U F C G
UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE
CENTRO DE TECNOLOGIA E RECURSOS NATURAIS
4P
UNIDADE ACADEMICA DE ENGENHARIA AGRlCOLA
(JfKN
COPEAG - COORD. DE P6S-GRADUAQAO EM ENG. AGRlCOLA •
PROGRAMA
D E POS-GRADUAgAO
E M ENGENHARIA A G R l C O L A
Dissertagao de Mestrado
DESENVOLVIMENTO E AVALIAQAO DE TECNICAS DE
MICROPROPAGAQAO E CRIOPRESERVAQAO
PARA 0 ARMAZENAMENTO DA MANGABEIRA
(HANCORNIA SPECIOSA GOMES)
U N I V E R S I D A D E F E D E R A L D E C A M P I N A G R A N D E P R O - R E I T O R I A D E P O S - G R A D U A C A O E P E S Q U I S A C E N T R O D E T E C N O L O G I A E R E C U R S O S N A T U R A I S C O O R D E N A C A O D E P O S - G R A D U A C A O E M E N G E N H A R I A A G R l C O L A D I S S E R T A C A O D E M E S T R A D O D E S E N V O L V I M E N T O E A V A L I A C A O D E T E C N I C A S D E M I C R O P R O P A G A C A O E C R I O P R E S E R V A C A O P A R A O A R M A Z E N A M E N T O DA M A N G A B E I R A {Hancornia speciosa Gomes)
A U T O R A : Fernanda Raquel Sartor
O R I E N T A D O R E S : Prof. Dr. Francisco de Assis Cardoso Almeida Dr. Ailton Melo de Moraes
Campina Grande, fevereiro de 2011.
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U N r V E R S I D A D E F E D E R A L D E CAMPINA G R A N D E C E N T R O D E T E C N O L O G I A E R E C U R S O S N A T U R A I S
P O S - G R A D U A C A O E M E N G E N H A R I A A G R l C O L A
D E S E N V O L V I M E N T O E A V A L I A C A O D E T F C N I C A S D E M I C R O P R O P A G A C A O E C R I O P R E S E R V A C A O PARA O A R M A Z E N A M E N T G ik) M A N G A B E K A (Hancornia speciosa Gomes)
Dissertacao apresentada ao Curso de Pos-Graduacao em Engenharia Agricola da Universidade Federal de Campina Grande, como parte dos requisitos necessarios para a obtencao do tftulo de Mestre em Engenharia Agricola.
A U T O R A : Fernanda Raquel Sartor
ORD2NTADORES: Prof. Dr. Francisco de Assis Cardoso Almeida
Dr. Ailton Melo de Moraes
A R E A D E C O N C E N T R A C A O : PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DE
PRODUTOS AGRICOLAS
Campina Grande - Paraiba Fevereiro, 2011
FICHA CATALOGRAFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA UFCG
S251d Sartor, Fernanda Raquel.
Desenvolvimento e avaliacao de tecnicas de micropropagacao e criopreservacao para o armazenamento da mangabeira (Hancornia
speciosa Gomes) 1 Fernanda Raquel Sartor. — Campina Grande, 2010.
88 f. : i l . col.
Dissertacao (Mestrado em Engenharia A g r i c o l a - Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Tecnologia e Recursos Naturais.
Referencias.
Orientadores: Prof. Dr. Francisco de Assis Cardoso A l m e i d a , Dr. A i l t o n M e l o de Moraes.
1. Germinacao. 2. Cultura de Tecidos Vegetais . 3. Criogenia. I . T i t u l o .
UNSVERSiDADE F E D E R A L D E CAMPINA G R A N D E
T E C
COORDENACAO DE POS-GRADUA^AO EM ENGENHARIA AGKICOLA
PARECER FINAL DO JULGAMENTO DA DISSERTAQAo DA MESTRANDA
FERNANDA RAQUEL SARTOR
DESENVOLV1MENTO E AVAUAQAO DE TECNICAS DE M1CROPROPAGAQAO E CRIOPRESERVAQAO PARA O ARMAZENAMENTO DA 8SANGABE1RA
Dr. Aifion Mefo de Moraes - Oriervtador
fXa^Josivanda Palmeira Gomes'- Btaminadora
Dr. Jorge G a z e FiJho - Examinador X
PARECER
FEVERErRO-2011
Av. Aprigio Veloso, 882 - Baixro IMver^tario Campina Grande - PB
DEDICAT6RIA
Aos meus pais ADEMAR e MARISA que sempre acreditaram em mim e me apoiaram incondicionalmente para que eu alcancasse todos os meus objetivos e realizasse meus sonhos.
As minhas irmas ULLIANA e MAR1ANE pela nossa anvizade, carinho, cumphcidade e amor.
Ao meu cunhado EVANDRO pela amizade e disponibilidade.
As minhas amigas, Luciane, Renati, Livia, Ana Paula, Tatiani, Monica, Luciana, Aline, Nadiege e as pitocas Amanda e Nathy, que mesmo distante sempre estiveram presentes com sua amizade e apoio neste perfodo de estudos.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais e minhas irmas...
Aos membros da banca examinadora e a Coordenacao do Programa de Pos-Graduacao em Engenharia Agricola da Universidade Federal de Campina Grande.
Ao Dr. Ailton, que muito alem de orientador tambem e urn grande amigo.
Ao Prof. Dr. Francisco de Assis Cardoso Almeida pela orientacao, bons ensinamentos e conselhos profissionais.
A Cleide, Denise e Vanessa pela amizade, companheirismo e coleguismo nas longas e arduas horas de estudos.
A Christiane e Herbert pela amizade e ajuda nos experimentos.
A Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuaria da Parafba, por disponibilizar o Laboratorio de Cultura de Tecidos Vegetais, e especial ao Dr. Ailton, Dr. Jorge Caze" Filho e ao Dr. Elson Soares dos Santos pelos valiosos ensinamentos estatfsticos.
Ao Departamento de Engenharia Agrfcola da Universidade Federal de Campina Grande, em especial as professoras Josivanda e Maria Elita e ao professor Mario pelos ensinamentos e incentivos.
Agradeco ao CNPq pela concessao da bolsa para a realiza5ao deste trabalho. A todos que contribuiram direta ou indiretamente na realizacao deste tr'abalho, o rneu muito obriaada.
SUM A RIO LISTA D E TABELAS »•—•--• »* L I S T A D E FIGURAS » xii RESUMO — xiii ABSTRACT ~~ • » » *iv 1. INTRODUCAO » 1 2. REVISAO D E L I T E R A T U R A — 2 2.1 A especie Hancornia speciosa Gomes 2 2.2 Micropropagacao • - 4
2.3 Fases e fatores importantes na micropropagacao 6
2.3.1 Selecao do material vegetal 6 2.3.2 Desinfestagiso do material vegetal 7 2.3.3 Meios de cultura - 9
2.3.4 Reguladores de crescimento 11 2.3.5 Contaminacao in vitro de plantas 12
2.3.5.1 Oxidacao fenolica 12 2.3.5.2Contaminacao fiingica e bacteriana 13
2.3.6 Multiplicacao - - 13 2.3.7 Enraizamento - 15
2.4 Crioconservacao de gemas de mangabeira 17 2.4.1 Encapsulamento-dessecacao 21
2.4.2 Vitrificacao 22 2.4.3 Crioprotetores 23 3. M A T E R I A L E M E T O D O S 24
3.1 Fases do protocolo de micropropaga§ao 25 3.1.1 Tratamento e isolamento dos explantes 25
3.1.2 Estabelecimento 26 3.1.3 Multiplicacao 26 3.1.4 Enraizamento.... 28
3.2 Criopreservacao de gemas de mangabeira (H. speciosd) 28
3.2.1 Encapsulamento-dessecacao ... 28
3.2.2 Vitrificacao 29 3.3 Procedimentos estatisticos 30 4. RESULTADOS E DISCUSSAO 30
4.1 Tratamento dos explantes 30 4.2 Estabeleeirnento - 34 4.3 Multiplicacao 36 4.4 Enraizamento 37 4.5 Encapsulamento-dessecacao 41 4.6 Vitrificacao 42 5. CONCLUSOES • 44 6. R E F E R E N CIAS 46 7. APENDICE 68
LISTA B E TABELAS
Tabela 3.1 Concentracoes da solucao de CaCl2C>2 e tempos de exposicao utilizados na desinfestacao de sememes de mangabeira (H.
speciosd) 25
Tabela 3.2 Meios de cultivo testados na fase de estabelecirnento de gemas
apicais e laterals de mangabeira (#. speciosd)., 26 Tabela 3.3 Meios de cultivo testados na fase de multiplicacao de plantulas de
mangabeira (H. speciosd) 27 Tabela 3.4 Meios de cultivo testados na fase de enraizamento de plantulas de
mangabeira (H, speciosd) 28 Tabela 4.1.1 Resumo da analise variancia para a variavel desinfestacao de
sementes de mangabeira (H. speciosd) 68 Tabela 4.1.2 Resumo da analise de variancia para a variavel gerxrunacao de
sementes de mangabeira (H. speciosd).. 68 Tabela 4.1.3 Resumo da analise de variancia para a variavel comprimento das
plantulas de mangabeira (H. speciosd) 69 Tabela 4.1.4 Medias para a variavel germinacao de sementes de mangabeira (H.
speciosd) em funcao do tempo de exposicao a concentracao de
CaCl?02 70
Tabela 4.1.5 Medias para a variavel comprimento de plantulas de mangabeira
(H. speciosd) em funcao do tempo de exposicao a concentracao de
CaCl202. 71
Tabela 4.2.1 Resumo da analise de variancia de gemas apicais de mangabeira
(H. speciosd) que sobreviveram na fase de estabelecirnento 72
Tabela 4.2.2 Resumo da analise de variancia de gemas apicais de mangabeira
(H. speciosd) que sobreviveram na fase de estabelecirnento 73
Tabela 4.2.3 Madias para a variavel sobrevivencia de gemas apicais de mangabeira (H. speciosd) em funcao da concentracao de carvao ativado e sacarose , 74
Tabela 4.2.4 Tabela 4.3.1 Tabela 4.3.2 Tabela 4.3.3 Tabela 4.3.4 Tabela 4.4.1 Tabela 4.4.2 Tabela 4.4.3 Tabela 4.4.4 Tabela 4.4.5 Tabela 4.4.6 Tabela 4.4.7
Medias para a variavel sobrevivencia de gemas laterals de mangabeira (H. speciosd) em funcao da concentracao de carvao
ativado e sacarose 76 Resumo da analise de variancia de gemas laterals de mangabeira
(H. speciosd) que sobreviveram na fase de multiplicacao...,. 37
Resumo da analise de variancia para a variavel taxa de multipucacao de gemas laterals de mangabeira (H. speciosd) 78 Medias para a variavel vida da gema lateral de mangabeira (H.
speciosd) em funcao da concentracao de AIB e BAP na fase de
multiplicacao 79 Medias para a variavel taxa de multiplicacao de gemas laterals de
mangabeira (H. speciosd) em funcao da concentracao de AIB e
BAP 80 Resumo da analise de variancia para a variavel mimero de novas
raizes emitidas por gemas apicais de mangabeira (H. speciosd) em
meio de cultura suplementado com AIB 38 Medias para a variavel nrimero de novas raizes emitidas por gemas
apicais de mangabeira {H. speciosd) em funcao da concentracao de
AIA 39 Medias para a variavel comprimento de novas raizes emitidas por
gemas apicais de mangabeira (H. speciosd) em funcao da
concentracao de AIA 41 Resumo da analise de variancia para a variavel comprimento de
raizes emitidas por gemas apicais de mangabeira (H. speciosd) em
meio de cultura suplementado com AIA 82 Medias para as variaveis numero e comprimento de novas raizes
emitidas por gemas apicais de mangabeira Qi. speciosd) em funcao
da concentracao de AIB 82
Resumo da analise de variancia para a variavel numero de novas raizes emitidas por gemas apicais de mangabeira (H. speciosd) em
meio de cultura suplementado com AIA.... 83 Resumo da analise de variancia para a variavel comprimento de
rarzes emitidas por gemas apicais de mangabeira (K speciosd) em
Tabela 4,5.1 Resumo da analise de variancia de gemas apicais de mangabeira
(H. speciosa) que sobreviveram ao encapsulamento e dessecacao.
42 Tabela 4.5.2 Medias para a variavel vida de gemas apicais de mangabeira (H.
speciosd) encapsuladas em funcao do tempo de dessecacao 84
Tabela 4.6.1 Resumo da analise de variancia de gemas laterals de mangabeira
(H. speciosa) que sobreviveram a vitrificacao 84
Tabela 4.6.2 Medias para a variavel vida de gemas laterals de mangabeira (H.
speciosd) vitrificadas em funcao da concentracao de DMSO e
sacarose 85
LISTA D E FIGURAS
Figura 1 Sementes de mangabeira (K speciosa) em fase de germinacao - - 86 Figura 2 Gemas apicais de laterals de mangabeira (ff. speciosa) na fase de
estabelecirnento 86 Figura 3 Plantula de mangabeira (H. speciosa) multiplicada.. 87
Figura 4 Plantulas de mangabeira (H. speciosa) enraizadas... 87 Figura 5 Gemas apicais de mangabeira (H. speciosa) encapsuladas e em fase
de dessecacao, - 88 Figura 4.1.1 Germinacao de sementes de mangabeira (H. speciosa) submetidas a
desinfestacao com CaCl202 - 32 Figura 4.1.2 Comprimento de plantulas de mangabeira (H. speciosa) submetidas
a desinfestacao com CaGbC^ — 33 Figura 4.2.1 Gemas apicais de mangabeira (B. speciosa) sobreviventes na fase
de estabelecirnento 35 Figura 4.2.2 Gemas laterals de mangabeira (B. speciosa) sobreviventes na fase
de estabelecirnento 35 Figura 4.3.1 Gemas laterals de mangabeira (H. speciosd) sobreviventes na fase
de multiplicacao - - 36 Figura 4,4.1 Numero de raizes de gemas apicais de mangabeira (H. speciosd)
utilizando tratamentos suplementados com AIB 38 Figura 4.4.2 Comprimento de raizes de gemas apicais de mangabeira (H.
speciosa) utilizando tratamentos suplementados com AIB 40
Figura 4.6.1 Gemas laterals de mangabeira (H. speciosa) sobreviventes aos
DESENVOLVIMENTO E AVALIACAO D E TECNICAS D E MICROPROPAGACAO E C R I O P R E S E R V A C A O PARA O ARMAZENAMENTO DA MANGABEIRA (Hancornia speciosa Gomes)
RESUMO: A mangabeira e uma planta nativa do Brasil, encontrada nas regioes Nordeste, Norte, Centro-Oeste e Sudeste. Pertence a familia das Apocinaceas e suas sementes sao classificadas como recalcitrantes. Esta pesquisa teve como objetivos desenvolver protocolos de micropropagacao e criopreservacao para o armazenamento da mangabeira; a mesma foi desenvolvida nos Laborat6rios de Armazenamento e Processamento de Produtos Agrfcolas do Departamento de Engenharia Agrfcola na Universidade Federal de Campina Grande e no Laboratorio de Cultura de Tecidos Vegetais da Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuaria da Parafba em Joao Pessoa -PB. O material bio!6gico utilizado foram sementes e gemas de mangabeira. Os experimentos conduzidos sob condicoes assepticas utilizando-se do meio de cultura WPM para todas as etapas experimentais. Na fase de desinfestacao as sementes foram submersas em aleool 70% e apos aplicados os seguintes tratamentos: concentracao de CaCl202 (2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,0; 15,0%) em funcao dos periodos de exposicao (5, 10,
15 20 e 25 min). Para o estabelecirnento das gemas in vitro utilizou-se meio WPM acrescido de carvao ativado (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0%) em funcao da sacarose (0, 10, 20, 30 e 40 g). Na multiplicacao o meio de cultura foi suplementado com BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mgL~!) em funcao do AIB (0,0; 0,25; 0,5; 0,75 e 1,0 mgL"!). Para o
enraizamento meios de cultura contendo AIB (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 e 4,0 mg.L4) e AIA (1,0; 2,0; 3,0 e 4,0 mgL"1). Na etapa de criopreservacao, para a tecnica do
encapsulamento-dessecacao, as capsulas foram formadas com auxflio de solueoes de gel de alginato (5%) e cloreto de calcio (0,2 M), os periodos de dessecacao foram de 0, 1,2 e 3 horas em camara de fluxo laminar. Posteriormente foi determinado o conteudo de agua das gemas para em seguida serem congeladas em nitrogenio Hquido (-196 °C) por 5 dias. No metodo da vitrificacao foram utilizadas concentracoes de sacarose (0; 0,25; 0,5 e 0,75 M) e DMSO (0, 5, 10 e 15%), apos, as gemas foram congeladas em nitrogemo Hquido por 5 dias e posteriormente cultivadas em meio de regeneracao. Diante dos resultados, conclui-se que o CaCl202 foi eficiente na desinfestacao de
sementes de mangabeira; o carvao ativado foi signifkativo para o estabelecirnento das gemas; a inducao de novas raizes ocorreu com meio suplementados com AIB; na etapa da criopreservacao as gemas nao regeneraram.
Palavras-chave: germinacao, cultura de tecidos vegetais, criogenia.
D E V E L O P E M E N T AND EVALUATION OF TECHNIQUES F O R T H E CR Y OPRESER VATION MICROPROPAGATION AND S T O R A G E O F
MANGABEIRA (Uancornia speciosa Gomes)
ABSTRACT: Mangabeira is a plant native to Brazil, found in the Northeast, North, Midwest and Southeast. It Belongs to the family Apocinaceae and their seeds are classified as recalcitrant. This research aimed to develop protocols for micropropagation and cryopreservauon storage of mangabeira. The research was conducted in the laboratories of Storage and Processing of Agricultural Products, Department of Agricultural Engineering at the Federal University of Campina Grande and the Laboratory of Plant Tissue Culture of the State Company for Agricultural Research in Paraiba in Joao Pessoa - PB. The biological material used were seeds of H. speciosa. The experiments were conducted under aseptic conditions using the WPM for all experimental. At the time sterilization the seeds were submerged in 70% alcohol and after the following treatments were: CaCl202 concentration (2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.0 and
15.0%) as a function of exposure times (5, 10, 15, 20 and 25 min). For the was used establishment of the buds in vitro WPM supplemented with active charcoal (0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0%) as a function of sucrose (0, 10, 20, 30 and 40 g). Multiplication in the culture medium was supplemented with BAP (0.0, 0.5, 1.0, 1,5 and 2,0 mgL4) as
a function of IBA (0.0, 0.25, 0.5, 0.75 and 1,0 mgL"1). For root culture media containing
ISA (0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 and 4.0 mgL"1) and AIA (1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 mgL" !) . In the step of cryopreservation technique for the encapsulation-desiccation, the
capsules were formed with the o solutions of alginate gel (5%) and calcium chloride (0.2 M), periods of dryness were 0, 1, 2 and 3 hours in a laminar flow chamber. After it was determined the water content of buds and subsequently frozen in liquid nitrogen (-196 °C) for 5 days. In the vitrification method we used sucrose concentrations (0.0, 0.25, 0.5 and 0.75 M) and DMSO (0, 5, 10 and 15%), after the buds were frozen in liquid nitrogen for 5 days and subsequently grown in culture medium. Given the results, we conclude that the CaCl202 was effective in disinfection of seeds of mangabeira; the
active carbon was significant for the establishment of the gems; the induction of new roots occurred of in medium supplemented with IBA; the step cryopreservation did not regenerate buds.
1. INTRODUCED
A fruticultura e urn dos setores agricolas mais importantes para o Brasil, influenciando na economia, sociedade, saude alimentar entre outros fatores. A diversidade genetica de especies frutiferas nativas no pais 6 uma caracteristica relevante, ocorrendo ern funcao do clima tropical e dos multiplos ecossistemas existentes, dando possibilidade para que cada regiao produza frutos exclusivos, oriundos de plantas que se estabelecem em determinados tipos de solos e temperaturas.
A mangaba e um fruto nativo das regioes Norte e Nordeste do Brasil, com pouca incidencia no Centro-Oeste. Seu sabor adocicado agrada ao paladar e por isso e muito apreciada na forma de sorvetes, geleias, compotas, doces, licores, sucos entre outros e ainda na extracao de latex para a producao de borracha, movimentando a economia das regioes produtoras.
Apesar da planta origmar produtos que proporcionam lucres aos produtores, a falta de informacao sobre a cultura restringe seu cultivo comercial, tomando o aproveitamento limitado a pequenos produtores onde rs extrativismo 6, praticamente, a sua unica forma de exploracao o que impede o aproveitamento total de sua potenci alidade.
Para garantir pomares e frutos de boa qualidade e necessario que as plantas sejam sadias. Sendo indicado a micropropagacao para a producao de mudas, por influfrem nas medidas de controle e prevencao da contaminacao por microorganismos, originam mudas com mais vigor e com melhor padrao fitossanitario, al&m de permitir que sejam selecionadas caracteristicas desejaveis a partir da planta mae, sendo possivel obter com rapidez um grande nilmero de mudas idSnticas. Essa metodologia permite maior germinabilidade das sementes do que em viveiros, porque as condi9oes de cultivo
in vitro sao mais adequadas para germinacao e desenvolvimento initial da plantula;
permitindo encurtar o periodo juvenil e antecipar a frulificacao.
Um fator preocupante verifica-se nas regioes de sua ocorrencia, que e principalmente nas areas litorSneas, onde a planta vein sendo eliminada para fins da construcao civil e tambem para monocultura da cana-de-agucar e pastagens, refletindo num acentuado processo de erosao genetica, em conseqiiencia diminuindo a producao de frutos e queda na qualidade dos mesmos. Fato que a coloca na atualidade como uma das fruteiras nativas mais ameacadas de extincao do Nordeste brasileiro.
A micropropagacao aliada a criopreservacao vem sendo utilizada para preservacao em longo prazo do germoplasma de especies vegetais, onde o material bio!6gico e conservado em nitrogenio h'quido, reduzindo a taxa de deterioracao, aumentando o perfodo de armazenamento, diminuindo os custos e a perda da viabilidade e, ainda, assegurando a preservacao das fontes geneticas da planta, atraves de bancos de germoplasma.
1.1 Objetivo geral
Desenvolver protocolos de micropropagacao e criopreservacao para a cultura da mangabeira.
1.2 Gbjetivos especfticos
Estabelecer um protocolo de micropropagacao utilizando gemas apicais e laterals de mangabeira;
Desenvolver metodologia de congelamento e descongelamento de gemas de mangabeira, atraves dos metodos da vitrificacao e do encapsulamento e dessecacao.
2. REVISAO DE L I 1 E R A T U R A
2.1 A especie Hancomia speciosa Gomes
A diversidade vegetal brasileira e de aproximadamente 60 mil especies entre elas 500 de frutiferas nativas. A mangabeira {Hancomia speciosa Gomes) e mais uma alternativa para diversificar a producao de frutas, tendo a vantagem de ser uma especie endemica brasileira (V ALOIS, 1999).
FONSECA et al. (2003) classificou a mangabeira pertencendo a famflia das Apocinaceas, como nativa dos solos brasileiros encontrada em diversas regioes do pais, vegetando espontaneamente no Nordeste com ocorrSncia desde os Tabuleiros Costeiros e Baixadas Litor&neas, onde ocupa solos profundos, pobres e arenosos. Tambem e cultivada nas areas de Cerrado da regiao Centro-Oeste e apresenta incidencia nas Regioes Norte e Sudeste (NETO et al., 2007).
Em pesquisa realizada por FONSECA (2003) buscando os estados produtores de mangaba, a Parafba, Bahia e Sergipe se destacam como produtores do pais, onde os
frutos sao obtidos principalmente de forma extrativista. As Areas em que o cultivo tecrrificado esta" implantado sao quase inexistentes, com excecao para algumas poucas que ocorrem em Sergipe e Parafba (SILVA JUNIOR, 2004).
De acordo com diagnostico realizado por AGUIAR FILHO e BOSCO (1998), na Parafba a planta ocorre na mesorregiao da Mata Paraibana, nas areas das microrregioes de Joao Pessoa e dos Litorais Norte e Sul.
Segundo estudos realizados por BRAG A (1960), o nome da mangabeira em tupi-guarani, significa "coisa boa de comer". Esta especie, de acordo com GUERRA et al. (2005), tambem, e conhecida por mangaba, mangabiba, magaiba, magaiba-uva entre outros. E uma planta de clima tropical que necessita para o seu desenvolvimento de temperaturas medias anuais em torno de 25 °C com chuvas bem distribuidas, variando de 750 a 1500 mm anuais.
LEDERMANN et al. (2000) estudando a mangabeira observou que a planta tolera periodos secos, 6 encontrada vegetando na maioria das vezes em solos arenosos, acidos, pobres em nutrientes e em materia organica, porem, apresenta melhor desenvolvimento em solos areno-argilosos profundos* drenados e com bom teor de materia organica. E encontrada em altitudes que vao desde o nfvel do mar ate mais de
1500 m.
Em estudos de caracterizacao, realizado por LEON (1987) a arvore atinge em torno de 5 a 10 m de altera. Apresenta copa irregular, tronco tortuoso, com muitos ramos e aspero, os ramos sao lisos e avermelhados. As folhas se dispoem de forma posta, simples, pecioladas, glabras, brilbantes e coriaceas. A mfSorescencia possui de 1 a 7 flores, perfumadas e de coloracao branca e a floracao ocorre durante o periodo de agosto a novembro, com pico em outubro. A frutificacao pode ocorrer em qualquer epoca do ano, mas concentra-se em julho a outubro ou de Janeiro a abril (SOARES, 2005).
De acordo com a classificacao feita por LEON (1987) o fruto possui forma elipsoidal ou esferica, com polpa aromatica e muito agradavel que e consurnido quando maduro. Ja AGUIAR FILHO et al. (1998) caracterizou o fruto como sendo do tipo baga, de tamanho, formato e cores variadas, normalmente elipsoidal ou arredondado, amarelados ou esverdeados, com pigmentacao vermelha ou sem pigmentacao, a polpa amarelada e adocicada, rica em vitaminas, ferro fosforo, calcio e proteinas. As sementes sao achatadas e disc6ides com coloracao castanho-clara (LEDERMANN et al., 2000).
Sobre o periodo de producao a mangabeira inicia a sua producao entre o terceiro e o quinto ano ap6s o plantio. SJXVA JHJNIOR (2004) relatou a partir do quinto ano, a cuitura pode apresentar produtividade de 10 a 12 toneladas por hectare. O fruto deve ser consumido quando maduro, in natura ou processado como polpa, doce, compotes, sorvetes. vinhos, vinagres, licores, sucos, etc.
A mangaba e uma das materias-primas mais importantes para a inddstria de sucos e sorvetes do Nordeste brasileiro e, esta entre as 10 especies selecionadas como de altissima prioridade pelo Programa Plantas do Futuro do CNPq/World BaruV/GEF/MMA/Probio, com maior potencial de uso imediato entre as fruteiras nativas da regiao Nordeste (FERREIRA et al., 2005).
De acordo com FERREIRA (1980) e PARENTE et al. (1985) o fruto da mangabeira e muito apreciado, consumido in natura e tambem 80% de sua utilizacao e na fabricacao de refrescos, sorvetes, doces secos, compotas, no prepare de vinhos e vinagres e na medicina popular. A mangaba tambem pode ser explorada na producgo de borracha (PAULA, 1992) que e utilizada na regiao dos cerrados para impermeabilizar tecidos na confeccao de bolsas e para tratar luxacoes e hipertensao (ESRSCHMANN e ARIAS, 1990).
Sobre o tema NETO et al. (2007) refere-se a mangabeira como uma boa opcao para fruticultura brasileira, mas que carece conhecimentos tecnicos no intuito de viabilizar piantios comerciais.
2.2 Micropropagacao
A micropropagagao compreende varias tecnicas que utilizam o cultivo asseptico de partes da planta em condicoes controladas de nutricao, luminosidade, foto-penodo e temperatura como forma de propagagao vegetativa (OUVEIRA et a l , 2007).
Segundo PAIVA et al. (2002) o metodo da micropropagacao e uma possibilidade real para obtencao de mudas com mais vigor e com melhor padrao fitossanitario. ERIG et al. (2004) afirma que esse tipo de cultivo e uma estrategia importante para solucionar problemas de propagagao, melhoramento gen6tico e biotecnologico das plantas. Deste modo, a propagacao in vitro apresenta muita influgncia nas medidas de controle e prevencao da contaminacao, sendo muito importante o estabelecirnento de um protocolo.
Para que seja possivel e se torne viavel a aplicagao da micropropagacao na producao de mudas e, que possa ser usada associada aos metodos tradicionais de propagacao, e necessario que se reduza os custos de producao, que em grande parte se devem as perdas causadas pela contaminacao in vitro, por desordens fisiologicas e morfo!6gicas nas plantas, a balxa percentagera de sobrevivencia das plantas na etapa de aclimatizacao, necessidade de m§o-de~obra especializada e, sobretudo o elevado custo de funcionamento e manutencao das salas de crescimento (CARVALHO et al., 2006).
O cultivo in vitro e um procedimento significante na propagacao de diferentes esp6cies. No entanto, problemas tern sido identificados na micropropagacao da mangabeira e, dentre eles destacam-se contaminantes fungicos e bacterianos presentes em explantes oriundos de plantas adultas que dificultam o estabelecirnento de protocolos de micropropagacao (ALOUFA, 2003; LEMOS et at, 2006).
De acordo com SCHTJCH et al. (2008) as plantas lenhosas, entre elas a maioria das frutiferas, sofrem mudancas consideraveis durante a transicao da fase juvenil para a fase adulta que segundo WENDLING e XAVIER (2001), a maturacao nelas € um assunto de extrema importancia por causar variacoes na capacidade de propagacao vegetativa, especialmente no que se refere ao potencial de clonagem.
JORDAN (1988) afirma que devido a recalcitrancia das sementes, tecnicas de micropropagacao vem sendo desenvolvidas. Diversas pesquisas utilizando meristemas, gemas ou segmentos de caule estao sendo desenvolvidas buscando sucesso na propagacao de frutiferas nativas, porem trabalhos com especies lenhosas como a mangabeira, ainda sao escassos,
STEIN et al. (2007), estudando a germinacao in vitro de inga\ dizem que estudos de meios de cultura que favorecam a germinacao in vitro de especies recalcitrantes sao importantes, tanto para maximizar a taxa de germinacao como para obter plantulas uniformes com qualidade genetica e fitossaoitana adequada.
Em estudo com copaiba, NOLETO e SILVEIRA (2004) concluiu que a germinacao de sementes in vitro apresenta uma maior germinabilidade do que em viveiros, porque as condicoes in vitro sao mais adequadas aos processes de germinacao e desenvolvimento inicial da plantula. PIMENTEL e SANTOS (1978) recomenda que as sementes devam ser utilizadas logo apos terem sido despolpadas, pois o vigor das sementes pode estar comprometido quando despolpadas ha mais de sete dias.
A micropropagacao nao s6 da mangabeira, como de outras especies, passa por diversas etapas que vao desde o estabelecirnento da cultura in vitro, at6 o enraizamento.
Uma microplanta com sistema radicular bem desenvolvido e de muita importancia para a sobrevivencia e crescimento de plltntulas de mangabeira, principal mente na aclimatacao e transplantio para o campo. Porem a sobrevivencia das plantulas nao depende somente da formacao de um sistema radicular com bom desenvolvimento, mas tambem da formacao de um bom sistema vascular entre o broto e raizes (SOMMER e CALDAS, 1991).
O sucesso de um protocolo de micropropagacao depende do controle de inumeras variaveis, que vgo desde a assepsia do material coletado do campo ate a aclimatacao do material produzido in vitro, passando pelos reguladores de crescimento e tipos de explantes utilizados. Para isso, devera ser testadas diversas dessas variaveis, a fim de se encontrar um protocolo com eficiencia, praticidade e custos compatfveis (MOURAetaL, 2008).
2,3 Fases e t'atores importantes na micropropagacao
O primeiro estagio da micropropagacao consiste na selegao de explantes, desinfestacao e cultivo em meio nutritivo sob conduces ass6pticas. O segundo estigio e a multiplicacao dos propagulos mediante sucessivos subcultivos em meio proprio, e o terceiro estagio e a transferencia das partes aereas produzidas para meio de enraizamento e subseqiiente transplantio das plantas obtidas para substrato ou solo (GRATTAPAGL1A e MACHADO, 1998).
2.3.1 Seleeao do material vegetal
Plantas de grande e medio porte tern sido tradicionalmente propagadas por sememes. A propagacao in vitro a partir de sementes e plantulas 6 viavel principalmente por aumentar o rendimento em especies que tern baixa producao de sementes. A aplicacao mais importante desta tecnica e a possibilidade de producao em massa de plantas em um programa de melhoramento (MANTELL et al., 1994).
Tambem sao utilizados outros tipo de explantes para o estabelecirnento in vitro, segmentos nodais de explantes juvenis, gemas axilares obtidas por rejuvenescimento de plantas adultas, embrioes zigdticos e as plantulas obtidas de sementes de origem sexual (OLMOS et a l , 2004).
2.3.2 Desinfestacao do materia! vegetal
Varios fatores podem afetar o vigor germinativo das sementes e promover a formacao de plantulas anormais ou sua morte, entre eles a dormencia e a presenca de microrganismos, sobre tudo de fungos e bacterias. Por isso, os metodos de desinfestacao devem ser eficazes, para que a platitula sirva de fonte de explante livre de agentes contaminantes (CORDER e BORGES JUNIOR, 1999; BORGES JUNIOR et al., 2004).
De acordo com NASCIMENTO et al. (2007), o etanol e os compostos a base de cloro sao as substantias com acao germicida mais utilizada neste processo. O hipoclorito de sodio ou de calcio vem mostrando grande eficiencia na desinfestacao de sementes, eliminando fungos e bacterias, assim como a utilizacao de fungicidas e bactericidas, promovendo aumento no total de plantulas germinadas a partir de sementes tratadas. A concentracao dos agentes desinfestantes e o tempo de exposicao das sementes a esses compostos podem variar de acordo com as especies, sendo necessario, entao, a sua adequacao de acordo com a sensibilidade do tecido.
Sementes contaminadas por fungos e bacterias nao sao capaz de germinar (COUTO et a l , 2004). CORDER e BORGES JUNIOR (1999), ao estudarem a germinacao de sementes de Acacia mearnsii em condicoes in vitro, observaram que a presenca de fungos e bacterias nas sementes foi o fator principal da ausencia de
germinacao.
CHALUPA (1981), JUNCKER e FAVRE (1994), afinnam que as condicoes fitossanitarias da planta matriz sao importantes na medida em que irao determinar a facilidade de se descontaminar o explante durante o isolamento. De acordo com GEORGE (1993), a concentracao e o tempo de exposicao aos desinfestantes dependem do material vegetal e diferentes partes da planta apresentam respostas variadas quanto a sensibilidade dos tecidos. Uma desinfestacao eficiente elimina os microrganismos e nao causa danos ou morte aos tecidos.
O etanol geralmente 6 utilizado na concentracao de 70%, com tempo de exposicao dos tecidos variando de alguns segundos a minutos. A utilizacao de cloro ativo varia nas concentracoes de 0,5 a 2% e o tempo de exposicao de 10 a 20 min (FAIADetal., 1997).
Os procedimentos de desinfestacao sao realizados em camara de fiuxo laminar, utilizando vidraria esteril. Apos a desinfestacao, sao efetuadas lavagens com agua
destiiada autoclavada, para a remocao dos residuos dos agentes desinfestantes (WENDLING et a l , 2006).
PINHEIRO et al. (2001) em estudos sobre a germinacao in vitro da mangabeira aconselham que as sementes devem se extraidas atraves de despolpamento dos frutos maduros sobre peneiras e em seguida levar as sementes com agua corrente e imergi~las em uma solucao de hipoclorito de s6dio (2,5% de cloro ativo) durante 10 min, os pesquisadores concluiram que este tipo de tratamento permite maior facilidade na retirada da polpa do fruto que apresenta consistencia pegajosa devido a presenca de latex. Ja BARROS et al. (2006) concluiu que a extracao manual de sementes de mangabeira proporcionam sementes com maior qualidade fisiol6gica.
Num estudo com diferentes meio de cultivo para germinacao de mangabeira, LflDO et al. (2007), utilizaram a seguinte seqiiencia de tratamentos para desinfestar as sementes: lavagem com solucao de detergente, enxague em agua destiiada para remocao do detergente, imersao em fungicida Benomil (5,0 g L4) por 5 mm em camara de fluxo
laminar, trSs lavagens com agua destiiada esteril, imersao em alcool etilico 70% por 10 segundos, imersao em solucao de hipoclorito de sddio 10% por 10 min e trSs enxagiies finais com agua destiiada esteril; esse procedimento mostrou-se eficiente e nao foi observada nenhuma contaminacao fungica ou bacteriana ao longo do periodo experimental.
PEDCOTO et al. (2006) utilizaram o anti fimgico Benomil (1,72 mM) por 10 minutos para Lippia filifolia Mart e ainda foi adicionado Benomil (0,172 mg) ao meio de cultura para controlar a contaminacao.
Para desinfestacao de explantes de ameixeira, ROGALSKI et al. (2003), utilizaram o processo de desinfestacao dos explantes a serem micropropagados, com as seguintes etapas: 5 min em solucao de agua -f Tween 20 (10 gotasL"1), lavagem em agua
corrente, 2 min em alcool 70%, 15 minutos em hipoclorito de s6dio (1,5%) e em c&mara de fluxo laminar trSs lavagens em agua destiiada autoclavada; com esta tecnica, obteve resultados favoraveis contra a contaminacao por fungos e bacterias.
Em experimentos de micropropagacao realizados com a planta medicinal
Potentilla potaninii, por HE et al. (2006) foram utilizadas sementes desinfestadas,
seguindo a seguinte metodologia: 30 segundos em etanol 70%, imersao em 0,1% de HgCl2 por 10 min e apds lavadas seis vezes em agua destiiada esteril.
O cloreto de mercurio foi mais eficieme que o hipoclorito de sddio na desinfestacao de brotacoes apicais de peroba-rosa, possibiHtando taxa mais elevada de sobrevivencia dos explantes (84,10%) (LOPES, 2005).
23.3 Meios de cultura
Os meios nutritivos se baseiam nas exigencias das plantas, quanto aos nutrientes, para seu crescimento, com algumas modificacoes para atender as necessidades especfficas das condicoes in vitro (SOUZA e JUNGHANS, 2006).
Os meios de cultura atuais utilizam os microelementos do meio B5 de
GAMBORG et a l (1968) ou misturas mais concentradas nos meios de cultura MS de MURASHIGE e SKOOG (1962). Os principals microelementos encontrados nos meios de cultura sao o mangan£s, zinco, boro, cobre, molibdSnio, cobalto, iodo, silicio, alumlnio, niquel, ferro e seus quelados, cloro e sddio (TORRES et a l , 1998).
A composicaodos meios de cultura utilizados para a micropropagacao varia de acordo com as especies e as diferentes etapas do processo. Os meios de cultura sao constituidos por agua, que e o componente utilizado em maior quantidade na preparacao, tambem sao constituidos por macronutrientes, que sao fornecidos ao meio de cultura na forma de sais (calcio, magnesio, potassio, nitrogenio, nitrato, fosforo, enxofre, sodio e cloro) (TORRES et at, 1998; ROJAS et al., 2004).
Os meios de cultura incluem um suporte semi-sdlido (agar ou outro produto), meio basal inorgiimco (macro e micronutriemes), uma fonte de energia (sacarose) e frequentemente algum suplemento vitaminico (HARTMANN e t a l , 2002).
Suplemento micro-organicos como vitaminas e aminoacidos sao componentes comumente adicionados aos meios de cultura. As vitaminas aumentam o crescimento e sobrevivencia de plantas quando adicionados ao meio de cultura, uma vez que estas substantias org&nicas se esgotam rapidamente da celula, se tornando necessaria a adicao das mesmas ao meio de cultura para que a planta possa sobreviver (ROJAS et al., 2004). As principals vitaminas incorporadas aos meios de cultura vegetal sao a teonina (vitamina B]), acido nicotinico (niacina), piridoxina (vitamina Be) e mio-inositol (SERAFINI et a l , 2001).
Existera meios de cultura com formulacoes especificas como o MS, as quais apresentam altas concentracoes de sais, sobretudo os ions nitrato e amonia, quando
coraparados a outras formulacoes salinas e meios com menores concentracoes de sais, em especial nitrogemo e potassio, como o meio de cultura WPM, que significa Wood Plant Medium (LLOYD e MCCOWN, 1981) este e utilizado geralmente em especies lenhosas quando o meio MS nao se mostrar eficiente (ROCHA, 2005).
GOMES (1999), estudando a propagacao in vitro de amoreira diz que alguns compostos podem ser adicionados ao meio de cultivo para auxiliar a inducao da rizogenese. O carvao ativado e um deles e tern sido relacionado com a inducao de raizes, provavelmente por criar uma condicao de escuro, na qual as raizes normalmente se desenvolvem. O mesmo autor relata tambem que o carvao ativado 6 um dos compostos mais utilizados para auxiliar na rizogenese in vitro, por possuir a capacidade de fixar auxinas e reter fen6is, sendo, de forma geral, benefico por promover o alongamento das raizes.
L&DO et al. (2007), concluiram que meios de cultura adicionado de 2,0 mgL"1
de carvao ativado proporcionou maior crescimento da raiz principal. GRATTAPAGLIA e MACHADO (1998) consideram o carvao ativado um agente benefico quando utilizado em concentracoes de 0.1 a 2%, fisicamente, ele simula a condicao de escuro no qual as raizes normalmente se desenvolvem melhor pela reducao da incidencia de luz na zona de crescimento ativo do sistema radicular, alem de adsorver substantias toxicas, principalmente fenois e/ou quinonas que podem afetar o desenvolvimento do explante.
Com especies lenhosas, o meio MS nao se mostra sausfatorio em alguns casos e composicoes mais diluidas em macronutrientes apresentam melhor desempenho (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).
STEIN et a l (2007), verificaram que o meio de cultura WPM/2 e o mais apropriado para a germinacao de sementes de ingazeiro in vitro, tendo apresentado mdice de 96% sendo superior ao WPM (66%), MS/2 (75%) e MS (30%). SOARES (2005) obteve maior porcentagem de germinacao de sementes de mangabeira em meio nutritivo MS/2.
PINHEIRO et al. (2001), afirmaram que sao necessarios mais estudos de meio de cultura que favorecam a germinacao in vitro na mangabeira, tanto para maximizar a taxa de germinacao, como para obter plantulas com qualidade genetica e fitossanitaria.
2.3.4 Reguladores de crescimento
Reguladores de crescimento sao analogos sinteticos dos fitohormonios, ou seja, tern a mesma funcao, porem sao sintetizados em laboratorio e nao pela planta (TERMIGNONI, 2005).
Para ZELENA e FUKSOVA (1991), no meio de cultura 6 essencial a presenca de auxinas, uma vez que elas sao responsaVeis na inducao de raizes, e os primordios radiculares dependem do balanco entre as concentracoes de auxinas e citocininas. As auxinas sao substantias que controlam o crescimento e o alongamento celular e as citocininas estimulam a divisao celular e reduzem a dominSncia apical (PASQUAL e BARROS, 1992; 2001).
De acordo com GRATTAPAGLIA e MACHADO (1998), a citocinina que esta comercialmente disponfvel, o 6-benzilaminopurina (BAP) 6 a que apresenta melhores resultados in vitro na promocao e multiplicacao de diversas especies, vem sendo utilizada em 60% dos meios de cultura. As auxinas mais utilizadas sao o acido indolbutfrico (AIB), o acido naftalenoacetico (ANA) e o acido 2.4 diclorofenoxiacetico (2.4-D). As duas primeiras sao geralmente utilizadas na fase de enraizamento, e a ultima, na inducao de calos e erabriogenese somatica.
O uso em excesso das citocininas e toxico e caracteriza~se, principalmente, pela falta de alongamento das culturas, reducao do tamanho das folhas, encurtamento dos entrenos, engrossamento exagerado dos caules e vitrificacao generalizada, alem de ocasionar sefios problemas na fase de enraizamento (CHAVES et al., 2005).
Para NARAYANASWAMY (1977), a toxidez causada pelo excesso de reguladores de crescimento no meio de cultura, ou pelo prolongado periodo de tempo em que a cultura permanece exposta a eles, pode provocar alteracoes geneticas, fisiologicas e morfo!6gicas, resultando na reducao da taxa de multiplicacao e no encurtamento dos caules, o que dificulta a individualizacao das plantas e o processo de enraizamento.
Em estudo sobre germinacao in vitro da mangabeira PINHEIRO et al. (2001) concluiram que a adicao de 0,1 mgL"1 de acido giberelico (GA3) no meio de cultura MS
liquido e solido favoreceu a germinacao das sementes, comprovando que as sementes de mangabeira necessitam de uma quantidade minima de hormSnio para estimular a sua germinacao. O excesso de hormonio causa efeito inibidor e eventualmente tdxico, pois fisiologicamente os hormdnios podem estar relacionados com o desenvolvimento das
sementes ou podem estar sendo acumulados para subsequente participacao no controle da germinacao e crescimento da plantula (BEWLEY e BLACK, 1983).
2.3.5 Contaminacao in vitro de plantas
Um explante pode alojar uma infinidade de microrganismos localizados externa ou intemamente, tais como bacterias, fungos, virus, vir6ides e outros que se nao forem controlados com eficiencia antes da inoculacao no meio nutritivo, irao contaminar o material onde se realiza o cultivo, inviabilizando a micropropagacao (C3D e ZIMMERMANN, 2006).
2.3J5.1 Oxidacao fenolica
A oxidacao fenolica 6 a reagao do 02 com ions metalicos (+) dos outros
compostos do meio de cultivo. Os explantes a serem inoculados no meio de cultivo podem liberar exudados que o tornam escuro. Esse tipo de escurecimento e consequencia da iiberacao de fenois dos ferimentos ocasionados no processo de exu-acao do material vegetal (SANTOS, 2001).
A oxidacao fendiica se da por meio de uma enzima chamada polifenol oxidase. A oxidacao dos polifendis leva a producao de substantias amareladas de composicao complexa, do tipo quinonas. Essas substancias podem se ligar a prolemas das membranas ou enzimas acarretando toxidez e morte da celula (TEIXEIRA, 2005).
GRATTAPAGLIA e MACHADO (1998) recomendam as segumtes medidas para controlar a oxidacao: lavagem do material em agua corrente antes da desinfestacao, pois ajudara na lixiviacao de compostos fenolicos, utilizacao de antioxidantes: acido asc6rbico, polivinilpirrolidona (PVP), carvao ativado, e incubacao inicial dos explantes no escuro.
Segundo DAVIES (1972) a atividade das enzimas que fazem a biossmtese e oxidacao de fendis e aumentada pela luz e a diminuicao da luminosidade na camara de fluxo laminar, durante a inoculacao tambem e benefica para reduzir a oxidacao (MARKS e SIMPSON, 1990).
2.3.5.2 Contaminacao fungi ca e bacteriana
Um dos maiores problemas da producao de mudas atraves da utilizacao de tecnicas de cultura de tecidos e a contaminacao do meio nutritivo por fungos e bacterias. A contaminacao se estabelece no meio de cultura e/ou material vegetal competindo pelos nutrientes, produzindo substantias tdxicas e imbindo o desenvolvimento do explante, ocasionando a sua perda (SOUSA et al., 2007).
Existem quatro fontes de contaminacao: a fonte de explante, o meio nutritivo, o ambiente e o operador (SOUSA et al., 2007).
O Benomil ou Benomyl e o primeiro fungicida sistemico desenvolvido, possui atividades preventivas, curativas e sistSmicas contra numerosos grupos de fungos, apresenta baixa toxicidade e de modo geral nao provoca fitotoxicidade (SATO et al., 2001).
O Benomil tern sido utilizado em diversos trabalbo no controle de contaminates fungicas do meio de cultivo e do material vegetal em varias concentracoes, de 50 mgU! (HAUPTMANN et al., 1985) a 0,6 mgL"1 (YANG, 1976)
de Benomil.
Os antibioticos e fungicidas sao utilizados no controle in vitro de patdgenos (LONDE et al., 2007). POLLOCK et al. (1983) demonstraram que o uso de certos antibioticos e eficiente no controle de bacterias, porem o uso deles para o controle in
vitro de bacterias contaminantes tern sido limitado devido a toxicidade para as plantas
(ARRUDA, 2000).
2.3.6 Multiplicacao
Estudos realizados in vitro independente da especie moslram que o suprimento adequado em agua, composic&o de sais e temperatura conveniente, assim como a luz, sao requisites fundamentals para a germinacao, assim como fatores de composicao qufmica e balance hormonal influenciam no processo germinativo (TOLEDO e MARCOS FILHO, 1977; MAYER e POUAKOFF-MAYBER, 1982, 1989; BEWLEY, 1984, BORGES e RENA, 1993). Segundo OLIVEIRA (1989) a faixa de temperatura otima de germinacao para sementes de mangaba e entre 20 e 30 °C, sendo que a luminosidade nao interfere na germinacao, ja que as sementes de Hancomia speciosa sao indiferentes a luz.
O crescimento e a organogenese in vitro sao altamente dependentes da interacao entre as substantias de crescimento que ocorrem naturalmente na planta e os analogos sinteticos (reguladores de crescimento) os quais sao adicionados ao meio de cultura (GEORGE, 1996).
GRATTAPAGLIA e MACHADO (1998) afirmaram que o tipo de citocinina e a sua concentracao sao os fatores que mais influenciam o sucesso da multiplicacao in
vitro. Plantulas originadas de sementes possuem tecidos pouco diferenciados, o que
possibilita uma otima fonte de explantes competentes. No entanto um alto percentual de germinacao de sementes in vitro 6 necessario para possibilitar um suprimento suficiente de explantes para a realizacao de experimentos em cultura de tecidos (SILVA et al., 2005).
NOLETO e S1LVEIRA (2004), em trabalhos com copaiba disseram que um aspecto que deve ser considerado 6 que a germinacao de sementes in vitro permits uma maior germinabilidade das sementes do que em viveiros, provavelmente porque as condicoes in vitro sao mais adequadas aos processos de germinacao e desenvolvimento initial da plantula. A porcentagem de germinacao de sementes de mangaba em condicoes de viveiro, no geral e baixa, nao so devido a presenca de inibidores na polpa como tambem ao fato das sementes serem recalcitrantes (LORENZI, 2000).
LEDO et al. (2007), em estudos de germinacao in vitro de sementes de mangabeira, obtiveram taxa de germinacao acima de 95%, isto se deve provavelmente a remocao da polpa do fruto e a rapida inoculacao das sementes, evitando a desidratacao e mantendo a viabilidade da semente.
PINHEIRO et al. (2001), realizando estudos com germinacao de mangabeira, obtiveram germiiiacao acima de 90%, provavelmente porque a polpa do fruto foi removida e tambem pela rapida inoculacao das sementes, que foi feita logo apos a colheita do fruto, evitando assim a perda de agua e mantendo a sua viabilidade. Trabalhos realizados anteriormente por PARENTE e MACHADO (1989) reforcam que a remocao da polpa aumenta o sucesso na germinacao.
Estudando a micropropagacao do pequizeiro, SANTOS et al. (2006), utilizaram na fase de multiplicacao meio de cultura WPM acrescido de 800 mgL"1 de PVP
(polivinilpirrolidona), 30 gL"1 de sacarose, 7gL"! de agar e varias concentracoes de
BAP.
Em estudos realizados com banana por PEREIRA et al. (2005), para a etapa de multiplicacao foi utilizado meio de cultura MS, suplementado com 5 mgL'1 de BAP,
30gL"5 de sacarose e 7gL~1 de agar para solidifioacao, esse meio de cultura apresentou
resultados significativos positivamente para esta etapa.
PINHEIRO et al. (2001), em estudos de germinacao de mangabeira sob diferentes condicoes de cultura In vitro, obtiveram aproxtmadamente 75% de germinacao em meio MS suplementado com 0,1 mg.L'J de GA3. LEMOS (2003)
alcancou 62% em meio MS sem reguladores de crescimento e SOUZA et al. (2005), 70% de germinacao em meio basico MS solido ou Hquido, independente das sementes apresentarem ou nao tegumento.
Diversos trabalhos com a germinacao in vitro de mangabeira, variedades botanicas do Nordeste e dos Cerrados, foram realizados (GR1COLLETO, 1997; LEMOS et al., 2006; MACHADO et a l , 2004), porem aspectos de enraizamento e aclimatizacao necessitam ser melhores caracterizados.
2.3.7 Enraizamento
A etapa de enraizamento caracteriza~se pela formacao de raizes adventicias nas plantulas proveniences da multiplicacao, permitindo assim o posterior transplantio ara condicoes ex vitro (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).
ASSIS e TEIXEIRA (1998), afirrnaram que durante o enraizamento, a fotossintese realizada pelos explantes nas condicoes in vitro 6 relativaraente baixa, e com a formacao de raizes e um processo que requer energia, o fomeciraento de carboidratos 6 quase sempre necessario. Segundo GRATTAPAGLIA e MACHADO (1998) geralmente a concentracao de sacarose do meio de enraizamento e mantida nos mesmos niveis do meio de multiplicacao, entre 20 e 30 g.L"1. De acordo com ASSIS e
TEIXEIRA (1998) outro fator que merece atencao no enraizamento in vitro 6 a concentracao dos sais minerals do meio de cultura.
HOFFMANN (2002) salienta que um dos maiores obstaculos a aplicacao pratica dos metodos de cultura de tecidos na propagacao de plantas 6 a dificuldade de transferir as mudas das condicoes in vitro para o solo com sucesso, devido a grande diferenca entre as condicoes ambientais do laboratdrio, onde as mudas sao produzidas e o campo. SILVA et al. (1995) disseram que estas novas condicoes devem ser impostas as plantas progressivarnente, de forma que elas nao sofram estresses que possam acarretar danos futuros ou mesmo a morte da planta.
O sucesso da transferencia de plantas micropropagadas para a casa de vegetacao e essencial para um sistema de micropropagacao bem sucedido (HOFFMANN, 2002). Segundo PASQUAL et a l (2000), dentre os reguladores, o acido indolbutfrico (AIB) tern sido o mais utilizado para induzir o enraizamento de brotos. A auxina mais utilizada alem da citada anteriormente e o Acido naftalenoacetico (ANA). As respostas as auxinas, no entanto, nao sao universais. Certas especies, principalmente as lenhosas, enrafzam com dificuldade ou nao errraizam, mesmo na presenca de auxinas e algumas especies ate dispensam o uso de regulares de crescimento no seu enraizamento (ROHR e HANUS, 1987).
Segundo KULESCHA (1988), o nivel das auxinas endogenas e o que determina a forrnacao de raizes adventicias, ou seja, 6 o acumulo de auxinas endogenas que induz a formacao de raizes.
SANTOS et al. (2006), encontraram 100% de formacao de raizes nas brotacoes de pequizeiro inoculadas em meio de cultura contendo carvao ativado e nos meios sem carvao ativado, todas as brotacoes desenvolvidas apresentaram formacao de calos em sua base, o que pode interromper a Hgac&o vascular entra as raizes e brotacoes, dificultando uma futura aclimatizacao.
Em estudos realizados por PEREIRA e FORTES (2001) com madeira, na fase de enraizamento dos explantes foi utilizado Vi da concentracao do meio de cultura MS, suplementado com 100 m g L4 de mio-inositol, 30 gL"1 de sacarose, 0,2 m g L4 de AIB e
6,0 g L4 de agar para que se houvesse sucesso na formacao de raizes.
GRATTAPAGLIA e MACHADO (1990) sugerem que apds os primeiros sinais de emergencia das raizes in vitro, as plantas devem ser imediatamente transplantadas. Porem, PEREIRA e FORTES (2001) observaram que para madeira, quanto menor o tempo das brotacoes em meio de enraizamento, menor foi o taraanho do sistema radicular e da parte aerea das plantas em casa de vegetacao, originando assim plantas de menor vigor.
PEREIRA et a l (2005) estudando a micropropagacao da bananeira, encontraram resultados significativos para o enraizamento utilizando meio de cultura com 50% dos sais mineiras do meio de cultura MS adicionado de 15 g L4 de sacarose e 7gL4 de agar,
2.4 Crioconservacao de gemas de mangabeira
A palavra criogenia deriva do grego "crios" que significa frio e "genia" que significa nascimento. Na pratica a criogenia de acordo com VICENTE et al., (1994), defmi-se como a ci@ncia dedicada a producao de baixas temperaturas, sendo que o adjetivo "criogenico" e utilizado para denominar gases como nitrogenio onde, em estado liquido, a sua temperatura e muito baixa (~196°C).
MEDE1R.OS e CAVALLAR (1992) definem crioconservacao em nitrogenio liquido como sendo a preservacao de materials biologicos a baixas temperaturas (entre
-160 e -196°C), nos quais todos os processos metabolicos sao paralisados e mantidos em estado latente, proporcionando a preservacao dos materials em longo prazo. E tambem um metodo potencialmente estudado para reduzir a taxa de deterioracao, aumentando o tempo de armazenamento das sementes, assegurando a preservagao das fontes geneticas da planta, alem de reduzir os custos e a perda da viabilidade (STANWOOD e BASS, 1981;STANWOOD, 1985).
A criopreservacao e considerada o metodo ideal para a conservacao de germoplasma, por permitir o armazenamento de materials biologicos por tempo indefmido, mantendo sua estabilidade genetica e suas caracterfsticas fenotipicas, usando pouco espago e requerendo muito pouca manutencao (ENGELMANN, 1997).
A tecnica da crioconservacao reduz o metabolismo a niveis muito baixos, no qual todos os processos bioqufmicos sao significativamente reduzidos e a deterioracao bioldgica e virtualmente paralisada. Pode-se citar algumas vantagens da crioconservacao como o pequeno espaco a ser ocupado por um banco de germoplasma, a simplicidade de manuseio das condicoes de armazenamento, e por fim o baixo custo do processo (ALMEIDA et a l , 2002; KARTHA, 1985).
A crioconservacao pode ser uma alternativa para a conservacao de especies que sao atualmente mantidas em colecoes de campo, jardins botSnicos, reservas naturals ou sistemas de conservacao in vitro com plantas em regime de crescimento controlado (HARDIN et al., 1997).
O germoplasma vegetal e a sua conservacao sao hoje, considerados de alta prioridade em diversos paises. Durante anos, considerou-se o solo, a agua e o ar, recursos naturals essentials; depois, adicionou-se o germoplasma como o quarto recurso natural essential (FREITAS et al., 1992) concluindo-se desta forma que Bancos Ativos de Germoplasma (BAGS) constituem um dos principals patrimdnios de uma empresa ou
insutuicao agropecuaria, por serera a fonte de genes que alimentam os programas de meihoramento das diferentes culturas vegetais (ROCHA et a l , 2009).
O grande desafio para a crioconservacao e realizar o congelamento sem a formacao de cristais de gelo no interior das celulas. A formacao de gelo no meio intracelular causa ruptura do sistema de membranas celulares, resultando em perda da semi-permeabilidade e da compaitimentacao celular em conseqiiencia disso, as celulas entram em colapso (BUZO e ROSA, 2007).
A opcao pela crioconservacao ira depender do periodo de conservacao desejavel, das especies a serem conservadas, da parte da planta a ser preservada, da disponibilidade de mao-de-obra e dos recursos financeiros disponiveis. Espera-se que, em poucos anos, a criopreservacao se tome mais utilizada no armazenamento de materials vegetais, e conseqiientemente, na conservacao das fontes geneticas vegetais por longos periodos de tempo (ENGELMANN, 2004).
A crioconservacao ainda precisa ser estudada para muitas especies, incluindo as frutiferas tropicals, cujos protocolos disponiveis se concentram em banana e citros (SANTOS, 2000).
De acordo com o Internacional Board for Plant Genetic Resources - TPBGR (1982) a crioconservacao e uma tecnica indicada para as especies de propagacao vegetativa, especies com sementes recalcitrantes, germoplasmas raros ou mesmo especies ameagadas de extingao e de plantas silvestres (STANWOOD, 1980, 1985,
1987).
A crioconservacao aliada a biotecnologia moderna pode ser a solucao chave para a sobrevivencia dos recursos geneticos, por evitar a erosao genetica, sendo hoje, mais que ontem, preciso conservar as sementes do passado e do presente para o futuro, antes que elas desaparecam (CHIN, 1994).
HENSHAW et al. (1980) dizem que embora seja possivel crioarmazenar varias partes da planta, os sistemas organizados, como sementes e embooes, sao mais adequados para conservacao de recursos geneticos.
Para a conservacao de sementes em longo prazo, deve-se conhecer, alem da condicao inicial das sementes, as suas caracteristicas de armazenamento especificos (ALTHOFF e CARMONA, 1999). Uma classificacao das sementes foi proposta por ROBERTS (1973) levando em consideracao suas caracteristicas de armazenamento em duas categorias: ortodoxas e recalcitrantes. Ortodoxas sao aquelas que podem ter o seu teor de agua reduzido pela secagem ate a umidade de 5 a 2% ou menos e, que suportam
baixas temperaturas, inclusive as temperaturas sub-zero empregadas na conservacao em longo prazo, sem ter a sua viabilidade comprometida. As semente que nao toleram dessecacao ate ru'veis abaixo de 12 a 31%, e que nao sobrevivem em temperaturas sub-zero sao classificados como "recalcitrantes".
CUNHA (1996) descreve que o teor de umidade da semente 6, provavelmente, o mais critico fator para o sucesso da crioconservag&o e se a umidade da semente e muito alta, observa-se a sua morte instantanea durante o processo de congelamento e/ou desc ongelament o.
Na maioria dos Bancos de Germoplasma, as sementes sao mantidas a uma temperatura de 10°C e umidade relativa do ar a 40%. No entanto, segundo GONZAGA et al. (2003) esse tipo de banco de germoplasma nao evita a erosao genetica das especies e recomendam a utilizacao de bancos criogenicos para a conservacao das especies vegetais.
Diversas tecnicas sao, com frequencia, estudas em busca de melhores condicoes de armazenamento, sendo que a principal baseia-se na reducao do metabolismo, seja atraves da remocao da agua e/ou da diminuicao da temperatura (KOHOMA et a l , 2006) .
Para a conservacao de germoplasma e desejavel que as sementes mantenham as suas caracteristicas geneticas e fisioldgicas por um periodo correspondents ao que seria necessario para a planta completar o seu ciclo reprodutivo (CHIN, 1988).
STANWOOD e ROOS (1979) submeteram sementes de hortalicas e de flores a imersao em nitrogenio liquido por 1, 30 e 180 dias, verificaram que nao ocorreu efeito prejudicial a germinacao e ao vigor das sementes e apontaram o nitrogenio liquido como um meio promissor a conservacao de sementes em longo prazo.
Na crioconservacao de sementes, os metodos de descongelamento sao de grande importancia, pois quanto mais rapido ocorrer o descongelamento das sementes e tecidos vegetais melbor a preservacao de suas caracteristicas fisioldgicas (ALMEIDA et al., 2007) .
Temperaturas baixas conservam melhor componentes celulares, como as enzimas, perrnitindo a disponibilizacao de glicose para a respiracao da semente, por meio da hidrdiise de sacarose ou outros oligossacarfdeos, podendo ainda agir em enzimas sintetizadoras de outros componentes responsaveis pela integridade das membranas (PETERBAUER e RICHTER, 2001). Porem ha especies que nao toleram grande reducao da temperatura, principalmente o congelamento (CHIN et al., 1989).
A eficiencia da crioconservacao pode depender da velocidade de congelamento e de reaquecimento (CROWE et al, 1990). Porem, materials com baixos teores de umidade o reaquecimento rapido pode provocar danos rTsicos devido a diferengas nas propriedades de expansao entre as partes das sementes, levando a trincamentos que podem alterar o contato entre cotiledones e endosperma (STANWOOD, 3985; MARIN et al., 1990). Para evitar esses danos MARIN et al. (1990) sugerem reduzir a velocidade de descongelamento.
A conservacao do material biologico i assegurada na criopreservacao, pois nessas temperaturas muito baixas o metabolismo celular fica tao reduzido que a deterioracao bioldgica 6 minimizada. Os riscos de perda do material bioldgico sao menores e os custos mais baixos em relacao a conservacao in vitro (SANTOS, 2000).
Em um banco de germoplasma a baixas temperaturas, nao so o processo de crioconservacao deve ser levado em consideracao como tambem o metodo de descongelamento, pois quanto mais rapido ocorrer o descongelamento das sementes, melhor a preservacao de suas caracteristicas fisiorogicas; portanto, o metodo de descongelamento a temperatura ambiente se torna questionavel, uma vez que existe a possibilidade do recongelamento durante esse periodo, necessitando, estudos em relac5o os metodos mais rapidos como o descongelamento em banho-maria (temperatura de 40°C) e a utilizacao de microondas (MOLINA et a l , 2006).
IRIONDO et al. (1992) analisaram a influencia da conservacao em nitrogenio liquido em diversas especies de plantas silvestres com teores de umidade e tempo de exposicoes diferentes. Os resultados nao indicaram diferencas significativas na maioria das especies em relagao ao percentual de germinacao, seja nas amostras de sementes com teores de umidade diferentes, seja nas amostras de sementes com diferentes tempos de exposicao ao nitrogenio liquido.
Antes do material ser congelado e necessario fazer uma desidratacao do material. A desidratacao, por sua vez, nao e um processo simples, pois a agua exerce inumeras fimgoes bioldgicas fundamentals nas celulas. A agua e um importante solvente, meio de transporte, tamponante e um constituinte essencial e estabilizador da estrutura de macromoleculas e organelas. O exito de um protocolo de criopreservacao dependera da defmicao do teor de agua que deverd ser baixo o suficiente para evitai- a
fonnacao de cristais de gelo, mas nao tao baixo que cause injuria por desidratacao excessiva (SANTOS et al., 2001).
Varios metodos sao empregados pai*a o congelamento de embrioes (ENGELMANN, 1991). Protocolos classicos incluindo pre-cultivo com crioprotetores e resfriamento lento, e encapsulamento-dessecacao sao usadas para embrioes. A maior parte dos embrioes sao congelados rapidamente apos dessecacao partial (DEREUDDRE et al., 1991).
Atualmente a criopreservacao de embrioes pode ser a metodologia mais apropriada para a conservacao em longo prazo da diversidade gen6tica das especies vegetais, uma vez que os embrioes podem resistir a condicoes que seriam letais para a semente inteira (BERJAK et al., 2000; SANTOS et al., 2002).
Segundo SAKAI (1997), para conservacao em longo prazo, a disponibilidade e desenvolvimento de tecnicas seguras e de custo efetivo, em subseqiiente elevada regeneracao de plantas sao os requerimentos basicos. Na ultima decada, alguns procedimentos criogenicos como a vitrificacao e encapsulamento-dessecacao tern sido desenvolvidos e aumentado o numero de especies ou cultivares criopreservadas.
2.4.1 Encapsulamento-dessecacao
Como alternativa a desidratacao celular induzida pelo congelamento antes da imersao em nitrogenio liquido, DEREUDDRE et al. (1990) propuseram o processo de encapsulamento-dessecacao, que se baseia na tecnologia desenvolvida para a producao de sementes artificials, sendo possfvel, entao, criopreservar apices ou embrioes somaticos encapsulados em alginate de sddio (3 a 5%), as quais sao pre-cultivadas em um meio contendo altos nfveis de sacarose (0,5 a 0,7 M ) sobre agitato, overnight (etapa de desidratacao), desidratadas por exposicao ao ar da cSmara de fluxo laminar ou com silica gel, colocados em ampolas, imersos diretamente em nitrogenio liquido e lentamente descongeladas.
O encapsulamento protege a estrutura embebida e a toma resistente a tratamentos, que poderiam ser letais (PAULET et al., 1993).
Esta tecnica oferece varias vantagens sobre as tecnicas de criopreservacao convencionais de congelamento lento, por exemplo, facilidade de manuseio de explantes reduzidos, simpb'ficacao do meio crioprotetor, eliminacao dos congeladores programaveis, sobrevivencia independente da velocidade de congelamento e aumento do numero de explantes que sobrevivem a exposicao do nitrogenio liquido (BACHIRI etal., 1995).
2.4.2 Vitrificacao
A vitrificacao e, basicamente, a solidificagao de um liquido, devido nao a sua cristalizacao, mas a uma elevacao extrema da viscosidade do mesmo, durante o congelamento (FAHY et al., 1984). Consiste em se utilizarem solucoes altamente concentradas para preparar os tecidos antes da imersao no rutrogenio liquido (NL) (SAKAI et al., 3990; THAMMASIRI, 2000). E o processo atraves do qual a agua sofre uma transicao da fase liquida para o estado solido amorfo e meta-estavel (FRANKS, 1982; FAHY etal., 1984).
A vitrificacao & o metodo contemporaneo de criopreservacao (FAHY et al., 1984; SAKAI etal., 1990, 1991a, 1991b).
O metodo da vitrificacao foi empregado com exito na criopreservacao de celulas vegetais, no initio da decada de noventa, em trabalhos realizados por SAKAI et al. (1990, 1991a, 1991b), YAMADAetal. (1991) e NISHIZAWA et al. (1993).
O processo de vitrificacao de uma celula inicia pela desidratacao da mesma, que pode ser mduzida por cristalizacao do meio externo durante uma fase lenta de resfriamento ate atingir -30° C a -4GDC, transferindo~se rapidaraente o material vegetal
para o nitrogenio liquido, ocorrendo a vitrificacao da celula, isto e, os componentes celulares passam do estado liquido para solido amorfo e metaestavel, evitando a formacao de cristais de gelo no interior da celula, que podem causar ruptura das membranas resultando em colapso e morte, como conseqiiencia da perda da semipermeabilidade e da compartirnentacao celular (SALOMAO, 2002).
Sao utilizadas baixas concentracoes de crioprotetores no material que sera vitriflcado para que haja entrada dos componentes permeaveis na celula, e, em seguida, solucoes concentradas de crioprotetores para promover a vitrificacao. Apos esse procedimento os frascos sao transferidos para o nitrogenio liquido (MOLINA et al., 2006).
A vitrificacao 6 feita, geralmente, em duas etapas. Na primeira, chamada de pre-vitrificacao, ha uma aumento na concentracao osmdtica, devido a aplicacao de crioprotetores capazes de passar pela membrana celular. Na segunda, fase de desidratacao propriamente dita. o material e imerso em uma solucao de vitrificacao (NISHIZAWA et al., 1993).
A solucao de vitrificacao retira agua do interior das celulas fazendo com que a solucao intracelular se solidiiique, formando um estado amorfo ou vitreo, quando colocada em nitrogenio liquido (GROUT e ROBERTS, 1995; WANG et al., 1998).
As tecnicas de criopreservacao desenvolvidas mais recentemente sao simples e baseiam~se na vitrificacao, ou seja, a agua sofre uma transicao da fase liquida para um estado solido amorfo e meta-estaVel (SANTOS, 2001). O solido assim formado e, na verdade, uma solucao supersaturada e de alta viscosidade, o que Ihe confere as propriedades meeamcas de um solido embora nao haja formacao de uma estrutura cristalina. A transicao para o estado vitreo nao envolve mudancas quimicas, apenas mudancas fisicas na viscosidade do liquido (BUZ6 e ROSA, 2007).
Os procedimentos baseados na vitrificacao simpliiicam o procedimento de crioprotecao e permite que explantes contendo diversos tipos de celulas sobrevivam a exposigao ao nitrogenio liquido (SANTOS, 2001).
Nesse metodo, a desidratacao acontece antes do congelamento. A desidratacao 6 feita, colocando o material em contato com substantias quimicas concentradas e, em seguida, por um rapido congelamento. Deste modo, 6 necessario que o material seja desidratado para um teor de agua apropriado e compatfvel para se obter altas taxas de sobrevivencias. Outra vantagem da vitrificacao e nao ser necessario o uso de criostatos, fatilitando o processo de criopreservacao e reduzindo os custos (ENGELMANN, 1997). Acucares como a sacarose, tralose e glucose, tern sido utilizados como substantias crioprotetoras, porque elas sao excelentes agentes vitrificadores e, alem disto, nao apresentam toxicidade para as celulas vegetais como os crioprotetores (WITHERS,
1991; YAMADA, 1993; DUMET et a l , 1994).
A eficiencia do processo de crioconservacao dependent dos resultados obtidos em cada uma das segumtes etapas: preparo do material, criopreservacao e descongelanento do material (TOWILL, 2002).
2.4.3 Crioprotetores
Os crioprotetores podem ser definidos como substantias quimicas que reduzem a injuria sofrida pela celula, durante seu congelamento e descongelamento. Ha dois tipos de crioprotetores com relacao a sua habilidade em penetrar as membranas celulares. Os crioprotetores que nao penetrant nas celulas atuam desidratando as celulas em
