Triagem de Bacillus sp capazes de crescer em meio licor de xilo-oligossacarídeos

O licor de xilo-oligossacarídeos, proveniente do pré-tratamento hidrotérmico do bagaço de cana-de-açúcar, também denominado licor de C5, representa uma fonte notável de açúcares de 5 carbonos. Após o pré-tratamento, a maioria dos açúcares do licor ainda se encontram polimerizados na forma de oligossacarídeos com diferentes tamanhos e ramificações. Além disso, o licor de xilo-oligossacarídeos contem ainda vários outros produtos de degradação de componentes do bagaço, que inibem o crescimento de micro-organismos e a ação de enzimas. São eles vários tipos de ácidos, além de furfural e hidroximetilfurfural (HMF), provenientes da desidratação de monossacarídeos em meio ácido (Alvira et al., 2010).

A Tabela 5.1 mostra a composição do licor de xilo-oligossacarídeos (licor de pré-tratamento hidrotérmico) utilizado neste trabalho nas etapas de seleção de micro-organismos. São apresentados a quantidade de açúcares monoméricos, ácidos, furtural e hidroximetilfurfural no licor utilizado para seleção. Para inferir a quantidade de xilose na forma xilo-oligossacarídeos no licor, é apresentada a composição desse material de partida logo após o pré-tratamento hidrotérmico do bagaço (licor de xilo-oligossacarídeos não hidrolisado) e também a composição do licor após a sua completa hidrólise com ácido, o que permite fazer o balanço de massa do material. Desse modo, fazendo a subtração da quantidade de xilose do licor completamente hidrolisado com ácido da xilose do licor não hidrolisado, foi estimada a quantidade de xilo-oligossacarídeos presente no licor (item 4.2).

Observou-se que o licor apresenta pequenas quantidades iniciais de açúcares monoméricos como arabinose (0,6431 g/L), glicose (0,2569 g/L) e xilose (3,7220 g/L). No entanto, as quantidades de açúcares monoméricos aumentam após hidrólise ácida, especialmente em relação a xilose (12,7860 g/L). Portanto, há pelo menos 9,064 g/L de xilose polimerizada em oligossacarídeos no licor não hidrolisado com ácido.

É importante notar que a hidrólise ácida também aumenta muito a quantidade de inibidores no licor, como no caso dos ácidos fórmico e acético, e de

furfural e hidroximetilfurfural, o que corrobora a necessidade de tratamentos menos agressivos como enzimático para a obtenção de xilose.

Tabela 5.1: Composição do licor de tratamento hidrotérmico antes e após hidrólise ácida. Componentes Licor de Xilo-oligossacarídeos não hidrolisado Licor de Xilo-oligossacarídeos completamente hidrolisado com ácido Glicose (g/L) 0,2569 1,5800 Xilose (g/L) 3,7220 12,7860 Arabinose (g/L) 0,6431 0,8185

Galactose (g/L) n.a* n.a*

Ácido Fórmico (g/L) 0,0993 0,1945

Ácido Acético (g/L) 0,2945 1,5745

Furfural (g/L) 0,3039 0,7860

HMF (g/L) 0,0179 0,0356

*Não determinado

Os micro-organismos foram selecionados com base no crescimento na presença de diferentes concentrações de licor de xilo-oligossacarídeos não hidrolisado, ou seja, mostraram-se capazes tanto de consumir açúcares presentes no licor quanto de tolerar os inibidores. Cabe ressaltar que todos os testes de seleção de micro-organismos e hidrólise enzimática deste trabalho foram realizados com o licor proveniente diretamente do pré-tratamento hidrotérmico sem a etapa de hidrólise com ácido.

Conforme descrito nos itens 4.3 e 4.4 a biblioteca contendo 104 isolados de Bacillus sp. e também outras 6 espécies conhecidas foram reativadas e mantidas em placas deep well como estoque, facilitando assim o manuseio para a inoculação com o carimbo transferidor de colônias.

Os primeiros testes de crescimento em meios contendo proporções crescentes de licor não hidrolisado com ácido demonstraram que nas concentrações mais baixas de 5 e 10 % quase toda a biblioteca crescia (resultados não mostrados), o que não favorecia uma seleção eficiente. Já em meio contendo 20 % de licor 15

linhagens formaram colônias, sendo que dentre elas apenas três (BH27, BH93 e BH104) também cresceram em meio com 30 % de licor (Figura 5.1).

Também foram feitos testes onde o meio de cultura contendo 20 % de licor foi preparado sem corrigir inicial (pH 5,6), mas somente o BH62 cresceu discretamente nessa condição, formando halo bastante restrito.

Figura 5.1: Cultivo da biblioteca de Bacillus sp. em meio contendo 20 % (A) e 30 % (B) de licor de xilo-oligossacarídeos não hidrolisado provenientes do bagaço de cana-de-açúcar.

Dessa forma, a placa com meio de cultura contendo 20 % de licor ajustada para pH 7,0 foi corada com vermelho congo após o cultivo das linhagens da biblioteca, o que permitiu a visualização das colônias formadoras de halo (Figura 5.2) e a seleção de 15 micro-organismos consumidores de xilo-oligossacarídeos (Tabela 5.2).

Os 15 micro-organismos selecionados foram cultivados em grupos de 4 com maior espaçamento entre os pontos de inoculação para melhor determinação do diâmetro das colônias e dos halos formados, permitindo o cálculo do índice enzimático que foi utilizado para a escolha das linhagens que apresentaram melhor capacidade de hidrólise de xilo-oligossacarídeos.

Com os micro-organismos selecionados (Tabela 5.2) foram realizadas as etapas seguintes de identificação, clonagem dos genes e expressão heteróloga de enzimas.

Figura 5.2: Triagem da biblioteca de Bacillus sp. termotolerantes em meio contendo licor de xilo-oligossacarídeos após coloração com vermelho congo. Áreas mais claras ao redor dos pontos de inoculação evidenciam atividade de xilanases. Biblioteca de Bacillus sp em ordem de numeração crescente (BH1 ao BH106), de cima para baixo da esquerda para a direita, mais seis espécies identificadas (B. cereus ATCC 14579, B. licheniformis ATCC 14580, B.

megaterium ATCC 14581, P. polymyxa ATCC 842, B. subtilis ATCC 168 e B. pumilus ATCC

7061).

A visualização de halos de degradação é uma técnica que vem sendo empregada para a rápida seleção de micro-organismos capazes de consumir substratos específicos. Concomitante a essa técnica, o índice enzimático (razão entre o diâmetro da colônia e o diâmetro do halo de degradação formado) é um parâmetro semi-quantitativo utilizado para a comparação da atividade enzimática entre variedades de micro-organismos dentro da mesma espécie (Hankin; Anagnostakis, 1975; Teather; Wood, 1982; Kausar et al., 2010 Goldbeck et al., 2012).

Dentre os exemplares de Bacillus ATCC que foram testados quanto ao crescimento no meio suplementado com licor junto com as linhagens da biblioteca, apenas o B. pumilus ATCC 7061 apresentou formação de halo com um índice enzimático de 3,0. Dessa forma, somente os micro-organismos que apresentaram um índice acima desse valor foram escolhidos para as etapas de extração do DNA genômico (BH02, BH24, BH26, BH27, BH35) com duas exceções. O BH62 foi selecionado por ser o único a crescer e formar halo em meio ácido, e o BH93 que apresentou crescimento em maior concentração de licor (30%).

Tabela 5.2: Micro-organismos selecionados para cultivo em meio contendo 20% de licor de xilo-oligossacarídeos e medida do diâmetro (mm) da colônia e do halo (mm) de degradação de xilo-oligossacarídeos formado após coloração com vermelho congo. Em destaque e marcados com (*) estão os micro- organismos selecionados para as etapas de clonagem de endoxilanases e β- xilosidases.

Bacillus Colônia Halo

hidrólis

hidr

I.E. Bacillus Colônia Halo I.E.

*BH02 0,4 1,2 3,0 BH87 0,7 1,8 2,5 *BH24 0,4 1,4 3,5 BH88 0,6 1,6 2,7 *BH26 0,3 1,4 4,7 BH90 0,5 1,3 2,6 *BH27 0,6 2,0 3,3 BH92 0,4 1,2 3,0 *BH35 0,4 1,3 3,2 *BH93 0,8 1,1 1,4 BH41 0,5 1,3 2,6 BH104 0,6 1,6 2,7 BH56 0,6 1,6 2,7 B. pumilus _{0,5 1,5 3,0} *BH62 0,6 1,3 2,2

I.E. = Índice enzimático = Dhidrólise/Dcolônia

É importante salientar que dentre os 15 micro-organismos escolhidos todos demonstraram a capacidade de sobreviver, crescer e produzir hemicelulases atuantes nos polissacarídeos presentes no licor, mesmo na presença de inibidores (HMF, ácido acético e furfural).

5.2. Amplificação da sequência do gene RNAr 16S, sequenciamento e