Capacidade de redução do radical livre DPPH •

O DPPH• (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) é um radical estável, muito utilizado em ensaios que avaliam capacidade antioxidante de diferentes compostos, como alimentos e extratos de plantas [102-103]. Conforme mostrado na Figura 29, para eliminar o radical DPPH• um átomo de hidrogênio ou um elétron é transferido para o DPPH• (violeta), este se tornando DPPH-R (amarelo).

Figura 29. Redução do radical DPPH• [104].

Como mostrado na Figura 30, o DPPH• possui um máximo de absorção em 517 nm, enquanto que a espécie DPPH-R não absorve neste comprimento de onda. Essa diferença de absorção permite quantificar (pela Lei de Beer) quanto DPPH• foi consumido em uma reação. Portanto, é possível determinar a capacidade antioxidante de um composto utilizando este ensaio [105]. Este método detecta apenas os compostos antioxidantes mais reativos.

DPPH·

violeta

DPPH-R

300 400 500 600 700 800 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Abso rb ân ci a Comprimento de onda / nm

Figura 30. Espectros de absorção do radical DPPH• (__) e do DPPH reduzido. BHT (__) foi utilizado como agente redutor.

Neste ensaio utiliza-se o solvente em que as soluções foram preparadas como controle e o BHT (2,6-di-terc-butil-4-metilfenol, hidroxitolueno butilado, Figura 31) como referência. O BHT é um antioxidante muito conhecido e utilizado como conservante em alimentos [106]. Além disso, estudos mostram que o BHT, em pequenas quantidades, apresenta ação preventiva contra estresse oxidativo, que é um dos causadores do câncer e do envelhecimento [107]. Isso reforça a importância do estudo com relação à atividade antioxidante do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] e suas

Figura 31. Representação estrutural do BHT.

Bondet et al. fizeram estudos cinéticos e investigaram os mecanismos de reação de diversos antioxidantes, sendo um deles o BHT, com o DPPH•. Eles comentam que a maioria dos compostos tidos como antioxidantes reage muito lentamente com o DPPH•, o que significa que os resultados desse ensaio dependem diretamente do tempo de incubação [108]. O tempo de incubação é o Δt em que o composto a ser avaliado é deixado para reagir com o radical que, no caso dos ensaios apresentados neste trabalho, é 60 minutos.

Os ensaios foram conduzidos com o ligante SFT, a referência BHT, o Cu(NO3)2 e o complexo [Cu(SFT)2(bipy)]. As quantidades utilizadas de SFT e do

Cu(NO3)2 foram proporcionais às suas quantidades molares no complexo. As

concentrações molares e as proporções encontram-se na Tabela 14.

Tabela 14. Proporções molares composto/DPPH• nos ensaios.

Composto Composto (mol) DPPH (mol)

proporção aproximada composto/DPPH• BHT 1,07x10-4 9,83x10-5 1:1 SFT 2,43x10-4 1,07x10-4 2:1 [Cu(SFT)2(bipy)] 1,32x10-4 1,06x10-4 1:1 Cu(NO3)2 1,08x10 -4 9,99x10-5 1:1

É importante ressaltar que, como os ensaios são relativamente demorados (tempo de incubação de 60 minutos por substância a ser analisada, cada uma sendo feita em triplicata), os compostos foram analisados em dias diferentes; por isso a absorbância inicial do DPPH• varia de ensaio para ensaio, pois a solução do radical só pode ser preparada no dia da análise, não podendo ser estocada. O controle e o composto em estudo são analisados utilizando mesma solução de DPPH• para que a comparação composto/controle possa ser feita. Os resultados de absorbância do DPPH• em função do tempo, já consideradas as triplicatas (foi feita a média aritmética dos resultados), são apresentados nas Figuras 32-35.

0 10 20 30 40 50 60 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Abso rb ân ci a Tempo / min

Figura 32. Ensaio de redução do DPPH• (■) utilizando a referência BHT (●). As absorbâncias foram medidas em 517 nm. BHT atua sobre DPPH•, e sua concentração diminui.

0 10 20 30 40 50 60 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Abso rb ân ci a Tempo / min

Figura 33. Ensaio de redução do DPPH• (■) utilizando o ligante SFT (●). As absorbâncias foram medidas em 517 nm. SFT não aruá sobre DPPH•.

0 10 20 30 40 50 60 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Abso rb ân ci a Tempo / min

Figura 34. Ensaio de redução do DPPH• (■) utilizando o complexo [Cu(SFT)2(bipy)] (●). As

0 10 20 30 40 50 60 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Abso rb ân ci a Tempo / min

Figura 35. Ensaio de redução do DPPH• (■) utilizando o Cu(NO3)2 (●). As absorbâncias

foram medidas em 517 nm. Cu(NO3)2 não atua sobre DPPH•.

O cálculo da porcentagem de redução do DPPH• foi feito de acordo com a Equação 3, fazendo uma combinação entre as triplicatas. Os resultados são a média aritmética dessas combinações e estão apresentados na Tabela 15. Nenhum composto foi capaz de reduzir o DPPH• nas condições experimentais empregadas.

(3)

Tabela 15. Resultados obtidos para a porcentagem de redução do DPPH•.

Composto Redução do DPPH• (%)

[Cu(SFT)2(bipy)] 0

SFT 2±1

Cu(NO3)2 4±4

4.2.7.2 Capacidade de eliminação do radical catiônico ABTS•+

Esse ensaio se baseia na redução do radical catiônico ABTS•+, pela doação de um átomo de hidrogênio ou de um elétron de uma espécie antioxidante. O ABTS•+, de coloração azul-esverdeada, é produzido ao reagir ABTS, de coloração verde-claro, com persulfato de potássio, conforme a Figura 36. A reação ocorre estequiometricamente na proporção de 1:0,5 (ABTS/persulfato), o que resulta na oxidação incompleta do ABTS. Essa reação tem duração de cerca de 6 horas [109].

Figura 36. Oxidação do ABTS pelo persulfato de potássio, gerando ABTS•+, e sua redução por um composto antioxidante [104].

ABTS

K2S2O2

ABTS•+

ABTS•+

ABTS•+ possui máximos de absorção em 415 nm, 645 nm, 734 nm e 815 nm [109], conforme a Figura 37. A espécie reduzida, ABTS+, é incolor e não absorve nestes mesmos comprimentos de onda. Isso permite determinar quanto de ABTS•+ foi consumido na reação redox ao comparar a absorbância do controle com a absorbância do composto em um dos comprimentos de onda determinados (de acordo com a Lei de Beer). Neste caso, o comprimento de onda utilizado para fazer a comparação foi 734 nm, baseado no procedimento da literatura [98]. Assim, pode- se avaliar a capacidade antioxidante do composto de interesse, que neste caso é o complexo [Cu(SFT)2(bipy)].

400 600 800 1000 0 1 2 Abso rb â n ci a Comprimento de onda / nm 734 nm

Figura 37. Espectro de absorção do ABTS•+ (__).

A reação entre o radical ABTS•+ e o composto antioxidante é muito rápida, durando de 1-6 minutos. Entre o tempo zero e um minuto a taxa de diminuição da absorbância é muito alta, enquanto que após um minuto essa taxa diminui consideravelmente [109]. Assim, as medidas de absorção dos compostos foram feitas após 1 minuto de incubação. Como controle foi utilizado o mesmo solvente empregado no preparo das soluções dos diferentes compostos, enquanto que como

referência foi utilizado o Trolox®, representado na Figura 38. Esta substância é um agente antioxidante bastante conhecido e empregado neste tipo de ensaio.

Figura 38. Representação estrutural do Trolox®.

Após a reação do ABTS (2,80x10-3 mol L-1) com persulfato de potássio (2,69x10-4 mol L-1), a concentração de ABTS•+ era de 5,38x10-4 mol L-1. Essa solução foi diluída 10 vezes, até a concentração final de 5,38x10-5 mol L-1. Os compostos utilizados foram: SFT (2,32x10-4 mol L-1); Cu(NO3)2·3H2O (1,08x10-4 mol L-1);

complexo [Cu(SFT)2(bipy)]·H2O (9,91x10-5 mol L-1) e Trolox® (1,08x10-4 mol L-1). As

proporções empregadas foram 1900:100 µL (v/v) e 1800:200 µL (v/v) (ABTS•+/composto). A porcentagem de composto em cada incubação, com relação ao ABTS•+, está apresentada na Tabela 16 e foi calculada de acordo com a Equação 4.

Tabela 16. Concentração das soluções de SFT, Cu(NO3)2, [Cu(SFT)2(bipy)] e Trolox® na

cubeta e porcentagem de composto com relação ao ABTS•+.

Composto [Composto] (mol L-1) proporção 1900:100 Quantidade de composto (%) [Composto] (mol L-1) proporção 1800:200 Quantidade de composto (%) Trolox® 5,39x10-6 10,5 1,08x10-5 22,3 SFT 1,12x10-5 21,9 2,23x10-5 46,0 [Cu(SFT)2(bipy)] 4,96x10-6 9,70 9,91x10-6 20,4 Cu(NO3)2 5,38x10-6 10,5 1,08x10-5 22,3

*A concentração de ABTS•+ nos ensaios foi de 5,11x10-5 mol L-1 para a proporção 1900:100µL (v/v)

(ABTS•+/composto) e de 4,85x10-5 mol L-1 para a proporção 1800:200 µL (v/v) (ABTS•+/composto).

A partir das absorbâncias medidas e utilizando a Equação 4 foi possível obter os valores da porcentagem de redução, fazendo uma combinação entre as triplicatas. Os resultados são a média aritmética das combinações, que são apresentados na Tabela 17.

Tabela 17. Resultados da porcentagem de redução dos compostos SFT, Cu(NO3)2,

[Cu(SFT)2(bipy)] e Trolox® frente ao ABTS•+.

Redução (%) ABTS•+/composto 1900:100 µL (v/v) 1800:200 µL (v/v) Cu(NO3)2 0 0 [Cu(SFT)2(bipy)] 13±1 20±2 SFT 20±2 27±1 Trolox® 33±2 75±1

O Trolox® foi capaz de reduzir o ABTS•+ em 33% e 75% considerando uma porcentagem molar do composto de 10,5% e 22,3%, respectivamente. Em segundo lugar, quem melhor reduziu o ABTS•+ foi o SFT (redução de 20% e 27% considerando uma porcentagem molar do composto de 21,9% e 46,0%, respectivamente), seguido do complexo [Cu(SFT)2(bipy)] (redução de 13% e 20%

considerando uma porcentagem molar do composto de 9,7% e 20,4%, respectivamente). O ligante SFT foi de 65% a 74% mais ativo que o complexo [Cu(SFT)2(bipy)], o que mostra que a atividade antioxidante do complexo

provavelmente se deva ao ligante, já que o sal de cobre, Cu(NO3)2, não mostrou

atividade nas condições experimentais empregadas. A vantagem do uso deste método está na sua sensibilidade, pois avalia a capacidade antioxidante total de determinado composto.

CAPÍTULO 5

5. Ensaios de atividade antibacteriana dos complexos Ag-SFT,

Ag-SFM e [Cu(SFT)

(bipy)]

Ensaios de concentração inibitória mínima (MIC) foram realizados com Ag- SFT, Ag-SFM e [Cu(SFT)2(bipy)] utilizando bactérias Gram-positivas e Gram-

negativas. Os resultados foram comparados com AgNO3, Cu(NO3)2 e Ag-SFD

(sulfadiazina de prata). O complexo Ag-SFD é insolúvel em DMSO, então seu ensaio foi feito em suspensão. O ensaio de MIC determina a menor quantidade de determinado composto que inibe o crescimento de 90-100% das cepas bacterianas [29].

Foram utilizadas cepas Gram-positivas de Staphylococcus aureus ATCC- 25923, Gram-negativas de Pseudomonas aeruginosa ATCC-27853, Escherichia coli ATCC-25922 e Salmonella enterica ATCC-10708. As cepas bacterianas escolhidas incluem as mais comuns que primeiro colonizam feridas causadas por queimaduras [110]. Os resultados encontram-se na Tabela 18. Os ligantes isolados (SFT e SFM) não apresentaram atividade nas concentrações testadas.

Observa-se maior atividade dos complexos de prata(I) frente às cepas Gram- negativas, em que a MIC foi menor que 0,05 mmol L-1. Para as cepas Gram- positivas, a MIC dos complexos de prata(I) foi igual a 0,05 mmol L-1. Os complexos de prata(I) foram mais ativos que o nitrato de prata nos dois casos.

O complexo de cobre(II) não apresentou atividade contra a cepa Gram- positiva (S. aureus) nas condições experimentais testadas, mas apresentou maior atividade que o nitrato de cobre contra as bactérias Gram-negativas. Os valores de MIC encontrados foram de 0,84 mmol L-1 para as bactérias E. coli e S. enterica e 0,10 mmol L-1 para P. aeruginosa.

Tabela 18. Valores de concentração inibitória mínima obtidos pelos ensaios de atividade antibacteriana dos compostos AgNO3, Ag-SFT, Ag-SFM, Ag-SFD, Cu(NO3)2 e

[Cu(SFT)2(bipy)].

Concentração inibitória mínima (mmol L-1)

Composto Gram-positiva Gram-negativa

S. aureus E. coli P. aeruginosa S. enterica

AgNO3 3,68 <0,11 0,23 0,11 Ag-SFT 0,05 <0,05 <0,05 <0,05 Ag-SFM 0,05 <0,05 <0,05 <0,05 Ag-SFD <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 Cu(NO3)2 5,17 5,17 5,17 5,17 [Cu(SFT)2(bipy)] - 0,84 0,10 0,84

Comparando a atividade dos complexos Ag-SFT e Ag-SFM frente a sulfadiazina de prata (Ag-SFD), eles apresentaram a mesma atividade com relação às bactérias Gram-negativas, mas foram menos ativos com relação à bactéria Gram- positiva. Uma vantagem dos compostos Ag-SFT e Ag-SFM frente à sulfadiazina de prata está na solubilidade desses compostos, que são solúveis em DMSO, enquanto que a sulfadiazina de prata é insolúvel, o que aumenta a possibilidade de aplicação dos complexos de prata(I) apresentados neste trabalho. O DMSO pode ser empregado em formulações de fármacos veterinários tanto para uso tópico quanto intravenoso [111], enquanto que ele pode ser empregado em formulações para uso tópico de seres humanos [112].

CAPÍTULO 6