UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
LUCAS RODOLFO DE OLIVEIRA ROSA
PAPEL DA FOCAL ADHESION KINASE (FAK) NA AÇÃO DO
TAUROURSODEOXYCHOLIC ACID (TUDCA) SOBRE O
ESTRESSE DE RETÍCULO EM CÉLULAS BETA
PANCREÁTICAS INS-1E
CAMPINAS 2019
LUCAS RODOLFO DE OLIVEIRA ROSA
PAPEL DA FOCAL ADHESION KINASE (FAK) NA AÇÃO DO
TAUROURSODEOXYCHOLIC ACID (TUDCA) SOBRE O ESTRESSE DE
RETÍCULO EM CÉLULAS BETA PANCREÁTICAS INS-1E
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestre em Biologia Funcional e Molecular, na área de Fisiologia.
Orientadora: Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio
CAMPINAS 2019
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO LUCAS RODOLFO DE OLIVEIRA ROSA E ORIENTADA PELA PROFA DRA. HELENA CRISTINA DE LIMA BARBOSA SAMPAIO.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Rosa, Lucas Rodolfo de Oliveira, 1994-
R71p RosPapel da focal adhesion kinase (FAK) na ação do tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) sobre o estresse de retículo em células beta pancreáticas INS-1E / Lucas Rodolfo de Oliveira Rosa. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
RosOrientador: Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio.
RosDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto
deBiologia.
Ros1. Estresse do retículo endoplasmático. 2. Ácido tauroursodesoxicólico. 3. Morte celular. 4. Diabetes Mellitus. I. Barbosa-Sampaio, Helena Cristina, 1978-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Role of focal adhesion kinase (FAK) on the action of
tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) on reticulum stress in INS-1E pancreatic beta cells
Palavras-chave em inglês:
Endoplasmic reticulum stress Ácido tauroursodesoxicólico Cell death
Diabetes Mellitus
Área de concentração: Fisiologia
Titulação: Mestre em Biologia Funcional e Molecular Banca examinadora:
Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio [Orientador] Gabriel Forato Anhê
Jane Cristina de Souza
Data de defesa: 09-04-2019
Programa de Pós-Graduação: Biologia Funcional e Molecular
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-8757-6165 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/8092287707261331
Campinas, 9/04/2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa Dra. Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio
Dra. Jane Cristina de Souza
Prof. Dr. Gabriel Forato Anhê
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer ao apoio dos meus pais, familiares e amigos, bem como de minha namorada e parceira Ariel Althero Zambon por todo o apoio e carinho que me ajudaram a me manter de pé durante momentos de desafio. Gostaria de agradecer ainda à minha orientadora, Helena Cristina de Lima Barbosa-Sampaio, pela orientação ímpar sem a qual este trabalho jamais seria possível, bem como aos colegas de laboratório Gabriela Moreira Soares, Emílio Marconato, Karina Rodrigues dos Santos e Lucas Zangerolamo pelo apoio e pela troca de experiências que me possibilitaram desenvolver o atual estudo. Por fim, o presente trabalho foi realizado com apoio do CNPq, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - Brasil" (processo 132344/2017-3).
RESUMO
Muitos fatores contribuem para o estabelecimento e progressão do diabetes mellitus; dentre eles, a perda de função de células beta pancreáticas em função da morte celular é uma das mais importantes. Muitos mecanismos podem levar à morte celular; dentre eles, o estresse de Retículo Endoplasmático (ER) é de grande relevância. Dentre as múltiplas substâncias capazes de combater a morte celular, o TUDCA tem ganhado muita atenção nos últimos anos devido à sua capacidade de combater o estresse de retículo. Porém, os mecanismos de ação do TUDCA ainda são pouco compreendidos; dentro os receptores aos quais o TUDCA se liga, estão o FGR5, S1PR2, Alfa5Beta1 Integrina, entre outros. Muitas moléculas estão envolvidas nos processos de morte e sobrevivência celular; dentre estes, a proteína FAK tem apresentado um importante papel na sobrevivência de células, incluindo células beta pancreáticas, através de sinalização mediada por integrinas. Assim, considerando o importante papel da FAK na sobrevivência celular, em nosso trabalho levantamos a hipótese que a FAK faria parte do mecanismo de ação TUDCA para amenizar o estresse de ER. Para testar esta hipótese, observamos primeiro o efeito de 500 uM de TUDCA sob células beta pancreáticas INS-1E que sofreram indução de estresse de retículo através de tratamento com 12,5 uM de CPA por 12 horas. Com a capacidade do TUDCA em minimizar esse estresse determinada (o que foi observado devido ao aumento de peIF2alfa, CHOP e BIP pelo tratamento com CPA e redução desses valores pelo tratamento com TUDCA), promovemos um knockdown da FAK através do tratamento com siRNA específico para FAK para avaliar se ainda haveria capacidade do TUDCA em minimizar o estresse de retículo. De fato, sob uma condição de knockdown da FAK, o TUDCA perdeu sua capacidade de minimizar as alterações de CHOP e BIP, indicando um possível papel da FAK na ação do TUDCA contra estresse de retículo em células beta pancreáticas, possivelmente devido à sinalização de Integrina Alfa5Beta1-FAK.
ABSTRACT
Many factors contribute for the establishment and progression of diabetes mellitus; among them, the loss of function of pancreatic beta cells due to cellular death is one of the most important. Many mechanisms may lead to cellular death; among them, endoplasmic reticule (ER) stress is of great relevance. Among the multiple substances capable of fighting cell death, TUDCA has gained much attention in the last years due to its capacity to combat reticule stress. However, the mechanisms of TUDCA’s action are still poorly understood; among the receptors that TUDCA binds to, are FGR5, S1PR2, Alfa5Beta1 Integrin, and others. Many molecules are involved in the cellular death and survival processes; among these, FAK presented an important role in cell survival, including pancreatic beta cells, through integrin-mediated signaling. Thus, considering the important role of FAK in cellular survival, we hypothesized that FAK may be part of TUDCA’s mechanism of action to minimize ER stress. To test this hypothesis, we first observed the effect of 500 µM of TUDCA on INS-1E pancreatic beta cells that suffered stress induction through treatment with 12,5 µM of CPA for 12 hours. With TUDCA’s capacity in minimizing stress determined (which was observed due to the increase of peIF2alfa, CHOP and BIP through the treatment of CPA and reduction of these values by the treatment with TUDCA), we promoted a knockdown of FAK through a treatment with specific SiRNA for FAK to evaluate if TUDCA would still be capable of minimizing the reticule stress. In fact, under a condition of FAK knockdown, TUDCA lost its ability to minimize the alterations of CHOP and BIP, indicating a possible role of FAK in TUDCA’s action against reticule stress, possibly due to Alfa5Beta1-FAK integrin signaling.
SUMÁRIO 1 Introdução ... 10 2 Materiais e Métodos ... 15 3 Resultados ... 17 4 Discussão ... 23 5 Conclusão ... 26 6 Referências ... 27 7 Anexos ... 29
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1. Introdução
Descoberta no início dos anos 90, a FAK rapidamente se estabeleceu como um componente chave da sinalização de integrinas (Zhao and Guan, 2011) e, portanto, da adesão celular (Michael et al., 2009). Porém, com o passar dos anos, múltiplos estudos começaram a implicar a FAK como um elemento importante em vários outros processos. A FAK está envolvida na angiogênese durante o desenvolvimento, crescimento, e no câncer (Zhao and Guan, 2011). De fato, a FAK parece ser crítica para o desenvolvimento do câncer – ela é superexpressa e super-ativada em tumores (Yoon et al., 2015), e tem um papel na motilidade, invasão, sobrevivência e na transição epitélio-mesenquimal (EMT) (Sulzmaier et al., 2014). Além disso, a FAK também possui um papel na sobrevivência, motilidade e adesão em células não-cancerígenas (Huang et al.; Sieg et al.; Yoon et al., 2015).
A FAK também parece desempenhar um papel importante na função da célula beta pancreática. A secreção de insulina requer o remodelamento do citoesqueleto de actina, e a FAK está envolvida nas vias de sinalização que acoplam a estimulação de glicose ao remodelamento de actina (Kalwat and Thurmond, 2013). A deleção específica de FAK em camundongos levou a uma redução na proliferação e na sobrevivência de células beta pancreáticas, bem como a uma deficiência na secreção de insulina (Cai et al., 2012). A respeito da sobrevivência, a FAK modula a via da phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt (Daval et al., 2011) e parece também ser importante para a sinalização de extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2) e para a supressão da Caspase 3 (Cai et al., 2012) em células beta pancreáticas. A FAK também possui uma relação importante de regulação com a proteína p53; a FAK é capaz de inibir a atividade da p53, ao passo que a p53 é capaz de inibir a atividade do promotor da FAK (Golubovskaya and Cance, 2011); células beta pancreáticas deficientes em FAK apresentaram um aumento dos níveis de p53 (Cai et al., 2012). Portanto, o equilíbrio entre as duas parece ser um elemento importante da determinação do destino celular.
Uma das características-chave tanto do diabetes tipo 1 quanto do tipo 2 é a perda de viabilidade e função de células beta pancreáticas. Vários mecanismos podem guiar esse processo; dentre eles, um de extrema importância é o estresse de ER (Eizirik et al., 2008). Glicotoxicidade, lipotoxicidade, inflamação, hipóxia, mutações e acúmulo de proteínas mal dobradas no lúmen do ER levam esta organela ao estado de estresse. Isso desencadeia uma resposta adaptativa, chamada Unfolded Protein Response (UPR), que busca restaurar
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a homeostase e prevenir a morte celular, ativando mecanismos que visam restaurar o enovelamento proteico normal e reduzir a carga de trabalho do retículo (Hetz, 2012). Esta resposta é mediada por três vias diferentes: a da IRE-1, da PERK e da ATF6 (Cnop et al., 2010) (Figura 1). Em condições basais, essas proteínas estão associadas à chaperona BIP, que as mantém inativas. Com o acúmulo de proteínas mal-enoveladas, a BIP passa a se ligar preferencialmente a elas, liberando as proteínas das vias da UPR para atuação (Hetz, 2012). Após a dissociação da BIP, a PERK se dimeriza e se autofosforila, tornando-se ativa. Ela então fosforila o initiation factor eukaryotic translation initiator factor 2α (eIF2α), que reduz a síntese proteica de forma geral, buscando diminuir a carga de proteínas direcionada ao retículo (Hetz, 2012; Hotamisligil and Davis, 2016). Porém, a fosforilação de eIF2α favorece a tradução de ATF4 que, uma vez sintetizada, agirá no DNA para promover a transcrição de genes relacionados à UPR, os quais envolvidos com autofagia, apoptose, resposta antioxidante e metabolismo de aminoácidos. ATF4 também induz fator de transcrição pró-apoptótico C/EBP-homologous protein (CHOP), que promove downregulation da proteína Bcl-1 (importante componente anti-apoptótico) e induz a ativação de elementos pró-apoptóticos (Cnop et al., 2010; Hetz, 2012; Hotamisligil and Davis, 2016). Estudos recentes também demonstraram que a indução de ATF4 leva à maior produção de XBP1, potencializando o ramo da IRE-1 descrito abaixo (Tsuru et al., 2016).
A dissociação da BIP com a IRE-1 também causa a dimerização e autofosforilação da mesma; uma vez ativada, a IRE-1 possui uma atividade cinase e endonuclease. Esta última permite a clivagem do RNAm do unspliced X box-binding protein 1 (XBP1u), convertendo-o em sua versão clivada, spliced (XBP1s). A XBP1s, uma vez traduzida e sintetizada, age como fator de transcrição, promovendo o correto enovelamento proteico, degradação proteica associada ao retículo (ERAD), síntese de fosfolipídeos e controle de qualidade proteico (Cnop et al., 2010). IRE-1 também pode recrutar o fator 2 associado ao receptor de TNFα (TRAF2) e ativar a JUN N-terminal kinase (JNK) e as cinases reguladoras do sinal apoptótico. A associação de IRE-1/TRAF2 também pode levar à ativação do nuclear factor-κB (NF-κB) (Hetz, 2012).
Por fim, a ATF6, em situações de estresse de ER, migra para o Golgi, onde é processada, liberando seu fragmento (ATF6f) no citosol. Este fragmento promove a transcrição de genes relacionados à ERAD, e também promove a transcrição de mais XBP1, potencializando a ação do ramo da IRE-1 (Hetz, 2012).
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Em um primeiro momento, portanto, a UPR ocorre no sentido de reverter o estresse de ER; porém, o estresse contínuo e a incapacidade de reverter esse quadro reconfigura a resposta da UPR de anti-apoptótica para pró-apoptótica (Cnop et al., 2010; Hetz, 2012; Hotamisligil and Davis, 2016). Assim, a UPR é uma resposta altamente complexa em condições de estresse de ER, promovendo melhora inicialmente, mas sinalizando a célula rumo a apoptose caso os danos não possam ser revertidos (Hetz, 2012).
Figura 1. Ilustração dos três braços da UPR e suas consequências. A resposta é composta de três
braços: PERK (b), IRE-1 (c) e ATF6 (a).O acúmulo de proteínas mal-enoveladas no lúmen do ER causa a dissociação da BIP com os elementos iniciadores dessas vias, iniciando sua sinalização. A ATF6 será translocada ao Golgi, processada, e seu fragmento irá ao núcleo promover transcrição gênica de componentes da UPR, entre eles XBP1, potencializando as ações do ramo da IRE-1. O segundo braço, da PERK, inicia-se com a dimerização e auto-fosforilação da PERK; esse processo resulta na fosforilação de eIF2alfa; essa fosforilação reduz a expressão proteica de forma geral, mas aumenta a expressão de ATF4. ATF4 irá resultar na produção de mais XBP1, genes de resposta anti-oxidante, e CHOP; a CHOP é pró-apoptótica, e direcionará a célula rumo à morte celular se o estímulo estressor for mantido por muito tempo. Por fim, o ramo da IRE-1 começa com a dimerização e auto-fosforilação da IRE-1, esse dímero passa a clivar o RNAm da XBP1, resultando em XBP1s; essa XBP1s irá ser encaminhada ao núcleo e promover transcrição
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de chaperonas e genes relacionados à degradação e qualidade proteica; a ativação da IRE-1 irá ativar sinais pró-apoptóticos caso sustentada a longo-prazo. Créditos da figura: (Walter and Ron, 2011).
Devido à importância da disfunção e morte de células beta na progressão do diabetes, é interessante buscar tratamentos que possam impedir ou atrasar a morte de células beta pancreáticas e combater o estresse de retículo. Atualmente, uma droga tem se destacado: o Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA). Utilizado na medicina chinesa por milênios, o TUDCA é um ácido biliar secundário, sendo a versão conjugada com Taurina do
Ursodeoxycholic acid (UDCA) (Vang et al., 2014). A bile de seres humanos contém
pouca quantidade de TUDCA em sua composição; ursos (Ursus thibetanus, entre outros), porém, possuem uma bile rica nesta substância (Boatright et al., 2009).
O TUDCA é capaz de reduzir a hiperglicemia diabética em vários modelos reportados, melhorarando a sobrevivência, secreção de insulina e morfologia celular (Vang et al., 2014). O TUDCA também foi capaz de reduzir apoptose em células beta pancreáticas em um modelo de camundongos pré-diabéticos (Engin et al., 2013), e prevenir a apoptose induzida por palmitato em células beta INS-1 através de sua capacidade de atenuar o estresse de ER (Zhu et al., 2013). Há um aumento das concentrações de ácidos biliares, especialmente dos conjugados à taurina (como o TUCA), em ratos que sofreram cirurgia bariátrica, indicando que esse pode ser um dos mecanismos dos efeitos positivos dessa cirurgia sobre o metabolismo glicêmico (Wu et al., 2016). Portanto, o TUDCA é um composto extremamente eficaz em promover a sobrevivência e função da célula beta, capaz de reverter alterações nesses parâmetros frente a diversos desafios; particularmente relevante para nosso trabalho é sua habilidade de reverter o estresse de ER (Vang et al., 2014).
O TUDCA, assim como outros ácidos biliares, induz sinalização celular através de receptores ligados à membrana ou receptores nucleares. Certos ácidos biliares podem se ligar aos receptores de membrana TGR5, S1PR2 e Alfa5Beta1 Integrina (McMillin and DeMorrow, 2016). Alternativamente, os ácidos biliares podem exercer seus efeitos através de receptores nucleares. Para a ligação a receptores nucleares, os ácidos biliares se difundem passivamente através da membrana celular ou são ativamente transportados por ASBT, NTCP ou OATP. Uma vez dentro da célula, os ácidos biliares podem se ligar
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aos receptores FXR, VDR, PXR, GR ou CAR (McMillin and DeMorrow, 2016), o que facilita a sua ligação ao DNA e regulação subsequente da transcrição gênica. Semelhante aos receptores de ácidos biliares da membrana, estes receptores nucleares têm afinidade por ácidos biliares específicos, conforme indicados na Figura 2.
Figura 2. Ilustração dos receptores com os quais ácidos biliares podem interagir, incluindo
receptores de membrana (TGR5, S1PR2, Alfa5Beta1 Integrinas) e nucleares (FXR, VDR, PXR, GR, CAR). Sinalização através de TGR5, S1PR2 e FXR já tiveram sua importância para a melhora de função e/ou sobrevivência de células beta pancreáticas muito bem descrita. TGR5:
G-protein coupled bile acid receptor 1 (também conhecido como GPBAR1); S1PR2: Sphingosine 1-phosphate receptor 2; ASBT: Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter; NTCP: Na+-taurocholate Cotransporting Polypeptide; OATP: Organic Anion-Transporting Polypeptide;
FXR: Farnesoid X receptor; VDR: Vitamin D Receptor; PXR: Pregnane X receptor; GR:
Glucocorticoid Receptor; CAR: constitutive androstane receptor. Créditos da Imagem:
Modificado de (McMillin and DeMorrow, 2016).
Os mecanismos de ação do TUDCA, porém, ainda não são completamente compreendidos. Sabe-se que sua interação com o receptor S1PR2 resulta na ativação da via PI3k/Akt no fígado de camundongos (Studer et al., 2012; Vettorazzi et al., 2017). O TUDCA também interage com os receptores FXR-α, PXR e o Receptor de Vitamina D
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em ilhotas pancreáticas porcinas (Lee et al., 2010); de fato, os mecanismos através de FXR parecem ser particularmente importantes para a secreção de insulina (Düfer et al., 2012). Outra interação relevante é a do TUDCA com o receptor FGR5; a ativação desse receptor estimula a secreção de insulina em células beta pancreáticas, sendo um mecanismo relevante da melhora da função de células beta induzida pelo TUDCA (Maczewsky et al., 2019). O TUDCA também parece ser capaz de inibir uma liberação anormal de cálcio intracelular em condições de estresse de retículo. Esse excesso de cálcio promove a ativação de diversas caspases, especialmente a caspase-12, levando a morte celular; o TUDCA é capaz de inibir esse processo em células hepáticas (Xie et al., 2002). No estudo mencionado, foi utilizada uma indução de estresse de retículo através de
thapsigardin, um composto que compromete irreversivelmente a homeostase de cálcio na
célula, e o estudo demonstrou a importância de vias não-mitocondriais para a morte celular (Xie et al., 2002).
Vale ressaltar que a relação do TUDCA com o receptor S1PR2 e consequente ativação de PI3K/Akt já fornece indícios de um possível envolvimento entre o TUDCA e a FAK, uma vez que a FAK tem uma importante associação com a via PI3K/Akt (Daval et al., 2011).
Considerando a importância da FAK para a sobrevivência de células beta pancreáticas bem como a capacidade do TUDCA em promover sobrevivência, nós levantamos a hipótese que a FAK possa ser um elemento necessário para a ação do TUDCA contra o estresse de ER e de seu mecanismo de ação. Para testar esta hipótese, utilizamos um inibidor seletivo da FAK (siRNA) em um modelo de linhagem de célula beta pancreática INS-1E.
2.
Materiais e Métodos
Cultura de células INS-1ELinhagens de células beta de rato, INS-1E, gentilmente cedidos pelo Prof Dr Wolheim (Center Medical Universitaire, Geneva, Switzerland), foram mantidas em cultura (37ºC, 5% CO2), em meio RPMI-1640 (Corning) contendo 11 mM de glicose e suplementado com 5% de soro fetal bovino, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 100 µg/ml de piruvato de sódio e 50 µmol/ml de mercaptoetanol. As células foram separadas em três grupos, tratadas com Dimetilsulfóxido (DMSO) (12,5 µM); Ácido Ciclopiazônico (CPA) (12,5 µM) ou CPA + TUDCA (12,5 µM e 500 µM,
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respectivamente) por 12 horas (tempo e dose de tratamento foi escolido baseado nos resultados de estudos preliminares de uma colaboradora, dados não publicados). O DMSO foi avaliado como grupo controle, uma vez que o DMSO é o veículo do CPA. Células foram coletadas em Laemli ou TryZol (Ambion) e o extrato foi utilizado para realização dos experimentos.
Inibição da atividade da FAK por siRNA ou inibidor farmacológico
Células INS-1E foram semeadas em placas com 96 ou 24 poços, dependendo do experimento. Quando a confluência adequada foi atingida, seguiu-se a transfecção utilizando a Lipofectamina RNAiMax (Invitrogen) seguindo as especificações do fabricante. Foram utilizados 100 nM de siRNA (Dharmacon) por poço, contendo 4 sequências contra a FAK. O volume final de transfecção por poço foi de 100 ou 250 µl de meio de cultivo, dependendo da placa (Optmem + RPMI 1640 com 10% FBS). No dia seguinte, o meio foi retirado e substituído por volume habitual de meio RPMI 1640; células descansaram por 24h, então foram coletadas (dependendo do experimento) ou tratadas com DMSO, CPA e CPA+TUDCA conforme descrito acima. As células foram avaliadas quanto à eficiência da inibição da FAK bem como da modulação das proteínas da UPR após 36 h da transfecção através de Western Blotting ou qPCR.
Western Blotting
Extratos proteicos de células INS-1E tratadas com os tratamentos delineados acima foram coletadas em Tampão de Laemmli contendo DTT e incubadas a 100°C por 5 min e aplicadas em gel para eletroforese. Após a corrida as amostras foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (BioRad) com tampão de transferência. Após bloqueio (5% de albumina bovina) as proteínas de interesse foram detectadas com anticorpo específico, seguida de incubação com anticorpo secundário contendo peroxidase (HRP) e, finalmente, com reagentes de quimioluminescência. As imagens foram capturadas em fotodocumentador (Amersham™ Imager 600, Life Sciences) e a intensidade e quantificação das bandas foram medidas por densitometria (ImageJ, Bethesda, USA), sendo os valores das bandas normalizados pelos valores de densitometria do controle interno GAPDH.
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PCR Quantitativo Relativo
Foi feita extração de RNA das células INS-1E tratadas com DMSO, CPA ou CPA + TUDCA, bem como das células transfectadas. As amostras de RNA das células foram obtidas através do uso do kit RNeasy (Qiagen), de acordo com instruções do fabricante. O RNA obtido foi convertido em cDNA utilizando-se kit High Capacity (Applied Biosystems), de acordo com manual do fabricante. Em seguida, o cDNA foi quantificado e foi aplicado em torno de 600 ng de amostra por poço em placa de 96 poços, bem como SYBR green mix (Applied Biosystems), de modo a obter a quantificação relativa de cDNA ao final do PCR quantitativo. A amplificação foi ainda normalizada pelo controle interno HPRT, e a expressão gênica relativa foi determinada utilizando o método de 2
-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001). As reações foram realizadas de acordo com o manual
do fabricante (Fast 7500, Applied Biosystems). Análise Estatística
Foram utilizados o teste ANOVA para avaliação da diferença de expressão proteica e gênica dos marcadores de estresse de retículo e Bcl-2. Foram considerados significativos resultados com p<0,05; e Teste T para a análise da redução de FAK pelo tratamento com SiRNA e para a comparação dos conteúdos gênicos de Bcl-2 entre os grupos SiC e SiFAK. Foram considerados significativos resultados com p<0,05.
3.
Resultados
TUDCA É Eficaz em Minimizar o Estresse de ER em Células Beta
No processo de validação do nosso modelo, observamos que o tratamento com CPA aumentou os níveis de peIF2alfa, conforme esperado (1,66 ± 0,25) (Figura 3A); além disso, esse aumento foi minimizado pelo tratamento com TUDCA no grupo CPA+TUDCA (1,15 ± 0,30). Os conteúdos de Bcl-2, importante proteína de sobrevivência celular, não apresentaram diferença estatística (CPA: 1,17 ± 0,20; CPA + TUDCA 1,27 ± 0,33) (Figura 3B). Quanto a expressão gênica da CHOP e da BIP (Figura 3D e 3E), observamos um aumento significativo também no grupo CPA (CHOP: 10,34 ± 1,79; BIP: 4,27 ± 0,23), mas minimizado significativamente pelo tratamento com TUDCA (CHOP: 6,97 ± 0,42; BIP: 2,31 ± 0,75). Apenas a expressão de ATF4 não foi reduzida significativamente pelo tratamento com TUDCA após o aumento induzido pelo CPA (CPA: 4,58 ± 0,80; CPA + TUDCA: 3,04 ± 1,05) (Figura 3C). Esses resultados
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indicam o estabelecimento da condição do estresse de retículo pelo tratamento com CPA com 12,5 µM por 12 horas, bem como uma capacidade do TUDCA em reverter parte destas alterações frente a este estresse.
Figura 3. Conteúdo proteico de peIF2alfa (A) e Bcl-2 (B); conteúdo gênico de ATF4 (C), CHOP
(D) e BiP (E) em resposta a tratamento por 12 horas com DMSO, CPA (12,5 µM), TUDCA ou CPA + TUDCA (12,5 µM e 500 µM, respectivamente; grupo TUDCA excluído da análise estatística). Todos os valores foram normalizados por expressão de GAPDH (peIF2alfa e Bcl-2) ou HPRT (ATF4, CHOP e BiP). Valores apresentados como fold change em relação aos valores do grupo controle (DMSO). Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05).
O Tratamento Com siRNA Foi Eficaz em Promover o Knockdown da FAK
O próximo passo foi a validação do tratamento com siRNA visando o silenciamento da FAK. Observamos uma redução de 62,8%, estatisticamente significativa (p<0,05) nos níveis de expressão proteica de FAK no grupo tratado com o siRNA, indicando o sucesso do procedimento de knockdown da FAK (Figura 4).
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Figura 4. Expressão proteica de FAK em resposta a tratamento com siRNA controle (scramble)
ou específico para a FAK. Todos os valores foram normalizados por expressão de GAPDH. Valores apresentados como média de valores brutos. Asterisco indica diferença estatisticamente significativa (p<0,05).
Knockdown da FAK Aboliu a Capacidade do TUDCA em Minimizar as Alterações
de CHOP e BIP em Células Beta Pancreáticas
Avaliando novamente os marcadores de Estresse de Retículo, dessa vez na presença dos tratamentos com SiRNA, observamos que, na peIF2alfa tratado com SiC (Figura 5 A1), foi observado um aumento da fosforilação no grupo CPA (1,50 ± 0,22) e uma redução (não significativa) pelo tratamento com TUDCA (094 ± 0,36), ao contrário do que havia sido observado nos grupos sem SiRNA, onde a diferença havia sido significativa (Figura 3A). O tratamento com SiFAK fez com que essa redução causada pelo TUDCA se tornasse ainda mais pronunciada (CPA SiFAK: 1,58 ± 0,11; CPA + TUDCA SiFAK: 0,67 ± 0,20) (Figura 5A2).
Para a análise gênica dos outros marcadores, os grupos que foram tratados com o SiControle (SiC) apresentaram, para a ATF4 e CHOP (Figuras 5B1 e 5C1), um padrão semelhante ao observado nos grupos onde não foi realizado tratamento com siRNA (Figuras 3C e 3D). A expressão gênica de ATF4 aumentou no grupo CPA (5,41 ± 0,73) e CPA+TUDCA (4,85 ± 0,79) em relação ao controle, e a de CHOP aumentou no grupo CPA (11,70 ± 2,04) com redução parcial pelo tratamento com TUDCA (8,23 ± 1,25) (Figura 5B1 e 5C1). A BiP (Figura 5D1) também apresentou um padrão bastante similar ao anterior (Figura 3E), com o TUDCA (3,49 ± 0,31) atenuando os aumentos induzidos pelo CPA (5,25 ± 0,86) (Figura 5D1). Os padrões tanto da CHOP quanto da BIP foram alterados pelo tratamento com SiFAK (Figuras 5C2 e 5D2), indicando que o tratamento com TUDCA (CHOP SiFAK: 10,38 ± 1,13; BIP SiFAK: 3,80 ± 0,79) perdeu pelo menos
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parcialmente sua capacidade em amenizar os efeitos do CPA (CHOP SiFAK: 8,45 ± 1,22; BIP SiFAK: 3,44 ± 0,58) sobre a expressão desses genes.
Figura 5. Conteúdo proteico de pEIF2alfa (A); Conteúdo Gênico de ATF4 (B), CHOP (C) e
BiP (D) em resposta a tratamento por 12 horas com DMSO, CPA (12,5 µM) ou CPA + TUDCA (12,5 µM e 500 µM, respectivamente), após tratamento com SiC (controle scramble) ou SiFAK. Todos os valores foram normalizados por expressão de GAPDH (A) ou HPRT (B, C, D). Valores apresentados como expressão relativa (fold change) em relação aos valores do grupo controle (DMSO) de cada tratamento. Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05).
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Expressão Proteica de Bcl-2 Foi Reduzida Pelo knockdown da FAK em Condição de Co-tratamento de CPA e TUDCA
Avaliando a proteína de sobrevivência celular Bcl-2, nos grupos tratados com SiC, observamos também um padrão semelhante ao observado nos grupos sem tratamento com SiRNA (Figura 3B) – ou seja, não observamos diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (CPA: 1,13 ± 0,14; CPA + TUDCA: 1,21 ± 0,26) (Figura 6A). Já nos grupos com knockdown da FAK, foi observado uma redução não-significativa nos conteúdos de Bcl-2 no grupo CPA (0,89 ± 0,13), e uma redução efetiva, estatisticamente significativa, no grupo tratado com TUDCA (0,68 ± 0,13) (Figura 6B). Também observamos que, comparando os valores brutos de Bcl-2 entre os tratamentos SiC (0,96 ± 0,19) e SiFAK (0,66 ± 0,08), houve uma redução desta proteína nas células com
knockdown de FAK (Figura 6C), indicando que a FAK possa ser importante na ação do
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CPA.
Figura 6. Conteúdo proteico de Bcl-2 em resposta a tratamento por 12 horas com DMSO, CPA
(12,5 µM) ou CPA + TUDCA (12,5 µM e 500 µM, respectivamente, após tratamento com SiC (scramble) ou SiFAK. Todos os valores foram normalizados por expressão de GAPDH. Valores apresentados como expressão relativa (fold change) em relação aos valores do grupo controle (DMSO) de cada tratamento (A) ou como valores brutos de Bcl-2/GAPDH (B). Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05).
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4. Discussão
Já é bem estabelecido na literatura o efeito do CPA em induzir o estresse de retículo nos mais diversos modelos, inclusive em células beta pancreáticas (Miani et al., 2013; Pirot et al., 2007), bem como a capacidade do TUDCA em amenizar este estresse (Vang et al., 2014; Zhu et al., 2013). Em nossos experimentos iniciais, sem o tratamento com SiRNA, observamos essa mesma capacidade do TUDCA em minimizar as alterações induzidas pelo CPA em diversas proteínas de estresse de retículo. Além disso, observamos que nosso protocolo de knockdown da FAK por siRNA foi eficaz em reduzir os conteúdos de FAK em 62,8% comparado ao SiC.
De forma geral, nosso estudo demonstrou boa reprodutibilidade, com os grupos tratados com SiC apresentando um padrão similar aos grupos que não foram tratados com SiRNA. Isso nos fornece a confiança necessária para afirmar que quaisquer alterações observadas no grupo SiFAK se deveram, de fato, ao knockdown da FAK, e não ao processo de transfecção. Houve duas exceções: o TUDCA havia inicialmente apresentado uma capacidade em reverter completamente o aumento da BiP induzido por CPA, ao passo que o TUDCA do grupo SiC conseguiu apenas uma atenuação. Já para a peIF2alfa, não conseguimos reproduzir o mesmo padrão de expressão observado no grupo sem SiRNA, apesar de termos observados uma redução considerável, com um valor de p próximo ao significativo. É possível que ambas as alterações tenham ocorrido devido a um possível estresse induzido pela transfecção do SiRNA, especificamente pelo uso da lipofectamina; esse procedimento é notoriamente estressante para a célula (Fiszer-Kierzkowska et al., 2011), e isso pode ter causado essa leve perturbação nos resultados de peIF2alfa e BIP, agravando levemente o estresse nessas células e dificultando um pouco a ação do TUDCA. Apesar disso, o TUDCA apresentou eficácia em amenizar a expressão gênica da BIP em SiC. Assim, considerando a reprodutibilidade dos outros resultados entre os grupos sem SiRNA vs SiC (CHOP, ATF e Bcl-2), concluímos que há evidências de que houve o estabelecimento do estresse do retículo pelo CPA e a sua atenuação pelo TUDCA; portanto, quaisquer alterações observadas no grupo SiFAK seriam de fato consequência do knockdown da FAK, e não um problema do tratamento com SiRNA.
E, de fato, observamos alterações nestes grupos. No que diz respeito ao estresse de retículo, observamos a perda da capacidade do TUDCA em minimizar as alterações da expressão de CHOP e BIP induzidas pelo CPA. Esses resultados indicam que de fato a
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FAK parece ter um papel importante na ação benéfica do TUDCA. Essa importância da FAK nos dá indícios de que receptores Alfa5Beta1 Integrinas sejam um mecanismo relevante pelo qual o TUDCA promove essa melhora do estresse de retículo em células beta. As integrinas Alfa5Beta1 podem atuar como receptores de membrana para ácidos biliares, em especial o TUDCA (McMillin and DeMorrow, 2016). Esses receptores já foram descritos em células beta (Krishnamurthy et al., 2008), e a FAK é a efetora da sinalização através desses receptores (Santos et al., 2012). Assim, o knockdown da FAK, possivelmente, prejudicaria a sinalização do TUDCA através de Alfa5Beta1 Integrina, como a ação do TUDCA foi abolida nos grupos com SiFAK, seria possível inferir que essa sinalização via Alfa5Beta1 Integrina seria um mecanismo importante da ação do TUDCA contra o estresse de retículo em células beta. Outra possibilidade, não explorada nesse estudo, seria uma possível modulação dos outros receptores do TUDCA – como FXR, TGR5, VDR, etc – pela sinalização mediada pela FAK, através de um cross-talk entre a ativação de Alfa5Beta1 Integrinas e a expressão desses outros receptores. Um estudo futuro, dedicado a testar essa hipótese, poderia ser de grande interesse.
Existem outras vias possíveis pelas quais a redução da FAK poderia estar interferindo na ação do TUDCA. Em outros tipos celulares, foi demonstrado que S1PR2 é um receptor para TUDCA (McMillin and DeMorrow, 2016), e promove ativação das vias ERK1/2 e Akt. Ambas essas vias também são moduladas pela FAK, pois a ativação de FAK leva à maior atividade dessas duas proteínas, promovendo sobrevivência celular (Lu and Rounds, 2012). Essa ativação de ERK e Akt por sinalização de integrinas via FAK também é bem conhecida em células beta (Lin and Sun, 2015; Riopel et al., 2011). Assim, é possível que o efeito do TUDCA se dê através do cross-talk de sinalização de Integrina e S1PR2, convergindo para as vias da Akt ou ERK1/2 (ou ambas); porém, não encontramos estudos sobre a existência ou função de S1PR2 em células beta, indicando que o papel desse receptor ainda é pouco estudado, e poderia ser um alvo interessante para estudos futuros.
Também é importante ressaltar que o mecanismo de ação do CPA se dá através da inibição da SERCA2 do retículo endoplasmático da célula, levando a um aumento do efluxo de cálcio para o citosol. (Xie et al., 2002). Portanto, é possível que o efeito do TUDCA em melhorar o estresse de ER se deva a essa capacidade de melhora da homeostase de cálcio, e não a uma ação diretamente sobre a expressão dos marcadores de estresse de ER. E, similarmente, também é possível que a FAK via sinalização de
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Alfa5Beta1 Integrinas interfira sobre este processo (a homeostase de cálcio) e não sobre o estresse de retículo em si.
Por fim, observamos uma redução de Bcl-2 no grupo tratado com CPA+TUDCA no contexto de knockdown da FAK, um padrão não observado nos dois grupos anteriores (SiC e sem SiRNA). Também observamos uma redução da expressão proteica de Bcl-2 no grupo SiFAK CPA+TUDCA quando comparado ao grupo SiC CPA+TUDCA. Isso indica que, em uma situação de estresse e de reversão parcial deste desse estresse com o TUDCA, o knockdown da FAK parece impedir que o TUDCA mantenha o conteúdo esperado de Bcl-2. Uma possível explicação para esse fenômeno reside na CHOP. É conhecido na literatura que a expressão exacerbada de CHOP leva a uma redução dos conteúdos de Bcl-2 (Li et al., 2014). No entanto, em nossos tratamentos com CPA, não encontramos redução do conteúdo proteico de Bcl-2. Apenas no grupo com knockdown da FAK foi observada redução significativa comparada aos grupos DMSO e CPA. Dessa forma, acreditamos que o knockdown da FAK pode ter resultado em um aumento da expressão gênica de CHOP no grupo SiFAK CPA+TUDCA comparada às outras condições, resultando nessa redução de Bcl-2.
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5. Conclusão
Em vista dos dados expostos, a FAK parece ter um papel nos mecanismos de ação do TUDCA contra estresse de retículo em células beta pancreáticas, visto que a melhora induzida pelo TUDCA é abolida em uma condição de knockdown da FAK. Isso provavelmente se deve a uma sinalização do TUDCA mediada por receptor de Alfa5Beta1 integrina e subsequente sinalização downstream da FAK.
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7. Anexos
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