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IGOR MONTEZE FERREIRA
ESTUDOS BIOQUÍMICOS E ESTRUTURAIS DA ENZIMA GLUTAMINASE-2 (GLS2) DE MAMÍFEROS
CAMPINAS-SP 2015
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RESUMO
O câncer é uma doença que afeta milhões de pessoas no mundo a cada ano. A identificação de alvos terapêuticos para seu tratamento tem sido o assunto de extensa investigação. Atualmente, é bem estabelecido que os níveis metabólicos de células tumorais são adaptados para suportar as altas taxas de crescimento e a proliferação característica de tais células cancerosas; e uma característica comum neste contexto é o elevado consumo de glicose e glutamina. Glutaminases são enzimas multidomínios responsáveis pela reação inicial para a entrada de glutamina em vias catabólicas. Mamíferos possuem dois genes distintos para glutaminases, gls e gls2. gls codifica para as isoformas, por splicing alternativo, KGA (Kidney-type glutaminase) e GAC (Glutaminase C), enquanto GLS2 codifica para as isoformas LGA (Liver-type glutaminase) e GAB (Glutaminase B), geradas por diferentes regiões de iniciação da transcrição. Coletivamente, KGA/GAC e LGA/GAB são normalmente referidas como GLS1 e GLS2, respectivamente. Este estudo concentra-se no entendimento dos mecanismos estruturais e catalíticos de GLS2, uma vez que recentemente esta tem sido relatada como importante para o crescimento e proliferação de tumores. Diversas construções de GLS2 humana foram produzidas para expressão heteróloga em sistemas bacteriano e de células de inseto. Uma construção que compreende o domínio de glutaminase foi cristalizada e a sua estrutura cristalina determinada por difração de raios X. Análise da estrutura sugere aminoácidos essenciais que podem ser responsáveis para os comportamentos cinéticos distintos entre GLS2 e GLS1. Em paralelo, estabelecemos um modo alostérico cooperativo de ativação para GLS2, como uma função de concentrações de enzima e substrato, bem como a presença do ativador fosfato inorgânico. Os coeficientes de Hill calculados demonstraram que o aumento da concentração de GLS2 nos ensaios culmina no crescimento da cooperação entre os monômeros, sugerindo ativação completa na forma de tetrâmeros. Análise complementares por gel-filtração analítica e microscopia eletrônica confirmam que GLS2 não se associa em oligômeros maiores que tetrâmeros - ao contrário de GLS1 - como função da concentração de proteína e presença de fosfato. Portanto, o aumento da cooperatividade, concomitante com o aumento da concentração de GLS2, não afeta o número de monômeros no oligômero. Uma vez que as enzimas alostéricas frequentemente participam como reguladores chave de vias metabólicas, mediante a acumulo de outros metabolitos, testamos algumas diferentes moléculas como possíveis moduladoras de GLS2 e obtivemos que, além de fosfato inorgânico, citrato, AMP (adenosina monofosfato), glicose-6-P e frutose-6-P podem eventualmente ser ativadores GLS2 biologicamente relevantes, permitindo assim, a regulação cruzada entre as vias metabólicas distintas. Finalmente, através da resolução da inédita estrutura cristalográfica do motivo ankyrin na região de C-terminal GLS2, fomos capazes de propor um modelo molecular para a GLS2 em sua forma completa, usando restrições espaciais fornecidas por SAXS. No geral, esta coleção de resultados pode ser relevante para a futura concepção de inibidores de GLS2, podendo se tornar, assim, uma abordagem terapêutica complementar para os tumores que apresentam expressão e atividade de GLS2 aumentadas.
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ABSTRACT
Cancer is a disease that affects millions of people each year worldwide. The identification of therapeutic targets for treatment has been the subject of extensive research. It is nowadays well established that the metabolic levels of tumor cells are adapted to support the high growth rates and proliferation characteristic of such cells; a common hallmark in that regard is the high consumption of glucose and glutamine by cancer. Glutaminases are multidomain enzymes responsible for the initial reaction for glutamine entry into the catabolic pathways. Mammals have two distinct genes for glutaminases, gls and gls2. gls encodes for splicing isoforms KGA (Kidney-type glutaminase) and GAC (Glutaminase C) while gls2 encodes for the LGA isoforms (Liver-type glutaminase) and GAB (Glutaminase B), under different transcription initiation sites. Collectively, KGA/GAC and LGA/GAB are referred to as GLS1 and GLS2, respectively. This study focuses on the understanding of GLS2 structural and catalytic mechanisms since it has recently been reported as important for tumor growth and proliferation. Several constructs of human GLS2 were cloned for heterologous expression in bacteria and insect cells and a construct containing the glutaminase domain was crystallized and its crystal structure determined by X-ray diffraction. Structure analysis suggests key aminoacids that may be responsible for the distinct kinetic behaviours between GLS2 and GLS1. In parallel, we have established a cooperative allosteric mode of activation for GLS2, as a function of enzyme and substrate concentrations, as well as the presence of the well-known activator inorganic phosphate. The Hill coefficient calculation demonstrated that increasing the GLS2 concentration in the assays culminates in growth of cooperation among the monomers, suggesting full activation as tetramers. Analytical Gel Filtration and Electron Microscopy confirms that GLS2 never assembles into oligomers larger than tetramers - as opposed to GLS1 – as a function of protein concentration and presence of phosphate. Therefore, the increasing of the cooperativity, concomitant with increasing GLS2 concentration, does not affect the number of monomers in the oligomer. Since allosteric enzymes often participate as key regulators of metabolic pathways, upon accumulation of other metabolites, we tested some of these ligands as possible GLS2 modulators and showed that, in addition to inorganic phosphate, citrate, AMP (adenosine monophosphate), glucose-6-P and fructose-6-P could possibly be biologically relevant GLS2 activators, thus allowing cross-talk between distinct metabolic pathways. Finally, by solving the crystallographic structure of the ankyrin repeats motif in the GLS2 C-terminal region, we are able to propose a molecular model for the full-length GLS2, using restraints provide by SAXS. Overall, this collection of results can be relevant for the future design of GLS2 inhibitors, thus becoming a complementary therapeutic approach for cancers that have increased expression and activity levels of GLS2.
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SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ... xvi
LISTA DE FIGURAS ... xviii
LISTA DE TABELAS ... xxii
LISTA DE ABREVIATURAS ... xxivv
1 - INTRODUÇÃO ... 1
1.1 - Efeito Warburg e alterações metabólicas em células tumorais... 1
1.2 - A importância da glutamina para o metabolismo proliferativo ... 3
1.3 - As diferentes glutaminases de mamíferos e seus domínios extra catalítico ... 6
1.4 - Perfil de expressão das glutaminases em tumor ... 10
1.5 - Características estruturais e cinéticas das glutaminases de mamíferos ... 12
2 - OBJETIVOS ... 16
2.1 - Objetivos Gerais ... 16
2.2 Objetivos Específicos ... 16
3 - MATERIAIS E MÉTODOS ... 16
3.1 - Obtenção de clones para expressão de GLS2 heteróloga ... 17
3.1.1 - Construção das mutações sítio-dirigidas T225K, Y251F-S255F, K253A e S219A. ... 17
3.1.2 - Clonagem de construções da GLS2 humana para expressão em bactéria 18 3.1.3 - Clonagem gênica de construções de GLS2 humana em vetor de expressão para células de inseto ... 22
3.1.4 - Infecção dos bacmídeos em células de inseto e produção de baculovírus 25 3.2 - Testes de Expressão solúvel ... 27
3.2.1 - Teste de expressão solúvel para GLS2.WT ... 27
3.2.2 - Teste de expressão solúvel das construções de GLS2 humana com 50 mL de cultura de bactéria ... 28
3.2.3 - Teste de expressão solúvel com 3 mL de cultura de células de inseto ... 29
3.2.4 - Teste de expressão solúvel com 50 mL de cultura de células de inseto .... 30
xi
3.3.1 - Expressão em larga escala e purificação da GLS2 wild type (GLS2.WT) e
dos mutantes T225K, Y251F-S255F, K253A e S219A ... 30
3.3.2 - Expressão em larga escala em bactéria e purificação do domínio glutaminase da GLS2 humana (GLS2.Cat) ... 32
3.3.3 - Expressão em larga escala em células de inseto e purificação da construção GLS2.L72 ... 34
3.3.4 - Expressão em larga escala e purificação do C-terminal da GLS2 humana (GLS2.Cterm) ... 35
3.3.5 - Proteólise limitada de GLS2.Cterm com quimiotripsina ... 37
3.4 - Estudos estruturais ... 37
3.4.1 - Montagem de placas de cristalização ... 37
3.4.2 - Coleta do padrão de difração de Raios X e resolução da estrutura da construção GLS2.Cat ... 38
3.4.3 - Difração dos cristais de GLS2.Cterm ... 39
3.4.4 - Comparação da estrutura de glutaminases ... 39
3.4.5 - Medidas e modelo de SAXS da GLS2.WT ... 40
3.5 - Análises de tamanho molecular ... 40
3.5.1 - Avaliação do tamanho molecular da GLS2.WT e mutantes por gel-filtração analítica ... 40
3.5.2 - Microscopia Eletrônica de Transmissão ... 42
3.6 - Estudos enzimáticos ... 43
3.6.1 - Ensaios de atividade enzimática ... 43
3.6.2 - Busca de moduladores da GLS2 por diferença na atividade ... 44
3.6.3 - Atividade de glutaminase nas frações mitocondriais de linhagens celulares MDA-MB 231 ... 44
3.7 - Cultivo de células, fracionamento celular e western blot ... 45
4 - RESULTADOS ... 46
4.1 - Clonagens e testes de expressão ... 46
4.1.1 - Teste de expressão de GLS2.WT em bactéria ... 46
4.1.2 - Clonagem gênica para expressão em bactéria da GLS2 humana e teste de expressão ... 47
xii
4.2 - Expressões em larga escala e purificações ... 52
4.2.1 - Expressão e purificação da GLS2.WT e dos mutantes T225K, Y251F-S255F, K253A e S219A ... 52
4.2.2 - Purificação da construção GLS2.Cat ... 54
4.2.3 - Purificação da construção GLS2.L72 expressa em células de inseto ... 56
4.2.4 - Purificação da construção GLS2.Cterm ... 57
4.2.5 - Clivagem da GLS.Cterm com quimiotripsina ... 58
4.3 - Cristalização, difração e resolução da estrutura do domínio catalítico da GLS2 ... 59
4.4 - Importância da estrutura da GLS2, mecanismo de catálise e comparação com a estrutura das outras isoformas de mamíferos e de glutaminases de outros organismos ... 61
4.5 - Estudos de cinética enzimática e tamanho molecular da GLS2.WT ... 65
4.5.1 - Cinética enzimática da GLS2.WT ... 66
4.5.2 - Cinética enzimática de mutantes da GLS2 ... 68
4.5.3 - Avaliação do tamanho da GLS2.WT e mutantes por gel-filtração analítica sem a presença do ativador fosfato inorgânico ... 70
4.5.4 - Atividade enzimática da GLS2.WT e K253A relacionada com o tamanho molecular ... 71
4.5.5 - Microscopia Eletrônica de Transmissão da GLS2.WT ... 72
4.6 - Cristalização do C-terminal da GLS2 (GLS2.Cterm digerida) ... 73
4.7 - Modelo de SAXS para GLS2.WT ... 77
4.8 - Varredura de moléculas para modulação da atividade de GLS2 ... 78
4.9 - Efeito da GLS2 na atividade glutaminolítica de células MDA-MB 231 ... 79
5 - DISCUSSÃO ... 81 6 - CONCLUSÃO ... 90 7 - PERSPECTIVAS ... 92 8 - BIBLIOGRAFIA ... 93 Anexo I ... 100 Anexo II ... 101
xiv
Dedico este trabalho a meu pai, Francisco, a minha mãe, Márcia, e a meu irmão, Gabriel, pelo apoio e amor incondicional que sempre sou agraciado.
xvi
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, gostaria de agradecer à Deus por ter me dado força e capacidade para a realização deste trabalho.
Agradeço, também, aos meus pais, Francisco e Márcia, por todo apoio, afeto e orações que para mim são indispensáveis.
Ao meu irmão, Gabriel, pelo companheirismo e amizade de uma vida toda. Ao meu orientador, Dr. Andre Ambrosio, por ter me concedido a oportunidade de fazer parte seu grupo de pesquisa e por todos os ensinamentos e contribuições para a minha formação acadêmica e profissional.
À Dra. Sandra Dias, por sempre estar disposta a contribuir com meu trabalho e minha formação acadêmica.
À todos os amigos do LNBio, em especial, do grupo PMT que fizeram do ambiente de trabalho um lugar agradável e descontraído, além de cooperarem diretamente com meu projeto.
Ao CNPEM (Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais) e LNBio (Laboratório Nacional de Biociências) por abrirem as portas para que eu pudesse realizar meu projeto de doutorado em suas instalações.
Ao SGC-Oxford (Structural Genomics Consortium) pela oportunidade de realizar a pesquisa do meu doutorado sanduíche em suas dependências.
Ao Dr. Wyatt Yue e ao Metabolic & Rare Diseases Group por terem me recebido tão bem durante o estágio em pesquisa no exterior.
Aos amigos da República Cassino e da República Amigos do Diomar, por sempre me oferecerem um lar em Campinas e não somente uma casa.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema representativo da produção de ATP em células normais e cancerosas na presença ou ausência de O2. ... 2
Figura 2. A importância da glutamina para o crescimento, proliferação e sobrevivência de células tumorais. ... 4
Figura 3. Representação molecular por traços de L-glutamina onde são apontados seus átomos de nitrogênio. ... 5 Figura 4. Esquema da reação de hidrólise de glutamina catalisada pelas enzimas
glutaminases. ... 6
Figura 5: Organização estrutural das isoenzimas das glutaminases de mamíferos. ... 9 Figura 6. Alinhamento dos domínios glutaminases de GLS1 e GLS2 de camundongo. ... 13 Figura 7. Análise cinética das isoformas GLS2 (LGA), KGA e GAC com 5 nM de enzima e em concentrações crescentes de fosfato inorgânico. ... 14 Figura 8. Imagens de Microscopia eletrônica utilizando a técnica de negative staining para as isoformas KGA, GAC e GLS2, respectivamente. ... 15
Figura 9. Esquema representativo da construção de GLS2 de camundongo clonada para expressão em bactéria. ... 17
Figura 10. Representação esquemática em barras das construções de GLS2 humana. ... 19 Figura 11. Esquema representativo das etapas de clonagem para expressão em células de inseto. ... 23 Figura 12. Representação esquemática das reações que ocorrem no ensaio acoplado para medida da cinética enzimática das glutaminases. ... 44
Figura 13. SDS-PAGE do teste de expressão solúvel para GLS2.WT de camundongo em E. coli.
... 47
Figura 14. Gel de agarose 1% do PCR de colônia para análise da ligação das construções de GLS2 humana no vetor pNIC28-Bsa4. ... 48 Figura 15. Gel SDS-PAGE do teste de expressão em bactéria das construções de GLS2 humana. ... 49
Figura 16. Gel de agarose 1% do PCR de colônia mostrando o sucesso na inserção do inserto ao vetor pFB-LIC-Bse. ... 50
Figura 17. Gel de agarose 1% do PCR de confirmação da transposição para o bacmídeo pFastBacTM, utilizando o DNA purificado. ... 50
Figura 18. SDS-PAGE do teste de expressão feito com 3 mL de cultura de células de inseto. ... 51
Figura 19. SDS-PAGE do teste de expressão realizado com 50 mL de cultura de células de inseto. ... 51
xix
Figura 20. Imagem, baseada na Figura 10, evidenciando as construções de GLS2 humana que
foram expressas em larga escala e purificadas. ... 52
Figura 21: Purificação da GLS2.WT, mutações T225K, Y251F-S255F, K253A e S219A. ... 53
Figura 22. SDS-PAGE da cromatografia de afinidade por níquel para GLS2.Cat. ... 54
Figura 23. Cromatograma e SDS-PAGE da purificação por gel-filtração para GLS2.Cat. ... 55
Figura 24. Cromatograma e SDS-PAGE da Cromatografia de Troca Iônica para GLS2.Cat. . 55 Figura 25. Análise por Espectrometria de Massas (MALDI-TOF) da amostra da proteína GLS2.Cat purificada e usada para cristalização. ... 56
Figura 26. Etapas de purificação da proteína GLS2.L72. ... 57
Figura 27. Purificação da Construção GLS2.Cterm. ... 58
Figura 28. O gel de SDS-PAGE mostra a proteína purificada antes da digestão e depois da digestão com quimiotripsina. ... 59
Figura 29. Sequência da construção GLS2.Cterm e identificação das regiões de clivagem por quimiotripsina. ... 59
Figura 30. Processo de resolução da estrutura cristalográfica do domínio catalítico da GLS2. ... 60
Figura 31. Estrutura cristalográfica do domínio catalítico da GLS2 com destaque da cavidade do sítio de reação da enzima. ... 62
Figura 32. Sobreposição das estruturas da GAC com fosfato inorgânico (PDB 3SS4), KGA com glutamato (PDB 3CZD), KGA apo (PDB 3VOY) e GLS2 apo (4BQM) indicando os contatos polares do fosfato inorgânico. ... 62
Figura 33. Sobreposição das estruturas da GAC com fosfato inorgânico, KGA com glutamato, KGA apo e GLS2 apo, indicando os contatos polares do L-glutamato. ... 63
Figura 34. Região da cavidade catalítica da GLS2. ... 63
Figura 35. Comparação entre os tetrâmeros de sítios catalíticos de GLS2, de GLS1 e das glutaminases de bactérias Ybgj (B. subitilis) e Ybas (E. coli). ... 64
Figura 36. Mecanismo de catálise da hidrólise de glutamina pelas glutaminases. ... 65
Figura 37. Cinética enzimática da GLS2 variando a concentração de GLS2 de 5 nM a 500 nM na ausência e na presença de 20 mM do ativador fosfato inorgânico (Pi). ... 67
Figura 38. Atividades de GLS2.WT e mutantes medidas com 100 nM de enzima e 20mM de fosfato inorgânico. ... 69
Figura 39. Cinética enzimática da atividade glutaminolítica de GLS2.WT e K253A à 0 mM e 20 mM de fosfato inorgânico. ... 72
Figura 40. Tamanho, em raio de Stokes, em diferentes concentrações da GLS2.WT e K253A com 0 mM e 20 mM de fosfato inorgânico. ... 72
xx
Figura 42. Cristalização da porção C-terminal da GLS2. ... 74 Figura 43. Esquema da resolução da estrutura cristalográfica dos motivos ankyrin da GLS2. 75 Figura 44. Estrutura cristalográfica do homodímero formado pelos motivos ankyrin (3 por monômero) presentes na região C-terminal da GLS2. ... 76
Figura 45. Os três motivos em tandem, vistos por dois ângulos diferentes, presentes na porção C-terminal da GLS2. ... 77 Figura 46. Sobreposição do envelope de SAXS da GLS2 com estruturas cristalográficas de diferentes porções das glutaminases de mamífero. ... 78
Figura 47. Atividade relativa da GLS2.WT com ligantes. ... 79 Figura 48. Atividade e localização subcelular de glutaminase em célula. ... 80
xxii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Primers direto e reverso utilizados para gerar as mutações sítio-dirigidas em GLS2. ... 18 Tabela 2. Primers utilizados para a clonagem das diferentes construções de GLS2 humana. 20 Tabela 3. Parâmetros da coleta de dados de cristalografia de raios-X e estatísticas do refinamento da estrutura cristalográfica do domínio catalítico da GLS2 humana. ... 61 Tabela 4. Apresentação dos parâmetros cinéticos da curva sigmoidal de cooperatividade para a GLS2. ... 68 Tabela 5. Parâmetros da cinética enzimática da GLS2.WT e mutantes medidos com 100 nM de enzima e 20 mM de fosfato. ... 69
Tabela 6. Dados da gel-filtração analítica da GLS2.WT e mutantes. ... 71 Tabela 7. Parâmetros da coleta de dados de cristalografia de raios X e estatísticas do refinamento da estrutura cristalográfica do domínio catalítico da GLS2 humana. ... 75
xxiv
LISTA DE ABREVIATURAS
aa: aminoácido
acetil-Coa: Acetil-Coenzima A
ADP: adenosina difosfato
AMP: Adenosine monofosfato
AMPK: AMP-activated protein kinase
APBS: Adaptive Poisson-Boltzmann Solver
ATP: Adenosine trifosfato
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
BPTES: Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide
BSA: Bovine serum albumin
Chym: Quimiotripsina
CNPEM: Centor Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais
dCTP: desoxicitidina trifosfato
dGTP: desoxiguanosina trifosfato
DLS: Dynamic Light Scattering
DNA: ácido desoxirribonucleico
dNTP: desoxinucleotídeo trifosfato
DOC: ácido deoxicólico
DTT: ditiotreitol
ECL: enhanced chemiluminescence
F-6P: fructose-6-fosfato
FBS: Fetal Bovine Serum
xxv FT: Flow through G-6P: glucose-6-fosfato GAB: Glutaminase B GAC: Glutaminase C GDH: Glutamato Desidrogenase
GIP-1: Glutaminase-interacting protein
GLS1: Glutaminase-1
GLS2.Cat: Construção de GLS2 humana que expressa o domínio catalítico
GLS2.Cterm: Construção que expressa a porção C-terminal da GLS2 humana
GLS2.L72: Construção de GLS2 humana que abrange o resíduo Leu72 ao Val602
GLS2.WT: GLS2 wild type
GLS2: Glutaminase-2
GSH: glutationa
Ins: fração insolúvel
IPTG: Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo
K253A: Mutação pontual K253A da GLS2
KGA: Kidney-type Glutaminase
LB: Lysogeny Broth
LGA: Liver-type Glutaminase
LIC: Ligation-Independent Cloning
LNBio: Laboratório Nacional de Biociências
LNNano: Laboratório de Nacional de Nanotecnologia
MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight
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mTOR: mammalian Target of Rapamycin
NAD+: Nicotinamida adenine dinucleotídeo oxidado
NADP+: Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato oxidado
NADPH: Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato reduzida
NRBox: Nuclear receptor box
OD280: Densidade óptica a 280 nm
PCR: Polimerase Chain Reaction
PDB: Protein Data Bank
PDZ: PSD95/Dlg/Z01
PEP: fosfoenolpiruvato
PFKFB3: fosfofrutoquinase/frutose-2,6-bifosfato B3
Pi: fosfato inorgânico
pI: ponto isoelétrico
PI3K/AKT: fosfoinositida 3-quinase/proteína quinase B
PKM1: piruvato quinase M1
PKM2: piruvato quinase M2
PMSF: fenilmetanosulfonilfluoreto
ROS: Reactive Oxygen Species
rpm: rotações por minuto
S219A: Mutação pontual S219A da GLS2
SAXS: Small-Angle X-ray Scattering
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SGC: Structural Genomics Consortium
xxvii
Sol: fração solúvel
T225K: Mutação pontual T225K da GLS2
TB: Terrific Broth
TCA: ciclo do ácido tricarboxílico
TE: Tampão de Eluição
TEV: Tobacco Etch Virus
TL: Tampão de Ligação
tRNAs: RNA transportador
TV: Tampão de Lavagem
UbgJ: Glutaminase de B. subtilis
Y251F-S255F: Mutação dupla Y251F-S255F da GLS2
1
1 - INTRODUÇÃO
1.1 - Efeito Warburg e alterações metabólicas em células tumorais
Câncer é uma classe de doença onde células iniciam um processo de divisão descontrolado, podendo tornar-se invasivas e, através da corrente sanguínea ou do sistema linfático, se espalhar para regiões do corpo diferentes de onde o tumor se originou. Segundo a Organização Mundial da Saúde, o câncer é a principal causa de morte em todo o mundo, sendo responsável por 8,2 milhões de mortes em 2012 (1).
Cada tipo de câncer apresenta diferenças peculiares com relação às células normais do qual foi derivado. Entretanto, alguns aspectos são comuns a todos ou à maioria deles, sendo estes conhecidos como os hallmarks da transformação tumoral (2). A adaptação metabólica é um destes processos amplamente presentes em todos os cânceres.
Células normais diferenciadas têm a fosforilação oxidativa mitocondrial como a principal maneira de obtenção de energia para os processos celulares, enquanto que a maioria das células cancerosas obtém parte substancial de sua energia através da glicólise aeróbica. Este processo, diferentemente da fermentação, ocorre mesmo com disponibilidade de oxigênio, e foi primeiramente descrito pelo fisiologista alemão Otto Warburg (3), tendo sido chamado efeito Warburg (Figura 1). Um aspecto curioso do efeito Warburg é que durante a glicólise, o saldo é de apenas 2 ATPs (Adenosine-5'-triphosphate) por molécula de glicose e através da fosforilação oxidativa mitocondrial, cada molécula de glicose pode gerar cerca de 36 ATPs (4). Levantando a questão de qual seria a vantagem dessa modificação metabólica. Uma explicação para esse fato é de que a eficiência da produção de ATP seria um fator importante para a proliferação celular apenas se as fontes de energia fossem escassas. Entretanto, sabe-se que, além do aumento na expressão de transportadores de nutrientes, os tumores estimulam a angiogênese e, desta maneira, garantem suprimento pela corrente sanguínea.
2 Outra explicação para a preferência pela glicólise aeróbica é que, para atender as demandas relacionadas com a constante proliferação celular, a necessidade por blocos biossintéticos e NADPH (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) é aumentada em células tumorais, e é maior que a necessidade por ATP como precursor biossintético (5). Por exemplo, para a formação do principal ácido graxo constituinte das membranas celulares, o palmitato, são necessárias 8 moléculas de acetil-CoA (acetil coenzima A), 14 moléculas de NADPH doadoras de elétrons e 7 ATPs (4).
Figura 1. Esquema representativo da produção de ATP em células normais e cancerosas na presença ou ausência de O2. Células diferenciadas normais têm a maioria de seus ATPs produzidos através da
fosforilação oxidativa, na presença de O2, e através da glicólise, na ausência de O2. Células proliferativas
e cancerosas produzem a maioria do ATP através da glicólise independentemente da disponibilidade de O2. Retirado de (5).
Após ser fosforilada à glicose-6-fosfato, a glicose pode ser desviada da rota da glicólise e entrar na via das pentoses fosfato onde ocorre produção de NADPH, que contribui para a defesa antioxidante celular, e ribose-5-fosfato, que é um dos principais
3 precursores da biossíntese de nucleotídeos (6).Outros intermediários da glicólise são desviados para a produção de aminoácidos não essenciais (4).
As duas moléculas catabolizadas em maior quantidade em células tumorais são a glicose e a glutamina, indicando que elas suprem a maioria do carbono, nitrogênio, energia livre e equivalentes redutores necessários para suportar o crescimento e divisão celular. O metabolismo de glutamina e glicose em células cancerosas está intimamente relacionado. Células de câncer de fígado e pulmão induzidos pelo fator de transcrição MYC captam mais glicose e apresentam maior taxa de produção de lactato e também maior atividade glutaminolítica comparados a células de tumores induzidos pelo fator de transcrição MET, o que pode explicar o fato das primeiras serem mais proliferativas que as últimas (7). O laboratório no qual este projeto de doutorado foi desenvolvido é focado na compreensão da importância do metabolismo de glutamina para a proliferação de células tumorais e no estudo das enzimas envolvidas nesse processo, do ponto de vista estrutural, molecular e celular.
1.2 - A importância da glutamina para o metabolismo proliferativo
A glutamina é um aminoácido tradicionalmente visto como não-essencial, cuja função primária é a de armazenamento de nitrogênio nos músculos e principal transportador de nitrogênio entre os órgãos. Embora constitua aproximadamente 4% de toda a massa proteica muscular, quando na forma livre, a glutamina pode contribuir com até 20% da fração de aminoácidos livres em plasma sanguíneo e com mais de 40% em músculos (8, 9). Mamíferos podem sintetizar glutamina em diversos tecidos, porém, durante períodos de rápido crescimento ou de doenças, onde a demanda por esse aminoácido excede a sua disponibilidade, torna-se nesse contexto um aminoácido essencial. Esse conjunto de observações faz hoje com que a glutamina seja considerada como “condicionalmente” essencial.
4 Células proliferativas são ávidas consumidoras de glutamina, por ser um dos nutrientes mais versáteis dentro do contexto do metabolismo intermediário e da mediação de vias de sinalização em mamíferos, como o transporte de aminoácidos essenciais e a estimulação da mTOR (mammalian Target of Rapamycin) (Figura 2). Desta maneira, a glutamina exerce papel importante na regulação do crescimento, proliferação, mobilidade e sobrevivência celular, além do processo de transcrição e síntese de proteínas (10).
Figura 2. A importância da glutamina para o crescimento, proliferação e sobrevivência de células tumorais. A figura mostra processos metabólicos, como a alimentação do ciclo do TCA com α-KG (α-cetoglutarato), a síntese de GSH (glutationa), nucleotídeos e glicosaminas e processos não metabólicos como o transporte de aminoácidos essenciais e a ativação de mTOR. GLS representa glutaminas; Ac-Coa, Acetil-Coa; Cit, citrato; Cys, cisteína; Cys-Cys, cistina; GLS, glutaminase; Glu, glutamato; GSH, glutationa; Lac, lactato; Mal, malato; ME, enzima málica; mTORC1, mTOR complexo 1; NEAA, aminoácidos não-essenciais; OAA, oxaloacetato; Pyr, piruvato; SLC1A5, carreador de soluto família 1, membro 5; SLC7A5, carreador de soluto família 7, membro 5. Adaptado de (11).
O alto consumo de glutamina por tumores está relacionado à dependência por esse aminoácido como precursor anaplerótico do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (11, 12), de maneira a suprir as demandas por blocos biossintéticos essenciais para a
5 síntese de novas proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos, constantemente requeridos para a divisão celular.
O destino metabólico da glutamina, por sua vez, pode ser ramificado em duas vias, dependendo do grupo químico a ser aproveitado. Na primeira via, o nitrogênio ligado ao carbono-δ (nitrogênio do grupo amida da glutamina) é utilizado para a biossíntese de nucleotídeos e de hexosaminas. Nesse caso, a glutamina é precursora direta da síntese tanto de anéis purínicos como pirimidínicos. O nitrogênio do grupo amida de duas moléculas de glutamina são utilizados para produzir um anel purínico e um terceiro é utilizado na conversão de xantina monofosfato a guanosina monofosfato. Na formação de anéis pirimidínicos é utilizado um nitrogênio do grupo amino da glutamina e um do aspartato, e outro nitrogênio proveniente de um grupo amino é adicionado à uridina trifosfato para formar citidina trifosfato (11).
Figura 3. Representação molecular por traços de L-glutamina onde são
apontados seus átomos de
nitrogênio. O nitrogênio do grupo amina e o nitrogênio amida estão indicados.
A segunda via faz uso do nitrogênio do grupo amina e/ou do esqueleto carbônico (Figura 3). Esses grupos químicos contribuem para a síntese de aminoácidos não-essenciais, como aspartato e alanina, e agentes antioxidantes, como a GSH (glutationa). Adicionalmente, o metabolismo da glutamina contribui para a geração de combustível respiratório através da sua oxidação no ciclo do TCA (ácido tricarboxílico). A oxidação do esqueleto carbônico desse aminoácido dentro da mitocôndria é uma das principais
6 fontes de energia em linfócitos, enterócitos, fibroblastos e diversas linhagens tumorais (11–14).
Um importante ponto em comum entre todas as reações inseridas na segunda via é que estas utilizam de fato o aminoácido glutamato derivado da hidrólise da glutamina. Apesar da glutamina ser um nutriente abundante, o glutamato não o é. A reação catalisada pelas glutaminases gera, pela quebra hidrolítica da cadeia lateral da glutamina, glutamato e mais um íon amônio (Figura 4). O processo de degradação da glutamina para o uso no metabolismo celular é chamado glutaminólise.
Figura 4. Esquema da reação de hidrólise de glutamina catalisada pelas enzimas glutaminases.
O glutamato gerado pela glutaminólise é então oxidado a α-cetoglutarato, pela glutamato desidrogenase, e entra no ciclo do TCA. A anaplerose do ciclo do TCA pelo α-cetoglutarato é de suma importância para a manutenção do equilíbrio metabólico nas situações de cataplerose ou baixa entrada de piruvato glicolítico, típicas de células proliferativas, o que as torna altamente dependentes de glutamina para a sobrevivência.
7 Mamíferos contêm dois genes distintos, porém estruturalmente relacionados, que codificam para pelo menos quatro diferentes isoenzimas de glutaminases (15, 16). O gene gls, constituído de 19 éxons e presente no cromossomo 2, codifica para duas isoformas produzidas por splicing alternativo, denominadas KGA e GAC. KGA ou Kidney-type glutaminase é expressa de maneira constitutiva na maioria dos tecidos, com exceção do fígado (17–19). GAC ou Glutaminase C é produto de splicing alternativo do gene gls1, e consiste da sequência que codifica para os éxons 1-15, enquanto a KGA é formada pelos exons 1-14 acrescido do 16-19. A GAC é comumente encontrada em coração, pâncreas, rim e pulmão, assim como em tecidos tumorais (18). KGA e GAC compartilham completa identidade sequencial desde o N-terminal até o fim do domínio glutaminase, e devido à ocorrência de splicing após a sequência codificante para estas regiões, o C-terminal das duas é somente 4% idêntico.
O gene gls2, presente no cromossomo 12, consiste em 18 éxons e codifica para a enzima LGA (Liver-type glutaminase). Originalmente identificada no fígado, LGA também é encontrada em tecidos cerebrais e no pâncreas (20). Recentemente foi reportada a identificação de uma outra isoforma das glutaminases, a GAB (Glutaminase B) que é codificada por todos os 18 éxons do gene gls2, enquanto LGA não possui o primeiro éxon devido a dois mecanismos de modulação da transcrição, iniciação alternativa da transcrição e promotor alternativo (21). Os termos GLS1 (Glutaminase-1) e GLS2 (Glutaminase-2) têm sido usados para se referir às proteínas codificadas por gls e gls2, respectivamente, independentemente da isoforma expressa. No caso deste trabalho, será utilizada a denominação GLS2 para as construções expressas de maneira heteróloga para estudos bioquímicos e estruturais da proteína LGA/GAB, uma vez que as construções começam e terminam em porções que são comuns à LGA e GAB. A nomemclatura GLS1 será usada quando não for necessária distinção entre KGA e GAC, mas as duas isoformas serão tratadas individualmente em alguns casos.
8 Uma representação esquemática da organização estrutural das proteínas GAC, KGA e GLS2 pode ser encontrada na Figura 5. Apesar de serem originadas de genes diferentes, as principais diferenças entre as sequências de nucleotídeos que codificam para as isoenzimas KGA e GLS2 encontram-se somente no éxon inicial e nos que procedem ao sítio catalítico (éxons 16 ao 19 em KGA e 16 ao 18 em LGA). O éxon 1 compartilha 62.5% de similaridade entre os dois genes e codifica para 129 resíduos em KGA, enquanto que somente 61 na LGA. A sequência codificada contém os sinais envolvidos para o direcionamento das proteínas para a mitocôndria. O éxon 18 da GLS2 possui o menor índice de similaridade entre as duas isoenzimas (29.4%). Porém, o domínio glutaminase dessas enzimas apresentam 81% de identidade e 90% de similaridade.
Como mostrado na Figura 5, além da sua função como enzima, GLS2 possui regiões adicionais, tanto na porção N- como na C-terminal, contendo algumas sequências consenso e domínios funcionais já descritos para outras proteínas, sugerindo que GLS2 seja multifuncional (20). Na extremidade N-terminal da GLS2 foi identificada uma sequência de 5 aminoácidos de consenso LXXLL (X representa qualquer aminoácido) para NRbox (Nuclear Receptor box), encontrada em proteínas que regulam o funcionamento (ativando ou reprimindo) de receptores nucleares, levantando a hipótese de que estes segmentos estejam envolvidos na associação das glutaminases com receptores nucleares. Apesar de alguns trabalhos demonstrarem a co-localização de GLS2 no núcleo em algumas células, o receptor alvo (caso exista), ou o mecanismo pelo qual GLS2 alcança esse compartimento também permanecem desconhecidos.
9
Figura 5: Organização estrutural das isoenzimas das glutaminases de mamíferos. KGA e GAC (GLS1) são produtos de splicing alternativo de gls1, enquanto que LGA e GAB (GLS2) são codificadas por gls2. Em comum, GLS1 e GLS2 possuem o sinal de localização para a mitocôndria, designado MS, o domínio catalítico Glutaminase (identidade sequencial acima de 80%), além de um motivo NRbox, de possível interação com receptores nucleares. KGA e GLS2 ainda possuem motivos ankyrin, que podem estar envolvidos na interação com outras proteínas. Na região C-terminal, KGA possui ainda outra sequência NRbox, enquanto que GLS2 tem uma sequência de interação com domínio PDZ, o motivo ZB. Não existe predição de motivos conhecidos para a região C-terminal de GAC. A tesoura representa a região processada uma vez que as isoenzimas recém-sintetizadas são direcionadas para a mitocôndria. Adaptado de (17).
Três repetições do motivo conhecido como ankyrin são encontradas na região C-terminal, adjacente ao domínio catalítico, em KGA e GLS2. Repetições Ankyrin estão presentes em proteínas de organismos dos três domínios de classificação dos seres vivos: Bacteria, Archaea e Eukarya(22). O número de repetições varia entre as proteínas e pode ir de dois a mais de uma dezena (22). Cada repetição possui uma sequência consenso de 33 aminoácidos e se enovela em uma estrutura de hélice-loop-hélice com um loop β-hairpin projetando para fora das α-hélices (23). Repetições ankyrin medeiam interações proteína-proteína e são um dos motivos mais comuns para tal função. Essas repetições são bastante frequentes em proteínas que regulam o ciclo celular, o transporte de íons, a transmissão de sinais e a transcrição (24). O presente trabalho apresenta a estrutura cristalográfica da porção C-terminal da GLS2 que contém as repetições ankyrin. Mesmo que ainda não tenham sido descritas possíveis proteínas que interajam com GLS2 através desse motivo.
Ainda, os 6 últimos aminoácidos da sequência da GLS2 foram caracterizados por reconhecerem e se ligarem à proteínas do tipo PDZ (PSD95/Dlg/ZO1), comumente
10 encontradas no cérebro (20). Mais de uma centena de proteínas já foram identificadas possuindo esse tipo de enovelamento e estão comumente envolvidas em vias de sinalização e na formação de complexos multiméricos (25–27). Nesse caso, já foi identificado um parceiro para GLS2, denominado Glutaminase-interacting protein, ou GIP-1, inicialmente identificado em um ensaio de duplo híbrido em levedura. Estudos de co-localização de GLS2 e GIP-1 em modelos de células neuronais sugerem que essa última pode contribuir para a distribuição sub-celular da GLS2 e até mesmo influir em sua função (25, 26).
1.4 - Perfil de expressão das glutaminases em tumor
Como consequência do processo de adaptação metabólica favorável ao fenótipo altamente proliferativo, células em constante divisão apresentam padrão de expressão diferenciado de algumas isoformas de enzimas metabólicas. A piruvato quinase é uma enzima glicolítica que catalisa a conversão de fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato, gerando um ATP por reação. A maioria dos tipos de células tumorais expressam isoforma M2 de piruvato quinase M (PKM2), enquanto que a isoforma M1 (PKM1) é expressa principalmente em células normais diferenciadas (28). O gene da fosfofrutoquinase/frutose-2,6-bifosfato B3 (PFKFB3) possui 6 variantes por splicing alternativo, com dois deles sendo mais expressos em tumores que em células normais (29). A isoforma 2 da hexoquinase e a isoforma L1 da transcetolase são outros exemplos desse tipo de expressão diferencial (30, 31).
No caso das glutaminases, a preferência das células tumorais por uma isoforma também é observada. Inicialmente a expressão de GLS1 foi descrita como preferencial em tumores e correlacionada com altas taxas de proliferação celular (32–34), enquanto GLS2 era apontada como tendo somente efeito antitumoral (32, 35–37). Todavia, ultimamente tem sido reportada a ação de GLS2 no sentido de aumentar a proliferação
11 tumoral e a resistência de câncer cervical à radiação ionizante (38, 39). Portanto, dava-se preferência à busca de inibidores específicos de GLS1 como alternativas terapêuticas no tratamento de tumores (34, 40). No entanto, com a recente descrição de GLS2 como um alvo terapêutico em potencial em alguns casos específicos de câncer, já se têm descritos alguns inibidores de GLS2 com pouco efeito em GLS1 (38).
Os tipos de câncer em que GLS2 é mais extensivamente descrita como diminuidora da proliferação tumoral são aqueles originados de células hepáticas e células do sistema nervoso (36, 37, 41). Nesses tipos tumorais a diminuição da expressão de GLS2 pode ser explicada pelo fato de que a transcrição do gene gls2 é fortemente regulada pelo supressor de tumor p53. Foi demonstrado que a ativação de p53 induz um aumento na expressão de GLS2, aumentando os níveis de glutamato e α-cetoglutarato e, consequentemente, a respiração mitocondrial. Ainda, níveis de glutationa reduzida (GSH) são elevados, protegendo, assim, as células contra os altos níveis de ROS (Reactive Oxygen Species) (36, 37). Em grande parte dos tumores, p53 contém mutações ou é inexistente, logo, a expressão de GLS2 se torna baixa. Também foi descrito que, em células de hepatocarcinoma o promotor de gls2 sofre hipermetilação em ilhas CpG, o que epigeneticamente reduz a expressão de GLS2 comparada à células de tecido adjacente ao tumor (42). No entanto, o mecanismo molecular pelo qual GLS2 influencia o grau de proliferação celular de células normais ou cancerosas, para mais ou para menos, está pouco elucidado e ainda é alvo de intenso estudo. Sabe-se que GLS2 pode afetar o nível de expressão gênica de outros genes e essa influência pode ser dada pela modificação na concentração de glutamina/glutamato intracelular ou devido à interação de GLS2 diretamente com outras proteínas envolvidas na regulação gênica (35). Em termos de sinalização celular, foi mostrado que a diminuição da proliferação de células de carcinoma hepatocelular causada pela superexpressão de GLS2 ectópica está relacionada à regulação negativa da sinalização da via PI3K/AKT
12 (43), e em casos onde GLS2 age de maneira a favorecer a proliferação celular evidencia-se a ativação de mTOR mediada por AMPK (38).
Em um projeto multidisciplinar e colaborativo com o laboratório da Dra. Sandra M. G. Dias, também pesquisadora do LNBio, estamos estudando a importância da atividade catalítica de GLS2 em um modelo de ação desta proteína no favorecimento da proliferação de células cancerosas de mama, da linhagem MDA-MB231 (estudo em andamento, dados não publicados). Este efeito inédito é observado quando a atividade glutaminase de GLS1 é inibida seja por administração de inibidores específicos de GLS1 ou pela diminuição dos níveis proteicos por knock down. Ou seja, em casos de tumores tratados com inibidores de GLS1, pode ocorrer das células se adaptarem, produzindo GLS2 em grandes quantidades, tornando-se resistentes a esse tipo de tratamento. Portanto, nesse caso a GLS2 seria um novo alvo terapêutico.
1.5 - Características estruturais e cinéticas das glutaminases de mamíferos
Como mencionado na Seção 1.3, KGA e GAC (GLS1) possuem os domínios glutaminases idênticos e compartilham de 81% de identidade sequencial com o domínio catalítico de LGA e GAB (GLS2), que por sua vez são idênticos entre si (Figura 6). Ainda, o alinhamento estrutural do domínio glutaminase de GLS1, GLS2 e de glutaminases de bactérias mostra alto grau de sobreposição entre elas (dados mostrados na seção de resultados). Os resíduos destacados na Figura 6 estão localizados no sítio ativo onde ocorre a catálise ou bem próximo a ele e mutações nesses resíduos foram estudadas neste trabalho para se avaliar a importância deles no mecanismo de catálise. Três desses resíduos estão localizados no gating loop, que é uma região flexível, que normalmente não apresenta mapa de densidade eletrônico definido em estruturas cristalográficas de glutaminase de mamífero, e que parece ser responsável pela acessibilidade do substrato ao sítio catalítico e também pela ciclagem (turnover) da
13 enzima no mecanismo de catálise (44, 45). Apesar da maior parte do gating loop não possuir mapa de densidade eletrônica nas estruturas cristalográficas de glutaminases de mamíferos, a análise dessas estruturas indicam que o mecanismo de ação do gating loop está diretamente relacionado com a oligomerização da proteína (44).
Figura 6. Alinhamento dos domínios glutaminases de GLS1 e GLS2 de camundongo. As sequências são 81% idênticas e 90% similares. Em vermelho está destacado o resíduo de serina que serve como nucleófilo no mecanismo de hidrólise da glutamina. Em azul está evidenciado o resíduo de lisina situado no gatting loop, cuja mutação para alanina ativa GLS1 em centenas de vezes (45). Em verde são mostrados os resíduos situados no bolsão catalítico que diferem entre GLS1 e GLS2 e que foram mutados para avaliação do efeito na catálise. O alinhamento foi feito utilizando a ferramenta online ClustalW2 (46).
Mesmo possuindo domínio glutaminase altamente conservados, GLS1 e GLS2 apresentam cinéticas enzimáticas consideravelmente distintas (44, 47). Em publicação do nosso grupo de pesquisa, uma comparação dos parâmetros cinéticos da atividade de GAC, KGA e GLS2 de mamíferos, expressas de forma heteróloga em bactéria e purificadas, mostra que GAC e KGA possuem maior 𝑉𝑚𝑎𝑥 (Velocidade máxima) e menor
𝐾𝑚 em relação à GLS2, quando em presença do ativador fosfato inorgânico (Figura 7) (44). A atividade das glutaminases de mamífero é muito baixa ou inexistente na ausência de fosfato inorgânico e o mecanismo pelo qual ele ativa a enzima está relacionado com a oligomerização da proteína (45).
14
Figura 7. Análise cinética das isoformas GLS2 (LGA), KGA e GAC com 5 nM de enzima e em concentrações crescentes de fosfato inorgânico. A) Os valores de Km mostram que a afinidade pelo substrato glutamina da KGA e GAC aumenta com o aumento da concentração de fosfato. B) A constante catalítica é menos aumentada para KGA com o aumento da concentração de fosfato. C) GAC é a isoenzima mais eficiente quando a concentração de fosfato está acima de 10 mM. Retirado de (44).
Outra diferença entre os modos que GLS1 e GLS2 fazem a hidrólise de glutamina é que KGA e GAC apresentam cinética de Michaelis-Menten enquanto GLS2 apresenta cinética sigmoidal/alostérica com cooperação positiva pela ligação do substrato (47, 48). O fato de ser uma enzima que apresenta alosterismo com relação ao substrato e tem atividade modulada por outras moléculas, pode indicar que GLS2 está envolvida na regulação de via metabólica (4, 49).
É conhecido que a associação em tetrâmeros é a unidade oligomérica mais simples para que as glutaminases de mamíferos apresentem atividade catalítica. Inclusive o mecanismo de ação proposto para a benzofenantridinona 968, um inibidor de GLS1, é a estabilização de monômeros ou dímeros da proteína, desfavorecendo a formação de tetrâmeros e resultando na diminuição da atividade catalítica (40).
Ainda, foi observado por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) que KGA e GAC quando ativadas por fosfato inorgânico podem adquirir formas oligoméricas ainda mais complexas e formarem fibras, enquanto GLS2 permanece como oligômeros menores (Figura 8). Sendo que o tamanho da fibra está diretamente relacionado com a eficiência catalítica (45). Foi mostrado que o inibidor específico de GLS1 Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide (BPTES), além de estabilizar o
15 tetrâmero em uma conformação inativa, atua também rompendo os superoligômeros (45). Então, a capacidade de formar fibras pode ser um ponto chave na diferença de mecanismo catalítico de GLS1 e GLS2.
Figura 8. Imagens de Microscopia eletrônica utilizando a técnica de negative staining para as isoformas KGA, GAC e GLS2, respectivamente (45). Mostrando a formação de fibras para KGA e GAC e que GLS2 não se organizam dessa forma. As imagens foram obtidas para as proteínas em tampão contendo 20 mM de fosfato.
O estudo da oligomerização de GAC e KGA possui um volume considerável de trabalhos já publicados na literatura, porém, o mesmo ainda não ocorre para GLS2. Portanto, o presente trabalho apresenta um extensivo estudo do estado oligomérico da GLS2 e sua relação com a atividade enzimática.
Nas seções seguintes são mostrados os resultados obtidos durante o doutorado no país como estudante do Instituto de Biologia da Unicamp com pesquisa realizada no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), sob orientação do Dr. Andre L. B. Ambrosio, e também na Universidade de Oxford, Inglaterra, no Structural Genomics Consortium (SGC) onde foi realizado doutorado sanduíche, sob orientação do Dr. Wyatt Yue. São apresentadas a estrutura cristalográfica do domínio catalítico de GLS2 humana e estudos de cinética enzimática da GLS2 e alguns mutantes. Também análises do tamanho molecular de GLS2 para correlacionar a atividade enzimática com o estado
16 oligomérico da enzima. Ainda, são mostrados estudos estruturais da porção C-terminal da GLS2.
2 - OBJETIVOS
2.1 - Objetivos Gerais
Como as diferentes glutaminases de mamíferos possuem propriedades particulares de ativação por oligomerização e cinética enzimática, esse trabalho tem como objetivo geral caracterizar o mecanismo de catálise e a cinética enzimática da GLS2 bem como fornecer informações estruturais da proteína que possam ajudar no melhor entendimento do metabolismo tumoral.
2.2 Objetivos Específicos
- Clonagem gênica de diferentes construções de GLS2 humana para expressão
heteróloga em bactéria e células de inseto;
- Realizar teste de expressão solúvel das construções de GLS2 clonadas; - Expressão em larga escala, purificação e cristalização da GLS2;
- Resolução da estrutura cristalográfica do domínio catalítico da GLS2;
- Comparar a estrutura cristalográfica do domínio catalítico da GLS2 humana com glutaminases de outros organismos;
- Caracterizar a cinética de atividade da GLS2 de camundongo; - Identificar moduladores da GLS2 utilizando de ensaio de atividade; - Caracterizar o estado oligomérico da GLS2;
- Resolução da estrutura cristalográfica da porção C-terminal da GLS2.
17
3.1 - Obtenção de clones para expressão de GLS2 heteróloga
3.1.1 - Construção das mutações sítio-dirigidas T225K, Y251F-S255F,
K253A e S219A.
A construção da GLS2 wild-type de Mus musculus (GLS2.WT) já havia sido clonada em vetor pET28a (Invitrogen) pelo Dr. Andre L. B. Ambrosio e estava disponível em nosso laboratório (Ref. NM_001033264). Esta se inicia a partir do aminoácido lisina 72 e termina no último aminoácido predito, a serina 602 (Figura 9).
Figura 9. Esquema representativo da construção de GLS2 de camundongo clonada para expressão em bactéria. A construção inicia no resíduo Leu72 e termina no resíduo Val602.
Os mutantes foram obtidos utilizando reações de PCR (Polimerase Chain Reaction) com o kit QuickChange®II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies) e primers internos contendo as mutações (Tabela 1). A reação foi montada, o termociclador programado conforme recomendações do fabricante do kit e o tempo de reação foi o suficiente para replicar todo o vetor no qual o gene está inserido (pet28a). Após o PCR, o DNA foi incubado com DpnI, uma enzima de restrição que digere DNA metilado, por 1 hora a 37ºC. Como o DNA formado no PCR não contém metilação, apenas os plasmídeos utilizados como molde são digeridos pela DpnI, logo, somente os plasmídeos gerados pelo PCR são viáveis para transformação em bactéria. Para a transformação por choque térmico colocou-se 2 µL de plasmídeo em 50 µL de cultura com Escherichia coli cepa TOP-10 e incubou-se em gelo por 30 minutos. Depois, foi dado o choque térmico por 45 segundos a 42ºC, os tubos foram colocados novamente em gelo por 5 minutos. Adicionou-se 500 µL de meio LB (Lysogeny Broth) e
18 incubou-se por 1 hora a 37ºC. Então a cultura foi plaqueada em meio LB-ágar contendo 50 mg.mL-1 de kanamicina e as placas foram incubadas a 37ºC overnight. No dia seguinte uma colônia de cada construção foi usada para o inóculo do miniprep, que foi realizado seguindo protocolo do kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Todas as mutações pontuais foram confirmadas por sequenciamento.
Mutação Primer Direto (5’ – 3’) Primer Reverso (5’ – 3’)
T225K CTGTGTCAAGCCCCTCAAATACGCCATCTCCGTGAG CTCACGGAGATGGCGTATTTGAGGGGCTTGACACAG
Y251F –
S255F
GCGCTTTAACAAACTCTTCCTCAATGAGGAAGGAA TTCCTTCCTCATTGAGGAAGAGTTTGTTAAAGCGC K253A GGTCTGCGCTATAACGCACTCTCCCTCAATGAGGA TCCTCATTGAGGGAGAGTGCGTTATAGCGCAGACC S219A TCCCCTTCTGCCTGCAGGCCTGTGTCAAGCCCCTCAC GTGAGGGGCTTGACACAGGCCTGCAGGCAGAAGGGGA
Tabela 1. Primers direto e reverso utilizados para gerar as mutações sítio-dirigidas em GLS2.
3.1.2 - Clonagem de construções da GLS2 humana para expressão em
bactéria
Na realização do estágio no exterior diversas construções de GLS2 humana foram clonadas tanto em vetor para expressão em bactérias (sistema procariótico), como em vetor para expressão em células de inseto (sistema eucariótico). As clonagens de mais de 20 construções diferentes para expressão em bactéria foram realizadas em colaboração com o Biotechnology Group do SGC.
A clonagem foi feita utilizando a técnica LIC (Ligation-Independent Cloning) onde é dispensada a utilização de uma DNA ligase. Nesta técnica, os primers são desenhados de forma que os produtos de PCR possuam extremidades complementares ao vetor. O tratamento dos produtos de PCR e do vetor com DNA polimerase (atividade 3’ – 5’ exonuclease) gera extremidades coesivas. O vetor bacteriano utilizado foi o pNIC28-Bsa4. Todas as construções possuem His-Tag na porção N-terminal, para ser
19 utilizada na afinidade por Níquel. A maioria das construções possui o domínio catalítico glutaminase e as outras compreendem a porção C-terminal (Figura 10).
Figura 10. Representação esquemática em barras das construções de GLS2 humana. As três construções de GLS2 humana que foram expressas em larga escala e purificadas estão destacadas com suas respectivas denominações. Em cada extremidade da barra são evidenciadas as posições em que cada construção se inicia e termina em relação à sequência full length da proteína (Ref NM_013267.3).
Aminoácidos Sequência 1º aa /
último aa Primers Diretos
20
KALQK TACTTCCAATCCATGAAGGCTCTGCAGAAGGCCCTG Lys5
GMLSR TACTTCCAATCCATGGGCATGCTGTCCCGCCTGGG Gly67
LGDLL TACTTCCAATCCATGCTGGGTGATTTGCTCTTTTAC Leu72
IPDFE TACTTCCAATCCATGTTCCTGATTTTGAGGAGTTC Ile154
TVVN TACTTCCAATCCATGAAGACTGTGGTCAACCTGTTA Lys485
Primers Reversos
...PRREG TATCCACCTTTACTGTCACCCTTCACGCCGTGGGTCTA Gly479
...NYDNL TATCCACCTTTACTGTCACAGGTTGTCATAGTTGTGGA Leu466
...LLQDY TATCCACCTTTACTGTCAGTAATCTTGAAGCAGTTTGA Tyr575
...LESMV TATCCACCTTTACTGTCATACCATGCTTTCTAAGTTCT Val602
Tabela 2. Primers utilizados para a clonagem das diferentes construções de GLS2 humana. A sequência destacada em vermelho é complementar à sequência do vetor pNIC28-Bsa4 e é responsável pelo pareamento de bases entre vetor e inserto, dispensando o uso de DNA ligase.
No PCR para a geração das construções foi utilizado como molde o gene de GLS2 humana (Ref NM_013267.3) clonado em vetor pCMV6-GFP. Foram usados primers específicos para formar as diferentes extremidades para cada construção (Tabela 2). Além da sequência de anelamento à construção da GLS2 os primers continham sequência de complementariedade ao vetor, necessária para a clonagem por LIC. Para cada reação de PCR foram utilizados 2,5 µL de Platinum® Pfx buffer, 1mM MgSO4 , 0,3 mM dNTP, 1 unidade de Platinum® Pfx DNA polimerase, 0,3 µM do primer direto e 0,3 µM do primer reverso e 7 ng de DNA molde em 25 µL de reação. A reação foi feita em termociclador programado para um passo de 94°C por 5 minutos, 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 52ºC por 30 segundos, 68°C por 2 minutos, e uma última etapa de 72 ºC por 10 minutos. Uma alíquota da reação foi corrida em gel de agarose 1% para avaliar o resultado do PCR.
Os produtos de PCR foram tratados com DpnI para degradar o DNA molde utilizado na reação de amplificação. Os insertos amplificados foram inseridos no vetor pNIC28-Bsa4. Para digestão do vetor utilizou-se 5 µg de DNA plasmidial, 30 unidades de BsaI (NEB), 10 µL NEB buffer 3 e 1µg de BSA (NEB) em 100 µL de reação e incubou-se a 50ºC em termociclador por 2 horas.
21 Vetor e insertos, após digestão e amplificação, respectivamente, foram tratados com T4 polimerase, utilizando-se dGTP para o vetor e dCTP para os insertos, de maneira a se formar extremidades coesivas. Para o vetor foram utilizados 50 µL do plasmídeo digerido, 10 µL de NEB Buffer 2, 2,5 mM de dGTP, 1 µg de BSA (NEB), 5 mM DTT e 15 unidades de NEB T4 polimerase em 105 µL de reação. A reação ocorreu por 30 minutos a 22ºC e depois deixada a 75ºC em um termociclador por 20 minutos. Para os insertos, foram utilizados 5 µL do produto de PCR, 1 µL de NEB Buffer 2, 1 mM de dCTP, 2 µg de BSA (NEB), 2 mM de DTT e 2 unidades de NEB T4 polimerase em um volume de 25 µL. A reação ocorreu por 30 minutos a 22ºC e depois deixada a 75ºC em um termociclador por 20 minutos.
Para a união do inserto com o vetor (apenas por pareamento de nucleotídeos) foram utilizados 2 µL do inserto com 1 µL do vetor, ambos previamente tratados com T4 polimerase. A mistura foi deixada a temperatura ambiente por uma hora. Para a transformação em bactéria, 1 µL da mistura foi adicionado a 50 µL de células MACH1, incubando-se 30 minutos em gelo. Após, fez-se o choque térmico a 42ºC por 45 segundos, os tubos foram deixados novamente em gelo por cinco minutos, e adicionou-se 100 µL de meio SOC (Super Optimal Broth with Catabolite repression) às células. Em seguida, as células foram incubadas a 37ºC por 90 minutos antes de se plaquear em meio sólido LB-ágar contendo 50 µg.mL-1 de kanamicina e 5% sacarose. As placas foram incubadas a temperatura ambiente por dois dias.
As colônias formadas foram coletadas com a ponta de uma ponteira e testadas por reação de PCR para verificação da presença de inserto. Para o PCR foram utilizados 2µL de REDTaq® buffer, 1 unidade de BIOTAQ™ Red DNA Polimerase, 1,5 mM de MgCl2, 3% (v/v) DMSO, 0,3 mM dNTPs, 0,1 µM do primer FBac1 e 0,1 µM do primer FBac2 (primers que anelam no vetor) em 22 µL de reação. A reação foi feita em termociclador programado para um passo de 98°C por 10 minutos, 30 ciclos de 98°C por 30 segundos, 50ºC por 30 segundos, 72°C por 3 minutos, e uma última etapa de 72
22 ºC por 5 minutos. Uma alíquota de cada reação foi analisada por eletroforese em gel de agarose 1% para avaliar o resultado do PCR.
A mesma ponteira utilizada para coletar as colônias para o PCR foi colocada em meio LB líquido 50 mg.mL-1 kanamicina e incubou-se por 37ºC overnight. No dia seguinte fez-se miniprep para a extração de DNA plasmidial utilizando-se do kit 96-well Plasmid and BAC Preparation (Milipore) dos clones identificados como positvos pelo screening de PCR.
3.1.3 - Clonagem gênica de construções de GLS2 humana em vetor de
expressão para células de inseto
A clonagem para a expressão em células de insetos se deu por um processo que utiliza dois vetores. O primeiro vetor utilizado foi o pFB-LIC-Bse, para a replicação em bactéria MACH-1. Este vetor foi posteriormente inserido na bactéria DH10Bac™, onde ocorre a transposição do gene de interesse para o bacmídeo pFastBac™. O bacmídeo é, então, transfectado para células de inseto onde irá promover a formação de baculovírus, que serão usados para a infecção de novas células (Figura 11). A infecção com baculovírus transfere a informação necessária para a produção da proteína de interesse. Doze construções de GLS2 contendo o domínio catalítico foram clonadas para esse sistema (Figura 10).
Os produtos de PCR utilizados para clonagem em vetor de expressão em bactéria foram usados para a clonagem no vetor pFB-LIC-Bse. A etapa de clonagem foi feita em placas de 96 poços, também utilizando a metodologia LIC.
A digestão do vetor foi feita com 5 µg de DNA plasmidial, 12 unidades de BseRI (NEB), 10uL NEB buffer 2, 1 µg de BSA (NEB), completou-se com água para um volume final de 100 µL e incubou-se a 37ºC por 2 horas, depois foram adicionados 20 µL de
23 água, 2,5 µL de NEB buffer 2 e 2,5 µL de BseRI (4000 unidades.mL-1) e incubou-se por mais 1 hora a 37ºC.
Figura 11. Esquema representativo das etapas de clonagem para expressão em células de inseto.
Após a digestão, o vetor foi tratado com T4 polimerase e dGTP, enquanto que os insertos foram tratados com T4 polimerase e dCTP, de maneira a se obter extremidades coesivas entre vetor e inserto. Para o vetor pFB-LIC-Bse a reação com T4 polimerase foi feita da mesma forma que para o vetor de expressão em bactéria. Para os insertos a reação de digestão com T4 polimerase já havia sido feita durante a clonagem em vetor de bactéria.
Para o anelamento do vetor com os insertos colocou-se 1µL do plasmídeo com 2 uL do inserto, ambos tratados com T4 polimerase, fazendo-se controle usando somente inserto e usando somente vetor. A mistura foi incubada a 22ºC por 30 minutos e depois colocada em gelo. Adicionou-se 40 µL de células MACH-1, incubou-se 30 minutos em gelo, fez-se o choque térmico a 42ºC por 45 segundos e os tubos foram deixados novamente em gelo por 5 minutos. Após, 100 µL de meio SOC (Super Optimal Broth) foram adicionados, a placa foi coberta com um filme adesivo poroso e incubada a 37ºC por 1 hora. A cultura foi então plaqueada em meio sólido LB-ágar contendo 100
24 µg.mL-1 de ampicilina e 5% sacarose. As placas de Petri foram incubadas a 37ºC overnight.
As colônias formadas foram coletadas com a ponta de uma ponteira e usadas para se colocar bactérias na solução do PCR de colônia, de modo a se confirmar a entrada do inserto no vetor. A reação de PCR foi preparada e feita da mesma maneira que para o PCR de colônia da clonagem para expressão em bactéria (seção 3.1.2). Uma alíquota de cada reação foi analisada por eletroforese em gel de agarose 1% para avaliar o resultado do PCR.
A mesma ponteira utilizada para o PCR de colônia foi colocada em meio LB líquido 50 mg.mL-1 ampicilina, incubou-se por 37ºC overnight e no dia seguinte fez-se miniprep para a extração de DNA plasmidial utilizando-se do kit 96-well Plasmid and BAC Preparation (Milipore).
Para a transformação do DNA em células DH10Bac, 2 µL do DNA recombinante proveniente do miniprep foi colocado nos poços de uma placa de 96 poços para PCR. A placa foi então colocada em gelo e adicionada de 20 µL de células DH10Bac em cada poço e deixada em gelo por 30 minutos. Após, o choque térmico foi feito a 42ºC por 45 segundos e a placa foi retornada para o gelo por 5 minutos. A suspensão foi transferida para um bloco de 96 poços e 900 μL de meio LB foi adicionado a cada poço. O bloco foi incubado a 37ºC por 5 horas a uma rotação de 700 rpm. Dez microlitros da cultura foram plaqueados em placa seletiva (50 µg.mL-1 kanamicina, 7 µg.mL-1 gentamicina, 10 µg.mL -1 tetraciclina, 40 µg.mL-1 IPTG e 100 µg.mL-1 Bluo-Gal) e as placas incubadas a 37ºC por 48 horas.
O sistema de seleção de clones positivos se dá através do gene lacZ presente no bacmídeo. Neste sistema, quando o inserto é inserido corretamente, o gene lacZ é danificado e as colônias ficam brancas. Se o gene lacZ se mantiver intacto as colônias
25 ficam azul devido ao metabolismo do Bluo-Gal, o que indica que não houve inserção do inserto.
Duas colônias brancas de cada placa foram coletadas e estriadas em uma nova placa com meio seletivo, seguido de incubação das placas a 37ºC overnight para confirmação do não metabolismo do Bluo-Gal. No dia seguinte uma colônia de cada placa estriada foi coletada e inoculada em 2 mL de meio LB com 50 µg.mL-1 kanamicina, 7 µg.mL-1 gentamicina e 10 µg.mL-1 de tetraciclina em poços de um bloco de 96 poços. O bloco foi coberto com um filme adesivo poroso e incubado a 37ºC over night a 700 rpm.
No dia seguinte centrifugou-se o bloco a 2600 rpm por 30 minutos, descartou-se o sobrenadante e os pellets foram utilizados para fazer miniprep com o kit 96-well Plasmid and BAC Preparation (Milipore). Uma pequena quantidade do bacmídeo proveniente do miniprep foi utilizado para a realização do PCR a fim de confirmar a inserção do gene. Para o PCR foi utilizado o protocolo padrão de PCR de colônia usado na clonagem para vetor de bactéria (Seção 3.1.2). Uma alíquota de cada reação foi analisada por eletroforese em gel de agarose 1% para avaliar o resultado do PCR.
3.1.4 - Infecção dos bacmídeos em células de inseto e produção de
baculovírus
Todo o processo de transfecção dos bacmídeos e infecção de células de inseto foram feitos em capela de fluxo laminar. Com um dia de antecedência, diluiu-se células Sf9 em meio Sf900-II (Life Technologies) para uma contagem final de 1.106 células.mL -1 para permitir que no dia seguinte a cultura estivesse na fase log. No dia seguinte, diluiu-se a cultura em meio Sf900-II para uma concentração final de células de 2.105 células.mL-1. Colocou-se 1 mL da cultura em poços de uma placa de 24 poços para
