro lado, em concentrações mais altas, apresenta o comportamento inverso, possui uma atividade antialérgica através da inibição da liberação de histamina proveniente de mastócitos. Supõe-se que essa ambiguidade esteja relacionada com a interação do peptídeo com a imunoglobulina E (IgE), que esta associada a reações alérgicas (SON et al., 2007).
Em contrapartida, alguns dos componentes da apitoxina podem apresentar ação deletéria. Dentre eles destacam-se as enzimas que, devido à sua faixa de massa molecular, são potencialmente alergênicas. As mais destacadas na literatura são a PLA2, a hialuronidase e a fosfatase ácida.
Fosfolipase A2 (PLA2) é o nome atribuído a todas as enzimas capazes de retirar, por meio de hidrólise, o ácido graxo situado na posição 2 da molécula de lecitina e substratos similares (fosfodiacilgliceróis), substâncias largamente presentes nas membranas celulares. Esta enzima está naturalmente presente em todos os seres vivos, sendo que os pesos moleculares, as estruturas químicas e as funções paralelas a ela associadas variam acentuadamente conforme o organismo produtor, acarretando os mais diversos espectros de efeitos fisiológicos. Dependendo da origem, a PLA2 pode acarretar efeitos anticoagulantes e inflamatórios. No entanto, estas ações tóxicas estão relacionadas a porções da molécula distintas do centro ativo responsável pela atividade enzimática (NICOLAS et al., 1997).Na apitoxina existem duas estruturas de PLA2, ambas com peso molecular da ordem de 30
11.000 Da e estruturas bem caracterizadas (MAIA, 2002). Usualmente considera-se o teor médio de 12 % mas, segundo Schumacher, Egan e Tanner (1996), as concentrações podem variar de 1,8 a 27,4 % m/m, sendo geralmente maiores nas abelhas africanas que nas europeias. Em pequenas doses, a PLA2 da apitoxina não apresenta danos, exceto para pessoas alérgicas. Em doses elevadas (por exemplo, associadas a centenas de picadas simultâneas) ocorrem efeitos tóxicos associados à inibição da agregação de plaquetas (HAKALA et al., 1999; WATALA e KOWALCZYK, 1990), necroses nas células do músculo esquelético (OWNBY et al., 1997) e do pâncreas (MOSSNER et al., 2000).
Ahialuronidase é umaenzimafacilitadora da difusão de líquidos. Esta, age despolimerizando reversivelmente o ácido hialurônicoexistente ao redor das células do tecido conjuntivo, reduzindo temporariamente a viscosidade desse tecido e tornando-o mais permeável à difusão de líquidos. Com isso, propicia a difusão dos demais componentes do veneno (MAIA, 2002).
A fosfatase ácida da apitoxina é considerada o principal alergênico em 18% dos pacientes alérgicos (KETTNER et al., 1999). Esta enzima está associada à liberação de histamina dos basófilos humanos, além de produzir inflamação e ardor na pele (MAIA, 2002).
Son e colaboradores (2007) demonstraram que diversos estudos experimentais e clínicos evidenciaram que a terapia com veneno de abelha pode ser usada como um tratamento alternativo para várias doenças, tais como artrite, dor, e câncer. De fato, já é possível encontrar produtos elaborados para essas finalidades, tais como cremes tópicos para aliviar dores, inflamações e combater o reumatismo. No entanto, várias preocupações surgem a respeito do uso da apitoxina in natura. A via de injeção, a dose, o sistema de entrega e, principalmente, os efeitos colaterais precisam ser considerados com cuidado antes do tratamento clínico com apitoxina.
A aplicação terapêutica da apitoxina já foi amplamente comprovada. Não se trata de uma opção desprovida de riscos, mas existem recursos tecnológicos para que sejam amplamente minimizados. Os componentes mais alergênicos da apitoxina são as enzimas com peso molecular acima de 10.000 Da e os de interesse terapêutico são cadeias com peso molecular entre 2.000 e 3.000 Da, além de outros ainda menores. Partindo desta premissa, pode-se conseguir uma drástica redução da alergenicidade do veneno de abelha mediante técnicas de fracionamento por peso molecular, como a cromatografia em coluna, a diálise e a ultrafitração.
Sob a óptica financeira, a apitoxina é uma fonte valiosa, cujo aproveitamento está muito abaixo de suas potencialidades, apesar da posição de destaque já ocupada pela apicultura brasileira no mercado mundial, principalmente através da própolis. Isto se deve às dificuldades ainda encontradas no Brasil para o fracionamento adequado da apitoxina e, até mesmo, para o fornecimento de garantias de autenticidade e pureza do produto.
2.2 CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DA MELITINA
A melitina (C131H229N39O31) é o principal componente do veneno de abelha e representa, aproximadamente, 50 % da massa do veneno seco.É formada a partir de sua precursora, a promelitina, durante a sua síntese na abelha e formilada em uma fase posterior, ainda dentro do organismo da abelha. Constitui-se em um peptídeo catiônico com 26 resíduos de aminoácidos (conforme pode ser observado na Figura 1) e sua massa molar é de 2847,5 Da. A melitina possui uma extremidade amino-terminal, composta, predominantemente, por aminoácidos hidrofóbicos (resíduos 1-20) e uma extremidade carboxi-terminal composta, principalmente, por aminoácidos hidrofílicos (resíduos 21-26). O peptídeo tem uma carga líquida positiva de z = 5 devido à presença de três lisinas e duas argininas. Quatro desses resíduos formam um cluster (-KRKR) na extremidade carboxi-terminal. A lisina-7 (K-7) está incorporada na região amino-terminal (hidrofóbica) do peptídeo. Em particular, a distribuição assimétrica de aminoácidos não-polares e polares produz uma estrutura anfifílica quando o peptídeo adota a conformação α-hélice (KLOCEK e SEELIG, 2008).
Figura 1- Representação esquemática da sequência de aminoácidos da melitina. Os resíduos hidrofóbicos estão representados pelos círculos em branco, os resíduos polares estão indicados pelos círculos em cinza, enquanto que os resíduos carregados positivamente estão representados pelos círculos em vermelho.
Fonte: adaptado de Klocek e Seelig (2008).
Rex e Schwarz (1998) determinaram a estrutura cristalina da melitina em solução aquosa por análise de raios X, com alta resolução de 2 Å, conforme pode ser observado na Figura 2a. Cada molécula é 32
(a)
composta por dois segmentos α- helicoidais com uma inclinação devido à presença da prolina na posição 14. Por conseguinte, a forma geral é chamada de "haste dobrada".
Figura 2 - (a) Estrutura cristalina α-hélice da melitina; (b) Diagrama de roda helicoidal da melitina: aminoácidos polares e carregados positivamente estão representados em cinza e vermelho, respectivamente.
Fonte: (a) adaptado de Rex e Schwarz (1998); (b) adaptado de Klocek e Seelig (2008). Embora a melitina contenha uma elevada proporção de aminoácidos hidrofóbicos, apresenta alta solubilidade em água e solubilidade moderada em metanol. Além disso, é muito sensível às condições da solução e pode adotar diferentes conformações e estados de agregação em solução aquosa: é amplamente desestruturada em água, mas forma uma α- hélice ao ligar-se a membranas lipídicas (BECHINGER e LOHNER, 2006).
Em baixa concentração e baixa força iônica a melitina ocorre, principalmente, como um monômero com conformação de hélice aleatória. Todavia, quando a concentração do peptídeo e/ou a concentração de sal é aumentada, ocorre agregação em um tetrâmero de estrutura de α-hélice (Figura 3) (LADOKHIN e WHITE, 2001; MONETTE e LAFLEUR, 1995; SHAI, 2002).
O pH da solução aquosa também influencia os estados conformacionais do peptídeo, o qual se apresenta na forma de tetrâmero nas concentrações em que se encontram dentro dos sacos de venenos das abelhas. Quando nesta conformação, provoca a despolarização das terminações nervosas, causando dor. Quay e Condie (1983) observaram modificação da conformação da melitina para um tetrâmero a pH elevado, apesar da concentração e da força iônica da solução serem mantidas a um nível baixo. Em concentração mínima necessária para o rompimento celular, ela se encontra na forma monomérica. Dessa forma, os estudos têm mostrado que a auto-associação/agregação do
(b)
(a)
peptídeo é um processo complexo e depende da concentração do mesmo e das propriedades da solução, tais como força iônica e o pH (KLOCEK e SEELIG, 2008).
Figura 3 - Representação da melitina na forma de: (a) tetrâmero (ocorrência natural) e (b) monômero.
Fonte: WEINBERG (2011).
A melitina é conhecida por exercer uma variedade de efeitos sobre as membranas celulares. Ela induz alterações estruturais das membranas, tais como a formação de poros, fusão, e formação de vesículas. Estas alterações morfológicas nas membranas podem ser atribuídas à capacidade que esse peptídeo possui de induzir a secreção de hormônios, além da habilidade de agregar proteínas nas membranas plasmáticas e alterar o potencial de membranas. Ademais, a melitina estimula diversas enzimas, incluindo a proteína-G, a proteína-quinase C, a adenilato-ciclase, as fosfolipases C2 e D e, principalmente, a PLA2, aumentando em até cinco vezes a sua atividade (ORSOLIC, 2012). As habilidades da melitina de modificar membranas celulares e estimular enzimas são responsáveis por conferir diversas de suas propriedades terapêuticas.
2.3 PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS E MECANISMOS DE AÇÃO DA MELITINA
2.3.1 Atividade lítica
Este peptídeo é uma molécula anfótera devido à disposição específica dos aminoácidos na cadeia. Esse caráter anfifílico confere uma ação lítica à melitina, agindo como um detergente natural de elevada atividade interfacial. Embora seja solúvel em água como um
(b) 34
monômero ou tetrâmero, este polipeptídeo rapidamente se incorpora nas membranas naturais e sintéticas. Sua baixa especificidade, no entanto, permite que a mesma interaja com todas as membranas lipídicas (HOSKIN e RAMAMOORTHY, 2008). Esse atributo permitiu que a mesma fosse usada como um peptídeo modelo adequado para o monitoramento de interações lipídeo-proteína em membranas celulares (RAGHURAMAN e CHATTOPADHYAY, 2007), tornando-a o composto mais importante para esse tipo de estudo.
A base da ação lítica é a ruptura física e química da estrutura da membrana, resultando na formação de poros e em um profundo comprometimento da barreira de permeabilidade da célula (YANG et al., 2001). Os atributos tóxicos da melitina advêm justamente de suas propriedades hemolíticas, uma vez que a mesma promove ruptura dos eritrócitos logo após o contato com essas células, como esquematizado na Figura 4. No entanto, apesar de potencialmente tóxica para células eucariótica e procariótica, a melitina apresenta-se como um peptídeo com amplo espectro de atividade antimicrobiana, sendo capaz de combater diversos patógenos.
Figura 4 - Interação da melitina com eritrócitos.
Fonte: WEINBERG (2011).
Desta forma, mostrou-se que a melitina exerce efeitos inibitórios sobre a Borrelia burgdorferi, bactéria que causa a doença de Lyme (LUBKE e GARON, 1997). Também foi observado que a melitina mata leveduras Candida albicans (KLOTZ et al., 2004) e suprime infecções causadas pelas bactérias Mycoplasma hominis e Chlamydia trachomatis (LAZAREV et al., 2005). Um estudo de Asthana, Yadav e Ghosh (2004) demonstrou que é possível manter a atividade bactericida da melitina e modular sua atividade hemolítica substituindo-se alguns 35
resíduos de aminoácidos na cadeia. Neste estudo foram substituídas as leucinas 6 e 13 por alaninas, dando origem a dois novos peptídeos gerados a partir da melitina. Esses peptídeos mutantes apresentaram menor permeabilidade em membranas zwiteriônicas, porém, em vesículas lipídicas carregadas negativamente a permeabilidade se manteve inalterada. Ademais, a atividade antimicrobiana permaneceu a mesma nos novos peptídeos.
A interação melitina-lipídeo tem sido estudada extensivamente a fim de determinar a natureza dessa interação. No entanto, até o momento, o mecanismo molecular de atuação da melitina não foi completamente elucidado. Muitas evidências apontam que diferentes mecanismos ocorrem em distintas situações, conferindo, assim, uma gama de efeitos desse peptídeo. Estudos indicam que interações hidrofóbicas, e também eletrostáticas, estão envolvidas na ligação melitina-lipídeo. Ademais, mostrou-se que a melitina natural possui maior afinidade por membranas carregadas negativamente que por membranas zwiteriônicas (WEINBERG, 2011).
O colesterol também possui fortes influências sobre a atividade lítica da melitina. O colesterol presente nas células eucarióticas acaba por induzir uma formação compactada da membrana lipídica, reduzindo a capacidade de ligação entre peptídeos e a membrana. Além disso, o resíduo de aminoácido triptofano presente na melitina tem a capacidade de formar um complexo bastante estável com a molécula de colesterol. Os eritrócitos, que são um alvo natural da melitina, são ricos em moléculas de colesterol (WEINBERG, 2011).
Foi demonstrado que o colesterol reduz a atividade lítica da melitina. A concentração necessária para romper 50% das células analisadas foi 3 vezes menor em eritrócitos empobrecidos em colesterol do que em eritrócitos de controle. O LD50
6
para a ruptura induzida pela melitina em eritrócitos normais foi de aproximadamente 0,67 µM, enquanto em eritrócitos empobrecidos, o LD50 foi de apenas 0,21 µM (RAGHURAMAN e CHATTOPADHYAY, 2005).
2.3.2 Efeito anti-inflamatório, anestésico e nociceptivo
Além de sua poderosa atividade lítica e antibactericida, a melitina possui muitas outras propriedades terapêuticas. Sua propriedade anti-inflamatória é amplamente conhecida e a séculos é usada para tratar
6Emtoxicologia,dose letal mediana(DL
50) é a dose necessária de uma dada substância ou tipo
de radiação para matar 50% de umapopulaçãoem teste. 36
diversas condições clínicas (ACS, 2008). A inibição de diversos aspectos da resposta inflamatória é de grande interesse. Apesar da grande variedade de classes farmacológicas e fármacos que têm sido usadas como analgésicos e anti-inflamatórios por décadas, existe uma busca contínua por novas alternativas, tanto pela baixa eficácia quanto pelos efeitos colaterais devido ao uso prolongado dos remédios tradicionais.
As terapias atuais utilizam-se de anti-inflamatórios não-esteroidais (aspirina, ibuprofeno e fenilbutazona) e esteróides (cortisona, prednisona e dexametasona). Todas elas têm efeitos colaterais acentuados devido à necessidade de tratamento permanente. Em especial, os fármacos esteroidais podem acarretar em impotência, edema, queda da resposta imunológica, crescimento excessivo dos cabelos e irregularidades cardíacas, além de úlceras e problemas renais. Pelo emprego da apitoxina, vários pesquisadores já demonstraram que é possível reverter a evolução da doença sem ocorrência de efeitos colaterais. (MAIA, 2002)
Outro aspecto importante na terapia contra inflamações e artrites empregando-se veneno de abelha é a via de injeção. Diversos estudos têm mostrado a relevância da acupuntura combinada com a apiterapia no tratamento de doenças (LEE et al., 2005). Os resultados sugerem que o local da aplicação das agulhas tem forte influência sobre o tratamento e que a acupuntura combinada com o veneno de abelha apresenta resultados muito mais satisfatórios (LEE et al., 2004).
Em um estudo realizado por Son e colaboradores (2007), dez pacientes diagnosticados com reumatismo receberam tratamento através de acupuntura combinada com veneno de abelha duas vezes por semana durante 3 meses. O estudo mostrou melhora notável em 2 pacientes, boa melhora em 5 casos e melhoria efetiva em 2 casos.
Ainda no mesmo estudo foi reportado o extenso mecanismo anti-artrítico e anti-inflamatório da melitina através da redução da atividade das enzimas COX-2 e PLA2 e dos níveis de TNF-α, IL-1, IL-6, NO e ROS. Além disso, outros trabalhos comprovaram que a melitina inibe o edema (CHANG e BLIVEN, 1979) e a nocicepção (LEE et al., 2001), bem como sinais inflamatórios em ratos (LEE et al., 2005) e a inflamação articular em coelhos (THOMSEN et al., 1984). Finalmente, observou-se que o veneno de abelha reduz a produção de mediadores inflamatórios de artrite em modelos animais (LEE et al., 2005).
Vários mecanismos têm sido propostos para explicar os efeitos anti-inflamatórios e antinociceptivos induzidos pelo veneno da abelha. 37
Foi demonstrado, por exemplo, que o mesmo inibe a expressão da ciclooxigenase-2 (COX-2), enzima responsável pela formação de importantes mediadores biológicos chamados prostanóides (a inibição farmacológica das COXs pode causar alívio aos sintomas de inflamação e dor), bem como a produção de citocinas inflamatórias e do óxido nítrico (NO), induzida por diferentes estímulos inflamatórios. Foi ainda reportado que a melitina aumentou a produção de cortisol em macacos e cães, um efeito que pode também contribuir para a sua atividade anti-inflamatória (MERLO et al., 2011).
Além da poderosa atividade anti-inflamatória, a melitina também apresenta atividade analgésica. É sabido que a picada de abelha inicialmente produz dor e hiperalgesia (sensibilidade exagerada a dor ou sensação elevada a estímulos dolorosos). Porém, há muitas evidências de que a melitina apresenta efeito anestésico sobre inflamações. Como dito anteriormente, o veneno de abelha tem sido usado para aliviar a dor e tratar doenças inflamatórias crônicas. Injeções subcutâneas de melitina através de acupuntura têm sido usadas para produzir um potente efeito analgésico.
Kwon et al. (2001) relataram um efeito anti-nociceptivo de injeções de veneno de abelha em um ponto de acupuntura específica (ponto Zusanli) em pacientes com artrite crônica. Em comparação com uma injeção num ponto não acupunterápico, o veneno de abelha reduziu significativamente o comportamento nociceptivo induzido pela artrite. Isto sugere que uma injeção de melitina diretamente num ponto de acupuntura pode produzir um efeito anti-nociceptivo potente.
Os efeitos anti-inflamatórios e anti-nociceptivos do veneno da abelha e da melitina em uma reação inflamatória localizada também têm sido relatados por Lee et al. (2001). Em animais normais, uma injeção de veneno de abelha no membro posterior resultou num ligeiro aumento no nível de expressão da proteína c-Fos7 na medula espinhal, sem produzir qualquer comportamento nociceptivo detectável ou hiperalgesia. Em seguida, um pré-tratamento com veneno de abelha antes da injeção de carragenina suprimiu o edema da pata e a hiperalgesia térmica provocada pela carragenina. Estes resultados sugerem que o pré-tratamento com melitina tem efeitos anti-nociceptivos e anti-inflamatórios contra a dor inflamatória induzida pela
7
Está envolvida em mecanismos celulares importantes, incluindo a proliferação celular, diferenciação e sobrevivência. Foi descoberto que a proteína c-Fos contribui para a indução da apoptose.
carragenina. Logo, isto também sugere que a melitina pode ser útil no tratamento da dor e edema associado às doenças inflamatórias crônicas.
O mecanismo preciso da ação anti-nociceptiva da melitina ainda não foi completamente elucidado, mas vários mecanismos têm sido propostos. Na revisão literária de Son e colaboradores (2007), diversos desses possíveis mecanismos estudados são descritos.
2.3.3 Influências sobre a pressão arterial
Com o tratamento secular de bursites, artrites, tendinites e reumatismo, logo surgiu o interesse de se investigar a interferência da melitina sobre o sistema cardiovascular. Estudos mostraram que o veneno de abelha bruto produzia uma resposta hipotensiva em gatos, ratos e sapos. (MARSH E WHALER, 1980)
Marsh e Whaler (1980) investigaram mais profundamente o efeito do veneno sobre o sistema cardiovascular. No estudo, os efeitos cardiovasculares do veneno de abelha e seus principais constituintes, melitina e PLA2 foram monitorados ao serem injetados em ratos anestesiados e em corações de ratos isolados. Injeções do veneno bruto (5-20 µg) paralisaram os corações isolados irreversivelmente em 30-60 s. Nos animais anestesiados, o veneno bruto causou dois efeitos contrários de acordo com o nível de repouso dos ratos. Nos animais com uma pressão sanguínea média de 95/67 mmHg, o veneno (0,5 mg/kg) causou um aumento de cerca de 20 mmHg em 30 s; em animais com uma pressão sanguínea média de 138/112 mmHg, o veneno (0,7 mg/kg) causou uma queda acentuada. Em ambos os casos, a pressão arterial voltou aos níveis de pré-injeção após 5 min. A maioria desses efeitos foi atribuída ao constituinte principal do veneno, a melitina. Esta, paralisou irreversivelmente o coração isolado em 37-64 s usando-se uma quantidade de 20-40 µg, enquanto a PLA2 não produziu qualquer efeito. Este estudo mostrou que a melitina é uma potente cardiotoxina.
Mais recentemente, e de uma forma mais aprofundada, os mesmos resultados foram corroborados por Kang et al. (2008). Em ratos anestesiados, a pressão arterial média, pressão sistólica, pressão de pulsação foram reduzidos pela injeção do veneno, mesmo que o batimento cardíaco tenha aumentado. As alterações apresentaram uma dependência direta com a dose injetada. Foi mostrado que o veneno de abelha induz depressão cardiovascular, diminuindo a pressão cardíaca e aumentando a concentração de magnésio ionizado no sangue.
Em contrapartida, outro estudo realizado em ratos com pressão arterial normal e ratos com pressão arterial baixa induzida por choque 39
hemorrágico, mostrou que a melitina aumenta a pressão arterial e reverte a hipotensão em situações de choques hemorrágicos. Verificou-se que a injeção de melitina em condições normais e hipotensas de pressão arterial produz respostas, aumentando os níveis de adrenalina, noradrenalina e vasopressina no plasma e aumenta a atividade da renina (enzima que regula a pressão arterial) (YALCIN e SAVCI, 2007). 2.3.4 Atividade anticancerígena
Um dos primeiros estudos a indicar o possível efeito antitumoral do veneno de abelha foi o de McDonald, Li e Mehta (1979). O grupo examinou as possíveis propriedades antitumorais do veneno de abelha estudando a mortalidade de apicultores profissionais. Analisando-se os obituários, os autores estabeleceram a causa de morte entre os apicultores e comparou-os com os da população em geral. O estudo mostrou que a incidência de mortalidade por câncer nos apicultores que foram expostos ao veneno durante a vida de trabalho era ligeiramente inferior do que na população em geral. Além disso, a mortalidade por câncer de pulmão foi significativamente mais baixa nos apicultores em comparação com a população. Em contrapartida, a mortalidade por outras doenças era igual ao resto da população em geral. O estudo sugeriu que o veneno de abelha poderia possuir efeito quimioterápico.
Depois disso, um grande número de estudos demonstrou propriedades antitumorais do veneno e, em particular, do seu principal constituinte, a melitina. Relatórios recentes apontam para vários mecanismos responsáveis pela citotoxicidade do veneno em diferentes tipos de células cancerosas, tais como: alterações do ciclo celular, efeito sobre a proliferação e/ou inibição do crescimento tumoral e indução de apoptose ou necrose do tecido tumoral. Comprovadamente, a melitina apresentou atividade anticancerígena in vivo e in vitro em um largo espectro de células cancerosas, tais como em tumores de rins, pulmões, fígado, próstata, mamas e bexiga, além de células leucêmicas, melanoma8 e osteossarcoma9 (GAJSKI e GARAJ-VRHOVAC, 2013; ORSOLIC, 2012).
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Melanoma é um tipo de câncer que atinge o tecido epitelial, mais especificamente a os melanócitos presentes na camada basal da epiderme. Representa 5% dos tipos de câncer da pele, sendo o mais grave.
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Osteossarcoma é o tipo mais comum de tumor ósseo maligno. O tumor ocorre preferencialmente na região da metástase óssea de ossos tubulares longos. Cinquenta por cento dos casos ocorrem próximos aos joelhos. Se propaga rapidamente para os pulmões e, com menos frequência, para outros órgãos.
O carcinoma é o tipo de câncer mais comum nos seres humanos, podendo surgir em praticamente todos os tecidos do corpo. Chama-se de carcinoma o câncer que se origina de um tecido epitelial, ou seja, o tecido que recobre a pele e a maioria dos órgãos. Mostrou-se que a melitina inibe a proliferação de células de carcinoma e o crescimento tumoral in vivo. A inibição do crescimento tumoral pela melitina foi relacionada com a estimulação da resposta imunitária celular (ORSOLIC, 2012). A indução da apoptose10, necrose e quebra das células tumorais foram considerados possíveis mecanismos pelos quais a melitina inibe o crescimento tumoral. Embora alguns estudos demonstraram claramente que a melitina possui efeitos anti-proliferativos e pró-apoptóticos, os mecanismos precisos responsáveis por estes efeitos em células tumorais ainda são desconhecidos.
O processo em que células cancerosas se disseminam pela corrente sanguínea e formam sub-populações de células malígnas em outros locais diferentes e/ou distantes do local de origem, denomina-se metástase. Esta capacidade de invadir tecidos adjacentes agrava muito a situação da doença e dificulta a evolução de cura, sendo a principal causa de morte em pacientes com câncer. Em um artigo recente, Liu et al. (2008) demonstraram que a melitina inibe a metástase de células tumorais em ratos através da redução da movimentação e migração das células cancerígenas. O autor sugere que a melitina é um potencial agente terapêutico para o câncer primário de fígado (carcinoma hepatocelular), bem como um agente anti-metastático.
A maioria dos peptídeos líticos produzidos pelos insetos, anfíbios e mamíferos têm uma estrutura anfipática, que se liga preferencialmente e se insere em membranas celulares carregadas negativamente. Células eucarióticas normais possuem um baixo potencial de membrana, ao contrário das membranas celulares de células procarióticas e cancerosas que possuem um grande potencial de membrana. Por essa razão, muitos peptídeos líticos rompem seletivamente as membranas de células cancerígenas, ao invés de atacar células normais.
De acordo com Gajski e Garaj-Vrhovac (2013), a melitina é um composto interessante para o tratamento quimioterápico de câncer, pois as células cancerosas têm menos probabilidade de desenvolver resistência a um formador de poros em membranas. A combinação de um fármaco quimioterapêutico em conjunto com a melitina pode ser
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Apoptose: conhecida como "morte celular programada", é um tipo de autodestruição celular. A apoptose pode realizar quatro funções básicas: esculpir estruturas, eliminar estruturas, regular a quantidade de células e eliminar células defeituosas.
