UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia de Alimentos
JOSÉ ALBERTO DIOGO
BIOPROSPECÇÃO E CONSTRUÇÃO DE HEMICELULASES
PARA PRODUÇÃO DE XILOSE A PARTIR DO LICOR DE
XILO-OLIGOSSACARÍDEOS E SUA UTILIZAÇÃO NA
PRODUÇÃO DE XILITOL VIA FERMENTATIVA
CAMPINAS 2016
JOSÉ ALBERTO DIOGO
BIOPROSPECÇÃO E CONSTRUÇÃO DE HEMICELULASES
PARA PRODUÇÃO DE XILOSE A PARTIR DO LICOR DE
XILO-OLIGOSSACARÍDEOS E SUA UTILIZAÇÃO NA
PRODUÇÃO DE XILITOL VIA FERMENTATIVA
Orientador: Profa. Dra. Hélia Harumi Sato Coorientador: Dr. Roberto Ruller
CAMPINAS 2016 Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pelo aluno José Alberto Diogo e orientado pela Profa. Dra. Hélia Harumi Sato
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Ciência de Alimentos
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________ Profa. Dra. Hélia Harumi Sato – DCA/FEA/UNICAMP
Orientadora
_________________________________________ Dra. Jaciane Lutz Ienczac – CTBE/CNPEM
Membro titular
_________________________________________ Profa. Dra. Rosana Goldbeck – DEA/FEA/UNICAMP
Membro titular
_________________________________________ Prof. Dr. Júnio Cota Silva – ICA/UFMG
Membro suplente
_________________________________________ Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas – DCA/FEA/UNICAMP
Membro suplente
A Ata da Defesa, com as respectivas assinaturas dos membros da Comissão Examinadora, encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por nunca desistir de mim e permitir que alcançasse meus sonhos mesmo quando perto de perder a esperança. Por me conceder saúde e calma nos momentos em que mais precisava, e que pessoas maravilhosas trilhassem o mesmo caminho que o meu.
À minha família, que apesar de simples, sempre me pautou pelos melhores exemplos permitindo que eu chegasse a conquistar meus objetivos de maneira honesta mesmo suportando muitas dificuldades. Em especial, a minha mãe Maria Elisa pelo sustento e apoio, e minha irmã Josimara pelo exemplo na dedicação aos estudos e amor à cultura.
Aos muitos amigos que me incentivaram a prestar o vestibular mesmo quando não via muita esperança de sucesso, como os que tive a oportunidade de estar junto na cidade de Araras: Fernanda, Maria Estela e Rosângela. Aos amigos que fiz desde a graduação até o final deste trabalho, e que em muitos momentos foram como uma família, passando juntos por muitos momentos bons e difíceis: Thamara, Vivi, Déia,Thiago, Paulinha, Anderson, Baku, Xororó, Marlon.
Também tenho muito a agradecer aos pesquisadores e amigos que fiz durante execução de trabalhos de iniciação científica no Centro de Citricultura Sylvio Moreira e que sem dúvida tiveram papel fundamental na minha formação. Em especial a Dra. Mariângela Cristofani-Yaly pela orientação, apoio e exemplo profissional.
Aos amigos do CTBE pela colaboração neste trabalho e pela convivência, em especial aos colegas da ilha dois: Evandro, Ricardo, Fernandinha, Carla, Claudinha e Letícia. Tenho muito que agradecer a Zaira Bruna Hoffmam, também colega de bancada, pelas colaborações fundamentais neste trabalho, sendo um exemplo de jovem cientista.
Agradeço ainda pela recepção, e confiança no meu trabalho os pesquisadores Hélia Harumi Sato e Roberto Ruller, respectivamente orientador e coorientador neste mestrado.
Ao Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE) pela infraestrutura para a realização deste trabalho.
RESUMO
Biomassas vegetais são constituídas principalmente de celulose, hemicelulose e lignina. Celulose e hemicelulose podem ser hidrolisadas enzimaticamente a açúcares monoméricos (principalmente glicose/C6 e xilose/C5) usando celulases e hemicelulases, respectivamente. Hemicelulases são enzimas do grupo das hidrolases glicosídicas que catalisam a reação de hidrólise da hemicelulose em xilose e outros açúcares. A hemicelulose compõe cerca de 30% dos polissacarídeos na biomassa do bagaço de cana, contudo, poucos estudos são direcionados para melhorar a sacarificação desses polissacarídeos à açúcares monoméricos, como a xilose, que pode ser transformado em outros produtos de valor agregado como bioetanol, ácidos orgânicos e xilitol.
O presente trabalho teve como objetivos a seleção de linhagens de Bacillus sp. capazes de crescer no licor de xilo-oligossacarídeos, proveniente do pré-tratamento hidrotérmico do bagaço de cana-de-açúcar, e produzir hemicelulases capazes de hidrolisar xilo-oligossacarídeos produzindo xilose a partir deste substrato. Adicionalmente, foi criada uma enzima quimérica bifuncional unindo atividades de endoxilanase e β-xilosidase aplicada na hidrólise de xilo-oligossacarídeos para obtenção de xilose, e sua posterior fermentação para produção de xilitol utilizando as leveduras Scheffersomyces stipitis e Candida guillermondii.
A partir de uma biblioteca contendo 104 isolados de Bacillus sp., foram selecionadas 7 linhagens, por meio da determinação do índice enzimático, que apresentaram a capacidade de crescer e hidrolisar os xilo-oligossacarídeos do licor. As linhagens selecionadas foram identificadas pela análise da sequência do gene RNAr 16S como linhagens de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis. Dentre as linhagens selecionadas, BH27 e BH93 apresentaram melhores resultados de crescimento e hidrólise e tiveram suas sequências de β-xilosidases (GH43) clonadas, expressadas e caracterizadas, mas não foram utilizadas na construção da enzima quimérica, tendo em vista que seus parâmetros bioquímicos, e tolerância a xilose foram inferiores ou semelhantes a outras β-xilosidases já estudadas. A enzima quimérica foi construída utilizando uma endoxilanase (M6) proveniente de evolução dirigida, e uma β-xilosidase de Bacillus subtilis ATCC 168. Apesar de apresentar um
Kcat/KM inferior ao das enzimas parentais, a construção demonstrou capacidade de
hidrolisar 30% dos xilo-oligossacarídeos presentes no licor até xilose permitindo sua utilização na fermentação e obtenção de xilitol. No estudo da produção de xilitol a partir de xilose por via fermentativa foram obtidos melhores resultados utilizando as leveduras Scherffersomyces stipitis e Candida guillermondii cultivadas na forma livre, comparada com as células imobilizadas. Após 96h de fermentação em meio contendo licor de xilo-oligossacarídeos não detoxificado e enzimaticamente hidrolisado, a levedura Candida guillermondii produziu 9,5 g/L de xilitol, exibindo eficiência de conversão de 33%, um fator de conversão de 0,3 g/g e produtividade volumétrica de 0,1 g/L/h.
ABSTRACT
The plant biomasses are composed mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose and hemicellulose can be hydrolyzed to monomeric sugars (primarily glucose/C6 and xylose/C5) with cellulases and hemicellulases, respectively. Hemicellulases are enzymes of glycoside hydrolyses group, which catalyze the hemicellulose hydrolysis to xylose and other compounds. Hemicellulose represents around to 30% of the polysaccharide in the biomass of sugarcane bagasses. However, few studies have focused on hemicellulose saccharification for monomeric sugars production, as xylose, and then its complete conversion to value-added byproduct, such as bioethanol, organic acids and xylitol.
This study aimed the selection of Bacillus sp. strains able to growth using xylooligosaccharide liquor from hydrothermal pretreatment of sugar cane bagass. Furthermore, a bifunctional enzyme (chimera) composed by an endo-xylanase and β-xylosidase activities was constructed for the hydrolysis of xylooligosacharides to xylose and its conversion to xylitol using free and immobilized yeasts.
After screening a library of 104 Bacillus sp. strains, 7 isolated were selected by the enzymatic index determination and their ability to growth in the liquor from pretreated sugarcane bagasse and hidrolyse the xylooligosacharides. The selected strains were identified by the RNAr 16S DNA sequence as being strains of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis. BH27 e BH93 strains showed the best results for growing and hydrolysis of xylooligosaccharides liquor and their β-xylosidases (GH43) sequences were cloned, expressed and characterized completely. However, none of these sequences were used in the construction of the chimeric enzyme, because their biochemical parameters and xylose tolerance were lower or similar as already studied for β-xylosidases. The chimeric enzyme was constructed using an endo-xylanase (M6) of directed evolution studies (previous works using mutagenesis) together of a β-xylosidase from Bacillus subtilis ATCC 168. Although chimera presented a Kcat/KM lower than parental enzymes, it showed
the ability to hydrolyze of 30% of xylooligosaccharides in the liquor to xylose for subsequent fermentation to xylitol. In the study of xylitol production from xylose by fermentation were obtained best results using the yeast Scherffersomyces stipitis and Candida guillermondii cultured in free form compared with immobilized cells.
After 96 hours of fermentation of broth containing xylooligosaccharides liquor (non-detoxified) and enzymatically hydrolysed by chimera, the yeast Candida guillermondii produced 9.5 g /L of xylitol, showed 33% of conversion efficiency, a conversion factor of 0.3 g / g and a volumetric productivity of 0.1 g / L / hr.
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1: Representação esquemática da organização dos diferentes constituintes da parede celular secundaria ... 24 Figura 3.2: Representação esquemática da formação de inibidores a partir do
pré-tratamento da biomassa lignocelulósica ... 27 Figura 3.3: Representação das principais hemicelulases atuando sobre a molécula de xilano ... 28 Figura 3.4: Via metóbilica da D-xilose em micro-organismos ... 33 Figura 4.1: Esquema simplificado da construção do gene para uma enzima bifuncional (quimera) ... 40 Figura 5.1: Cultivo da biblioteca de Bacillus sp. em meio contendo licor de xilo-oligossacarídeos ... 54 Figura 5.2: Triagem da biblioteca de Bacillus sp. termotolerantes em meio contendo licor de xilo-oligossacarídeos após coloração com vermelho congo ... 55 Figura 5.3: Gel de agarose 1% ... 57 Figura 5.4: Árvore filogenética construída a partir de sequências 16S dos micro-organismos selecionados e de linhagens de Bacillus depositadas no National Center of Biotechnological
Information (NCBI) ... 58
Figura 5.5:Eletroforese dos produtos de PCR de amplificação dos genes de endoxilanase GH11, em gel 1% de agarose ... 59 Figura 5.6: Sequências de aminoácidos traduzidas após sequenciamento dos genes
amplificados de endoxilanases GH11 dos Bacillus sp. selecionados ... 60 Figura 5.7: Resultado do PCR para amplificação dos genes de β-xilosidases ... 61 Figura 5.8: Sequências de aminoácidos traduzidas após sequenciamento dos genes
amplificados de β-xilosidases GH43 das linhagens BH27 e BH93, juntamente com a
sequência conhecida de β-xilosidase de B. subtilis 168 (BS) ... 62 Figura 5.9: SDS-PAGE das diferentes β-xilosidases após purificação por cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados ... 63 Figura 5.10: Curvas de pH ótimo de atividade das β-xilosidases GH43 das linhagens BH27 e BH93 e de Bacillus subtilis (XBBS) ... 64 Figura 5.11: Curvas de temperatura ótima de atividade das β-xilosidases GH43 das
Figura 5.12: Curvas de atividade específica das β-xilosidases XB27, XB93 e XBBS na
presença de concentrações crescentes de xilose ... 66
Figura 5.13: Total de xilose presente no licor diluído 5 vezes (mesmo licor utilizado na seleção dos micro-organismos a 20%), após hidrólise enzimática de 14horas com diferentes combinações de enzimas... 68
Figura 5.14: Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio ... 70
Figura 5.15: Géis de SDS-PAGE ... 72
Figura 5.16: Curvas de atividade da quimera MXB e seus módulos individuais (xilanase M6 e β-1,4 xilosidase XB) em diferentes temperaturas ... 73
Figura 5.17: Curvas de atividade da quimera MXB e seus módulos individuais (xilanase M6 e β-1,4 xilosidase XB) em diferentes valores de pH ... 75
Figura 5.18: Perfis cinéticos da quimera MXB no substrato xilano de faia ... 76
Figura 5.19: Perfil cinético da quimera MXB no substrato ... 76
Figura 5.20: Otimização da hidrólise do licor de xilo-oligossacarídeos ... 80
Figura 5.21: Curvas de atividade relativa da enzima quimérica bifuncional MXB e do módulo individual de β-xilosidase de B. subtilis ATCC 168 em substrato pNPX na presença de concentrações crescentes de xilose ... 82
Figura: 5.22: Micrografia da levedura C guillermondii em aumento de 100X ... 83
Figura: 5.23: Micrografia da levedura S. stipitis em aumento de 100X ... 84
Figura 5.24: Curvas de produção de xilitol e etanol pelas leveduras Scheffersomyces stipitis e Candida guillermondii nas formas livre e imobilizada ... 85
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1: Ocorrência das hemiceluloses nas paredes primária e secundária de dicotiledôneas e gramíneas (Poaceae) ... 23 Tabela 4.1: Primers utilizados na construção da quimera MXB ... 41
Tabela 4.2: Matriz para otimização da hidrólise enzimática do licor de xilo-oligossacarídeos. ... 47
Tabela 4.3: Composição do meio de cultura... 49 Tabela 5.1: Composição do licor de tratamento hidrotérmico antes e após hidrólise ácida .. 53 Tabela 5.2: Micro-organismos selecionados para cultivo em meio contendo 20% de licor de xilo-oligossacarídeos e medida do diâmetro (mm) da colônia e do halo (mm) de degradação de xilo-oligossacarídeos formado após coloração com vermelho congo ... 56 Tabela 5.3: Parâmetros cinéticos das β-xilosidases de Bacillus subtilis ATCC 168 (XBBS), da linhagem BH27 (XB27) e da linhagem BH93 (XB93) ... 66 Tabela 5.4: Caracterização do licor de pré-tratamento hidrotérmico concentrado antes e após hidrólise ácida ... 69 Tabela 5.5: Índice enzimático de atividade de hidrólise de xilo-oligossacarídeos das linhagens de B subilitis BH27 e BH93 crescidas em placas contendo 10% de licor concentrado ... 69 Tabela 5.6: Parâmetros cinéticos para a quimera e enzimas nativas em xilano de faia e pNPX ... 77 Tabela 5.7: Desenho experimental para otimização da hidrólise enzimática do licor de xilo-oligossacarídeos ... 78 Tabela 5.8: Coeficientes de regressão para a resposta concentração de xilose ... 79 Tabela 5.9: Análise de variância para o modelo de hidrólise de xilo-oligossacarídeos e obtenção de xilose ... 80 Tabela 5.10: Ensaios de hidrólise de xilo-oligossacarídeos com enzima quimérica bifuncional suplementados com arabinofuranosidase. ... 82 Tabela 5.11: Parâmetros da fermentação de xilose e glicose em xilitol e etanol no tempo de 72 horas pelas leveduras Scheffersomyces stipitis e Candida guillermondii nas formas livre (L) e imobilizadas (I) ... 86 Tabela 5.12: Parâmetros da fermentação de xilose e glicose em xilitol e etanol no tempo de 96 horas pelas leveduras Scheffersomyces stipitis e Candida guillermondii nas formas livre (L) e imobilizadas (I) ... 86
LISTA DE ABREVIATURAS
ATCC - American Type Culture Collection BH27 - Linhagem de Bacillus subtlilis BH93 - Linhagem de Bacillus subtilis BS - Bacillus subtilis ATCC 168
DCCR - Delineamento Composto Central Rotacional GH - Glicosídeo hidrolases
IPTG - Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
M6 - Endoxilanase GH11 mutada de Bacillus subtilis ATCC 168 MXB - Enzima quimérica bifuncional
NCBI - National Center of Biotechnological Information pb - pares de bases
PCR - Polymerase Chain Reaction PMSF - fluoreto de fenilmetilsulfonil pNP - paranitrofenol
pNPX - p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo Qp - Produtividade volumétrica
SOC - Meio de cultura para bactérias
XABS - Endoxilanase GH11 nativa de Bacillus subtilis ATCC 168 XB27 - -1,4 xilosidase GH43 da linhagem BH27
XB93 - -1,4 xilosidase GH43 da linhagem BH93
XBBS - -1,4 xilosidase GH43 nativa de Bacillus subtilis ATCC 168 YP - Meio para cultivo de leveduras
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ... 5 RESUMO ... 6 ABSTRACT... 8 LISTA DE FIGURAS ... 10 LISTA DE TABELAS ... 12 LISTA DE ABREVIATURAS ... 13 SUMÁRIO ... 14 1.INTRODUÇÃO GERAL ... 17 2. OBJETIVOS ... 19 2.1. Objetivos gerais ... 19 2.2. Objetivos Específicos ... 19 3. REVISÃO DE LITERATURA ... 203.1. Novas fontes de energia e matérias-primas... 20
3.2. Biomassa ... 21
3.2.1. Celulose ... 21
3.2.2. Hemicelulose ... 22
3.2.3. Pectina ... 23
3.2.4. Lignina ... 23
3.2.5. Organização dos constituintes da parede celular ... 24
3.3. Fontes de biomassa ... 24
3.4. Pré-tratamento ... 26
3.5. Hidrólise enzimática da hemicelulose ... 27
3.6. Enzimas multifuncionais ... 29
3.7. Xilitol ... 30
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 35
4.1. Locais de desenvolvimento do projeto ... 35
4.2. Obtenção do licor de xilo-oligossacarídeos do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado ... 35
4.3. Preparação da biblioteca de Bacillus sp. ... 36
4.4. Meios de cultivo e seleção de linhagens de Bacillus sp. ... 36
4.5. Extração de DNA genômico das linhagens selecionadas ... 37
4.6. Amplificação da sequência do gene RNAr 16S ... 38
4.7. Amplificação de sequências de endoxilanases e β-xilosidases ... 38
4.8. Sequenciamento e análise ... 39
4.10. Clonagens ... 41
4.11. Expressão heteróloga, lise celular e purificação das enzimas ... 42
4.12.Cristalização da enzima purificada ... 43
4.13. Caracterização bioquímica das enzimas recombinantes ... 44
4.13.1. Atividade de β-xilosidase ... 44
4.13.2. Atividade de xilanase ... 44
4.13.3. Atividade da enzima recombinante em diferentes substratos ... 45
4.14. Testes de hidrólise do licor rico em xilo-oligossacarídeos ... 45
4.15. Otimização da hidrólise do licor rico em xilo-oligossacarídeos... 46
4.16. Hidrólise de xilo-oligossacarídeos em xilose utilizando a enzima quimérica MXB recombinante e posterior fermentação da xilose para obtenção de xilitol utilizando leveduras ... 47
4.16.1. Hidrólise de xilo-oligossacarídeos do licor para xilose utilizando a enzima quimérica MXB recombinante produzida em E. coli pRARE II ... 47
4.16.2. Fermentação de xilose e obtenção de xilitol utilizando-se as leveduras Scheffersomyces stipitis (Pichia stipitis) e Candida guillermondii. ... 48
4.16.2.1. Leveduras ... 48
4.16.2.2. Preparação do pré-inóculo ... 48
4.16.2.3. Preparação do inóculo ... 48
4.16.2.4. Imobilização das leveduras S. stipitis e C. guillermondii ... 49
4.16.2.5. Fermentação de xilose pelas leveduras S. stipitis e C. guillermondii para a obtenção de xilitol ... 49
4.16.2.6. Cálculo dos fatores de conversão, rendimento e produtividade... 50
4.17. Quantificação de xilose... 50
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 52
5.1 Triagem de Bacillus sp. capazes de crescer em meio licor de xilo-oligossacarídeos .. 52
5.2. Amplificação da sequência do gene RNAr 16S, sequenciamento e identificação dos micro-organismos ... 56
5.3 Clonagem e sequenciamento de genes de endoxilanase ... 58
5.4. Clonagem e sequenciamento de genes de β-xilosidase ... 60
5.5. Expressão heteróloga, purificação e caracterização de β-xilosidase ... 63
5.6. Testes com a β-xilosidase putativa de Bacillus licheniformis ... 63
5.7. Caracterização bioquímica das β-xilosidases das linhagens de Bacillus subtilis BH27 e BH93 ... 64
5.8. Hidrólise enzimática do licor de xilo-oligossacarídeos ... 67
5.9. Testes de crescimento das linhagens de Bacillus subtilis BH27 e BH93 em licor de pré-tratamento hidrotérmico concentrado ... 68
5.10.1. Construção da enzima bifuncional ... 70
5.10.2. Caracterização da enzima quimérica ... 72
5.10.3. Otimização da hidrólise do licor de xilo-oligossacarídeos ... 78
5.11. Fermentação do hidrolisado contendo xilose para obtenção de xilitol utilizando-se as leveduras Scheffersomyces stipitis (Pichia stipitis) e Candida guillermondii, nas formas livre e imobilizadas ... 83
6.CONCLUSÕES ... 87
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 89
8. ANEXOS ... 105
Anexo 1 – Relatório da avaliação de biossegurança do projeto de pesquisa pela Comissão Interna de Biossegurança do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM) ... 105
1. INTRODUÇÃO GERAL
Diante da demanda crescente de energia e matérias-primas, a busca por fontes renováveis atualmente deixou de ser uma opção e passa a ser um imperativo. O modelo econômico baseado em petróleo e carvão começa a dar sinais de ter se tornado insustentável, haja visto as demandas ambientais cada vez mais expressivas. A alternativa ecologicamente correta, seja para geração de energia ou produção de materiais, é a biomassa vegetal, melhor opção em termos compostos de carbono disponível no planeta, além dos fósseis não renováveis (Soares; Andreozzi, 2011; Rodrigues, 2011; Stocker et al., 2013).
A proposta de utilização da biomassa para geração de combustíveis e outras moléculas de valor agregado envolve o conceito de biorrefinaria, que engloba uma rede de indústrias para o refino de matérias-primas renováveis, como a biomassa vegetal, aos moldes do que acontece no setor petroquímico (Rodrigues, 2011; Menon; Rao, 2012; Kamm, 2013; Esposito; Antonietti, 2015).
Biomassas vegetais são constituídas principalmente de celulose, hemicelulose e lignina. Esses componentes encontram-se na parede celular vegetal formando uma estrutura rígida e de difícil acesso às enzimas hidrolíticas, necessitando de pré-tratamentos de ordem física e/ou química para que seja realizada a hidrólise enzimática. A celulose pode ser hidrolisada enzimaticamente para glicose e posteriormente fermentada pela levedura Saccharomyces cerevisiae para obtenção de etanol. A hemicelulose pode ser hidrolisada para xilose e convertida para xilitol por hidrogenação química ou por fermentação (Ogeda; Petri, 2010; Menon; Rao, 2012).
O Brasil como grande produtor agrícola dispõe de uma enorme quantidade de biomassa vegetal como subproduto da agroindústria. Uma das culturas mais desenvolvidas é a cana-de-açúcar, cujo bagaço pode ser utilizado como matéria prima na biorrefinaria. Contudo, o aproveitamento desse subproduto depende do desenvolvimento de tecnologias e processos que permitam a hidrólise enzimática da biomassa e sua sacarificação com baixo custo e alta eficiência (Buckeridge et al., 2010).
As hemicelulases são enzimas do grupo das hidrolases glicosídicas e que em atuação sinérgica com celulases e ligninases promovem a hidrólise da
biomassa vegetal. A hemicelulose responde por cerca de 30% dos polissacarídeos na biomassa do bagaço de cana, e recentemente têm surgido estudos visando a sacarificação desses polissacarídeos a açúcares monoméricos, e posteriormente a sua completa transformação em outros produtos de valor agregados como bioetanol, ácidos orgânicos e açúcares como o xilitol (Masarin et al., 2011; Souza, 2013).
Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivos a utilização do licor de xilo-oligossacarídeos, proveniente do pré-tratamento hidrotérmico do bagaço de cana, para seleção de bactérias e isolamento/construção de enzimas hemicelulolíticas atuantes nesse substrato, permitindo a obtenção de xilose e a fermentação desta à xilitol utilizando leveduras livres, e também imobilizadas em uma matriz de pectato de cálcio.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
Prospectar enzimas de micro-organismos capazes de crescer e hidrolisar o licor de xilo-oligossacarídeos proveniente do pré-tratamento hidrotérmico do bagaço da cana-de-açúcar e utilização do mesmo como substrato para a produção de xilitol via fermentação.
2.2. Objetivos Específicos
a) A partir de uma biblioteca de isolados de Bacillus sp (hemicelulolítico/termorresistentes), realizar bioprospecção em licor xilo-oligossacarídeos.
b) Identificar via sequenciamento da região RNAr 16S os Bacillus sp. capazes de crescer em licor de xilo-oligossacarídeos.
c) Clonar e expressar hemicelulases de Bacillus sp. em Escherichia coli .
d) Construir uma enzima bifuncional (“quimera” xilanase-xilosidase) utilizando as sequências dos genes das hemicelulases isoladas no item c.
e) Determinar e comparar os parâmetros bioquímicos e cinéticos das enzimas estudadas (pH ótimo, temperatura ótima, KM, Kcat).
f) Utilizar as enzimas para produção de um licor hidrolisado rico em xilose.
g) Utilizar o licor de xilo-oligossacarídeos hidrolisado enzimaticamente para fermentação e produção de xilitol utilizando as leveduras Scheffersomyces stipitis (Pichia stipitis) e Candida guillermondii livres e também imobilizadas em matriz de pectato de cálcio.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Novas fontes de energia e matérias-primas
Uma das maiores preocupações do mundo contemporâneo tem sido encontrar fontes de energia e matérias-primas suficientemente abundantes e acessíveis para satisfazer as necessidades humanas, que estão em constante crescimento mesmo em face ao desenvolvimento de tecnologias mais eficientes energeticamente, e que permitem o uso mais racional de materiais.
As mais importantes fontes primárias de energia exploradas atualmente são aquelas baseadas em combustíveis fósseis, especialmente petróleo, carvão e gás natural, que juntos fornecem 70% da energia total consumida mundialmente (IEA, 2015). Cabe lembrar, entretanto, que o petróleo além de atuar como peça chave na matriz energética fornece uma gama enorme de moléculas a baixo custo, usadas em larga escala em uma variedade extraordinária de materiais de uso cotidiano (Torres, 1997; Rodrigues, 2011).
Uma matriz energética, assim como uma indústria baseada em fontes fósseis, possui alguns problemas que são inerentes a sua característica não renovável como, por exemplo, a sua finitude e a liberação de gases para a atmosfera, principalmente o CO2. Além disso, a instabilidade no fornecimento de petróleo, devido a fatores políticos ou logísticos, e a demanda por um modelo de desenvolvimento sustentável, tem enfatizado a busca por fontes alternativas mais limpas (Soares; Andreozzi, 2011; Stocker et al., 2013).
Tendo em vista esse cenário, surge como alternativa a utilização da biomassa como fonte de energia e matéria-prima, já que se trata do único material rico em carbono disponível no planeta além dos fósseis, e que atende as necessidades atuais de sustentabilidade. Além disso, a biomassa fornece uma variedade de moléculas, cuja versatilidade permite sua transformação em vários produtos, em um processo semelhante ao que se faz na indústria petroquímica (Rodrigues, 2011; Isikgor; Becer, 2015).
Nesse contexto tem sido proposto o conceito da biorrefinaria, uma rede de indústrias que refina matérias-primas renováveis (biomassa ou resíduo de alimentos) para produção de biocombustíveis e produtos químicos por meio de conversão via processos químicos e biológicos, em uma organização similar ao que
acontece em uma refinaria de petróleo (Rodrigues, 2011; Menon; Rao, 2012; Esposito; Antonietti, 2015). Dessa forma, tem sido propostos modelos de produção integrada de alimentos, combustíveis, produtos químicos e materiais através de uma tecnologia desenvolvida de forma interdisciplinar (Kamm, 2004; Kamm, 2013).
.
3.2 Biomassa
A biomassa é um termo que pode designar tanto o conjunto de seres vivos como o total de produtos orgânicos gerados por eles (Couto, 2004). No que concerne aos vegetais (biomassa vegetal) e a sua utilização como fonte de matéria orgânica para a indústria de bioprocessamento, o foco principal é a parede celular, que é constituída de polissacarídeos, proteínas, compostos aromáticos e sais minerais.
Os polissacarídeos são os componentes mais representativos da biomassa, respondendo por 60-80% de seu peso, e incluem basicamente a celulose, hemicelulose e pectina enquanto os compostos aromáticos que constituem a lignina somam de 15 a 30% da biomassa (Santos et al., 2012; Esposito; Antonietti, 2015). De fato, a proporção entre esses componentes assim como sua composição variam de acordo com a espécie vegetal ou com a camada da parede celular (Carvalho et al., 2009), ou ainda com as condições de crescimento, parte da planta analisada e idade (Ogeda; Petri, 2010; Souza et al., 2013; Davison et al., 2013; Szczerbowski et al., 2014).
3.2.1 Celulose
A celulose é um homopolissacarídeo linear composto de unidades de D- glicose unidas por ligações glicosídicas -1,4 por meio da perda de uma molécula de água (Fengel; Weneger, 1989; Ogeda; Petri, 2010). É um polissacarídeo presente na parede celular da imensa maioria dos grupos de plantas e corresponde a aproximadamente de 35 a 50% da biomassa (Mood et al., 2013)
Devido à natureza linear das moléculas de celulose estas se alinham paralelamente em pequenos grupos (seis a oito moléculas) por meio de ligações de hidrogênio formando fibrilas com diferentes tamanhos e comprimentos, que é insolúvel em água e contem regiões mais organizadas cristalinas, e menos organizadas, amorfas (Ramos, 2003; Carvalho et al., 2009; Buckeridge et al., 2010),
mas que podem ser hidrolisadas em monossacarídeos e serem utilizadas em processos fermentativos.
3.2.2 Hemicelulose
A hemicelulose engloba um conjunto de diferentes polissacarídeos heterogêneos que não apresentam cristalinidade. São constituídos de pentoses, hexoses, ácidos urônicos e grupos acetila. As diversas hemiceluloses são agrupadas de acordo com a composição monomérica do resíduo principal de açúcar no esqueleto do polissacarídeo, sendo assim, os principais grupos são os xilanos, glucanos e mananos (Ogeda e Petri, 2010).
Apesar das hemiceluloses não formarem um grupo bem definido, o termo vem sendo mais utilizado para descrever o grupo de polissacarídeos que não se enquadram no grupo das pectinas nem da celulose, formado por cadeias principais de monossacarídeos, que podem ser de xilose, glicose e manose, unidos por ligações do tipo -1,4, sendo que todos possuem a mesma configuração equatorial nas ligações entre os carbonos C1 e C4 (Scheller e Ulvskov, 2010).
Dependendo da espécie vegetal e do tecido analisado diferentes combinações e proporções das várias hemiceluloses podem ser encontradas na parede celular. Enquanto na parede primária das dicotiledôneas o xiloglucano é a principal hemicelulose com uma alta proporção de pectina, nas gramíneas (Poaceae) ocorre o predomínio dos glucuronoarabinoxilano com baixa quantidade de pectina Tabela 3.1 (Scheller e Ulvskov, 2010; Buckeridge e Souza, 2014).
Dentre as hemiceluloses as xilanas compõem a porção mais representativa e são compostas por um esqueleto central de unidades de xilose (xilopiranose) unidas por ligações -(1,4) contendo substituições com outras unidades de açúcares e grupos acetila. Suas moléculas se encontram entre as microfibrilas de celulose, sendo paralelamente orientadas em relação a esta desempenhando um importante papel na manutenção e proteção da celulose (Uffen, 1997).
Tabela 3.1: Ocorrência das hemiceluloses nas paredes primária e secundária de dicotiledôneas e gramíneas (Poaceae)
*Adaptado de Scheller e Ulvskov, 2010
3.2.3 Pectina
As pectinas compõem um grupo de materiais poliméricos compostos de um esqueleto de ácido galacturônico contendo grupos carboxílicos esterificados com metanol. Possui regiões lineares e também altamente ramificadas com diversos açúcares, sendo que o grau de esterificação varia com a fonte da pectina (Mohnen, 2008; Yadav et al., 2009).
A pectina compõe a mais estruturada e complexa família de polissacarídeos estando presente principalmente na parede primária das células vegetais, assim como nas paredes das células em crescimento e se dividindo, lamela média e partes moles das plantas (Mohnen, 2008).
3.2.4 Lignina
A lignina é um composto formado majoritariamente a partir da polimerização de três unidades substituídas de fenil propano, sendo elas os alcoóis cumarílico, coniferílico e sinaptílico, que são produtos da transformação do aminoácido L-fenilalanina em uma via bioquímica de conversão que envolve mais de 11 enzimas (Hammel; Cullen, 2008; Ralph, 2004; Martinez et al., 2008; Ragauskas et al., 2014; Esposito; Antonietti, 2015).
A união das três unidades formadoras da lignina ocorre por meio da combinação dos radicais fenol mediante ação de peroxidases. A estrutura resultante é bastante heterogênea e possui como característica a presença de várias ligações
do tipo carbono-carbono e aril-éter que conferem à estrutura bastante resistência a ataques químicos e enzimáticos (Castro; Pereira Jr., 2010; Esposito; Antonietti, 2015).
3.2.5 Organização dos constituintes da parede celular
De forma geral as fibrilas de celulose ficam agrupadas e envoltas por uma monocamada de hemicelulose e estas ficam imersas em uma matriz de hemicelulose e lignina, que estão associadas entre si por meio de interações físicas e ligações covalentes, formando uma microfibrila celulósica (Carvalho et al., 2009).
Ao mesmo tempo em que as hemiceluloses impedem que as fibrilas de celulose colapsem entre si, permitem uma interação fraca entre elas, além de interagirem com proteínas e lignina, gerando uma estrutura em rede resistente e protegida, tornando-as refratárias à hidrólise (Buckeridge et al., 2010; Ogeda; Petri, 2010; Arola et al., 2013).
Além disso, a microfibrila celulósica é entremeada por uma rede de pectina, porém sem interação entre elas. Contudo, a pectina controla a porosidade da parede celular e parece sinalizar a presença de patógenos e insetos, dentre outras funções (Davison, 2013; Buckeridge, 2010) (Figura 3.1).
Figura 3.1: Representação esquemática da organização dos diferentes constituintes da parede celular secundária. Adaptado de Doherty et al., 2011.
3.3 Fontes de biomassa
O Brasil ocupa posição de destaque na produção agrícola mundial devido a fatores geográficos e climáticos, sendo possível a produção de uma gama variada
de culturas. Tamanha produção gera uma grande quantidade de resíduos agroindustriais ricos em compostos ligno-hemicelulósicos, uma promissora fonte de carboidratos, óleos e compostos fenólicos com aplicação na produção de combustíveis e outros produtos de valor agregado (Werpy et al., 2004; Paula et al., 2011). Dentre as culturas de maior relevância em termos de produção, destaca-se a cana-de-açúcar, com uma safra 2014/2015 de 634,8 milhões de toneladas moída, sendo o Estado de São Paulo o maior produtor nacional respondendo por 53,8% desse total (CONAB, 2015).
O processamento de cada tonelada de cana-de-açúcar gera aproximadamente 0,3 toneladas de bagaço com 50% de umidade, uma biomassa rica em polímeros (celulose, hemicelulose e lignina), onde a maior parte é queimada para cogeração de energia elétrica das usinas de açúcar e álcool assim como na indústria de papel (Hofsetz, 2012).
A palha da cana-de-açúcar, que corresponde por um terço de seu potencial energético, tem ganhado destaque como fonte de biomassa, já que possui basicamente os mesmos componentes do bagaço (Santos et al., 2012; Leal et al., 2013). Além disso, tem sido desenvolvidos e aperfeiçoados cultivares mais produtivos como a cana energia, rica em fibras e de altíssima produtividade em termos de biomassa (Carvalho-Neto et al., 2014; Matsuoka et al., 2014).
Apesar de variações em decorrência do cultivar analisado e do tipo de análise feita, a composição da parede celular da cana que basicamente compõe o bagaço é de aproximadamente 38–43 % de celulose, 25-32 % de hemicelulose, 17-24 % de lignina e 1,6-7,5 % de compostos solúveis em solventes orgânicos (Masarin et al., 2011; Souza, 2013). Essa proporção de polissacarídeos coloca o bagaço da cana entre as biomassas residuais da agroindústria mais ricas em hemicelulose. Além disso, cerca de 25,2% da hemicelulose do bagaço é composta de monossacarídeos de xilose (Brienzo et al., 2009), o que a torna uma interessante fonte desse monossacarídeo.
Dessa forma, o bagaço da cana-de-açúcar, que já foi considerado como resíduo da indústria sucroalcooleira, atualmente tem status de subproduto haja visto suas aplicações na cogeração de energia elétrica e térmica dentro das próprias usinas, além da produção do chamado etanol celulósico. De fato, a escolha das usinas de álcool entre utilização do bagaço na cogeração de energia e sua utilização
para a produção do etanol celulósico e outros produtos químicos depende do mercado (Hofsetz, 2012).
Atualmente, a opção pela queima do bagaço para produção de energia elétrica tem se mostrado mais vantajosa, tendo em vista ser um mercado com regras claras. No entanto, a situação pode mudar a medida que a tecnologia do etanol celulósico estiver completamente estabelecida e regras de incentivos forem adotadas para a viabilização dessa tecnologia, assim como a possibilidade de geração de biomoléculas com valor de mercado mais atrativo que a geração de energia (Hofsetz, 2012; Milanez et al., 2015).
3.4 Pré-tratamento
As características físico-químicas dos materiais lignocelulósicos dificultam o acesso de enzimas hidrolíticas e a consequente liberação dos monossacarídeos que a compõem. Dessa forma, visando desfazer a estrutura da lignina, assim como as regiões cristalinas da celulose, são utilizados pré-tratamentos da biomassa e que podem ser de natureza biológica, química, física ou uma combinação deles (Mosier, et al., 2005; Alvira et al., 2010).
Dentre os pré-tratamentos estudados o tratamento hidrotérmico (HT) vem ganhando bastante espaço (Rogalinsk, 2008). Nesse caso o processo se faz pelo uso de água a alta temperatura e pressão, aumentando a força iônica do meio e promovendo a ruptura das ligações da lignina com os carboidratos, assim como das ligações glicosídicas, especialmente as das hemiceluloses. O tratamento hidrotérmico tem um custo menor em relação a outros pré-tratamentos, como a hidrólise ácida, porque não necessita de equipamentos resistentes à corrosão e gera menos resíduos a serem neutralizados, além de também apresentar um bom rendimento na solubilização de xilanas (Liu; Wyman 2003).
A hidrólise térmica tem como objetivo principal solubilizar a hemicelulose tornando a celulose mais acessível à ação de enzimas, e evitar a formação de inibidores, o que acaba gerando uma fração sólida rica em celulose e lignina e uma fração líquida (licor) rica em oligossacarídeos provenientes da degradação da hemicelulose (Alvira et al., 2010). Dessa forma, o tratamento hidrotérmico permite a obtenção de um licor rico em xilo-oligômeros adequado para um processo de hidrólise utilizando uma endoxilanase e uma β-xilosidase até a obtenção do monossacarídeo xilose.
Contudo, mesmo no pré-tratamento hidrotérmico ainda são gerados compostos que inibem os processos fermentativos, devido à degradação não seletiva dos constituintes monoméricos da biomassa. Estes podem ser agrupados em três classes: (1)Ácidos orgânicos que incluem os ácidos acético, fórmico e levurínico; (2) derivados de furano, furfural e 5-hidroximetilfurfural; (3) compostos fenólicos (Chandel et al., 2011) (Figura 3.2).
Dentre as formas de lidar com a presença desses inibidores podem ser destacados os processos de detoxificação do licor que abrangem o uso de procedimentos químicos físicos e biológicos. Tais processos representam etapas a mais no tratamento desse material e consequentemente o aumento do custo final, além de promoverem a perda de açúcares do meio. O desenvolvimento de micro-organismos tolerantes a esses compostos inibitórios também tem se mostrado uma estratégia importante (Marton et al., 2006; Cavka, 2013; Silva et al., 2014).
Figura 3.2: Representação esquemática da formação de inibidores a partir do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica. Adaptado de Palmqvist e Hahn-Hagerdal, 2000.
3.5 Hidrólise enzimática da hemicelulose
Devido à composição e organização complexa da biomassa vegetal, a extração dos monossacarídeos não é um processo trivial, sendo necessário um conjunto de enzimas de ação sinérgica, que possibilitem a degradação tanto da celulose como das hemiceluloses e lignina.
A degradação da hemicelulose em seus respectivos constituintes monoméricos requer a utilização de diversas classes de hidrolases devido a sua composição variável (Figura 3.3). São necessárias principalmente hemicelulases como arabinofuranosidases, arabinases e glucoronidases que atuam desramificando a molécula de xilana, além de acetil-xilano esterases e feruloil esterases que rompem a porção ligada a lignina (Beg et al, 2001). Também é necessário a endo- -1,4-xilanase (endoxilanase) e a -1,4 xilosidase (-xilosidase), sendo que a primeira produz oligossacarídeos a partir da quebra da cadeia principal de xilose, enquanto que a segunda hidrolisa os oligossacarídeos produzindo o monossacarídeo (HOWARD et al., 2003; KNOB et al., 2010).
Figura 3.3: Representação das principais hemicelulases atuando sobre a molécula de xilano. (1) endoxilanase rompendo o polissacarídeo em unidades menores, formando oligossacarídeos (xilo-oligômeros) que ainda serão hidrolisados até a formação de xilobiose onde a enzima (6) β-xilosidase pode atuar para que seja liberado o monossacarídeo xilose. (2) α-L-arabinofuranosidases. (3) glucoronidases. (4) feruloil esterases. (5) acetil esterases. Adaptado de Chávez et al., 2006.
As hemicelulases endo-β-1,4-xilanase e β-1,4-xilosidase, além de serem fundamentais para liberação de xilose a partir de xilanas e hemicelulose, também possuem outras aplicações biotecnológicas já em uso, como na indústria de papel em processos de branqueamento da polpa de celulose. Também são utilizadas na indústria de alimentos em panificação, para aumento do volume de pães, biscoitos
6 Xilobiose Xilo-oligômero 2 1 3 4 5 β-D-xilopiranose
água sal, em processos de clarificação de sucos, melhorar a qualidade de cervejas por meio da solubilização de arabinoxilanos, diminuição da concentração de β-glucanos na produção de vinhos, e ainda, para processamento de rações melhorando sua digestibilidade (Juturu e Wu, 2010).
Há outros usos potenciais para hemicelulases, um dos que mais se destacam é a sacarificação de biomassas para utilização na produção do bioetanol, um processo no qual a pentose (C5) liberada é metabolizada por certos micro-organismos capazes de converter xilose em etanol por fermentação alcoólica (Collins et al., 2005; Knob et al., 2010).
Endo-β-1,4-xilanases (E.C 3.2.1.8), estão presentes em várias famílias de hidrolases glicosídicas de acordo com a classificação do banco CAZy (Henrissat B., 1991;1993 ), sendo que a família GH11 é uma das mais estudadas devido seu uso em vários processos industriais. As xilanases dessa família são caracterizadas por um domínio catalítico pequeno (~20 KDa), altos valores de pI e atuam pelo mecanismo de retenção da configuração do carbono anomérico (Dumon et al., 2012).
As β-xilosidases também são encontradas em uma grande variedade de famílias de hidrolases glicosídicas, sendo que a maioria delas opera via mecanismo de retenção, com exceção dos membros da família GH43 que operam via mecanismo de inversão, uma característica relativamente negligenciada, mas fundamental para a obtenção de xilose a partir da biomassa em altos rendimentos já que as xilosidases que atuam por inversão não mostram atividade de transglicosilação (Dumon et al., 2012; Song et al., 2012)
3.6 Enzimas multifuncionais
Na natureza são encontradas enzimas multifuncionais utilizadas por micro-organismos para a degradação eficiente de polissacarídeos, como os complexos multienzimáticos que estão presentes principalmente em bactérias do gênero Clostridium e Bacillus (Doi; Kosugi, 2004; Dyk et al., 2010; Jones et al., 2012).
Em relação a processos e em especial visando o desenvolvimento de enzimas para composição de um coquetel para hidrólise de biomassas vegetais, a utilização de enzimas com mais de um tipo de atividade catalítica tem sido apontado como uma estratégia promissora no sentido de diminuir a quantidade de enzimas
necessárias para a liberação de monossacarídeos da biomassa, além de apresentar atividade sinérgica na degradação de substratos complexos (Fan et al., 2009a).
Além disso, a construção de enzimas fusionadas artificialmente (quimeras enzimáticas) tem como objetivo alterar as características dos módulos parentais visando aumentar sua eficiência catalítica, assim como sua termoestabilidade, e ainda permitir o efeito de tunelamento pela proximidade dos centros catalíticos complementares, onde o produto da ação de uma enzima é o substrato da outra (Elleuche, 2015).
Estudos focando a engenharia de proteínas multifuncionais tem demonstrado que é possível obter ganho na atividade e termoestabilidade de uma enzima quimérica quando comparado a seus módulos separados (Xue et al. 2009; Adlakha et al., 2011; Diogo et al., 2015), o que tem sido atribuído a maior proximidade física das enzimas e a flexibilidade conformacional dada pelo linker que une as duas unidades (Xue et al. 2009).
A criação de enzimas multifuncionais in vitro é possível graças a técnicas de DNA recombinante. A associação de enzimas diferentes é feita pela ligação dos domínios utilizando-se um ou mais linkers de pequenas cadeias peptídicas por meio da utilização das técnicas de fusão “end-to-end” (Fan et al., 2009a).
3.7 Xilitol
A xilose proveniente da hidrólise da hemicelulose pode ser convertida em xilitol, um poliálcool de cinco carbonos e estrutura aberta, de massa molecular de 152,15g/mol e fórmula C5H12O5. O xilitol possui sabor doce e é obtido na forma de pó branco cristalino, mais higroscópico que a sacarose e menos que o sorbitol em elevada umidade relativa. Possui solubilidade em água a 20ºC de 63g/100g de solução, ponto de fusão variando de 92 a 96ºC, com ebulição a 216ºC e permanecendo estável até 120ºC (Hyvönen et al., 1982; Bar, 1991).
O poder adoçante do xilitol é praticamente o mesmo da sacarose e superior a outros polióis utilizados em alimentos, como o sorbitol e o manitol, mas apresenta valor calórico de apenas 2,4 cal/g enquanto que a sacarose possui 4,0cal/g (Granström et al., 2007a), o que claramente representa uma vantagem na sua utilização em produtos alimentícios de baixo valor calórico.
Além disso, outras características físico-químicas que tornam o xilitol interessante para a utilização em alimentos são o seu calor de solução endotérmico
de 34,8 cal/g, que proporciona a sensação de frescor na boca em contato com a saliva, e ainda, a ausência de grupos cetônicos ou aldeídicos em sua molécula, impedindo que participe de reações de escurecimento não enzimático com aminoácidos, denominadas Reações de Maillard (Pepper; Olinger, 1988; Hyvönen et al., 1982).
O xilitol é considerado uma substância do tipo GRAS (Generally Recognized as Safe) pela FDA (Food and Drug Administration, EUA), e desde 1984 pela European Economic Community, e é utilizado em alguns produtos como gomas de mascar, balas, confeitos, compotas, caramelos, chocolates, geleias, pudins entre outras. Além disso, também é utilizado em artigos de higiene bucal com potencial de aplicação em muitos outros produtos (Mussatto; Roberto, 2007). O principal fator de impedimento para expansão da utilização do xilitol tem sido o preço, visto que sua produção é mais onerosa que a da sacarose ou sorbitol (Nigam; Singh, 1995; Parajó, 1998). Contudo, o uso do xilitol não se resume a alimentos de baixo valor calórico. Desde que sua produção em escala industrial teve início, várias pesquisas têm demonstrado seus efeitos benéficos.
O xilitol não é completamente metabolizado por algumas bactérias, e por isso apresenta atividade antimicrobiana em certos casos, como tem sido amplamente relatado na prevenção e combate de cáries (Mäkinem, 2011), mas também na prevenção da otite média aguda e tratamento de infecções respiratórias (Kontiokari et al.,1995; Urari et al., 1998; Azarpazhooh et al., 2011)
Considerando-se que o Diabetes mellitus é uma patologia do metabolismo de glicídios, onde o controle da glicemia se encontra comprometido devido a não absorção da glicose disponível no sangue, o uso do xilitol em alimentos para pessoas diabéticas se mostra extremamente útil, posto que seu metabolismo é independente da insulina. (Yilikari, 1979; Olinger, 2000; Manz et al., 1973; Pepper, Olinger, 1988; Islam, 2011).
Também é atribuída ao xilitol a capacidade de atuar no tratamento e prevenção da osteoporose, estimulando a absorção de cálcio pelo intestino assim como a captação desse mineral pelos ossos (Mattila et al., 1999; Sato et al. 2011). Além disso, o xilitol também tem uso como matéria-prima para outros açúcares raros como L-lixose, L-xilose, L-arabinose e L-xilulose, que servem como ponto de partida para diversos outros tipos de moléculas ramificadas com perspectivas para drogas antivirais e outras aplicações médicas, assim como na indústria química, sendo
encontrado na lista dos 12 produtos de maior valor agregado obtidos a partir de biomassa (Granström et al., 2007b; Werpy et al., 2004; Isikgor; Becer, 2015).
Presente em leveduras, algas, liquens, cogumelos, e em pequenas quantidades em algumas frutas e vegetais, o xilitol é também um intermediário natural no metabolismo mamíferos no ciclo do ácido urônico. Apesar de amplamente distribuído naturalmente, a extração do xilitol das fontes naturais é inviável economicamente devido ao baixo rendimento do processo de extração, menor que 0,9% num procedimento do tipo sólido-líquido (Yilikari, 1979; Hyvönen et al., 1982; Pepper; Olinger, 1988).
A produção química do xilitol compreende a hidrogenação catalítica de xilose pura em condições de altas temperaturas e pressão (Mussato; Roberto, 2002). A primeira etapa do processo químico envolve a hidrólise ácida de materiais ricos em xilano para obtenção da xilose em grandes quantidades. No entanto, a xilose resultante precisa ser purificada devido à presença de outros açúcares e substâncias formados nesse tratamento e que podem interferir na redução da xilose a xilitol. A xilose purificada, é reduzida a xilitol por meio de um processo de hidrogenação sob condições de temperatura que podem variar de 80 a 140 °C e pressões de 31 a 50 atm na presença de um catalisador químico (liga de níquel e óxido de alumínio). Posteriormente são realizadas etapas de purificação do xilitol dos subprodutos resultantes da reação de hidrogenação e, finalmente, sua cristalização (Jaffe et al.,1974; Melaja; Hämäläinen, 1977; Hyvönen et al., 1982).
As várias etapas de purificação somadas às condições de altas temperaturas e pressão, fazem a via química de produção do xilitol um processo até 10 vezes mais caro que o da sacarose ou do sorbitol, com um rendimento de 50 a 60% da xilose presente na biomassa utilizada inicialmente (Nigam & Singh, 1995; Parajó, 1998). Dessa forma, nos últimos anos muitos estudos tem sido realizados na tentativa de desenvolver um processo por via biológica que seja menos dispendioso utilizando micro-organismos, assim como enzimas, para sua produção em escala industrial (Silva e Chandel, 2012).
Apesar de não terem sido encontrados estudos sobre uma avaliação econômica da produção biotecnológica do xilitol assim como comparações entre os custos da via química e biotecnológica, podem ser apontadas como vantagens em utilizar uma via biotecnológica a maior especificidade na conversão dos substratos nos produtos de interesse aumentando sua concentração e reduzindo a formação de
substâncias indesejáveis, consequentemente facilitando as etapas de purificação. Além disso, o cultivo de micro-organismos pode ser realizado em condições bem mais brandas de temperatura e pressão sem a necessidade de catalisadores metálicos, o que também representa maior economia no processo (Albuquerque et al., 2014).
A produção biológica do xilitol está condicionada a capacidade dos micro-organismos em expressar a enzima xilose redutase NAD(P)H dependente, assim como na manutenção de um balanço favorável desses cofatores no citossol (Figura 3.4) (Roseiro et al. 1991).
Figura 3.4: Via metóbilica da D-xilose em micro-organismos. Adaptado de Albuquerque et al.,2014.
No metabolismo microbiano a D-xilose é reduzida a xilitol por ação da xilose redutase NAD(P)H dependente. O xilitol então pode ser simplesmente excretado, ou ainda, oxidado pela enzima xilitol desidrogenase NAD(P)+ dependente, formando D-xilulose, que então é convertida a xilulose-5-fosfato, composto intermediário da Via das Pentoses-Fosfato (Figura 3.4). No entanto a
Xilose Xilose Redutase (XR) Xilitol Xilulose Xilulose-5P Etanol Xilose isomerase (XI) Xilitol Desidrogenase (XDH)
Via das Pentoses-Fosfato
Xilulose quinase NAD(P)H NAD(P)+ NAD(P)+ NAD(P)H Glicólise
maioria das bactérias dispõem da enzima xilose isomerase que converte a D-xilose a D-xilulose em apenas uma etapa.
Os micro-organismos que mais tem se destacado na produção de xilitol são as leveduras, especialmente dos gêneros Candida e Pichia (Prakasham et al. 2009; Chandel et al. 2011). Contudo, fungos filamentosos e algumas bactérias também possuem o aparato enzimático necessário à conversão, entretanto não tem despertado o interesse dos pesquisadores devido à baixa produtividade de xilitol (Winkelhausen; Kuzmanova, 1998; Aguiar, 1999).
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Locais de desenvolvimento do projeto
O projeto de pesquisa foi desenvolvido no Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE) que integra o Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM – Campinas, SP), sob coorientação do pesquisador Dr. Roberto Ruller, em parceria com o Laboratório de Bioquímica de Alimentos do Departamento de Ciência de Alimentos na Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA)/ Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) sob orientação da Prof. Dra. Hélia Harumi Sato.
4.2. Obtenção do licor de xilo-oligossacarídeos do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado
O licor de xilo-oligossacarídeos utilizado neste trabalho, originado do tratamento hidrotérmico do bagaço da cana-de-açúcar, foi gentilmente cedido pela pesquisadora Dra. Sarita Cândido Rabelo, do grupo de estudos de pré-tratamentos físico-químicos do CTBE (Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol), já caracterizado quanto a sua composição em termo de inibidores e quantidades de xilo-oligômeros.
Para a produção do licor, o bagaço de cana-de-açúcar foi reduzido a fibras e lavado com água para a remoção da sacarose remanescente, seco, e então submetido ao pré-tratamento hidrotérmico com água na proporção de 1:10 a temperatura 170 °C por 90 min em reator de aço. Após o pré-tratamento foram separadas as fases sólida (celulose e lignina) e líquida (licor contendo xilo-oligossacarídeos).
. Para determinação total dos açúcares monoméricos o licor de xilo-oligossacarídeos foi completamente hidrolisado com ácido. Essa pós-hidrólise consistiu em tratar o licor com 4% de ácido sulfúrico e autoclavar a 121 °C por 1 hora. A quantidade oligossacarídeos presente no licor do pré-tratamento hidrotérmico foi então calculada pela diferença do conteúdo de monossacarídeos do licor do pré-tratamento hidrotérmico e do completamente hidrolisado com ácido (Santucci et al., 2015).
4.3. Preparação da biblioteca de Bacillus sp.
A biblioteca de Bacillus sp. pertencente ao Laboratório de Bioquímica de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Unicamp, contem 104 linhagens termotolerantes de Bacillus sp. isolados de uma planta piloto de processamento de sucos, e que se encontram armazenados em tubos de meio Agar Nutriente inclinado coberto por vaselina, e mantidos a temperatura entre 4 e 8 °C.
Para a reativação dessa biblioteca cada uma das linhagens foi estriada em placa de meio LB sólido (1 % triptona, 1 % NaCl, 0,5 % extrato de levedura, 1,5 % agar) e incubadas a 37 °C por 16 horas. As colônias isoladas das placas de LB foram estriadas em tubos de meio Ágar Nutriente sólido inclinados (0,1 % extrato de carne, 0,2 % extrato de levedura, 0,5 % peptona , 0,5 % NaCl, 2 % Ágar) e incubadas por 16 horas a 37 °C, sendo então cobertas por vaselina líquida esterilizada e armazenada a 4 °C. A partir desse repique da biblioteca foi feito o cultivo de cada linhagem em meio LB líquido e montada duas placas de trabalho (placasmãe) de 96 poços. Os microorganismos nas placas foram conservados a -80 °C em meio LB com 20 % de glicerol.
A identificação adotada para cada linhagem desta biblioteca foi a sigla BH seguida por um número em ordem crescente de 01 a 106, sendo que os BH31 e BH60 não estão mais na biblioteca, pois não cresceram durante o procedimento de reativação.
4.4. Meios de cultivo e seleção de linhagens de Bacillus sp.
A seleção das linhagens potencialmente produtoras de hemicelulases foi realizada mediante cultivo em placas de petri contendo meio sólido mínimo de sais Bushnell Haas DifcoTM (sulfato de magnésio 0,2 g/L, cloreto de cálcio 0,02 g/L, fosfato de potássio monobásico 1,0 g/L, fosfato de amônio dibásico 1,0 g/L, nitrato de potássio 1,0 g/L, cloreto férrico 0,05 g/L) suplementado com 2 % (m/v) de extrato de levedura e diferentes proporções (5 a 30 %) de licor de xilo-oligossacarídeos proveniente do pré-tratamento hidrotérmico do bagaço da cana-de-açúcar. O pH final antes da autoclavagem foi ajustado para 7,0 com NaOH 1M.
Com o auxílio de carimbo transferidor de colônias as diferentes linhagens foram inoculadas e mantidas a 30 °C por 18 horas, para que seu crescimento fosse lento e as colônias não se misturassem. Em cada placa também foram inoculados 5 espécies ATCC (American Type Culture Collection) de Bacillus sp conhecidos, entre
eles B. cereus ATCC 14579, B. licheniformis ATCC 14580, B. megaterium ATCC 14581, B. pumilus ATCC 7061 e B. subtilis ATCC 168 e também o Paenibacillus polymyxa ATCC 842. Após o tempo de crescimento a placa foi lavada com água destilada para desprender as colônias que haviam crescido, e então adicionada solução 4 mg/mL de vermelho congo (Congo Red Sigma®) até cobrir toda a superfície da placa. Após tempo de 30 min o corante foi retirado e adicionou-se solução 1 M de NaCl deixando por mais 30 minutos. Foram feitas até três lavagens com a solução 1 M de NaCl para visualização dos halos claros de degradação formados ao redor do local onde as colônias haviam crescido, que são o indicativo da atividade de degradação dos poli e oligossacarídeos presentes no meio (Teather e Wood, 1982).
Para a seleção dos micro-organismos foi utilizado como parâmetro o índice enzimático, que é a razão entre o diâmetro do halo formado pela degradação dos polissacarídeos e o diâmetro da colônia aferidos mediante uso de paquímetro (Hankin; Anagnostakis, 1975; Hankin; Anagnostakis 1977).
4.5. Extração de DNA genômico das linhagens selecionadas
O DNA genômico das linhagens de Bacillus sp. foram extraídos como descritos por Cheng e Jiang (2006) e Neumann (1992) com adaptações.
As linhagens selecionadas foram cultivadas por 16 horas em meio LB líquido a 37 °C, 250 rpm. Alíquotas de 1,5 mL da cultura foram centrifugadas obtendo-se um sedimentado de células que foi ressuspendido em 1 mL de tampão STE (90 mM NaCl, 9 mM Tris HCl pH 8,0, 0,9 mM EDTA pH8,0) contendo 2% de SDS (dodecil sulfato de sódio), 0,84 mg/mL de proteinase K, 0,5 mg/mL de lisozima e 0,2 mg/mL de RNAse. As amostras foram incubadas a 50 °C por 45 minutos e após esse período foi adicionado fenol na proporção 1:1 (equilibrado 10 mM Tris HCl, pH 8.0, with 1 mM EDTA até pH7,9) sendo então centrifugadas a 16000 x g por 5 minutos.
Aproximadamente 400 µL da fase superior foram transferidas para outro tubo e em seguida foi adicionado 3X o volume de etanol absoluto gelado e 160 µL de acetato de sódio 3 M. As amostras foram incubadas a -80 °C por 20 minutos e após esse período centrifugadas por 10 minutos a 16000 x g. O sobrenadante foi descartado e nas amostras foram adicionados 500 µL de etanol 70 % sem
ressuspender. Novamente as amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 16000 x g e o sobrenadante descartado.
Após evaporação do etanol o DNA foi ressuspendido em 100 µL de tampão TE (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA pH8,0). A quantificação do DNA genômico extraído foi feito por espectroscopia a absorbância de 280 nm. A qualidade do DNA obtido foi avaliada segundo a razão das absorbâncias A260/A280, assim como por eletroforese em gel de agarose 1 % corado com brometo de etídio.
4.6. Amplificação da sequência do gene RNAr 16S
O DNA genômico, extraído das linhagens de Bacillus sp. selecionadas de acordo com o screening, foi utilizado como molde para a amplificação via reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) das sequências do gene RNAr 16S. Para o PCR foram utilizados oligonucleotídeos que flanqueavam as sequências do gene RNAr 16S de acordo com Lane, 1991, sendo o primer Foward 5’-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’ e o Reverse 5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’ em uma reação padrão feita com kit Taq Phusion (Thermo Scientific) conforme instruções do fabricante, sendo utilizada a temperatura de 55 ºC para o anelamento dos primers.
4.7. Amplificação de sequências de endoxilanases e β-xilosidases As reações de amplificação dos genes de endoxilanases foram realizadas com oligonucleotídeos desenhados para sequências conservadas de endoxilanases
de GH11, sendo o primer Foward 5’ - TATATAGCTAGCAGCACAGACTACTGGCAAAA-3’ e o primer Reverse
5’-TATATAGGATCCTTACCACACTGTTACGTTAG-3’ com temperatura de
anelamento de 53 °C. Ambos os primers contem sítios de restrição para as enzimas NheI e BamHI (sublinhado) que facilitam as etapas de clonagem.
Para a amplificação dos genes das β-xilosidases também foram desenhados oligonucleotídeos para sequências conservadas contendo sítios de
restrição para NheI e BamHI sendo o Foward 5’-TATAGCTAGCATGAAGATTACCAATCCC-3’ e o Reverse
5’- TATAGGATCCTGCAAATTATTTTT- 3’. A reação de PCR foi realizada com a temperatura de anelamento fixa a 50 °C.
Também foram desenhados primers para amplificação da sequência de uma β-xilosidase GH43 de Bacillus licheniformis ATCC 14580 (Foward
5’-ATATATGCTAGCATGAGCGGTGAACACACATA-3’ e Reverse 5’-
TATATAGAATTCTTAATATGCAATATAGCGGA-3’), mas agora utilizando um sítio de restrição EcoRI no lugar de BamHI já que a sequência putativa dessa β-xilosidase continha sítio para essa enzima de restrição. A temperatura de anelamento usado no PCR foi de 53 °C.
4.8. Sequenciamento e análise
As reações de sequenciamento foram realizadas com o reagente Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) e analisadas no sequenciador automático DNA ABI PRISM 377 Genetic Analyser (Applied Biosystems).
Para sequenciamento completo de fragmentos do gene de RNAr 16S foi utilizado o primer interno 907r (5’ CCGTCAATTCMTTTRAGTT 3’) (LANE, 1991). As sequências obtidas foram analisadas e os contigs montados no programa Geneious 6.1.5 (Biomatters) e comparadas através da ferramenta BLAST N (disponível em http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). As sequências foram alinhadas usando o programa CLUSTAL X (Thompson et al., 1997) e a análise filogenética foi construída com o auxílio do programa MEGA 6.0 (Tamura et. al,. 2007) usando o algoritmo do vizinho mais próximo (Saitou e Nei, 1987), e o modelo de substituição de nucleotídeo Kimura 2-P (Kimura, 1980).
As sequências de nucleotídeos para as enzimas de interesse foram traduzidas usando a ferramenta ExpASy Translate Tool (disponível em http://web.expasy.org/translate/) e valores de massa molecular e coeficiente de extinção molar estimados com o uso da ferramenta ExPASy ProtParam Tool (disponível em http://web.expasy.org/protparam/).
4.9. Construção da enzima bifuncional (quimera)
Para a criação da enzima quimérica foi utilizada uma variação da técnica fusão end-to-end descrita por Fan et al., (2009) e Heckman e Pease, (2007). Tal método tem mostrado grande potencial para o estudo de enzimas envolvidas na degradação de materiais lignocelulósicos, assim como para sua eficiente hidrólise
