factor from Wilson Plot (Å2) 45

Monomers/AU 10

Solvent content (%) 58.3

Matthews coeff. (Å3/Da) 2.95 Refinament

Resolution range (Å) 44 – 2.55

Reflections (cross-validation) 2218 (4.9)

Rfactor/Rfree (%) 20.5 / 26.1

Rmsd from standard geometry

Bond length (Å) 0.014 Bond angles (º) 1.64 Ramachandran plot Most favored (%) 94.70 Allowed (%) 4.55 Outlier (%) 0.76

Tabela 7. Parâmetros da coleta de dados de cristalografia de raios X e estatísticas do refinamento da estrutura cristalográfica do domínio catalítico da GLS2 humana.

Apesar de a unidade assimétrica conter dez cópias do monômero, uma análise da superfície e energia de ligação nas interfaces que medeiam os contatos intermonômeros, com o software Pisa (69) – realizado não só em toda a unidade assimétrica, mas também em contatos com parceiros relacionados pela simetria cristalina - indica que a unidade funcional é um dímero (Figura 44). Nesse contexto, Pisa determina que a área ocluída na formação da interface do dímero é de 790 Å2_{, associada} a um ganho de energia livre de solvatação de -4.6 kcal/mol e com um score fracional de significância de complexação (CSS) de 1.00. CSS indica o quão significativo para a

76 função biológica pode ser a formação da interface analisada. Portanto, cinco dímeros compõe a unidade assimétrica.

Figura 44. Estrutura cristalográfica do homodímero formado pelos motivos ankyrin (3 por monômero) presentes na região C-terminal da GLS2. As diferentes cores destacam os monômeros formadores do dímero.

O enovelamento que define um domínio ankyrin é definido pela repetição de motivos, tipicamente de 33 resíduos em comprimento, que consistem em duas α-hélices antiparalelas seguidas por um loop β-hairpin ou um loop longo (24). Na estrutura obtida são observados três repetições ankyrin (Figura 45), porém na repetição da extremidade C-terminal está faltando um loop β-hairpin. A perda de informação estrutural do último loop β-hairpin do motivo ankyrin é muito comum em estruturas cristalográficas de domínios que contêm repetições ankyrin (23). Alternativamente, esta perda pode ser ainda atribuída ao tratamento da porção C-terminal com a protease quimiotripsina. Predições feitas por análise da sequência primária pelo banco de dados PFAM (70) e BLAST (71) indicaram que GLS2 possui três ou duas repetições ankyrin, respectivamente. Com a recente resolução da estrutura cristalográfica pôde-se confirmar que três repetições ankyrin estão presentes na porção C-terminal da GLS2.

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Figura 45. Os três motivos em tandem, vistos por dois ângulos diferentes, presentes na porção C-terminal da GLS2. Cada cor representa um motivo individual.

4.7 - Modelo de SAXS para GLS2.WT

O modelo de SAXS gerado para as medidas com 3,9 mg.mL-1 de GLS2.WT, de camundongo tem simetria P222 com diâmetro de 16 nm. O modelo mostra que, nas condições em que foram feitas as medidas, a GLS2 se apresenta na forma tetramérica, aumentando as evidências de que GLS2 não assume estrutura quaternária maior que homotetrâmero.

Como o modelo de SAXS gerado para GLS2 foi para uma construção próxima ao tamanho da full length, este modelo foi utilizado para se fazer a montagem das estruturas cristalográficas obtidas para diferentes porções das glutaminases de mamífero (domínio catalítico e porção C-terminal da GLS2 e a porção N-terminal de GLS1) dentro do envelope de SAXS (Figura 46). Esta montagem permite estimar a estrutura completa da GLS2, com a porção N-terminal, C-terminal e do domínio catalítico, o que é novo para qualquer glutaminase de mamífero.

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Figura 46. Sobreposição do envelope de SAXS da GLS2 com estruturas cristalográficas de diferentes porções das glutaminases de mamífero. A) Modelo de SAXS da GLS2 sobreposta com a estrutura cristalográfica do domínio catalítico e da porção C-terminal da GLS2 de humano e N-terminal da GLS1. Azul: domínio catalítico da GLS2 humana. Alaranjado: porção C-terminal da GLS2 humana. Verde: porção N-terminal da GLS1 de camundongo. B) Curva p(r) x r das medidas de SAXS para GLS2 de camundongo.

4.8 - Varredura de moléculas para modulação da atividade de GLS2

Normalmente, enzimas alostéricas estão envolvidas na regulação de vias metabólicas e, geralmente, existe mais de uma molécula modulando sua atividade. Portanto, As moléculas ATP, ADP, AMP, α-cetoglutarato, citrato, glicose-6-P, frutose-6- P, fosfoenol-piruvato, NADP+_{, e Ca}2+ _{foram testadas como possíveis moduladores de} GLS2.

Das moléculas que alteraram a velocidade da reação da GLS2, apenas citrato, AMP, glicose-6-P e frutose-6-P não alteraram a velocidade de GDH. Estas quatro moléculas ativaram GLS2 em mais de 10 vezes (Figura 47) na reação com 100 nM de enzima, 30 mM de glutamina e 20 mM da molécula testada. Fosfato, citrato e AMP já eram conhecidos como reguladores da GLS2 (47). Já glicose-6-P e frutose-6-P ainda não foram reportadas na literatura como ativadores de GLS2.

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Figura 47. Atividade relativa da GLS2.WT com ligantes. O controle sem ligante foi tomado como 100% de atividade. As medidas da velocidade de reação foram feitas com 100 nM de enzima, 30 mM de L-glutamina e 20 mM de ligante. G-6P: glicose-6-fosfato. F-6P: frutose- 6-fosfato.

4.9 - Efeito da GLS2 na atividade glutaminolítica de células MDA-MB 231

Como a GLS2 heteróloga purificada apresenta atividade mensurável a altas concentrações de enzimas foi avaliado se o mesmo ocorria em modelos celulares. Portanto linhagens de células MDA-MB 231 foram geradas de modo que se obteve células knock down para GLS1 e que super expressam GLS2. Observou-se que a super- expressão de GLS2 aumenta atividade glutaminolítica da fração mitocondrial da célula (Figura 48A). Como controle foram utilizadas células super expressando o mutante S219A da GLS2, pois se sabe que essa mutação inativa a capacidade de hidrólise de glutamina (Figura 38). Portanto, esses dados indicam que, no modelo celular estudado, a atividade de GLS2 também é dependente da concentração elevada da proteína. Pela imunodetecção, pode-se observar que a localização da GLS2 e GLS1 são mitocondriais (Figura 48B).

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Figura 48. Atividade e localização subcelular de glutaminase em célula. A) Atividade glutaminolítica da fração mitocondrial de células MDA-MB 231 com tratamentos para

knockdown de GLS1, expressão ectópica de GLS2 e controles. B) Western blot

mostrando a localização mitocondrial das glutaminases e indicando a presença ou ausência de GLS1 e GLS2 nas células.

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5 - DISCUSSÃO

O câncer é uma doença que mata milhões de pessoas por ano. Inúmeros estudos ao longo dos anos foram feitos para entender a causa dessa doença e quais são as principais diferenças entre as células cancerosas e células de tecidos normais, estabelecendo assim os chamados pilares (hallmarks) da transformação tumoral (2). Dentre estes pilares, se encontra a adaptação do metabolismo energético para suportar a rápida proliferação de células neoplásicas. Uma adaptação metabólica comum às células tumorais é a produção de ATP pela glicólise aeróbica, fenômeno conhecido como efeito Warburg (5). Outra situação amplamente observada é a alta captação e consumo de glicose e glutamina por células proliferativas. O metabolismo da glutamina, chamado glutaminólise, supre vias anapleróticas que alimentam vias de biossíntese de moléculas necessárias para a multiplicação celular, como aminoácidos, nucleotídeos e agentes redutores para o controle do estresse oxidativo.

É amplamente observado que para manter o fenótipo tumoral as células cancerosas têm preferência para isoformas específicas de proteínas envolvidas na produção energética e de biomoléculas da célula, de modo a tornar o metabolismo mais eficiente para as necessidades das células em alta taxa de multiplicação. As glutaminases, enzimas responsáveis pela hidrólise de glutamina em glutamato, são exemplo disso. Existem dois genes que codificam para glutaminases em mamíferos, gls1 e gls2. gls1 pode dar origem à KGA ou GAC (GLS1) por splicing alternativo e gls2 pode codificar para LGA ou GAB (GLS2) que se distinguem por diferentes origens de transcrição. Inicialmente as glutaminases provenientes de gls1 eram descritas como preferidas por tumores, como glioblastoma (41). No entanto, recentemente tem sido descritos aumento de expressão de GLS2 em câncer de fígado e células de câncer cervical, sendo GLS2 importante para a proliferação celular e resistência das células à tratamento de radioterapia (38, 39). Deste modo, o melhor entendimento do funcionamento da GLS2 pode ser aplicado em futuras terapias.

82 O presente trabalho apresenta a estrutura cristalográfica do domínio catalítico glutaminase da GLS2, até então ainda não descrita. O alinhamento estrutural dos domínios catalíticos de GLS2 humana com outras glutaminases, tanto de mamífero quanto de bactérias, evidencia uma estrutura muito conservada entre diferentes espécies. Apesar do alto grau de alinhamento estrutural dos domínios catalíticos de GLS2 e GLS1, inclusive dentro do sítio ativo, o comportamento dessas proteínas apresentam diferenças peculiares. Uma delas é que GLS2 apresenta cinética enzimática sigmoidal (47) para o substrato enquanto GLS1 apresenta comportamento Micheliano, além de que a eficiência catalítica de GLS1 é maior que a de GLS2 (44). Outra característica que distingue essas glutaminases é que GLS1 tem a capacidade de formar fibras na presença do ativador fosfato inorgânico, enquanto GLS2 não as forma (45).

O domínio catalítico de GLS2 e GLS1 possui tamanha identidade estrutural que não se pôde evidenciar um ponto chave para a distinção na eficiência catalítica apresentada pelas diferentes enzimas nem para a capacidade de formação de fibras. A região conhecida como gating loop é apontada como sendo responsável por fechar ou abrir a entrada do sítio ativo, permitindo a entrada de substrato e saída de produto (44, 45), ou seja, está relacionada com o turnover da enzima. Esse loop também está envolvido na ativação da enzima pela oligomerização, pois indica-se que na forma tetramérica da proteína o gating loop está permitindo maior abertura da entrada do bolsão catalítico, culminando em maior taxa de catálise (44, 45). O alinhamento sequencial de GLS1 e GLS2 (Figura 6) mostra que o gating loop não é totalmente idêntico entre as proteínas e as diferenças nessa região podem estar diretamente relacionadas com a eficiência catalítica. Entretanto, nas estruturas cristalográficas de glutaminases de mamíferos essa região não apresenta mapa de densidade eletrônica bem definido devido à sua alta flexibilidade conformacional que, provavelmente, é

83 necessária para cumprir seu papel de abrir e fechar a entrada do sítio ativo, assim regulando a acessibilidade do substrato ou a saída do produto.

Algumas diferenças sequencias entre GLS2 e GLS1 foram consideradas para que fossem feitas mutações em GLS2 de modo a se trocar o aminoácido de GLS2 pelo correspondente em GLS1. Essas mutações foram T225K e o mutante duplo Y251F- S255F. O aminoácido Thr225 está localizado no sítio catalítico e esperava-se que a substituição desse aminoácido, que possui cadeia lateral polar não carregada, por uma lisina, com cadeia lateral positiva, aumentasse a carga positiva do sítio ativo, pois a análise eletrostática no sítio ativo de GLS2 e GLS1 mostra uma menor quantidade de carga positiva nessa região da GLS2. Com a mutação dupla Y251F-S255F esperava- se que a atividade de GLS2 passasse a apresentar alguma característica de cinética de GLS1, como maior eficiência catalítica ou cinética Michaeliana. A mutação T225K causou uma diminuição no [Gln]0,5 da enzima, indicando maior afinidade do substrato pelo sítio ativo, supostamente devido ao aumento da carga positiva nessa região ocasionada pela troca de uma treonina por uma lisina. Diferentemente do esperado, a mutação dupla Y251F-S255F não alterou nenhum parâmetro cinético da GLS2, levando à conclusão que esses resíduos não estão envolvidos diretamente no processo da catálise, apesar de estarem presentes no gating loop.

Também foram caracterizadas a cinética enzimática de outras duas mutações, S219A e K253A. A mutação S219A substitui a serina, um aminoácido polar que apresenta uma hidroxila na cadeia lateral, por uma alanina, o menor aminoácido com cadeia lateral, de natureza hidrofóbica. A hidroxila da Ser219 é a responsável pelo primeiro ataque nucleofílico ao carbono amida da glutamina durante a hidrólise, como indicado na seção 4.4, então a substituição desta serina por uma alanina causou a inativação da catálise realizada pela GLS2. A mutação K253A ocorre no gating loop e foi feita porque a mesma lisina quando mutada por uma alanina em GAC causa um grande aumento na eficiência catalítica e independência de fosfato para ativação da

84 enzima, ambos os efeitos resultantes da associação de GAC em filamentos (45). Na GLS2 esta mutação causou os mesmos efeitos, porém o aumento na eficiência catalítica não foi tão grande.

Devido à falta de informação cristalográfica do gating loop as bases moleculares da ativação causada pela mutação K253A ainda não são claras. Mas, como GLS2 wild type depende de fosfato inorgânico para oligomerização e ativação e K253A não depende, fica evidente que a mutação K253A facilita a formação de tetrâmero, mimetizando o efeito da ligação do fosfato, visto que em GAC essa mutação favorece a formação de fibras mesmo na ausência de fosfato inorgânico (45). O aumento da atividade catalítica e indução da formação de tetrâmero pela mutação K253A traz mais uma evidência da relação direta do gating loop com a atividade dependente de oligomerização apresentada pelas glutaminases de mamíferos. Sabe-se que em GAC esta lisina sofre acetilação como um processo de regulação da atividade glutaminolítica em modelos celulares (72). Como o sítio onde esta lisina se encontra em GLS1 é muito conservado comparado à GLS2, supõe-se que essa mesma acetilação também ocorra em GLS2, porém ainda necessita confirmação experimental. Como a mutação K253A causa um efeito de neutralização de cargas semelhante ao da acetilação pode-se prever que o efeito dessas acetilações em glutaminases causa a ativação dessas enzimas além de deixa-las menos dependentes de fosfato inorgânico para execução da catálise. Portanto, em um momento metabólico de excesso de suprimento de glutamina ou em caso de necessidade de hidrólise rápida de glutamina para alimentar a célula com blocos biossintéticos a acetilação da Lys253 e a correspondente em GLS1 seria uma ferramenta útil para aumentar a taxa glutaminolítica da célula.

No desenvolvimento deste projeto de doutorado também foi feita uma avaliação mais elaborada do estado oligomérico da GLS2, pois a oligomerização está bem descrita apenas para GAC e KGA na literatura. O modelo de SAXS e as análises por gel-filtração Analítica e Microscopia Eletrônica de Transmissão mostram que GLS2 em

85 altas concentrações (acima de 1 mg.mL-1_{) está na forma tetramérica mesmo na} ausência de fosfato inorgânico. Por isso nos ensaios enzimáticos sem fosfato inorgânico apenas na concentração de 500 nM de enzima foi observada atividade evidente da glutaminase. Contudo, em concentrações menores, mais próximas à fisiológica, GLS2 está na forma tetramérica na presença de fosfato e é dimérica na ausência de fosfato, como observado por gel-filtração analítica. Mais uma vez, comparando esses dados com os de atividade enzimática em diferentes concentrações de proteína observa-se que GLS2 é ativa somente quando na forma de tetrâmero. Como existe a relação direta de aumento de tamanho do oligômero com aumento da atividade enzimática, o fato de GLS2 não formar oligômeros maiores que tetrâmeros ou fibras pode ser uma das explicações desta enzima não ser tão cataliticamente eficiente quanto GLS1.

Como as glutaminases de mamíferos são mitocondriais e dependem da ativação por fosfato inorgânico, sugere-se que a regulação da atividade destas enzimas está intimamente relacionada com o contexto metabólico das células, pois concentração de fosfato inorgânico aumentada indica que grande quantidade de ATP foi hidrolisada e há a necessidade de repor o estoque de energia (4). Logo a ativação das glutaminases pode suprir o ciclo do TCA, através do α-cetoglutarato, e aumentar a produção de ATP.

A caracterização enzimática da GLS2 também foi apresentada nesta pesquisa, onde os parâmetros cinéticos para as curvas sigmoidais de atividade para diferentes concentrações de proteína e glutamina foram calculados. Os resultados estão de acordo com a atividade de glutaminase mitocondrial de fígado humano (47) e mostram que GLS2 possui cinética sigmoidal para a glutamina, o que sugere cooperatividade para a ligação do substrato. Isto é, a ligação de uma molécula de glutamina a um monômero do oligômero induz mudanças conformacionais nos monômeros adjacentes que resultam em aumento da afinidade destes pelo substrato. A equação que descreve essa cinética é a equação de Hill (49). Na equação de Hill o parâmetro 𝑛 (coeficiente de Hill) ou 𝑛_𝑎𝑝𝑝 indica o grau de cooperação entre os monômeros e o valor máximo que ele

86 deve alcançar é igual ao número de unidades que interagem com alta cooperatividade, ou seja, o valor máximo é igual ao número de monômeros, para o caso das glutaminases. 𝑛𝑎𝑝𝑝 geralmente é um número fracionário que sugere uma média do

número de unidades que possuem alta cooperatividade entre si.

Os valores de 𝑛_𝑎𝑝𝑝 obtidos para ensaios enzimáticos na presença de 20 mM de fosfato inorgânico para diferentes concentrações de GLS2 aumentam de acordo com o aumento da concentração. As medidas de tamanho molecular por gel-filtração Analítica sugere que, nas concentrações de GLS2 ensaiadas com 20 mM de fosfato inorgânico, GLS2 está na forma tetramérica, então indica-se que o aumento de 𝑛_𝑎𝑝𝑝 com o aumento da concentração de proteína se dá pelo crescimento da cooperação entre os monômeros e não por formação de oligômeros maiores. Outra evidência disso é que o valor de 𝑛_𝑎𝑝𝑝 não ultrapassa 4.

A atividade dos mutantes T225K e K253A promoveram a alteração de alguns parâmetros cinéticos da catálise, como o [Gln]0,5, mas a sigmoidicidade não foi perdida. Como o domínio catalítico das diferentes glutaminases de mamífero são muito semelhantes tanto em sequência primária quanto em estrutura tridimensional, supõe-se que as regiões que conferem cooperatividade entre os monômeros de GLS2 podem estar localizadas nas porções C- ou N-terminais desta enzima, pois essas regiões possuem menor identidade e similaridade sequencial com KGA e GAC.

Cinética enzimática sigmoidal é característica de enzimas alostéricas (4, 49). Esse tipo de enzima geralmente está envolvido na regulação de vias metabólicas. Pensando nisso, alguns metabólitos de vias metabólicas principais foram testados para o efeito na atividade de GLS2. Citrato, AMP glicose-6-P e frutose-6-P, além do fosfato inorgânico, aumentaram consideravelmente a atividade de GLS2. Fosfato, citrato e AMP já haviam sido descritos na literatura como ativadores de glutaminase de fígado (47).

87 Glicose-6-P e frutose-6-P são metabólitos canonicamente descritos como citosólicos, porém eles podem regular diretamente o metabolismo energético na mitocôndria, como no efeito Crabtree, onde células de diversos tipos, como bactérias, leveduras e células tumorais passam a aumentar a taxa de glicólise e diminuir a fosforilação oxidativa quando suplementadas com glicose (73). Não se sabe ainda se o papel desses metabólitos no efeito Crabtree é de modulação direta ou indireta na atividade das enzimas mitocondriais. Portanto, o mesmo raciocínio pode, a princípio, ser usado para a participação de glicose-6-P e frutose-6-P na regulação da glutaminólise que ocorre na mitocôndria. Ainda, GLS2 já foi encontrada co-localizada no núcleo de células de cérebro de mamíferos (74), ou seja, ela não é exclusivamente mitocondrial e em algum momento glicose-6-P e frutose-6-P podem estar presente no mesmo compartimento celular que GLS2. Todavia, a modulação da atividade de GLS2 por glicose-6-P e frutose-6-P demonstrada neste trabalho é um estudo preliminar e o efeito desses metabólitos na taxa glutaminolítica precisa ser confirmado por outros ensaios, principalmente in vivo. A localização celular diferenciada (extra-mitocondrial) de GLS2 ainda não foi explorada de maneira mais detalhada.

A atividade de GLS2 também foi avaliada em células MDA-MB 231 de câncer de mama. Células knock down de gls1 tem a atividade de glutaminase diminuída e a expressão ectópica de GLS2 promove a recuperação de glutaminólise da célula. O aumento da concentração de GLS2 compensa a menor eficiência catalítica desta enzima quando comparada à atividade de GLS1, portanto a célula retoma sua taxa de hidrólise de glutamina mesmo com a atividade de GLS1 silenciada. O mutante S219A também foi ectopicamente expresso nas células com knock down de gls1, mas nesse caso, não houve recuperação da atividade, reforçando o que foi observado para a proteína heteróloga, em que essa mutação inativa a atividade catalítica da GLS2.

Mais estudos em modelos celulares acerca da importância da atividade de GLS2 em células estão sendo feitos em nosso laboratório em colaboração com a Dra. Sandra

88 M. G. Dias e seus alunos. Nesses trabalhos está sendo avaliada a importância da GLS2 na defesa contra estresse oxidativo e na produção de ATP e outros metabólitos em células MDA-MB 231.

Como parte do projeto de doutorado, também foi proposto o estudo da estrutura da região da GLS2 que possui motivos ankyrin em tandem, as chamadas repetições