UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Química
JULIA HELENA BORMIO NUNES
COMPLEXOS DE Ag(I) E Cu(II) COM SULFONAMIDAS: CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E ESTUDOS DE ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
CAMPINAS 2015
JULIA HELENA BORMIO NUNES
COMPLEXOS DE Ag(I) E Cu(II) COM SULFONAMIDAS: CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E ESTUDOS DE ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
ORIENTADOR: PROF. DR. PEDRO PAULO CORBI
Orientador: Prof. Dr. Pedro Paulo Corbi
__________________________________ ASSINATURA DO ORIENTADOR
CAMPINAS 2015
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRA EM QUÍMICA NA ÁREA DE QUÍMICA INORGÂNICA.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA JULIA HELENA BORMIO NUNES, ORIENTADA PELO PROF. DR. PEDRO PAULO CORBI.
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação à minha família, meus pais Carlos Angelo
Nunes e Cristina Bormio Nunes, e meu irmão Vitor Henrique Bormio
Nunes, por todo apoio e carinho durante minha caminhada. Em segundo
lugar, dedico ao meu melhor amigo Rafael Michielin De Santi, pela
companhia no meu dia-a-dia e ao longo de todo meu trabalho, pelo
apoio, paciência e companheirismo em todos os momentos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por todas as oportunidades que
me foram dadas e pela minha saúde, condição imprescindível para
seguir em frente. Em segundo lugar, agradeço ao meu anjo da guarda,
por seu apoio e presença em todas as horas.
Agradeço também à minha família, meu pai Carlos, minha mãe
Cristina e meu irmão Vitor, por todo amor, incentivo e apoio
incondicionais. Ao Rafael, meu melhor amigo e companheiro de todas
as horas, nas alegrias e nas dificuldades. À minha avó Temes, que
sempre me ajudou e esteve presente desde o momento em que
ingressei na Unicamp e me mudei para Campinas. À Lily, minha
cachorrinha fofa e companheira, que esteve presente no colinho durante
boa parte da redação deste trabalho.
À Unicamp, lugar onde cresci e amadureci muito durante os
últimos seis anos, onde conheci pessoas excepcionais e fiz amizades
para toda a vida. A todos meus amigos, obrigada pelo apoio e amizade.
Ao meu orientador prof. Pedro, pela oportunidade de trabalhar em
seu grupo e por todo aprendizado e amizade durante esses três anos de
mestrado e iniciação científica. Ao Raphael Enoque, meu tutor durante
minha iniciação científica, obrigada pela amizade e auxílio no trabalho,
você fez muita falta nesse último semestre. Aos colegas e ex-colegas do
LQBM, Camilla, Raphael, Fernando, Douglas, Nina, Marcos e Ana. A
todo pessoal do LQC e LNNanoMol, pela companhia, pelas conversas,
risadas, jogos e cooperação no dia-a-dia. À Cíntia, nossa técnica, pela
ajuda na organização do laboratório e por sempre velar pela nossa
segurança. Ao Instituto de Química, por fornecer todo parque
instrumental e infraestrutura para que esse trabalho fosse possível.
Aos colaboradores Alexandre Cuin, pela resolução das estruturas
por raios X de pó, e Rogério Lustri, pelos ensaios de atividade
antibacteriana. Muito obrigada pela paciência, atenção e auxílio no
trabalho.
Por fim, a todos que foram importantes em minha vida, aos que
direta ou indiretamente fizeram parte de minha formação, o meu muito
obrigado.
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de
água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.”
RESUMO
COMPLEXOS DE Ag(I) E Cu(II) COM SULFONAMIDAS: CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E ESTUDOS DE ATIVIDADE ANTIBACTERIANA. Neste trabalho são descritas as sínteses dos complexos de prata(I) com os ligantes sulfatiazol (AgC9H8N3O2S2, Ag-SFT) e sulfametoxazol (AgC10H10N3O3S, Ag-SFM), assim como
a de um novo complexo de cobre(II) com os ligantes sulfatiazol e 2,2’-bipiridina (CuC28H26N8O5S4, [Cu(SFT)2(bipy)]·H2O). Os complexos de prata(I) foram
preparados a partir de soluções aquosas dos ligantes e de nitrato de prata, em meio alcalino, enquanto que o complexo de cobre(II) foi preparado a partir de uma solução metanólica de nitrato de cobre e bipiridina e de uma solução alcalina do ligante SFT em metanol. Os resultados de análise elementar sugerem a proporção 1:1 (metal/ligante) para os dois complexos de prata(I). A análise elementar e a espectrometria de emissão óptica por plasma indutivamente sugerem a proporção 2:1:1 (SFT/cobre/bipy) para o complexo de cobre(II). Técnicas espectroscópicas como RMN de 1H, 13C e de 15N e espectroscopia no infravermelho evidenciam coordenação das sulfonamidas aos íons Ag(I) e Cu(II) pelo átomo de nitrogênio do grupo SO2-N. As estruturas cristalinas dos complexos Ag-SFT e [Cu(SFT)2(bipy)]
foram resolvidas por difração de raios X, utilizando o método do pó. No complexo Ag-SFT há a formação de uma estrutura dimérica com o ligante em ponte entre dois íons prata(I), com a participação do nitrogênio do anel heterocíclico tiazol. No complexo [Cu(SFT)2(bipy)] o sulfatiazol se coordena ao cobre de forma bidentada,
pelos nitrogênios do grupo SO2-N e do tiazol. Os dois ligantes SFT juntamente com
a bipiridina formam um complexo octaédrico distorcido. Estudos de atividade antibacteriana mostraram atividade dos complexos Ag-SFT e Ag-SFM sobre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, com valores de MIC (concentração inibitória mínima) menores ou iguais a 0,050 mmol L-1, atividade semelhante à da sulfadiazina de prata. O complexo [Cu(SFT)2(bipy)] não apresentou atividade sobre
Staphylococcus aureus (bactéria Gram-positiva); entretanto, os valores de MIC para
as bactérias Gram-negativas variaram de 0,10 a 0,84 mmol L-1. Tanto os complexos de prata(I) quanto o complexo de cobre(II) foram mais ativos que seus sais precursores. Estudos de atividade antioxidante para o complexo de cobre(II) mostraram que ele é capaz de reduzir o radical catiônico ABTS•+ em 13% e 20%, considerando porcentagens molares do complexo de 10% e 20%, respectivamente.
O complexo de cobre não foi capaz de reduzir o radical DPPH• nas condições experimentais testadas.
ABSTRACT
Ag(I) AND Cu(II) COMPLEXES WITH SULFONAMIDES: STRUCTURAL CHARACTERIZATION AND ANTIBACTERIAL ASSAYS. The present work describes the synthesis and spectroscopic characterization of two silver(I) complexes with the ligands sulfathiazole (AgC9H8N3O2S2, Ag-SFT) and sulfamethoxazole
(AgC10H10N3O3S, Ag-SFM) and a novel copper(II) complex with sulfathiazole and
2,2'-bipyridine (CuC28H26N8O5S4, Cu[(SFT)2(bipy)]·H2O). The silver(I) complexes
were prepared from aqueous solutions of the ligands and silver nitrate in an alkaline medium, whereas the copper(II) complex was prepared from a methanolic solution of copper nitrate and bipyridine, and an alkaline solution of the SFT ligand in methanol. Elemental analysis results indicate a 1:1 (metal/ligand) ratio for the two silver(I) complexes. Elemental analysis and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy suggest a 2:1:1 (SFT/copper/bipy) ratio for the copper(II) complex. Spectroscopic techniques such as 1H, 13C and 15N NMR and infrared spectroscopy indicate the coordination of the sulfonamides to Ag(I) and Cu(II) ions by the nitrogen atom of the SO2-N group. Crystal structures of the complexes Ag-SFT and
[Cu(SFT)2(bipy)] were solved by powder X-ray diffraction. In the Ag-SFT complex the
ligand is bridging two silver(I) ions in a dimeric structure, with the participation of the nitrogen atom of the thiazole heterocycle. In the [Cu(SFT)2(bipy)] complex,
sulfathiazole has a bidentate coordination to copper through the nitrogens of SO2-N
and thiazole groups. Both SFT ligands and bypiridine form a distorted octahedral geometry around the Cu(II) center. Antibacterial studies have shown antibacterial activity of Ag-SFT and Ag-SFM complexes over Gram positive and Gram negative bacteria, with MIC (minimum inhibitory concentration) values less or equal to 0.050 mmol L-1. This activity is similar to that of silver-sulfadiazine. The [Cu(SFT)2(bipy)]
complex did not show activity against Gram positive bacteria Staphylococcus aureus. For Gram negative bacteria MIC values are in the range 0.10-0.84 mmol L-1. Both silver(I) and copper(II) complexes were more active than their precursors. Antioxidant studies of the copper(II) complex showed that it is capable of reducing the radical cation ABTS•+ in 13% and 20%, considering a complex molar percentage of 10% and 20%, respectively. The copper complex was not able to reduce DPPH• radical in the considered conditions.
Abreviaturas, acrônimos e símbolos
Abs – absorbância
ABTS – 2,2'-azino-bis-(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) Ag-SFD – sulfadiazina de prata
Ag-SFM – complexo de prata com sulfametoxazol Ag-SFT – complexo de prata com sulfatiazol ATCC − American Type Culture Collection ATP – trifosfato de adenosina
Bactrim® – sulfametoxazol + trimetoprima BHI − Brain Heart Infusion
BHT – 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol; hidroxitolueno butilado bipy – 2,2’-bipiridina
[Cu(SFT)2(bipy)] – complexo de cobre com sulfatiazol e bipiridina
DHO – água em que um hidrogênio foi trocado por deutério DMSO – dimetilsulfóxido
DMSO-d6 – dimetilsulfóxido deuterado DNA – ácido desoxirribonucleico DPPH – 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
E. coli – Escherichia coli
ESI-QTOF-MS − Espectrometria de Massas - Ionização por eletrospray-quadrupolo-tempo-de-voo
ICP-OES – Espectrometria de Emissão Óptica por Plasma Indutivamente Acoplado IV – Espectroscopia vibracional no Infravermelho
MIC – Concentração Inibitória Mínima MS – Espectrometria de Massas m/z – relação massa carga PABA – ácido p-aminobenzóico
P. aeruginosa – Pseudomonas aerugionosa
rRNA – ácido ribonucleico ribossômico RMN – Ressonância Magnética Nuclear
S. aureus – Staphylococcus aureus S. enterica – Salmonella enterica
SFM – sulfametoxazol SFT – sulfatiazol
SOD – superóxido dismutase TGA − Análise Termogravimétrica TMS – tetrametilssilano
Trolox® – ácido (±)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico u – unidade de massa atômica
u.a. – unidades arbitrárias
UFC − Unidade Formadora de Colônia
UV-Vis – Espectroscopia eletrônica de absorção no Ultravioleta-Visível XRPD − Difração de Raios X de Pó
{15N,1H} HMBC – Correlação heteronuclear a múltiplas ligações nitrogênio-hidrogênio
as – modo de estiramento vibracional assimétrico
Lista de tabelas
Tabela 1. Dados de análise elementar dos complexos Ag-SFT e Ag-SFM, com os valores calculados e experimentais ... 45 Tabela 2. Principais ângulos entre os átomos do complexo Ag-SFT ... 49 Tabela 3. Atribuições dos espectros no infravermelho dos ligantes SFT e SFM e dos complexos Ag-SFT e Ag-SFM ... 54 Tabela 4. Atribuições dos espectros de RMN de 1H do SFT e do complexo Ag-SFT .... 56 Tabela 5. Atribuições dos espectros de RMN de 13C do SFT e do complexo Ag-SFT ... 57 Tabela 6. Atribuições dos mapas de contorno de RMN {15N,1H} HMBC do SFT e do complexo Ag-SFT ... 59 Tabela 7. Atribuições dos espectros de RMN de 1H do SFM e do complexo Ag-SFM.. ... 60 Tabela 8. Atribuições dos espectros de RMN de 13C do SFM e do complexo Ag-SFM ... 62 Tabela 9. Atribuições dos mapas de contorno de RMN {15N,1H} HMBC do SFM e do complexo Ag-SFM ... 63 Tabela 10. Dados de análise elementar do complexo [Cu(SFT)2(bipy)]·H2O, com os
valores calculados e experimentais ... 65 Tabela 11. Principais ângulos entre os átomos do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] ... 68
Tabela 12. Porcentagem de cobre no complexo [Cu(SFT)2(bipy)] obtida pela análise
de ICP-OES ... 70 Tabela 13. Atribuições dos espectros no infravermelho do SFT e do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] ... 72
Tabela 14. Proporções molares composto/DPPH• nos ensaios ... 75 Tabela 15. Resultados obtidos para a porcentagem de redução do DPPH• ... 78 Tabela 16. Concentração das soluções de SFT, Cu(NO3)2, [Cu(SFT)2(bipy)] e
Tabela 17. Resultados da porcentagem de redução dos compostos SFT, Cu(NO3)2,
[Cu(SFT)2(bipy)] e Trolox® frente ao ABTS•+ ... 82
Tabela 18. Valores de concentração inibitória mínima obtidos pelos ensaios de atividade antibacteriana dos compostos AgNO3, Ag-SFT, Ag-SFM, Ag-SFD,
Cu(NO3)2 e [Cu(SFT)2(bipy)] ... 85
Tabela S1. Parâmetros da estrutura cristalina e refinamento do complexo
Ag-SFT 104
Tabela S2. Parâmetros da estrutura cristalina e refinamento do complexo
[Cu(SFT)2(bipy)] 105
Tabela S3. Propriedades físicas dos complexos Ag-SFT, Ag-SFM e
[Cu(SFT)2(bipy)] 105
...
...
Lista de figuras
Figura 1. Fármacos antibacterianos e seus alvos nas bactérias ... 25
Figura 2. Representação estrutural da sulfadiazina de prata(I) ... 27
Figura 3. Similaridade estrutural entre as sulfonamidas, o PABA e o ácido fólico ... 32
Figura 4. Representação estrutural do sulfatiazol (SFT) ... 33
Figura 5. Representação estrutural do sulfametoxazol (SFM) ... 34
Figura 6. Desprotonação da sulfonamida ... 44
Figura 7. Estrutura de uma unidade do complexo Ag-SFM ... 45
Figura 8. Representação da estrutura supramolecular do complexo Ag-SFM ... 46
Figura 9. Estrutura de uma unidade do complexo Ag-SFT ... 47
Figura 10. Dímero do complexo Ag-SFT obtido pelo método de Rietveld ... 47
Figura 11. Estrutura 1D da cadeia polimérica do complexo Ag-SFT ... 48
Figura 12. Análises termogravimétricas dos complexos Ag-SFT e Ag-SFM ... 50
Figura 13. Difratogramas de raios X dos resíduos de degradação térmica dos complexos Ag-SFT e Ag-SFM ... 51
Figura 14. Espectro de massas do complexo Ag-SFT... 52
Figura 15. Espectro de massas do complexo Ag-SFM ... 52
Figura 16. Espectros no infravermelho do SFT, Ag-SFT, SFM e Ag-SFM ... 53
Figura 17. Espectros de RMN de 1H do SFT e do complexo Ag-SFT ... 55
Figura 18. Espectros de RMN de 13C do SFT e do complexo Ag-SFT ... 57
Figura 19. Mapas de contorno de RMN {15N,1H} HMBC do SFT e do complexo Ag-SFT ... 58
Figura 20. Espectros de RMN de 1H do SFM e do complexo Ag-SFM ... 60
Figura 21. Espectros de RMN de 13C do SFM e do complexo Ag-SFM ... 62
Figura 22. Mapas de contorno de RMN {15N,1H} HMBC do SFM e do complexo Ag-SFM ... 63
Figura 23. Representação estrutural da bipiridina ... 64
Figura 24. Estrutura cristalina do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] obtida pelo método de Rietveld ... 66
Figura 25. Estrutura da unidade assimétrica do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] obtida pelo método de Rietveld ... 67
Figura 26. Espectro de massas do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] ... 69
Figura 27. Espectros de massas teórico e experimental da espécie de m/z 728, do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] ... 69
Figura 28. Espectros no infravermelho do SFT e do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] ... 71
Figura 29. Redução do radical DPPH• ... 73
Figura 30. Espectros de absorção do radical DPPH• e do DPPH reduzido ... 74
Figura 31. Representação estrutural do BHT ... 75
Figura 32. Ensaio de redução do DPPH• utilizando a referência BHT ... 76
Figura 33. Ensaio de redução do DPPH• utilizando o ligante SFT ... 77
Figura 34. Ensaio de redução do DPPH• utilizando o complexo [Cu(SFT)2(bipy)] ... 77
Figura 35. Ensaio de redução do DPPH• utilizando o Cu(NO3)2 ... 78
Figura 36. Oxidação do ABTS pelo persulfato de potássio, gerando ABTS•+, e sua redução por um composto antioxidante... 79
Figura 37. Espectro de absorção do ABTS•+ ... 80
Figura S1. Representação estrutural do dímero de Ag-SFT 98
Figura S2. Difratogramas de raios X experimental e teórico (obtido pelo método
Rietveld) do complexo Ag-SFT 98
Figura S3. Mapa de contorno {13C, 1H} HSQC do complexo Ag-SFT 99
Figura S4. Mapa de contorno {13C, 1H} HMBC do complexo Ag-SFT 99
Figura S5. Mapa de contorno {13C, 1H} HSQC do complexo Ag-SFM 100
Figura S6. Mapa de contorno {13C, 1H} HMBC do complexo Ag-SFM 100
Figura S7. Espectros de absorção do complexo Ag-SFT em DMSO 101
Figura S8. Espectros de absorção do complexo Ag-SFM em DMSO 101
Figura S9. Representação estrutural do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] 102
Figura S10. Difratograma de raios X experimental e teórico (obtido pelo método
Rietveld) do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] 102
Figura S11. Difratograma de raios X do CuO, produto de degradação térmica do
complexo [Cu(SFT)2(bipy)] 103
Figura S12. Espectros de absorção do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] em DMSO 103
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
SUMÁRIO
1. Introdução ... 23
1.1. Metais em sistemas biológicos e metalofármacos... 23
1.2. Resistência bacteriana ... 24 1.3. A prata ... 26 1.4. O cobre ... 29 1.5. Sulfonamidas ... 31 1.6. Sulfatiazol ... 32 1.7. Sulfametoxazol ... 33 2. Objetivos ... 35 3. Procedimentos experimentais ... 36
3.1. Síntese dos complexos de prata ... 36
3.2. Síntese do complexo de cobre ... 36
3.3. Ensaios para determinação de atividade antioxidante ... 37
3.3.1. Capacidade de reduzir o radical livre DPPH• ... 37
3.3.2. Capacidade de eliminação do radical catiônico ABTS•+ ... 38
3.4. Ensaios de atividade antibacteriana - concentração inibitória mínima (MIC)..39
3.5. Materiais e métodos ... 39
3.5.1. Análise elementar ... 40
3.5.2. Espectroscopia no infravermelho (IV) ... 41
3.5.3. Espectroscopia no ultravioleta-visível (UV-Vis) ... 41
3.5.4. Ressonância magnética nuclear (RMN) ... 41
3.3.6. Análise termogravimétrica (TGA) ... 42
3.5.7. Difração de raios X - método de pó (PRXD) ... 42
3.5.8. Espectrometria de emissão óptica por plasma indutivamente acoplado (IPC-OES) ... 43
4. Resultados e discussão ... 44
4.1 Caracterização estrutural dos complexos Ag-SFT e Ag-SFM ... 44
4.1.1. Síntese dos complexos ... 44
4.1.2. Análise elementar ... 45
4.1.3. Difração de raios X para determinação da estrutura ... 45
4.1.4. Análises termogravimétricas... 50
4.1.5. Espectrometria de massas ... 51
4.1.6. Espectroscopia no infravermelho ... 53
4.1.7. Ressonância magnética nuclear do SFT e do complexo Ag-SFT ... 55
4.1.8. Ressonância magnética nuclear do SFM e do complexo Ag-SFM ... 59
4.2. Caracterização estrutural do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] ... 64
4.2.1. Síntese do complexo ... 64
4.2.2. Análise elementar ... 65
4.2.3. Difração de raios X para determinação da estrutura ... 66
4.2.4. Espectrometria de massas ... 68
4.2.5. Espectrometria de emissão óptica por plasma indutivamente acoplado . ...70
4.2.6. Espectroscopia no infravermelho ... 70
4.2.7 Ensaios de atividade antioxidante ... 72
4.2.7.1. Capacidade de redução do radical livre DPPH• ... 73
5. Ensaios de atividade antibacteriana dos complexos Ag-SFT, Ag-SFM e [Cu(SFT)2(bipy)] ... 84 6. Considerações finais ... 86 Referências bibliográficas ... 88 Material suplementar 98 A) Figuras 98 B) Tabelas 104 ... ... ...
CAPÍTULO 1
1. Introdução
1.1. Metais em sistemas biológicos e metalofármacos
Alguns metais desempenham funções específicas em sistemas biológicos que não poderiam ser exercidas por moléculas orgânicas. Íons metálicos específicos são indispensáveis em processos metabólicos, mesmo em pequenas quantidades nos organismos vivos, variando de microgramas a traços [1]. Como exemplos, podemos destacar o papel do Zn(II) como cofator de enzimas (carboxipeptidase, anidrase carbônica) e o Fe(II) presente na hemoglobina, responsável pelo transporte de oxigênio na corrente sanguínea. Esses metais são denominados metais essenciais, pois desempenham funções em processos fisiológicos [1-2]. Além disso, os metais essenciais têm sido utilizados há muito tempo na medicina. Por exemplo, os egípcios utilizavam cobre e zinco, o primeiro para esterilizar água e o segundo na cura de feridas [3]. Vale ressaltar que em altas concentrações os metais essenciais são tóxicos, tanto para nosso organismo quanto para agentes patogênicos.
Os metais não essenciais são aqueles que não estão presentes nos processos fisiológicos e são geralmente tóxicos mesmo em baixas concentrações [4]. Por outro lado, os metais não essenciais têm sido utilizados desde a antiguidade no tratamento de doenças e, mais recentemente, em exames de diagnóstico [5]. Por exemplo, os chineses e árabes utilizavam ouro em seus medicamentos, acreditando que ele teria alguma propriedade medicinal devido às suas características pouco comuns (por ser um metal nobre, pouco reativo) [6]. É importante ressaltar que tanto os metais essenciais quanto os não essenciais podem apresentar efeitos benéficos e terapêuticos, quando utilizados de maneira correta. Como já dizia o médico Paracelso, que viveu no século XVI, a diferença entre remédio e veneno está na dosagem.
A partir das propriedades medicinais dos metais foram produzidos metalofármacos. Experimentos com esses novos fármacos foram realizados pela primeira vez com base no conhecimento das propriedades tóxicas de íons metálicos
em sistemas biológicos [7]. O primeiro complexo utilizado na clínica médica foi o Salvarsan (1910), um composto de arsênio empregado no tratamento da sífilis [8]. Também é importante citar como destaques a cisplatina (1971), explorada por sua atividade antitumoral [9], e a sulfadiazina de prata (1968), explorada por sua atividade antibacteriana [10-11]. Hoje em dia, complexos de platina(II), como a carboplatina e a oxaliplatina e, mais recentemente, a nedaplatina, a lobaplatina e a heptaplatina [12], são utilizados no tratamento do câncer [13-14], enquanto que compostos de ouro(I), como a auranofina, apresentam atividade antiartrítica [15] e compostos de prata(I) são utilizados como agentes antibacterianos [16-17]. Torna-se notório, com isso, que a combinação dos metais com ligantes específicos é capaz de reduzir a toxicidade dos mesmos, além de atribuir propriedades benéficas aos complexos sintetizados, tanto no diagnóstico quanto no tratamento de doenças [18].
1.2. Resistência bacteriana
A resistência bacteriana aos antibióticos atuais é uma ameaça ao tratamento de doenças infecciosas, o que é um desafio para a saúde pública mundial, pois diminui a eficácia de fármacos utilizados para o tratamento de infecções bacterianas, tornando o tratamento mais difícil, custoso ou até mesmo impossível [19]. Em seu discurso quando laureado com o prêmio Nobel em 1945, Alexander Fleming, que descobriu a penicilina em 1929, já havia alertado o mundo com relação ao fato de que as bactérias iriam adquirir resistência aos antibióticos, caso estes fossem utilizados incorretamente [20]. Até os anos 1970 inúmeros fármacos antibacterianos foram descobertos, mas desde então o número de descobertas na área foi bastante reduzido, e o uso indevido desses fármacos começou a acelerar a resistência bacteriana [21]. Na década passada pode-se destacar a descoberta das oxazolidinonas [22] e, este ano, da teixobactina [23].
A resistência bacteriana é um fenômeno que ocorre naturalmente. No entanto, tem sido acelerada com o uso indevido dos antibióticos, tanto em animais [24-25] quanto em seres humanos [19-26]. Como mostrado na Figura 1, cada classe de quimioterápico antibacteriano possui um alvo específico para inibir o crescimento bacteriano [27]. Por exemplo, tetraciclinas inibem a síntese de proteínas das
bactérias, tendo como alvo a subunidade 30S dos ribossomos. Já as quinolonas foram desenvolvidas para inibir a replicação do material genético das bactérias, tendo como alvo enzimas chamadas topoisomerases (também conhecidas como DNA girases) [21]. A resistência bacteriana é uma forma que a bactéria possui de contornar o dano causado pelos fármacos, seja expelindo-os, modificando a molécula do fármaco ou até mesmo sofrendo mutações [27,28].
Figura 1. Fármacos antibacterianos e seus alvos nas bactérias. Adaptado da referência [29].
A necessidade da descoberta de novos fármacos com diferentes mecanismos de ação é alarmante, devido à resistência bacteriana que vem sendo adquirida pelos fármacos atuais, o que os tornará ineficientes contra infecções bacterianas. De acordo com uma projeção, se novos medicamentos não forem desenvolvidos, bactérias se tornarão resistentes a praticamente todos os quimioterápicos antibacterianos atuais e, em 35 anos, bactérias multirresistentes, apelidadas de “superbactérias”, irão causar pelo menos 10 milhões de mortes por ano, mais do que o câncer causa hoje em dia. Além disso, inúmeros procedimentos médicos se tornarão inviáveis devido à necessidade do uso de fármacos antibacterianos, que se tornarão ineficazes, como transplantes, quimioterapia e cirurgias [30].
Mais importante do que descobrir novos agentes antibacterianos é manter a eficácia dos que já existem, com o intuito de prevenir a multirresistência bacteriana. Além disso, é uma alternativa economicamente mais viável, pois os custos para o desenvolvimento de novos fármacos é muito alto (cerca de 1,5 bilhão de dólares), e leva em média 8 anos [31-32]. Assim, a combinação de fármacos já existentes com íons metálicos tem sido uma alternativa para contornar o desafio da resistência, mantendo a eficácia dos fármacos atuais, pois os metais podem atuar em mais de um alvo celular, já que quanto maior o número de alvos que possam ser atingidos nas bactérias, mais difícil será para estas criarem mecanismos de defesa [33]. Além disso, os metais podem atuar em um efeito sinérgico ou aditivo com os fármacos orgânicos [34].
1.3. A prata
A prata é o elemento de número 47 da Tabela Periódica dos Elementos, estando no quinto período e no grupo 11. Ela possui dois isótopos naturais, um de massa 107 u (abundância de 52%) e outro de massa 109 u (abundância de 48%) [35]. Sua configuração eletrônica é [Kr]4d105s1, sendo o estado de oxidação +1 o mais comum, mas existindo também os estados +2 e +3 [35]. Devido à sua configuração eletrônica de camada fechada (d10), os complexos de prata(I) podem apresentar diversos números de coordenação (1 a 6) e não possuem preferência por uma geometria específica [36-3738]. Além disso, os complexos obtidos com prata(I)
são de coloração branca, pois não apresentam transições d-d. Para o estado de oxidação +1 é bastante comum encontrar complexos com número de coordenação 1 e 2, de geometria linear, sendo formados majoritariamente com ligantes N,P- ou S- doadores [35].
O primeiro relato do uso da prata como agente antimicrobiano data do século XVIII, em que o nitrato de prata era utilizado para tratar lesões de pele [10].Porém, no século XX, com o surgimento da penicilina e de outros quimioterápicos antibacterianos, o uso da prata no tratamento de infecções foi muito reduzido [39]. Somente em 1960 a prata(I) voltou a ser utilizada, quando o nitrato de prata foi empregado no tratamento de queimaduras e infecções de pele [40]. Apesar disso,
seu uso apresenta desvantagens, como queda acentuada na concentração dos íons sódio e cloreto no sangue, além da presença elevada de prata nos rins, fígado e músculos do paciente, evidenciados por exame pós-morte ou necroscópico. O desafio então é desenvolver compostos de prata em que a liberação dos íons seja lenta e controlada [7].
A sulfadiazina de prata, representada na Figura 2, foi o primeiro medicamento à base de prata utilizado no tratamento de queimaduras de pele, com intuito de prevenir infecções [10-11], sendo o primeiro complexo metálico de Ag(I) utilizado na clínica médica. Ela se mostrou 50 vezes mais ativa que a sulfadiazina livre e sua vantagem frente ao nitrato de prata está, principalmente, na liberação mais lenta dos íons prata(I) [41]. Porém, um aspecto desvantajoso da sulfadiazina de prata é o fato do complexo ser insolúvel em água e em solventes orgânicos, o que limita sua aplicação.
Figura 2. Representação estrutural da sulfadiazina de prata(I). Essa figura não apresenta todas as interações do íon Ag(I) e do ligante sulfadiazina.
Desde então, novos compostos à base de prata(I) têm sido sintetizados com intuito de obter agentes antibacterianos mais eficientes que os disponíveis atualmente. Por exemplo, Zanvettor et al. relatam a obtenção do complexo de Ag(I) com sulfadoxinato, que mostrou atividade semelhante à da sulfadiazina de prata contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas [42]. Também foram relatados dois complexos de prata(I), Ag(ThioEn) e (AgThioEn2) (ThioEn =
N,N’-bis(tiofeno-2-ilmetilideno)etano-1,2-diamina), que se mostraram ativos contra Mycobacterium
tuberculosis [43]. Além disso, vários complexos de Ag(I) com ligantes do tipo
coumarina-4-carboxilato substituídos mostraram atividade contra cepas de
Devido aos vários mecanismos de ação dos íons prata(I), agentes antibacterianos à base de prata conseguem, na maioria das vezes, vencer a resistência bacteriana. A prata(I) é capaz de inativar proteínas pela formação de ligações Ag-S estáveis, além de participar de reações redox catalíticas, resultando em ligações de dissulfeto (R-S-S-R). A formação dessas ligações pode levar a alterações nas estruturas secundária e terciária de proteínas, levando à inativação de enzimas, podendo também bloquear a respiração celular e o transporte de elétrons. Além disso, é conhecido que o DNA é capaz de se ligar à prata [44]. Modak e Fox estudaram cepas de P. aeruginosa expostas a doses subletais de sulfadiazina de prata. Eles observaram que mais de 12% da prata aparecia ligada ao DNA. O íon prata(I) penetra na célula através de proteínas presentes na membrana celular (proteínas transmembrânicas) [44]. A CopB-ATPase (uma enzima que catalisa a hidrólise de ATP; ATP = trifosfato de adenosina) de Enteroccocus hirae, por exemplo, pode mediar o transporte do íon prata(I), apesar de sua função primária ser o transporte de cobre [45]. Os íons prata(I) também podem alterar a estrutura da parede celular bacteriana, causando mudanças na sua estabilidade e, consequentemente, a morte da bactéria [46-4748]. Mais recentemente, Wakshlak et al.
descreveram que os íons prata(I) não perdem sua atividade bactericida após passarem pelos diferentes mecanismos de ação na bactéria. Mais ainda, as bactérias mortas com prata(I) se tornam um reservatório desses íons, liberando-os gradualmente pelo princípio básico de Le-Chatelier, em que as espécies químicas migram de um local a outro devido a um deslocamento de equilíbrio. Como as bactérias mortas acabam sendo as causadoras da morte de outras à sua volta, devido a essa liberação gradual dos íons, os autores nomearam esse fenômeno de “efeito zumbi” [49].
Com relação à toxicidade da prata para seres humanos, existem vários limites de exposição recomendados por diversas fontes. A Organização Mundial da Saúde definiu que um consumo de 10 g de prata ao longo de uma vida (média de 75 anos) não apresenta efeitos colaterais para o ser humano [50]. No geral, pessoas dificilmente são expostas a quantidades suficientes de prata que possam causar doenças durante suas vidas [42-51]. Porém, o uso de uma grande quantidade de prata(I) em um curto período de tempo pode causar argiria, uma doença em que a pele se torna permanentemente azulada devido à exposição excessiva e prolongada
aos íons prata(I) (geralmente sais à base de prata), principalmente se ingeridos [52]. Por isso, compostos à base de prata têm sido majoritariamente empregados na forma de cremes de uso tópico [53], em que a liberação do íon prata(I) é lenta e controlada.
1.4. O cobre
O cobre é o elemento de número atômico 29 da Tabela Periódica dos Elementos, estando no quarto período e no grupo 11. Ele possui dois isótopos naturais, um de massa 63 u (abundância de 69%) e outro de massa 65 u (abundância de 31%) [35]. Sua configuração eletrônica é [Ar]3d104s1, apresentando compostos com estados de oxidação +1, +2, +3 e +4, sendo os dois primeiros os mais comuns [44]. Os complexos apresentam diversos números de coordenação (4-8), sendo 4, 5 e 6 os mais recorrentes [35, 54]. Considerando Cu(II) (d9), as geometrias podem ser das mais variadas, devido ao efeito Jahn-Teller (distorção do campo octaédrico) [55]. Além disso, cobre(II) possui maior tendência de formar complexos com ligantes O,N- doadores [56]. Com relação ao espectro eletrônico, compostos d9 apresentam espectros simples, semelhantes aos de complexos d1, sendo as colorações dos compostos majoritariamente azuis ou verdes, devido à absorção de luz na região de 600-900 nm [55].
No grupo 11, dos metais Cu, Ag e Au, o cobre é o único metal que possui papel na sustentação da vida. O cobre é essencial ao metabolismo, estando presente, em sua maioria, ligado a proteínas, sendo que no corpo humano há cerca de 100 mg de cobre [35]. O alto potencial redox do cobre o faz um importante cofator de enzimas, essas estando envolvidas em inúmeros processos oxidativos, como respiração celular e eliminação de radicais livres [57]. Por ser um metal essencial, empregar o cobre na síntese de metalofármacos é uma estratégia muito interessante, já que sua homeostase é bastante conhecida e a possibilidade de intoxicação é reduzida [58].
Ao ser ingerido (como em castanhas, por exemplo, que são alimentos ricos em cobre), a proteína albumina e/ou o aminoácido histidina, presentes no sangue,
levam o íon Cu(II) até o fígado, onde a maioria das metaloproteínas de cobre são sintetizadas [59-60], e o Cu(II) é reduzido a Cu(I). O organismo mantém uma baixa concentração de íons cobre(II) livres no citoplasma das células, o excesso sendo armazenado na forma de cobre(I) dentro de proteínas chamadas metalotioneínas [61]. Quando ocorre intoxicação por cobre, rapidamente se inicia uma grande produção de metalotioneínas. Portanto, a homeostase, a regulação da concentração de cobre dentro das células, é mantida de acordo com o feedback que o metabolismo recebe da síntese de metalotioneínas [59,61].
Como exemplos de enzimas e proteínas que contêm cobre, podemos citar a hemocianina, o equivalente da hemoglobina nos artrópodes e moluscos, fazendo o transporte de oxigênio [59] e a citocromo c oxidase, uma proteína encontrada na membrana celular, em que existem dois centros de cobre, responsáveis pelo transporte de elétrons e pela transformação do O2 em H2O (respiração celular) [62].
Outra metaloenzima de cobre extremamente importante é a superóxido dismutase (SOD), que possui a função de defesa contra o estresse oxidativo nas células. Ela catalisa a dismutação do radical aniônico superóxido a oxigênio e peróxido de hidrogênio de acordo com as Equações 1 e 2, respectivamente [63]:
O2•- + SOD-Cu(II) → O2 + SOD-Cu(I) (1)
SOD-Cu(I) + O2•- + 2H+ → SOD-Cu(II) + H2O2 (2)
Devido à propriedade da superóxido dismutase de eliminar radicais livres, muitos complexos de cobre(II) têm sido sintetizados com intuito de mimetizar a atividade da SOD [64], tendo suas capacidades antioxidantes avaliadas, já que o cobre possui papel muito importante nessa enzima. Por exemplo, foram sintetizados dois complexos de cobre(II) com fluoroquinolonas, que além de apresentarem atividade mimética à SOD, ainda apresentaram atividade antibacteriana contra cepas Gram-positivas e Gram-negativas [65].
É reportado na literatura que o íon cobre(II) pode apresentar atividade antibacteriana. Como muitos complexos de cobre(II) que utilizam fármacos como ligante apresentam melhor atividade biológica sobre cepas bacterianas quando comparado com a ação do fármaco livre [66], inúmeros complexos de cobre(II) com fármacos são reportados na literatura com relação às suas atividades
antibacterianas. Como exemplos, podemos citar os complexos de cobre(II) com diversas fluoroquinolonas, como o enrofloxacino [67], levofloxacino [68], lomefloxacino [69], norfloxacino [70] e sparfloxacino [71], que mostraram ter atividade antibacteriana superior à do fármaco livre contra diversas cepas Gram-positivas e Gram-negativas, além de atividade mimética à SOD em alguns casos. Outros exemplos são os complexos de cobre(II) com sulfonamidas, que também exibiram atividade contra diversas cepas bacterianas, como Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli [72].
1.5. Sulfonamidas
Historicamente as sulfonamidas foram os primeiros agentes quimioterápicos sintéticos efetivos utilizados sistematicamente na prevenção e na cura de infecções bacterianas [73]. Elas são um grupo de fármacos bacteriostáticos que agem pela inibição competitiva com o PABA (ácido p-aminobenzóico) pela enzima dihidropteroato sintetase. Essa enzima é responsável pela síntese de hidrofolato, um intermediário da síntese bacteriana de ácido fólico, importante na síntese de purinas (que são indispensáveis na síntese do DNA) [74]. A similaridade estrutural entre as sulfonamidas, o PABA e o ácido fólico está representada na Figura 3. Os seres humanos não sintetizam ácido fólico, pois ele é obtido através da dieta; então o mecanismo de ação das sulfonamidas não afeta nossa produção de purinas [29].
Após o descobrimento da penicilina e de outros antibióticos, o uso das sulfonamidas foi reduzido, principalmente devido à toxicidade. Efeitos adversos mais comuns são alterações no sistema gastrointestinal (náusea, vômitos), dores de cabeça e tonturas, podendo chegar a complicações renais em casos mais graves [75]. Apesar disso, as sulfonamidas ainda são largamente utilizadas no tratamento de infecções do trato urinário e do trato gastrointestinal, hoje em dia com maior atenção à toxicidade [76]. A busca por novos complexos metálicos com sulfonamidas é uma importante área de pesquisa, considerando o fato de que é possível combinar a atividade antibacteriana das sulfonamidas com a atividade biológica intrínseca do metal. Além disso, espera-se que a toxicidade causada pela
sulfonamida seja reduzida, já que um efeito sinérgico ou aditivo é esperado e, desta maneira, a administração de quantidades menores do fármaco seja necessária [66].
Figura 3. Similaridade estrutural entre as sulfonamidas, o PABA e o ácido fólico.
1.6. Sulfatiazol
O sulfatiazol (SFT, representado na Figura 4) foi uma das primeiras sulfonamidas empregadas em seres humanos após o descobrimento dessa classe de quimioterápicos antibacterianos. Devido à sua alta toxicidade, hoje em dia ele é utilizado em conjunto com outras sulfonamidas, como a sulfabenzamida e a sulfacetamida, para tratamento de infecções vaginais. Ele é também utilizado em combinação com outros fármacos no tratamento de infecções de pele [77]. Pelo fato do sulfatiazol ser praticamente insolúvel em água, o sulfatiazolato de sódio, juntamente com outros agentes antibacterianos, é empregado topicamente no tratamento de infecções oftalmológicas [78]. Muitos complexos metálicos utilizando o sulfatiazol como ligante são descritos na literatura, como, por exemplo, o complexo de Co(II) com sulfatiazol e ácido acético, no qual a unidade assimétrica do composto
Sulfonamida
Ácido fólico
contém um ânion tetraclorocobaltato(II), dois cátions sulfatiazólio e uma molécula de ácido acético na cela unitária do cristal [79]. Outro exemplo é o complexo de Co(II) com sulfatiazol [Co(SFT)2(H2O)4] que, neste caso, apresentou atividade contra
Aspergillus fumigatus e Aspergillus flavus [80]. Mais exemplos são o complexo de
Pt(II) com sulfatiazol, em que a estrutura cristalina definida por difração de raios X do composto cis-[Pt(SFT)2(PPh3)2] (PPh3 = trifenilfosfina) mostra os ligantes sulfatiazol
se coordenando pelo nitrogênio do anel heterocíclico tiazol [81]. Por fim, um complexo de prata com sulfatiazol, que foi sintetizado em 1976, tendo sido caracterizado apenas por espectroscopia no infravermelho e espectroscopia na região do UV-Vis [82]. Apesar do complexo de prata(I) com sulfatiazol já ter sido sintetizado, ele não teve suas caracterizações espectroscópicas e estruturais descritas e não foi avaliado em relação ao seu potencial como agente antibacteriano. Isso mostra que ainda existem vários aspectos que podem ser estudados e abordados com relação a esse complexo.
Figura 4. Representação estrutural do sulfatiazol (SFT).
1.7. Sulfametoxazol
O sulfametoxazol (SFM, representado na Figura 5) faz parte da segunda geração de sulfonamidas. Hoje em dia é utilizado em combinação sinérgica com a trimetoprima, sendo o Bactrim a forma farmacêutica mais conhecida. A combinação de sulfonamidas com trimetoprima ou com análogos de trimetoprima resulta em um efeito bactericida (em que ocorre a morte bacteriana), enquanto que a sulfonamida isolada possui efeito bacteriostático (em que ocorre a inibição do crescimento bacteriano) [75]. O sulfametoxazol também é o fármaco escolhido para tratar infecções causadas pelo patógeno Pneumocystis pneumonia, fungo que causa um
tipo de pneumonia que afeta pacientes com HIV [83]. Porém, a resistência bacteriana ao sulfametoxazol é um grande desafio a ser vencido, assim como sua toxicidade. Alguns complexos metálicos com sulfametoxazol foram previamente descritos na literatura, como o complexo com Co(II), em que a difração de raios X mostrou que o metal no [Co(SFM)2(H2O)2].H2O está em um sítio octaédrico
ligeiramente distorcido. Neste caso, as moléculas de sulfametoxazol agem como ligantes em ponte entre os átomos de cobalto, formando cadeias poliméricas. Ensaios biológicos contra Mycobacterium tuberculosis mostraram que o complexo não consegue vencer a parede celular bacteriana em uma quantidade suficientemente ativa [84]. Complexos de Co(II) e Cd(II) com sulfametoxazol tiveram seus espectros no infravermelho investigados. No complexo de Cd(II), o ligante se coordena ao metal pelos átomos de nitrogênio e oxigênio do grupo SO2-N, enquanto
que no complexo de Co(II) o ligante se coordena pelos nitrogênios do grupo SO2-N e
NH2 [85]. Complexos de Au(I) e Ag(I) com sulfametoxazol foram também
sintetizados e caracterizados por difração de raios X de monocristal. O complexo de Au(I) apresenta geometria linear em que o metal se liga ao nitrogênio do grupo SO2
-N e à trifenilfosfina. Já no complexo de Ag(I) o metal também é coordenado pelo nitrogênio do grupo SO2-N. Os complexos foram testados sobre bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas e o complexo de ouro mostrou boa atividade sobre cepas de E. coli e S. aureus [86]. No entanto, em relação ao complexo de prata, ainda há muito trabalho a ser realizado, sobretudo quanto à sua caracterização espectroscópica, pois os autores apresentaram apenas a caracterização por difração de raios X, o que faz com que um estudo mais detalhado seja necessário.
CAPÍTULO 2
2. Objetivos
Este trabalho teve como objetivo o estudo das propriedades espectroscópicas e estruturais de complexos de Ag(I) e Cu(II) com sulfatiazol e sulfametoxazol, bem como a avaliação de suas atividades antibacterianas sobre cepas Gram-positivas e Gram-negativas.
CAPÍTULO 3
3. Procedimentos experimentais
3.1. Síntese dos complexos de prata
Em um béquer de 25 mL adicionou-se 0,50 mmol da sulfonamida de interesse e 4,0 mL de água. Em seguida, adicionou-se uma solução de 1,0 mmol de hidróxido de potássio (KOH) em 4,0 mL de água, garantindo completa solubilização do ligante. A solução foi mantida sob agitação e protegida da luz. Depois, adicionou-se gota-a-gota uma solução contendo 0,50 mmol de nitrato de prata (AgNO3) em 2,0 mL de
água. A solução, inicialmente transparente, tornou-se turva e amarelada com a adição do metal e, em seguida, formou-se um precipitado branco. Após 1 hora de reação o sólido obtido foi filtrado em funil de placa porosa e lavado abundantemente com água. O complexo de prata com sulfatiazol (Ag-SFT) foi obtido com 90% rendimento, enquanto que o complexo de prata com sulfametoxazol (Ag-SFM) foi obtido com 73% de rendimento.
3.2. Síntese do complexo de cobre
Em um béquer de 25 mL contendo 0,50 mmol de nitrato de cobre trihidratado (Cu(NO3)2·3H2O) adicionou-se uma solução de bipiridina (0,50 mmol em 2,0 mL de
metanol). Formou-se uma solução azul escura, que foi mantida sob agitação. Em outro béquer de 25 mL contendo 0,50 mmol do sulfatiazol (SFT) adicionou-se 2,0 mL de metanol contendo 10 gotas de NH4OH concentrado (28-30%). O sufatiazol foi
solubilizado em meio básico e essa solução foi gotejada na solução azul escura, formando um precipitado verde. Após 3 h de reação o sólido verde foi filtrado e lavado abundantemente com metanol. O complexo de cobre com sulfatiazol e bipiridina ([Cu(SFT)2(bipy)]) foi obtido com rendimento de 47%.
3.3. Ensaios para determinação de atividade antioxidante
3.3.1. Capacidade de reduzir o radical livre DPPH•
Foram preparadas as seguintes soluções: 1,0x10-4 mol L-1 do complexo [Cu(SFT)2(bipy)]; 2,0x10-4 mol L-1 do ligante SFT; 1,0x10-4 mol L-1 do sal de cobre
utilizado na síntese do complexo (Cu(NO3)2·3H2O); 1,0x10-4 mol L-1 do hidroxitolueno
butilado (BHT). Todas as soluções, exceto a do sal de cobre, foram preparadas em etanol absoluto com 10% de DMSO. A solução do sal de cobre foi preparada em etanol com 10% de água. Preparou-se também uma solução denominada solvente, sendo este apenas etanol absoluto com 10% de DMSO (esta solução foi utilizada para todos os compostos, exceto para o sal de cobre). Todas as soluções foram protegidas da luz.
No dia da análise foi preparada uma solução 1,0x10-4 mol L-1 do 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em etanol absoluto, que foi protegida da luz. Em seguida, foram feitos os estudos cinéticos por espectroscopia na região ao ultravioleta/visível (UV-Vis), com duração de 60 minutos para cada análise. As medidas de absorbância em 517 nm foram realizadas de 5 em 5 minutos. Todas as análises foram feitas em triplicata. Na cubeta de quartzo com caminho óptico de 1 cm adicionava-se 1,0 mL da solução de DPPH• e 1,0 mL de outra solução (complexo, ligante, sal de cobre ou BHT). O branco foi feito utilizando etanol absoluto + solvente. O controle foi feito utilizando a solução de DPPH• + solvente. Mediu-se o decréscimo da absorbância em 517 nm, típica do radical DPPH•, sendo este decréscimo diretamente relacionado à redução do radical devido à capacidade antioxidante do outro composto presente. As capacidades antioxidantes dos compostos foram expressas em porcentagem de redução do DPPH• (% redução = [(ADPPH• - Acomplexo)] x100 / ADPPH•).
3.3.2. Capacidade de eliminação do radical catiônico ABTS•+
Foi preparada no dia anterior à análise uma solução do 2,2'-azino-bis-(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico, ABTS) com persulfato de potássio (K2S2O8) em
água. A concentração de ABTS foi 2,0x10-3 mol L-1 e a de persulfato 1,7x10-4 mol L-1. Essa solução foi deixada ao abrigo da luz por aproximadamente 18 horas antes do experimento. Foram preparadas soluções de concentração 1,0x10-4 mol L-1 da referência, o ácido (±)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (Trolox®), do ligante SFT, do sal de cobre (Cu(NO3)2·3H2O) e do complexo [Cu(SFT)2(bipy)],
todas em etanol com 10% de DMSO (a solução do sal de cobre foi preparada em etanol com 10% de água, devido à sua solubilidade). Após 18 h a solução do radical ABTS•+ foi diluída, utilizando 10 mL de ABTS•+ (preparado em água), que foi completado até 100 mL utilizando etanol. Mediu-se o valor da absorbância dessa solução em 734 nm (Abs = 0,687). Foram feitos estudos cinéticos por espectrometria no UV-Vis, com incubação de 1 minuto para cada análise, medindo a absorbância em 734 nm. Todas as análises foram feitas em triplicata. Na cubeta de quartzo com caminho óptico de 1 cm adicionou-se 100 µL da solução de interesse (complexo, ligante, sal de cobre ou Trolox®) e 1900 µL da solução de ABTS•+. O branco foi feito utilizando 1900 µL de etanol absoluto e 100 µL de uma solução de etanol com 10% de DMSO. O controle foi feito utilizando 1900 µL da solução de ABTS•+ e 100 µL de uma solução de etanol com 10% de DMSO. O mesmo procedimento foi executado, agora utilizando 200 µL da solução de interesse e 1800 µL da solução de ABTS•+, em um novo ensaio. Assim, foram obtidos resultados para a proporção, em volume, de 100:1900 µL e 200:1800 µL composto/ABTS•+. Mediu-se o decréscimo da absorbância em 734 nm, que está diretamente relacionado à redução desse radical devido à capacidade antioxidante do outro composto adicionado. A capacidade antioxidante dos compostos foi calculada em porcentagem de redução do ABTS•+ (% redução = [(AABTS•+ - Acomposto)] x100 / (AABTS•+).
3.4. Ensaios de atividade antibacteriana - concentração inibitória mínima (MIC)
Para determinação da concentração inibitória mínima (MIC) dos complexos de prata(I) e cobre(II) foram utilizadas as cepas Gram-positivas de S. aureus (ATCC-25923) e Gram-negativas de E. coli (ATCC-25922), P. aeruginosa (ATCC-27853) e
Salmonella enterica (ATCC-10708). As cepas bacterianas escolhidas incluem as
mais comuns que primeiro colonizam lesões causadas por queimaduras. Elas foram inoculadas em tubos contendo 2,0 mL de BHI (Brain and Heart Infusion) e incubadas durante 18 h à 35-37°C. Inóculo suficiente de cada suspensão bacteriana foi adicionado em novos tubos de meio BHI estéril até atingir a turbidez 1,0 da escala de McFarland (~3,0x108 UFC mL-1; UFC = unidade formadora de colônia). As soluções dos compostos Ag-SFT, Ag-SFM, [Cu(SFT)2(bipy)] e a suspensão do
composto Ag-SFD (sulfadiazina de prata) foram preparadas em DMSO. Um volume de 100 µL dos complexos metálicos (estoque 20 g µL-1) foi adicionado nos primeiros poços e, a partir destes, foram realizadas diluições seriadas com água (1:2, 1:4; até 1:512) em diferentes poços de uma microplaca de 96 poços. A seguir, um volume de 100 µL das suspensões dos micro-organismos, na escala 1,0 de McFarland, foi adicionado a cada diluição sequencial, atingindo a turbidez de 0,5 McFarland (~1,5x108 UFC mL-1), em um volume final de 200 µL/poço. A concentração de DMSO em cada poço foi menor que 1%. As microplacas foram incubadas durante 18h à 35-37°C em câmara úmida. Após o período de incubação as concentrações inibitórias mínimas foram analisadas. Como controles positivos foram utilizadas as soluções de SFT (20 g µL-1) e SFM (20 g µL-1) e os sais de partida AgNO3 (20 g µL-1) e Cu(NO3)2 (20 g µL-1), nas mesmas concentrações,
mas neste caso esses compostos foram preparados em água e não em DMSO.
3.5. Materiais e métodos
Todos os materiais e reagentes foram utilizados como adquiridos, sem tratamento prévio.
Reagentes adquiridos da Sigma-Aldrich: sulfatiazol (98%); sulfametoxazol; hidróxido de potássio; nitrato de prata (99%); dimetilsulfóxido deuterado; 2,2’-bipiridina; hidróxido de amônio (28-30%); padrão de cobre (1001±2) mg L-1; 2,2-difenil-1-picrilhidrazil;
2,6-di-terc-butil-4-metilfenol (hidroxitolueno butilado, 99,0%, pó);
2,2'-azino-bis-(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (98%);
persulfato de potássio (99,0%);
ácido (±)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (97%).
Solvente adquirido da Synth:
metanol.
Solvente adquirido da J.T. Baker:
etanol desnaturalizado (99%).
Reagente adquirido da Proquímicos:
nitrato de cobre trihidratado (99,9%).
3.5.1. Análise elementar
As análises elementares de carbono, hidrogênio e nitrogênio foram realizadas utilizando um analisador CHNS/O Perkin Elmer 2400 CHNS/O.
3.5.2. Espectroscopia no infravermelho (IV)
Os espectros na região do infravermelho (IV) foram obtidos na região de 4000-400 cm-1 utilizando o espectrofotômetro Bomem MB-Series Modelo B100 FT-IR, com resolução de 4 cm-1. As amostras foram preparadas em pastilhas de KBr.
3.5.3. Espectroscopia no ultravioleta-visível (UV-Vis)
Os espectros na região do UV-Vis foram obtidos na região de 190 a 1100 nm, à 25°C, utilizando o equipamento Hewlett-Packard 8453, com detector de arranjo de diodos e cubeta de quartzo de 1 cm de caminho óptico e sob agitação.
3.5.4. Ressonância magnética nuclear (RMN)
Os espectros de RMN de 1H e 13C do ligante SFT foram obtidos em um equipamento Bruker 250 MHz, à 25°C, operando em 250,0 MHz para o hidrogênio e 62,9 MHz para o carbono. Os espectros de RMN de 1H, 13C e {15N,1H} HMBC do ligante SFM e dos complexos Ag-SFT e Ag-SFM foram adquiridos em um equipamento Bruker Avance III 500 MHz, à 25°C, operando em 500,0 MHz para o hidrogênio, 125,7 MHz para o carbono e 50,7 MHz para o nitrogênio. As amostras foram analisadas em dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) e os valores dos deslocamentos químicos são relativos ao tetrametilsilano (TMS).
3.5.5. Espectrometria de massas (MS)
Os espectros de massas dos complexos de prata foram obtidos em um equipamento Waters Quattro Micro API com infusão direta e operando no modo positivo. As amostras foram preparadas em DMSO com 0,1% (v/v) de ácido fórmico e posteriormente diluídas 100 vezes em metanol. A análise do complexo de cobre foi feita por espectrometria de massas por tempo de voo (ESI-QTOF-MS) em um equipamento Waters Synapt HDMS. O complexo foi preparado em metanol com 0,1% (v/v) de ácido fórmico.
3.3.6. Análise termogravimétrica (TGA)
As análises termogravimétricas foram realizadas em um termoanalisador TGA/DTA SEIKO EXSTAR 6000 nas seguintes condições: atmosfera oxidante, vazão de 100 mL min-1 e rampa de aquecimento de 10°C min-1 de 25°C a 1000°C. Os resíduos do tratamento térmico foram analisados em um difratômetro Shimadzu XRD-6000 (radiação CuKα, = 1,54056 Å) com monocromador de grafite, com
voltagem de 40 kV e corrente de 30 mA. As amostras foram analisadas na região de 5° a 50° (2θ), à temperatura ambiente.
3.5.7. Difração de raios X - método de pó (PRXD)
As análises dos complexos de prata e cobre com sulfatiazol por difração de raios X foram efetuadas em colaboração com o Prof. Dr. Alexandre Cuin da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF). Amostras policristalinas dos complexos Ag-SFT e [Cu(SFT)2(bipy)] foram previamente trituradas em um almofariz
de ágata. Os dados de difração foram coletados em um equipamento Bruker Axs D8 da Vinci (radiação CuKα, = 1,5418 Å, com filtro de Ni), com gerador a 40 kV e 40
mA. Para a análise do complexo Ag-SFT as fendas de espalhamento, divergência e recepção foram 2,94°, 0,3° e 8,0 mm, respectivamente. A região analisada foi de 5° a 105° (2θ), com rampa 0,02°. Para a análise do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] as
fendas de espalhamento, divergência e recepção foram de 2,94°, 0,3° e 9,36 mm, respectivamente. A região analisada foi de 4° a 105° (2θ), com rampa de 0,02°. O pico em 12,88° (2θ) foi considerado como sendo de um contaminante desconhecido e, portanto, foi eliminado da indexação. A indexação dos complexos foi feita utilizando o conjunto de programas TOPAS-R [TOPAS-R (Versão 4.2), Bruker AXS, Karlsruhe, Alemanha (2009)]. O refinamento foi realizado pelo método Rietveld utilizando TOPAS-R.
3.5.8. Espectrometria de emissão óptica por plasma indutivamente acoplado (IPC-OES)
A análise por ICP-OES do complexo de cobre com sulfatiazol foi feita em um equipamento Perkin Elmer - Optima 8300. Foi utilizado padrão de cobre de concentração (1001±2) mg L-1 para produzir uma solução estoque de 100,1 mg L-1. Essa solução estoque foi utilizada para fazer as soluções da curva de calibração (100,1; 50,05; 25,02; 12,51; 6,31 mg L-1). Foi feita digestão ácida para abertura da amostra, com 0,3009 g do complexo [Cu(SFT)2(bipy)], 15 mL de HNO3 concentrado
e 5 mL de água, à 280°C por 30 minutos. O volume restante ao final da digestão foi transferido para um balão volumétrico de 100 mL, que foi completado com água deionizada. A partir dessa solução de 309 mg L-1 foram feitas duas soluções diluídas, de concentrações 154,5 e 77,2 mg L-1.
CAPÍTULO 4
4. Resultados e discussão
4.1 Caracterização estrutural dos complexos Ag-SFT e Ag-SFM
4.1.1. Síntese dos complexos
A proposital desprotonação do ligante (Figura 6) é a justificativa da escolha da síntese em meio básico, pois isso acarreta em um aumento da reatividade do nitrogênio do grupo SO2-N para uma possível complexação com o íon prata(I). O
nitrogênio do grupo SO2-N é um dos possíveis sítios de coordenação.
Figura 6. Desprotonação da sulfonamida.
Após a adição do nitrato de prata forma-se primeiramente um sólido marrom, que se dissolve no meio da reação e, logo em seguida, há a formação de um composto de cor branca. Acredita-se que o sólido marrom seja AgOH, porém esse composto não foi isolado e nem caracterizado. As análises feitas para a caracterização dos sólidos brancos obtidos serão apresentadas no decorrer deste trabalho. O uso de excesso de base na proporção molar 2:1 (KOH/sulfonamida) é utilizado para atingir um pH acima do pKa da sulfonamida, garantindo a completa desprotonação e solubilização do ligante. No caso, o pKa do SFT é 7,10 e do SFM é 5,81 [87]. Vale ressaltar que o grupo amino não é desprotonado, pois os hidrogênios são pouco ácidos.
4.1.2. Análise elementar
A Tabela 1 mostra os resultados obtidos pela análise elementar de carbono, hidrogênio e nitrogênio do Ag-SFT e do Ag-SFM. Os valores calculados também são apresentados. Os resultados obtidos confirmam a proporção 1:1 metal/ligante nos complexos, confirmando a composição AgC9H8N3O2S2 para Ag-SFT e
AgC10H10N3O3S para Ag-SFM.
Tabela 1. Dados de análise elementar dos complexos Ag-SFT e Ag-SFM, com os valores calculados e experimentais. Elemento Calculado (%) Ag-SFT Experimental (%) Ag-SFT Calculado (%) Ag-SFM Experimental (%) Ag-SFM C 29,6 29,5 33,3 32,1 H 2,76 2,30 2,80 2,86 N 11,5 11,4 11,7 11,1
4.1.3. Difração de raios X para determinação da estrutura
Conforme já citado, a estrutura do complexo de prata com sulfametoxazol (Ag-SFM) foi elucidada por Marques et al. por difração de raios X de monocristal em 2007 [86]. A coordenação a um íon prata(I) ocorre pelo nitrogênio do grupo sulfonamida (distância N-Ag 2,183 Å), sendo a proporção 1:1 (metal/ligante), como mostrado na Figura 7, que representa a estrutura de uma unidade do complexo, não representando todas as interações feitas pelo íon Ag(I) e pelo ligante SFM.
Figura 7. Estrutura de uma unidade do complexo Ag-SFM obtida por Marques et al. [86]. Essa figura não apresenta todas as interações do íon Ag(I) e do ligante SFM.
Os autores também mostraram a estrutura supramolecular deste complexo, em que há participação de mais dois ligantes SFM na coordenação ao íon Ag(I). No primeiro ligante SFM a coordenação ocorre pelo nitrogênio do anel heterocíclico isoxazol (distância N-Ag 2,241 Å) e por um dos oxigênios do grupo sulfona (grupo SO2, distância O-Ag 2,571 Å). No segundo, há participação do nitrogênio da amina
aromática (grupo NH2-Ph, distância H2N-Ag 2,473 Å). Essas interações são
mostradas na Figura 8.
Figura 8. Representação da estrutura supramolecular do complexo Ag-SFM elucidada por Marques et al. As ligações N-Ag e O-Ag não estão nas proporções corretas. Distâncias de ligação: grupo SO2-N, N-Ag 2,183 Å; grupo isoxazol, N-Ag 2,241 Å; grupo NH2, N-Ag 2,473
Å; grupo SO2, O-Ag 2,571 Å (adaptado da referência [86]).
A estrutura cristalina do complexo de prata com sulfatiazol (Ag-SFT) descrita neste trabalho foi determinada e refinada a partir da análise dos dados de difração de raios X em policristais (XRPD), em parceria com o Prof. Dr. Alexandre Cuin da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) [88]. Os difratogramas experimental e teórico (obtido pelo método Rietveld) e os parâmetros da estrutura cristalina e do
refinamento encontram-se no material suplementar. A estrutura de uma unidade do complexo é mostrada na Figura 9.
Figura 9. Estrutura de uma unidade do complexo Ag-SFT. Essa figura não apresenta todas as interações do íon Ag(I).
O resultado da análise por difração de raios X do complexo Ag-SFT mostra a formação de um dímero com um centro de inversão, em que a coordenação a um íon prata(I) ocorre pelo nitrogênio do grupo SO2-N, enquanto que a coordenação a
outro íon prata(I) ocorre pelo nitrogênio do anel heterocíclico tiazol. Além disso, existe uma interação prata-prata (também conhecida como interação argentofílica) de distância 2,89 Å, o que também é observado para complexos de Ag(I) com ligantes carboxílicos [16,89]. A estrutura obtida é apresentada na Figura 10.
Figura 10. Dímero do complexo Ag-SFT obtido pelo método de Rietveld. Legenda dos átomos: carbono (
•
), oxigênio (•
), enxofre (•
), nitrogênio (•
) e hidrogênio (•
). Os nitrogênios N1 são do grupo SO2-N (distância N1-Ag 2,120 Å), enquanto que os nitrogênios N2 são doanel heterocíclico tiazol (distância N2-Ag 2,184 Å). Os oxigênios ligados aos íons Ag(I) são de grupos SO2 de ligantes SFT vizinhos.
Os íons Ag(I) também interagem com oxigênios de grupos SO2 de ligantes
SFT vizinhos com um comprimento de ligação de 2,579 Å, o que está representado na Figura 11 (estrutura 1D ao longo do eixo b). As duas distâncias de ligação S-O do complexo Ag-SFT são de 1,430 Å, se mantendo inalteradas após a coordenação [90]. Além disso, há ligações hidrogênio entre grupos amino de diferentes unidades assimétricas com distâncias de ligação entre 2,60 a 2,91 Å e interações π-stacking entre os anéis NH2-Ph paralelos de 3,448 Å [88].
Figura 11. Estrutura 1D da cadeia polimérica do complexo Ag-SFT ao longo do eixo b, formada pela ligação Ag-O, de comprimento 2,579 Å. As interações π-stacking entre os anéis NH2-Ph paralelos são de 3,448 Å (adaptado da referência [88]).
Um anel de oito membros, quase planar, é formado com a sequência [AgNCN]2, em que as distâncias N-Ag possuem de 2,1 a 2,2 Å, estando de acordo
com alguns polímeros que possuem ligação N-Ag [91]. Os valores de ângulos mais relevantes encontram-se na Tabela 2 (numeração dos átomos de acordo com a Figura 11).
Tabela 2. Principais ângulos entre os átomos do complexo Ag-SFT. A numeração dos átomos está de acordo com o representado na Figura 11.
Ângulo (°) N1-Ag-N2 170,6 N1-Ag-O1 109,2 N1-Ag-Ag 83,7 N1-C1-N2 134,0 N2-Ag-O1 77,6 N2-Ag-Ag 86,9 O1-Ag-Ag 136,4 O1-S-O2 109,9 C1-N2-Ag 116,7
Logo após o estudo e publicação da estrutura do complexo Ag-SFT por nosso grupo de pesquisas [88] foram publicados outros artigos com relação à caracterização estrutural de complexos de prata(I) com sulfonamidas. Tailor e Patel obtiveram monocristais dos complexos [Ag2(smx)2(py)3] (smx = sulfametoxazol; py =
piridina) e [Ag(smz)(py)] (smz = sulfametazina) ao evaporar os compostos lentamente em piridina [92-93] e mostram uma estrutura similar à do complexo Ag-SFT. Nestes complexos os autores mostram estruturas que também são compostas por dois íons Ag(I), em que a coordenação a um íon prata(I) ocorre pelo nitrogênio do grupo SO2-N e a coordenação a outro íon prata(I) ocorre pelo nitrogênio do anel
heterocíclico, como na estrutura do Ag-SFT já apresentada. A diferença entre essas estruturas e a estrutura do Ag-SFT descrita nessa dissertação está na participação da piridina na coordenação aos íons Ag(I), nas duas primeiras. Na estrutura do complexo [Ag2(smx)2(py)] há dois íons prata, onde um íon Ag(I) é tetracoordenado e
o outro é pentacoordenado. O íon tetracoordenado possui como ligantes três nitrogênios (cada ligante smx contribui com um nitrogênio e a piridina contribui com o terceiro) e um íon Ag(I). Já o íon pentacoordenado possui como ligantes um íon Ag(I) e quatro nitrogênios (cada ligante smx contribui com um nitrogênio e há mais duas piridinas, cada uma contribuindo com um nitrogênio) [92]. Na estrutura do complexo [Ag(smz)(py)] a prata é tetracoordenada, sendo os ligantes três nitrogênios (dois sendo de dois ligantes smz e o terceiro sendo da piridina) e um íon Ag(I) [93]. Apesar disso, as estruturas definidas por esses autores também apresentam o anel de oito membros formado com a sequência [AgNCN]2. O
