UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
ANDRÉ DE CARVALHO JORGE
ESTUDO DA REATIVIDADE DE PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS FRENTE A AGENTES DE LIGAÇÃO CRUZADA FOTOATIVÁVEIS BASEADOS EM DIAZIRINAS UTILIZANDO TÉCNICAS DE ESPECTROMETRIA DE MASSA
CAMPINAS 2020
ANDRÉ DE CARVALHO JORGE
ESTUDO DA REATIVIDADE DE PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS FRENTE A AGENTES DE LIGAÇÃO CRUZADA FOTOATIVÁVEIS BASEADOS EM DIAZIRINAS UTILIZANDO TÉCNICAS DE ESPECTROMETRIA DE MASSA
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências
Orientador: Prof. Dr. Fabio Cesar Gozzo
O Arquivo digital correspondente à versão final da Tese defendida pelo aluno André de Carvalho Jorge e orientada pelo Prof. Dr. Fabio Cesar Gozzo.
CAMPINAS 2020
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química
Simone Luiz Alves - CRB 8/9094
Jorge, Andre de Carvalho, 1979-
J768e JorEstudo da reatividade de peptídeos e proteínas frente a agentes de ligação cruzada fotoativáveis baseados em diazirinas utilizando técnicas de
espectrometria de massa / Andre de Carvalho Jorge. – Campinas, SP : [s.n.], 2020.
Jo Orientador: Fabio Cesar Gozzo.
Jor Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Jor 1. Espectrometria de massa. 2. Ligação cruzada. 3. Diazirinas. I. Gozzo, Fabio Cesar, 1972-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Study of peptide and protein reactivity using photoactivatable crosslinking
compounds based on mass spectrometry techniques Palavras-chave em inglês:
Mass spectrometry Cross-linking Diazirines
Área de concentração: Química Orgânica Titulação: Doutor em Ciências
Banca examinadora:
Fabio Cesar Gozzo [Orientador] Denize Cristina Favaro
Paulo Cesar Muniz de Lacerda Miranda Luiz Alberto Beraldo de Moraes
Eduardo Jorge Pilau
Data de defesa: 19-02-2020
Programa de Pós-Graduação: Química Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-5752-2561
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Fabio Cesar Gozzo (Orientador)
Prof. Dr. Luiz Alberto Beraldo de Moraes (Universidade de São Paulo) Prof. Dr. Eduardo Jorge Pilau (Universidade Estadual de Maringá) Prof. Dra. Denize Cristina Favaro (UNICAMP)
Prof. Dr. Paulo Cesar Muniz de Lacerda Miranda (UNICAMP)
A Ata da defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na secretaria do programa da Unidade.
Este exemplar corresponde à redação final da tese de Doutorado defendida pelo aluno ANDRÉ DE CARVALHO
JORGE, aprovada pela Comissão
Agradecimentos
Ao meu, antes de tudo amigo e orientador Prof. Dr. Fabio Gozzo pela amizade e carinho durante todos esses anos de convivência, por confiar a mim este trabalho e acompanha-lo sempre tão de perto.
À Universidade Estadual de Campinas e ao Instituto de Química pela oportunidade de realizar este trabalho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) por todo o suporte financeiro ao nosso grupo de pesquisa.
Ao Prof. Dr. Francisco Benedito Teixeira Pessine pelo empréstimo dos filtros de luz e pelas valiosas discussões sobre espectroscopia.
À professora Dra Lucia Helena Brito Baptistella por ter me iniciado no mundo da ciência.
Aos Prof. Dr. Carlos Roque Duarte Correia e Prof. Dra. Denize Favaro, pelas valiosas sugestões feitas durante o exame de qualificação.
À 3M do Brasil, pelo apoio e incentivo na execução desse trabalho e em especial à Camila Cruz Durlacher que me instigou desde o início a iniciar essa longa jornada. Aos amigos e colegas do laboratório Dalton: Hector, Alex, Hugo, Gisel, Renata, Mari, Allan, Tati, Luana, Renan, Bruno e Eduardo. Vocês foram fundamentais e me
ajudaram mais do que possam imaginar.
Aos meus pais Daniel e Bernadete e minhas irmãs Lia e Isabel, pela ajuda e apoio incondicional mesmo estando distantes (João, Mateus, Lucas e Marcos também!). À Renatinha, meu amor, que esteve ao meu lado nesses últimos dois anos e por me fazer acreditar que era possível trabalhar, pedalar, nadar, correr, fazer doutorado, casar e ter filhos, tudo ao mesmo tempo.
Finalmente ao meu filho, Bruno, que acabou de chegar. Que você possa se inspirar em seu pai e nunca desistir dos seus sonhos.
O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001
Resumo
A aplicação da espectrometria de massas (MS) em análises proteômica tem evoluído extensivamente, a ponto de se tornar rotineira no sequenciamento e identificação de proteínas e determinação de modificações pós-traducionais. Entretanto, o uso de MS na análise de estruturas tridimensionais de proteínas é ainda restrito, apesar das inúmeras vantagens potenciais que poderia apresentar nessa área. Nesse âmbito, a metodologia de ligação cruzada acoplada a MS visa obter informações estruturais de proteínas e complexos proteicos pela determinação de restrições espaciais de distância entre resíduos de aminoácidos, mediante reação com compostos homo ou bifuncionais, proteólise enzimática e análise dos peptídeos resultantes por MS. A primeira parte deste trabalho estuda a aplicação de um novo agente de ligação cruzada (ALC) heterobifuncional e foto ativável, do tipo NHS-diazirina, para formar ligações cruzadas inespecíficas em peptídeos e proteínas. O emprego desse ALC permitiu obter ligações cruzadas únicas nos alvos estudados, e os peptídeos modificados formados foram caracterizados por MS possibilitando a formação de isóbaros e demonstrando o potencial desse ALC para o uso em sistemas reais como proteínas e complexos proteicos. A segunda parte do trabalho envolveu a aplicação da técnica desenvolvida nos peptídeos sintéticos em proteínas padrão para validar a viabilidade da metodologia em sistemas reais quando comparados com ALC mais tradicionais como os homobifuncionais do tipo NHS-NHS. A capacidade desses ALCs foto ativáveis de formar mais espécies de ligação cruzada devido à sua inespecificidade, demonstrou o grande potencial da ferramenta para a entrega de um pacote mais robusto de dados para análises de modelagem computacional.
Abstract
The application of mass spectrometry (MS) in proteomics has evolved extensively, becoming routine in protein sequencing, identification and determination of post-translational modifications. However, the use of MS in the three-dimensional analysis of protein structures is still restricted, despite the numerous advantages that this technique could represent for the area. In this sense, chemical cross-linking coupled to MS aims to obtain structural information on proteins and protein complexes by determining spatial distance constraints between amino acid residues by reaction with homo or bifunctional compounds, enzymatic proteolysis and analysis of the resulting peptides by MS. The first part of this work shows the application of a novel heterobifunctional, photoactivatable NHS-diazirine-type cross-linking agent to form nonspecific cross-linking in peptides and proteins. The use of this type of compound allowed to obtain unique cross-linking on the targets under study, and the modified peptides were analyzed by MS allowing the formation of an isomeric mixture and demonstrating the potential of this reagent for the application in real systems as proteins and protein complexes. The second part of this work involved the application of the technique developed on synthetic peptides to standard proteins to validate the feasibility of the methodology in real systems when compared to more traditional cross-linking reagents such as NHS-NHS homobifunctional ones. The ability of these photoactivatable compounds to form more cross-linked species due to their non-specificity has demonstrated a great potential of this tool delivering a more robust data package for computational and modeling analysis.
Lista de Figuras
Figura 1. Arranjos estruturais de proteínas. Os diferentes níveis são exemplificados
para a estrutura da proteína hemoglobina (Entrada no PDB 1C7D). Estruturas primárias se referem à sequência de aminoácidos da cadeia. Estruturas secundárias inclui segmentos de alfa-hélices e folhas-beta. Estruturas terciárias se referem ao arranjo tridimensional compacto resultante das diversas forças físicas atuantes no enovelamento proteico. Por fim, a estrutura quaternária refere-se ao arranjo entre proteínas que resultam em uma unidade supramolecular biologicamente ativa.
Figura 2. Representação esquemática de um experimento de ligação cruzada
acoplado a espectrometria de massas. (1) Reação da proteína com o ALC; (2) Digestão enzimática dando origem às diversas espécies de peptídeos, convencionais e modificados; (3) Análise da mistura por LC-MS/MS; (4) Agrupamento das restrições de distância obtidas experimentalmente em um mapa de restrições de distância; (5) Utilização do conjunto de restrições para predição de estruturas ou seleção de modelos compatíveis.
Figura 3. Sequência utilizada na determinação de estruturas quaternárias, onde
poucas restrições de distância são necessárias para determinação da região de interação proteína-proteína
Figura 4. Sistemas de complexos proteicos resolvidos pela análise de ligação cruzada
seguida por espectrometria de massas. Sistemas Tom70-Hps90, FAK-aBcristalina, e FAK-Miosina, respectivamente.
Figura 5. Erros quadráticos médios (RMS) e desvios padrões para comparações
entre estruturas de XRD ou NMR previamente disponíveis e conjuntos de estruturas-modelo com 10, 30, 50, 70 e 90% de restrições de distância em relação ao número de resíduos, para os domínios A) Subunidade f da RNA polimerase (1GO3); B) Proteína ribosomal 50s 17/112 (1DD3); C) Neurotoxina b (1NXB); D) Di-hidrofolato redutase (1VIE); E) 1,4-alfa- maltotetrahidrolase (1JDC); F) Proteína g (1IGD); G) Proteína ribosomal 130 (1BXY); H) Proteína de divisão celular ftsa (1E4F); I) Proteína
anticoagulante (1D0D). Os códigos entre parênteses se referem às estruturas do PDB com as quais foram feitas as comparações.
Figura 6. À esquerda: abundância natural de aminoácidos de acordo com o banco
de dados trEMBL. À direita: Esquema de ligações cruzadas baseadas em ésteres de NHS que visam principalmente os resíduos de lisina e eventualmente serina (flechas em azul), que representam um pouco mais de 11%, da abundância natural de aminoácidos em proteínas. O método multiplex é capaz de gerar restrições de distância entre as cadeias laterais ácidas (flechas em vermelho) por meio de um reagente diamina e permite ainda a formação de uma espécie de comprimento zero, quando lisinas ou serinas se ligam a resíduos ácido. Os resíduos potencialmente reticuláveis, nessa abordagem, constituem cerca de 24% da abundância natural de aminoácidos em proteínas (barras vermelhas).
Figura 7. Três tipos de reagentes fotoativáveis: (1) benzofenonas, (2) azidas, (3)
diazirinas
Figura 8. Síntese de uma diaziridina a partir de uma cetona
Figura 9. Preparação de uma diazirina a partir de uma diaziridina via oxidação de
Jones
Figura 10. Produzidos a partir de diazirinas ou compostos diazo, carbenos são
gerados pela perda de N2 através de decomposição térmica ou fotolítica com a quebra
da ligação C-N e a formação de dois compostos neutros. Nesse exemplo, a eliminação de nitrogênio molecular de diazirinas formando carbenos diretamente ou mediante rearranjo para espécie diazo.
Figura 11. Esquema representando os produtos observados para reação de um ALC
do tipo heterobifuncional contendo um grupo éster de NHS e um grupo diazirina fotoativável. A molécula do ALC é inicialmente ligada pelo grupo éster de NHS, nesse exemplo a um resíduo de lisina (K), e a seguir pelo carbeno gerado mediante eliminação de N2 da diazirina, em etapas separadas, sendo a Etapa 3 totalmente
Figura 12. Carbenos e suas estruturas eletrônicas com duas multiplicidades de spin:
singleto e tripleto
Figura 13. Substituintes doadores de elétrons que estabilizam estado singlete de
carbenos X= F, Cl, OR, NR2
Figura 14. Reatividade típica dos carbenos migração-1,2, dimerização, adição a
ligações múltiplas e reações de inserção C-H, N-H, O-H ou S-H
Figura 15. Mapeamento de interações proteína-proteína em meio intracelular.
Esquerda: aminoácidos modificados com grupos diazirina empregados nos estudos, photo-Leu, photo-Ile e photo-Met. Direita: fotografia de análises por Western Blotting, demonstrando a ocorrência de ligações cruzadas entre proteínas constituintes do complexo proteico estudado após incidência de radiação UV, quando as mesmas foram biossintetizadas incorporando os aminoácidos modificados do meio intracelular.
Figura 16. A) Incorporação de diazirina à base púrica citosina (através da desproteção
do DNA substituído por O4-triazolil-dUs) ou pirimídica guanina (através da desproteção do DNA substituído com 2-F-dI) utilizando as correspondentes diazirinas-aminas. B) O DNA modificado com diazirina pode ser fotoativado para gerar um intermediário de carbeno para reticulação com as proteínas de ligação ao DNA. (DBU = 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno.)
Figura 17 - Esquema simplificado para a detecção da foto incorporação de azilálcool
em proteínas. A proteína foto marcada pode ser analisada por MALDI-TOF ou ESI para identificar a foto incorporação e estequiometria. Os locais de foto incorporação são detectados através da aquisição de dados de espectros de MS/MS após a digestão enzimática e separação por cromatografia líquida da amostra.
Figura 18. a) Estruturas de MTS-diazirina. b) Esquema ligação cruzada: Uma proteína
de isca contendo resíduo de cisteína é covalentemente ligada ao reagente MTS-diazirina. Após a adição da proteína alvo, a amostra é irradiada com luz UV de 365 nm, revelando um carbeno que reage com o alvo. A redução do grupo sulfeto deixa uma etiqueta sulfidrila na proteína alvo no local da interação.
Figura 19. a) Estruturas dos foto excipientes L-foto-leucina (pLeu) e foto glicosamina,
(pGlcN); b) Reação dos foto-excipientes com a calcitonina (peptídeo) de salmão no estado sólido por exposição à luz UV, mostrando a produção inicial do carbeno reativo seguido pela formação de uma ligação covalente com o peptídeo.
Figura 20. Interações entre a transferrina hospedeira (Tf) em verde e a proteína de
ligação em azul (TbpB). Restrições de distância menores ou iguais a 30 Å mostrados em azul, restrições de distância acima de 30 Å mostrados em vermelho, mostrando a dinâmica do complexo em solução. Restrições de distância acima de 30 Å são encontradas pelo uso de DSS já que a dinâmica do complexo permite que os grupos se aproximem e se afastem durante a reação de ligação cruzada.
Figura 21. Os agentes de ligação cruzada utilizados no presente estudo
NHS-Diazirina (SDA), NHS-LC-NHS-Diazirina (LC-SDA) e NHS-NHS (DSS)
Figura 22. Representação esquemática das etapas reacionais pra se obter peptídeos
com ligação cruzada intramolecular pelo LC-SDA, com respectivos deslocamentos de massa. Etapa 1: Reação no grupo éster de NHS; Etapas 2 e 3: Ativação dos grupos diazirina, eliminação de N2 e reação do carbeno.
Figura 23. Representação esquemática das etapas reacionais pra se obter peptídeos
com ligação cruzada intramolecular pelo LC-SDA, com respectivos deslocamentos de massa. Etapa 1: Reação no grupo éster de NHS; Etapa 2: Ativação dos grupos diazirina, eliminação de N2 e reação do carbeno; Etapa 3: Digestão com tripsina. Figura 24. Representação esquemática da fonte de luz UV empregada para foto
ativação dos grupos diazirina.
Figura 25. Espectros de ESI(+)-QTOF full scan para etapa 1 dos peptídeos A) P11
(Ac-ARVALKAV) - observa-se em m/z 435 (2H+) o peptídeo intacto e nos destaques
em m/z 546 (2H+) e 1092 (1H+) a entrada do LC-SDA com deslocamentos de massa
de 224 Da; B) P12 (Ac-ARAYVALKA) observa-se em m/z 502 (2H+) o peptídeo intacto
e nos destaques em m/z 614 (2H+) e 1227 (1H+) a entrada do LC-SDA com deslocamentos de massa de 224 Da; C) P18 (Ac-RKRVWSEKGNMAR) observa-se
nos destaques em m/z 527 (4H+) e 703 (3H+) a entrada de dois equivalentes de
P19 (Ac-RLKRDTYQAGKFHR) observa-se nos destaques em m/z 566 (4H+) e 755
(3H+) a entrada de dois equivalentes de LC-SDA com deslocamentos de massa de
448 Da possivelmente nas duas lisinas (K) disponíveis. (Conforme Etapa 1 da Figura 22).
Figura 26. Representação esquemática de possíveis rotas reacionais para o carbeno
gerado mediante eliminação de N2 de grupos diazirina em solução aquosa. A) Inserção em uma ligação da cadeia do peptídeo, B) Inserção em uma molécula de água, gerando um composto com deslocamento de massa de +18 Da; C) Inserção em uma ligação da cadeia do ALC, resultando em dois diferentes isômeros sem deslocamento de massa.
Figura 27. Espectros de ESI(+)-QTOF full scan para etapa 2 de fotoativação do grupo
diazirina a 365 nm dos peptídeos A) P11 (Ac-ARVALKAV + 224 Da) observa-se nos destaques em m/z 532 (2H+) a saída de N2 (-28 Da) e consequente inserção do carbeno na cadeia do peptídeo e 541 (2H+) referente a saída de N2 (-28 Da) e subsequente reação do carbeno com a água do meio reacional (+18 Da); B) P12
(Ac-ARAYVALKA + 224 Da) observa-se nos destaques em m/z 600 (2H+) a saída de N2
(-28 Da) e consequente inserção do carbeno na cadeia do peptídeo e 609 (2H+) referente a saída de N2 (-28 Da) e subsequente reação do carbeno com a água do meio reacional (+18 Da); C) P18 (Ac-RKRVWSEKGNMAR + 448 Da) observa-se nos
destaques em m/z 684 (3H+) a saída de duas moléculas de N2 (-56 Da) e consequente
inserção dos carbenos resultantes na cadeia do peptídeo e em 690 (3H+) a saída de
duas moléculas de N2 (-56 Da) e subsequente reação dos carbenos, um com a água do meio reacional (+ 18 Da) e o outro com inserção na cadeia do peptídeo; D) P19
(Ac-RLKRDTYQAGKFHR + 448 Da) observa-se nos destaques em m/z 736 (3H+) a
saída de duas moléculas de N2 (-56 Da) e consequente inserção dos carbenos resultantes na cadeia do peptídeo e em 742 (3H+) a saída de duas moléculas de N2 (-56 Da) e subsequente reação dos carbenos, um com a água do meio reacional (+18 Da) e o outro com inserção na cadeia do peptídeo; (conforme esquema da Figuras 26).
Figura 28. Espectros de ESI(+)-QTOF full scan para etapa 2 de fotoativação do grupo
entrada de três equivalentes do ALC LC-SDA (+672 Da) saída de três moléculas de
N2 (-84 Da) e consequente inserção dos carbenos resultantes na cadeia do peptídeo;
em m/z 650 (4H+) a entrada de 4 equivalentes do ALC LC-SDA (+896 Da) saída de 4
moléculas de N2 (-112 Da) e consequente inserção dos carbenos resultantes na
cadeia do peptídeo; em m/z 736 (3H+) a entrada de 2 equivalentes do ALC LC-SDA
(+448 Da) saída de 2 moléculas de N2 (-56 Da) e consequente inserção dos carbenos
resultantes na cadeia do peptídeo.
Figura 29. Espectros de ESI(+)-QTOF full scan para etapa 3 de digestão enzimática
com tripsina. A) Digesto do P11 [VALKAV + 224 Da - 28 Da + H+] no destaque a entrada do carbeno na cadeia do peptídeo e também a reação com a água do meio
reacional; B) Digesto do P12 [AYVALKA + 224 Da - 28 Da + H+] no destaque a entrada
do carbeno na cadeia do peptídeo e também a reação com a água do meio reacional;
C) Digesto do P18 [VWSEKGNMAR + 224 Da - 28 Da + 2H+] no destaque a entrada do carbeno na cadeia do peptídeo e também a reação com a água do meio reacional;
D) Digesto do P19 [DTYQAGKFHR + 224 Da - 28 Da + 2H+] no destaque a entrada do carbeno na cadeia do peptídeo e também a reação com a água do meio reacional
e digesto [LKR + 224 Da - 28 Da + 2H+]; (O colchete na parte superior das estruturas
representa a reação do carbeno na cadeia do peptídeo formando uma ligação cruzada).
Figura 30. Representação das possibilidades de ligação cruzada de um ALC
fotoativável no peptídeo P11 de m/z 532. A ausência de especificidade do carbeno gerado leva a um aumento do número de ligações cruzadas (veja Cromatograma TIC do peptídeo P11 na figura 31)
Figura 31. Cromatograma dos peptídeos P11 ARVALKAV) e P12
(Ac-ARAYVALKA) após Etapa 3 (ver Figura 3). Cada pico do cromatograma indica a separação de um isómero do íon dicarregado m/z 532 para o peptídeo P11, e m/z 600 para o P12, indicando a reação entre o carbeno gerado, após ativação por UV.
Figura 32. Avanço da reação em função do tempo durante a ativação da porção
diazirina com luz UV 354 nm. Observa-se os materiais conforme descritos na tabela 2: materiais de partida em azul, a formação do carbeno com inserção na cadeia dos peptídeos em laranja e reação do carbeno com água do meio reacional em cinza.
Figura 33. Mecanismo de fragmentação por CID em um peptídeo monocarregado.
Após a colisão com o gás, o sítio protonado direciona as reações de fragmentação. Após uma reação de ciclização, duas etapas distintas podem são possíveis. A reação
I gera íons do tipo b (que contém a porção N-terminal e a reação II gera íons do tipo y (que contém a porção C-terminal)48.
Figura 34. Mapas das ligações cruzadas identificadas para reação de lisozima com
os ALCs SDA, ALC LC-SDA e DSS. Nota-se a formação de um maior número espécies nas duas reações em que foram utilizados os ALCs fotoativáveis SDA e LC-SDA Também é possível notar uma cobertura maior da sequência da proteína nesses dois casos quando comparados com DSS. Foi considerado score 3 para a ilustração desses exemplos.
Figura 35. Espectros de íons produtos, obtido em experimentos de MS2, de digestos de ligação cruzada intermolecular para as reações dos ALCs com lisozima em A) DSS ligação intramolecular entre dois resíduos de lisina B) LC-SDA Ligação intramolecular entre um resíduo de alanina na cadeia alpha e uma lisina na cadeia beta. C) SDA Ligação intramolecular entre um resíduo de valina na cadeia alpha e uma lisina na cadeia beta. Cadeias alpha e beta são definidas por convenção por sua massa molar, sendo a cadeia alpha sempre a de maior massa molar.
Figura 36. Exemplo da diferença entre distância topológica (em azul) e Euclidiana (em
laranja).
Figura 37. Exemplo de distância de ligação entre os carbonos β utilizados como dados de entrada no programa TopoLink para cada par de resíduos considerado com seu
respectivo ALC. Nesse exemplo a distância entre os carbonos β entre dois resíduos
de lisina quando ligados entre si pelo ALC DSS é de 17.8 A, conforme tabela 5.
Figura 38. Número de restrições de distância consistentes e inconsistentes quando comparados com as estruturas cristalográficas para cada ALC e após reação com cada proteína. As restrições listadas foram encontradas pelo programa SIM-XL, separadas por pontuação (score) e comparadas as distâncias pelo programa TopoLink. Consideradas nessa figura apenas as distâncias Euclidianas.
Figura 39. Espectros de íons produtos, obtido em experimentos de MS2, de digestos
de ligação cruzada intermolecular para as reações dos ALCs com lisozima em A) DSS ligação intramolecular entre dois resíduos de lisina; B) SDA Ligação intramolecular entre um resíduo de valina na cadeia alpha e uma lisina na cadeia beta.
Figura 40. Validação das restrições de distâncias experimentais dos ALCs em função
de desvios de até 50 A. Curvas em laranja, azul e cinza são referentes a experimentos de restrições de distância realizado com cada proteína com os ALCs DSS, LC-SDA e SDA, respectivamente.
Lista de tabelas
Tabela 1. Conjunto de sinais encontrados no espectro da Figura 28, onde “carbeno”
é a representação da entrada do carbeno na cadeia do peptídeo sem modificação de
massa e H2O representa a entrada de água do meio reacional no carbeno formado a
partir de uma diazirina com deslocamento de massa de 18 Da.
Tabela 2. Relação de sinais monitorados durante o estudo de monitoramento do
consumo de material de partida e produtos formados durante a etapa de foto ativação dos grupos diazirina por UV. Para os peptídeos P11 e P12 foi monitorada como material de partida a entrada de uma molécula do ALC (Massa do peptídeo + 224Da); inserção do carbeno gerado na cadeia do ALC (massa do peptídeo + 224Da – 28Da); e inserção do carbeno em uma molécula de água do meio reacional (massa do peptídeo + 224Da – 28Da + 18Da). Para o peptídeo P18 foi considerada a entrada de duas moléculas do ALC, nas duas lisinas presentes em sua estrutura.
Tabela 3. Proteínas utilizadas nos estudos de ligação cruzada. Dentre as razões para
a escolhas dessas proteínas estão estabilidade, facilidade de manuseio e presença de um número adequado de resíduos de lisina passíveis de modificação pela porção éster de NHS dos ALCs utilizados.
Tabela 4. Possibilidade de pares de ligação cruzada consideradas para cada ALC
com seus respectivos deslocamentos de massas. Adicionadas manualmente no programa SIM-XL.
Tabela 5. Distâncias de ligação entre carbonos-β calculados para cada par de aminoácido somada a distância da cadeia espaçadora de cada ALC.
Lista de Abreviaturas e Siglas
ALC Agente de ligação cruzada
CID Dissociação Induzida por Colisão
DMF N,N-dimetilformamida
DNA Ácido desoxirribonucleico
DSS Suberato de N,N-dissuccinimidila
DTT Ditiotreitol
EM Microscopia Eletrônica
ESI Ionização por electrospray
HDX Troca de hidrogênio/ deutério
IAA Iodo acetamida
IMS foot-printing de proteína
LC Cromatografia líquida
LC-SDA Succinimidila 6-(4,4` azipentanamido) hexanoato
MALDI Dessorção/ionização a laser auxiliada por matriz
MeCN Acetonitrila
MS Espectrometria de massas
NHS N-hidroxisuccinimida
PDB Protein Data Bank
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RMS Erro quadrático médio
RNA Ácido ribonucleico
SDA Succinimidila (4,4` azipentanamido) hexanoato
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida
SIM-XL Spectrum Identification Machine for Cross-Linked peptides
SPE Extração em fase sólida
TOF Analisador de massas do tipo tempo de voo
UPLC Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência
UV Ultravioleta
XL Reações ligação cruzada
Sumário
Introdução...21
Espectrometria de massas na análise de estruturas de proteínas...23
Agentes de Ligação Cruzada Fotoativáveis...30
A Química das Diazirinas...31
Reatividade e a Química dos Carbenos...34
Uso de Diazirinas como no Estudo de Estruturas Quaternárias...36
Objetivo...44
Experimental...45
Parte A – Estudos com peptídeos sintéticos...45
Reação do LC-SDA com peptídeos...45
Análises por MS do Peptídeos Sintéticos...48
Parte B – Estudos com proteínas padrão...48
Análises por MS da Proteínas Padrão...49
Resultados e Discussão...51
Parte A – Estudos com peptídeos sintéticos...51
Reação de Transamidação dos Petídeos Sintéticos – Etapa 1...51
Ativação dos Grupos Diazirina...53
Digestão enzimática dos Peptídeos padrão...57
Separação dos Isômeros por Cromatografia Utilizando um TriploQuadrupolo...58
Parte B – Estudos com proteínas padrão...63
Conclusão...80 Referências Bibliográficas...81
Introdução
A biologia estrutural é um ramo da biologia molecular e da bioquímica interessada na estrutura de macromoléculas biológicas, especialmente proteínas, RNA ou DNA e membranas. Especificamente, as proteínas são de grande interesse para o entendimento dos processos biológicos pois são essas macromoléculas que realizam a maior parte das funções em uma célula, sendo que essas atividades estão diretamente relacionadas a seus enovelamentos em formas tridimensionais específicas. Essa arquitetura compõe a cadeia polipeptídica como um todo que tende a se enovelar em uma estrutura compacta, a “estrutura terciária”. Essa estrutura constitui a forma mais estável da cadeia proteica, otimizando as forças que atuam entre os diferentes aminoácidos e também entre a cadeia polipeptídica, o solvente e os íons. Usualmente, a estrutura terciária é também a forma biologicamente ativa da proteína e a perturbação da estrutura leva a sua inativação parcial ou completa. Ela é também referida como estrutura nativa da proteína.
Algumas proteínas incluem mais de uma cadeia e nesses casos, cada cadeia se enovela separadamente em sua estrutura terciária, que se junta a outras para formar um complexo biologicamente ativo. Esse tipo de organização constitui a estrutura quaternária ou um complexo proteico. A Figura 1 ilustra cada um dos níveis estruturais presentes em proteínas.1
O objetivo da biologia estrutural é elucidar a estrutura tridimensional dessas macromoléculas, para entender como e por que elas exercem as suas funções específicas bem como de que modo alterações em sua estrutura afetam sua função.
Figura 1. Arranjos estruturais de proteínas. Os diferentes níveis são exemplificados para a
estrutura da proteína hemoglobina (entrada no PDB 1C7D)2. Estruturas primárias se referem
à sequência de aminoácidos da cadeia. Estruturas secundárias incluem segmentos de alfa-hélices e folhas-beta. Estruturas terciárias se referem ao arranjo tridimensional compacto resultante das diversas forças físicas atuantes no enovelamento proteico. Por fim, a estrutura quaternária refere-se ao arranjo entre proteínas que resultam em uma unidade supramolecular biologicamente ativa.
O padrão-ouro da caracterização estrutural é o de elucidar estruturas tridimensionais de proteínas com resolução atômica, usando para isso técnicas como difração de raios-X3, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)4 ou crio
microscopia eletrônica (Cryo-EM)5. Entretanto, a maioria das proteínas ou conjuntos
de proteínas não são passíveis de análise por essas técnicas de alta resolução já que para estudos de difração de raios-X a proteína deve formar um bom monocristal que difrate, o que em muitos casos pode se tornar um desafio, especialmente para proteínas de membrana ou proteínas altamente flexíveis. Para RMN, essa limitação é ainda mais restritiva, sendo que proteínas acima de 40 kDa já fornecem espectros extremamente complexos e que inviabilizam sua resolução. Além disso, as proteínas analisadas por RMN devem ser estáveis em solução de tampões que não interfiram
nas análises por longos períodos, que podem chegar a vários dias6. Por fim, Cryo-EM
2Brucker, Eric Allen. "Genetically crosslinked hemoglobin: a structural study." Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 56.7 (2000): 812-816.
3Ilari, Andrea, and Carmelinda Savino. "Protein structure determination by x-ray crystallography." Bioinformatics. Humana Press, 2008. 63-87.
4Tugarinov, Vitali, Peter M. Hwang, and Lewis E. Kay. "Nuclear magnetic resonance spectroscopy of high-molecular-weight proteins." Annual review of biochemistry 73.1 (2004): 107-146.
5 Doerr, A. Structural biology: Cryo-EM goes high-resolution. Nat. Methods 12, 598–599 (2015)
6Alber, F., Förster, F., Korkin, D., Topf, M. & Sali, A. Integrating Diverse Data for Structure Determination of Macromolecular Assemblies. Annu. Rev. Biochem. 77, 443–477 (2008).
também possui limites inferiores de tamanho para resolução de estruturas de proteínas, atualmente na faixa de 60-70 kDa7.
Devido à essas limitações, outras metodologias de baixa resolução têm sido utilizadas como forma de obter informações sobre sistemas proteicos que não são passíveis de análise pelas técnicas mencionadas anteriormente, e uma das que vêm recebendo destaque é a espectrometria de massas.
Espectrometria de massas na análise de estruturas de proteínas
A espectrometria de massas (MS) é o estudo de íons na fase gasosa, sendo a caracterização estrutural de compostos uma de suas grandes aplicações. Já nos anos 70, havia um grande interesse na utilização de MS para a realização de experimentos de caracterização de proteínas e outras biomoléculas. Entretanto, uma das principais limitações desse desafio envolvia a dificuldade de geração de íons de macromoléculas
em fase gasosa pelos métodos de ionização então disponíveis.89
A utilização da espectrometria de massas (MS) como uma técnica de baixa resolução para a determinação da estrutura de proteínas se tornou altamente atrativa a partir do final dos anos 80, com o advento de técnicas de ionização suaves
denominadas ionização por electrospray (ESI)10 e dessorção/ionização a laser
auxiliada por matriz (MALDI)11, introduzidas respectivamente por J. B. Fenn, e por M. Karas, F. Hillenkamp, e K. Tanaka.
Métodos para estudos de proteínas baseados em MS estão unidos sob a subárea chamada “MS estrutural”, que pode render valiosa complementaridade de
informação estrutural. Esses métodos incluem troca de hidrogênio/ deutério (HDX)12,
7 Patwardhan, A. & Lawson, C. L. Databases and Archiving for CryoEM. The Resolution Revolution: Recent Advances In
cryoEM 579, (Elsevier Inc., 2016).
8 Davis, R.; Frearson, M. Mass Spectrometry – Analytical Chemistry by Open Learning, John Wiley & Sons, London 1987. 9Munson, Milam SB, and F-H_ Field. "Chemical ionization mass spectrometry. I. General introduction." Journal of the American Chemical Society 88.12 (1966): 2621-2630.
10Fenn, John B., et al. "Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules." Science 246.4926 (1989): 64-71. 11Karas, Michael, and Franz Hillenkamp. "Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons." Analytical chemistry 60.20 (1988): 2299-2301.
12 a)Konermann, Lars, Jingxi Pan, and Yu-Hong Liu. "Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics." Chemical Society Reviews 40.3 (2011): 1224-1234; b)Harrison, Rane A., and John R. Engen. "Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen–deuterium exchange mass spectrometry." Current opinion in structural biology 41 (2016): 187-193.
MS nativo13, espectrometria de mobilidade iônica (IMS)14, marcação covalente de proteína15 e ligação cruzada (XL)16.
Nos experimentos de ligação cruzada associados à espectrometria de massas, um reagente químico (chamado de agente de ligação cruzada, ou ALC) é adicionado à uma solução da proteína. Dependendo de sua reatividade, esse composto se liga às cadeias laterais de dois resíduos espacialmente próximos na estrutura, sejam eles
dentro de uma mesma proteína ou em um complexo proteico17. O ALC consiste em
dois ou mais grupos reativos, que são separados através de uma cadeia espaçadora de comprimento definido e é, portanto, frequentemente referido como uma “régua molecular" capaz de fornecer informações estruturais acerca da distância entre os resíduos conectados pelo ALC. Os resíduos ligados covalentemente pelo ALC são identificados após a digestão enzimática da proteína utilizando separação por cromatografia líquida, seguida de ionização por electrospray e análise por espectrometria de massa sequencial (LC/ESI-MS/MS). As restrições de distância que são fornecidas pelo ALC na estrutura terciária da proteína ou de um complexo proteico servem como base para estudos subsequentes de modelagem computacional para obtenção ou validação de modelos estruturais tridimensionais18 (Figura 2).
13 a)Benesch, Justin LP, et al. "Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics." Chemical reviews 107.8 (2007): 3544-3567; b) Heck, Albert JR. "Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology." Nature methods 5.11 (2008): 927.; c)Sharon, Michal. "How far can we go with structural mass spectrometry of protein complexes?." Journal of the American Society for Mass Spectrometry 21.4 (2010): 487-500.
14 a) Göth, Melanie, and Kevin Pagel. "Ion mobility–mass spectrometry as a tool to investigate protein–ligand interactions." Analytical and bioanalytical chemistry 409.18 (2017): 4305-4310.; b) Jurneczko, Ewa, and Perdita E. Barran. "How useful is ion mobility mass spectrometry for structural biology? The relationship between protein crystal structures and their collision cross sections in the gas phase." Analyst 136.1 (2011): 20-28.
15 a) Konermann, Lars, and Yan Pan. "Exploring membrane protein structural features by oxidative labeling and mass spectrometry." Expert review of proteomics 9.5 (2012): 497-504.; b)Yan, Yuetian, et al. "Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) maps the epitope of EGFR binding to adnectin." Journal of the American Society for Mass Spectrometry 25.12 (2014): 2084-2092.
16 a)Sinz, Andrea. "Chemical cross‐linking and mass spectrometry to map three‐dimensional protein structures and protein– protein interactions." Mass spectrometry reviews 25.4 (2006): 663-682.; b) Rappsilber, Juri. "The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes." Journal of structural biology 173.3 (2011): 530-540; c) Leitner, Alexander, et al. "Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics." Molecular & Cellular Proteomics 9.8 (2010): 1634-1649.; d)Petrotchenko, Evgeniy V., and Christoph H. Borchers. "Crosslinking combined with mass spectrometry for structural proteomics." Mass spectrometry reviews 29.6 (2010): 862-876.; e) Liu, Fan, and Albert JR Heck. "Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry." Current opinion in structural biology 35 (2015): 100-108.
17Iglesias, Amadeu H., Luiz Fernando A. Santos, and Fábio C. Gozzo. "Identification of cross-linked peptides by high-resolution precursor ion scan." Analytical chemistry 82.3 (2010): 909-916.
18 a)Kahraman, Abdullah, et al. "Cross-link guided molecular modeling with ROSETTA." PloS one 8.9 (2013): e73411.; b) Kalkhof, Stefan, et al. "Computational modeling of laminin N‐terminal domains using sparse distance constraints from disulfide bonds and chemical cross‐linking." Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 78.16 (2010): 3409-3427.
Figura 2. Representação esquemática de um experimento de ligação cruzada associada à
espectrometria de massas. (1) Reação da proteína com o ALC; (2) Digestão enzimática dando origem às diversas espécies de peptídeos, convencionais e modificados; (3) Análise da mistura por LC-MS/MS; (4) Processamento dos dados e agrupamento das restrições de distância obtidas experimentalmente em um mapa de restrições de distância com o uso de programas específicos; (5) Utilização do conjunto de restrições para predição de estruturas ou seleção de modelos compatíveis.
A principal informação que os experimentos desse tipo nos fornecem é uma lista de restrições entre átomos, ou a distância entre eles ao longo da superfície da proteína. Essa informação é associada a um comprimento máximo definido a partir do alcance da cadeia espaçadora do agente de ligação cruzada (ALC), que define um limite máximo de distâncias entre os resíduos. O comprimento do agente de ligação cruzada pode ser da ordem de vários angstrons e assim, geometricamente associados a resíduos relativamente distantes na sequência da proteína.
A técnica é muito bem estabelecida para definição de estruturas quaternárias (complexos protéticos), onde mesmo um número baixo de restrições de distância já pode ser usado para se determinar a topologia do sistema de interação proteína-proteína, conforme o esquema da figura 3.
Figura 3. Sequência utilizada na determinação de estruturas quaternárias, onde poucas
restrições de distância são necessárias para determinação da região de interação proteína-proteína
A Figura 4 apresenta algumas das colaborações do grupo de pesquisa do Prof. Fabio Gozzo na elucidação de complexos proteicos de vários sistemas binários nos últimos anos19.
Figura 4. Sistemas de complexos proteicos resolvidos pela análise de ligação cruzada
seguida por espectrometria de massas. Sistemas Tom70-Hps90, aBcristalina, e FAK-Miosina, respectivamente.
19 a)Zanphorlin, Leticia M., et al. "Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the
mitochondrial import receptor Tom70." Journal of Biological Chemistry 291.36 (2016): 18620-18631.; b);Santos, Aline M., et al. "FERM domain interaction with myosin negatively regulates FAK in cardiomyocyte hypertrophy." Nature chemical biology 8.1 (2012): 102.c) Pereira, Michelle BM, et al. "αB-crystallin interacts with and prevents stress-activated proteolysis of focal adhesion kinase by calpain in cardiomyocytes." Nature communications 5 (2014): 5159
Inúmeros avanços têm sido relatados pelo uso da técnica de análise de ligação cruzada por espectrometria de massas em termos de aplicações a amostras biológicas complexas, na elucidação de estruturas quaternárias incluindo lisados celulares, células intactas e mesmo amostras de tecido celular permitindo o
entendimento das interações do proteoma de diversos organismos20.
Experimentalmente, a técnica de ligação cruzada apresenta uma série de limitações, especialmente porque o número de restrições está limitado à reatividade dos agentes de ligação cruzada, pela abundância de resíduos reativos na proteína de interesse e pela exposição desses resíduos reativos ao solvente. A interpretação dos
espectros de massa torna-se também uma tarefa complexa21, que requer algoritmos
e programas específicos22, e além de uma minuciosa análise manual dos resultados.
A qualidade da informação estrutural obtida em experimentos desse tipo depende diretamente do número de restrições de distância obtidas. Alguns estudos mostram que se o número de ligações cruzadas for próximo de 20 a 30% do número de resíduos de aminoácido do sistema, então o tipo de enovelamento da proteína, ou sua estrutura terciária pode ser determinado com um erro quadrático médio (RMS) da ordem de 8 angstroms (Figura 5).2324
20Chavez, Juan D., and James E. Bruce. "Chemical cross-linking with mass spectrometry: a tool for systems structural biology." Current opinion in chemical biology 48 (2019): 8-18..
21Iacobucci, Claudio, and Andrea Sinz. "To be or not to be? Five guidelines to avoid misassignments in cross-linking/mass spectrometry." Analytical chemistry 89.15 (2017): 7832-7835.
22Götze, Michael, et al. "StavroX—a software for analyzing crosslinked products in protein interaction studies." Journal of the American Society for Mass Spectrometry 23.1 (2012): 76-87.; Sarpe, Vladimir, et al. "High sensitivity crosslink detection coupled with integrative structure modeling in the Mass Spec Studio." Molecular & Cellular Proteomics 15.9 (2016): 3071-3080.
23Chen, Yiwen, Feng Ding, and Nikolay V. Dokholyan. "Fidelity of the protein structure reconstruction from inter-residue proximity constraints." The Journal of Physical Chemistry B 111.25 (2007): 7432-7438.
24Young, Malin M., et al. "High throughput protein fold identification by using experimental constraints derived from intramolecular cross-links and mass spectrometry." Proceedings of the National Academy of Sciences 97.11 (2000): 5802-5806..
Figura 5. Erros quadráticos médios (RMS) e desvios padrões para comparações entre
estruturas de XRD ou NMR previamente disponíveis e conjuntos de estruturas-modelo com 10, 30, 50, 70 e 90% de restrições de distância em relação ao número de resíduos, para os domínios A) Subunidade f da RNA polimerase (1GO3); B) Proteína ribosomal 50s 17/112 (1DD3); C) Neurotoxina b (1NXB); D) Di-hidrofolato redutase (1VIE); E) 1,4-alfa- maltotetrahidrolase (1JDC); F) Proteína g (1IGD); G) Proteína ribosomal 130 (1BXY); H) Proteína de divisão celular ftsa (1E4F); I) Proteína anticoagulante (1D0D). Os códigos entre
parênteses se referem às estruturas do PDB com as quais foram feitas as comparações.
Nesse contexto, um dos potenciais pouco explorados está na possibilidade de aplicar a técnica na elucidação da estrutura terciária de proteínas, já que um dos desafios relacionados a essa metodologia refere-se a dificuldade de se obter um número adequado de espécies de ligações cruzadas, o que pode depender do sistema alvo e do ALC utilizado.
Nos ALCs homobifuncionais tradicionais como suberato de dissuccinimidila (DSS) são
empregados ésteres de NHS, reativos
principalmente frente a aminas primárias dos
resíduos de lisina e do resíduo N-terminal, as ligações cruzadas formadas ficam restritas a pares desses resíduos presentes na estrutura, expostos ao solvente e dentro da faixa de alcance estipulada pela cadeia espaçadora do ALC (nesse exemplo 11,4 A).
Em uma tentativa recente de aumentar o número de restrições de distância para análises de estrutura terciária, Fioramonte e colaboradores25, diante das limitações apresentadas pelo uso de DSS e derivados de ésteres de NHS em geral, desenvolveram uma metodologia alternativa utilizando uma diamina como ALC. Segundo essa abordagem, resíduos eletrofílicos de ácido aspártico e glutâmico são ativados por reagentes de acoplamento, que permitem o uso de diaminas como ALCs atacando as espécies ativadas e formando produtos de ligação cruzada.
Esse reagente é reativo também frente aos grupos nucleofílicos (lisinas, serinas, N-terminal, etc.), e a metodologia desenvolvida ainda permitiu que resíduos de ácido aspártico e ácido glutâmico da proteína formem espécies de ligação cruzada sem cadeia espaçadora (espécies de comprimento zero, ou zero-length) com os resíduos nucleofílicos, multiplexando as reações de ligação cruzada em um mesmo experimento e se apresentando como uma alternativa vantajosa frente ao uso dos ésteres de NHS.
Utilizaram para essa demonstração uma proteína alvo pobre em resíduos de lisina, a SalBIII. De acordo com a figura 6 essa nova metodologia foi capaz de cobrir
cerca de 24% da abundância natural média de aminoácidos em proteínas26. Um salto
de cerca de 10% quando comparada com a metodologia tradicional baseada exclusivamente em ésteres de NHS.
Dessa maneira, o uso de ALCs cada vez menos seletivos e capazes de formar ligações cruzadas entre mais tipos de resíduos teriam o potencial de aumentar o número de ligações cruzadas e consequentemente, a qualidade da informação estrutural obtida para elucidação de estruturas terciárias.
25Fioramonte, Mariana, et al. "XPlex: an effective, multiplex cross-linking chemistry for acidic residues." Analytical chemistry 90.10 (2018): 6043-6050.
Figura 6. À esquerda: abundância natural de aminoácidos de acordo com o banco de dados
TrEMBL. À direita: Esquema de ligações cruzadas baseadas em ésteres de NHS que visam principalmente os resíduos de lisina e eventualmente serina (flechas em azul), que representam um pouco mais de 11%, da abundância natural de aminoácidos em proteínas. O método multiplex é capaz de gerar restrições de distância entre as cadeias laterais ácidas (flechas em vermelho) por meio de um reagente diamina e permite ainda a formação de uma espécie de comprimento zero, quando lisinas ou serinas se ligam a resíduos ácido. Os resíduos potencialmente reticuláveis, nessa abordagem, constituem cerca de 24% da
abundância natural de aminoácidos em proteínas (barras vermelhas)25.
Agentes de Ligação Cruzada Fotoativáveis
Uma alternativa com grande potencial de aumentar o número de espécies de ligação cruzada obtidas é a utilização de uma classe distinta de ALC formada por compostos contendo grupos reativos fotossensíveis, capazes de ativação pela incidência de radiação na região do ultravioleta (UV). Uma vez ativados esses grupos reagem rápida e indiscriminadamente com cadeias laterais de resíduos de aminoácidos próximos, formando produtos estáveis, também passíveis de identificação mediante análise por espectrometria de massas27. Esses agentes de ligação cruzada foram desenvolvidos para sofrer ativação em comprimentos de onda na região do UV (>300 nm), de forma a evitar danos diretos à estrutura das proteínas, como pela incidência de radiação em 254 nm. A fotólise desses reagentes fornece os
27 a) Sinz, Andrea. "Chemical cross‐linking and mass spectrometry to map three‐dimensional protein structures and protein– protein interactions." Mass spectrometry reviews 25.4 (2006): 663-682. b) Gomes, Alexandre F., and Fabio C. Gozzo. "Chemical cross‐linking with a diazirine photoactivatable cross‐linker investigated by MALDI‐and ESI‐MS/MS." Journal of mass spectrometry 45.8 (2010): 892-899.
produtos ativados com alto rendimento28. Reagentes fotoativáveis incluem azidas, compostos diazo, benzofenonas e finalmente diazirinas que é o foco desse trabalho (Figura 7).29 30
Figura 7. Três tipos de reagentes fotoativáveis: (1) benzofenonas, (2) azidas, (3) diazirinas
A Química das Diazirinas
Diazirinas são produzidas a partir da oxidação de diaziridinas. Estas por sua
vez, podem ser preparadas a partir de cetonas23 por oximação, seguidas de tosilação
(ou mesilação), seguido por tratamento com amônia. Geralmente, as reações de oximação são realizadas pela reação da cetona com cloreto de hidroxilamônio sob aquecimento na presença de uma base como a piridina. A tosilação ou mesilação subsequentes do oxigênio alfa substituído com cloreto de tosil ou mesil na presença de base produz a tosil ou mesil oxima. O tratamento final da tosil ou mesil oxima com amônia produz a diaziridina (Figura 8).
Figura 8. Esquema reacional de síntese de uma diaziridina genérica a partir de uma cetona.
28Blencowe, Anton, and Wayne Hayes. "Development and application of diazirines in biological and synthetic macromolecular systems." Soft Matter 1.3 (2005): 178-205.
29Dubinsky, Luba, Bastiaan P. Krom, and Michael M. Meijler. "Diazirine based photoaffinity labeling." Bioorganic & medicinal chemistry 20.2 (2012): 554-570.
30Sinz, Andrea. "The advancement of chemical cross-linking and mass spectrometry for structural proteomics: from single proteins to protein interaction networks." Expert review of proteomics 11.6 (2014): 733-743.
As diaziridinas também podem ser produzidas diretamente pela reação de cetonas com amônia na presença de um agente aminado, como uma monocloramina ou ácido O-sulfônico de hidroxilamina. As diaziridinas podem ser oxidadas em
diazirinas por vários métodos23. Isso inclui oxidação por reagentes à base de cromo,
como a oxidação de Jones (Figura 9), oxidação por iodo e trietilamina, oxidação por óxido de prata, oxidação por cloreto de oxalil, ou até oxidação eletroquímica em um ânodo de platina-titânio.
Figura 9. Esquema reacional de preparação de uma diazirina genérica a partir de uma
diaziridina via oxidação de Jones.
Embora as diazirinas constituam heterociclos de três membros com alta tensão de anel, possuem ótima estabilidade química sob diversascondições.3132 A incidência de radiação UV ao redor de 350 nm em alquil 3334 e arildiazirinas35 provoca eliminação
de N2 e formação de carbenos altamente reativos36. Há também a possibilidade de
formação de espécies diazo isoméricas que, por sua vez, podem formar carbenos por eliminação de N2, além de agirem como eletrófilos 25 e alquilantes fortes37 (Figura 10).
Pela combinação dessas características, as diazirinas constituem ótimos
precursores de carbenos,38 sendo assim excelentes grupos fotossensíveis para ALC
fotoativáveis. Os carbenos resultantes da ativação são capazes de inserção em quaisquer ligações C-H, N-H, O-H ou S-H, abundantes em estruturas proteicas, e que estejam espacialmente próximas.
31Church, Robert FR, and Martin J. Weiss. "Diazirines. II. Synthesis and properties of small functionalized diazirine molecules. Observations on the reaction of a diaziridine with the iodine-iodide ion system." The Journal of Organic Chemistry 35.8 (1970): 2465-2471.
32Moss, Robert A. "Carbenic reactivity revisited." Accounts of Chemical Research 22.1 (1989): 15-21..
33Smith, Richard AG, and Jeremy R. Knowles. "Aryldiazirines. Potential reagents for photolabeling of biological receptor sites." Journal of the American Chemical Society 95.15 (1973): 5072-5073.
34Smith, Richard AG, and Jeremy R. Knowles. "The preparation and photolysis of 3-aryl-3 H-Diazirines." Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2 7 (1975): 686-694.
35Blencowe, Anton, and Wayne Hayes. "Development and application of diazirines in biological and synthetic macromolecular systems." Soft Matter 1.3 (2005): 178-205.
36Tanaka, Yoshihito, Michelle R. Bond, and Jennifer J. Kohler. "Photocrosslinkers illuminate interactions in living cells." Molecular bioSystems 4.6 (2008): 473-480.
37Brunner, Josef. "New photolabeling and crosslinking methods." Annual review of biochemistry 62.1 (1993): 483-514. 38Moss, Robert A. "Diazirines: Carbene precursors par excellence." Accounts of chemical research 39.4 (2006): 267-272.
A suposta inespecificidade de ligação do carbeno tem o potencial para formação de um maior número de espécies de ligação cruzada, que agora podem ocorrer entre aminas primárias (lisinas e N-terminal) e quaisquer outros resíduos de aminoácido a distâncias apropriadas.
Figura 10. Produzidos a partir de diazirinas ou compostos diazo, carbenos são gerados pela
perda de N2 através de decomposição térmica ou fotolítica com a quebra da ligação C-N e a
formação de dois compostos neutros. Nesse exemplo, a eliminação de nitrogênio molecular de diazirinas formando carbenos diretamente ou mediante rearranjo para espécie diazo.
No esquema da figura 11, um ALC baseado em um grupo NHS e uma diazirina, pode ser ancorado em um resíduo de lisina em uma etapa inicial e numa segunda etapa, a diazirina reage com luz UV a 354 nm liberando nitrogênio gasoso. O carbeno formado é altamente reativo e pode se ligar inespecíficamente a qualquer resíduo de aminoácido que esteja próximo.
Figura 11. Esquema representando os produtos observados para reação de um ALC do tipo
heterobifuncional contendo um grupo éster de NHS e um grupo diazirina fotoativável. A molécula do ALC é inicialmente ligada pelo grupo éster de NHS, nesse exemplo a um resíduo
de lisina (K), e a seguir pelo carbeno gerado mediante eliminação de N2 da diazirina, em etapas
separadas, sendo a Etapa 3 totalmente inespecífica. A barra em azul representa um peptídeo
ou uma proteína.
Reatividade e a Química dos Carbenos
Carbenos são uma classe de compostos neutros que possuem um átomo de carbono divalente, contendo 6 elétrons de valência sendo dois em cada ligação e dois elétrons não-ligantes. São espécies muito reativas e extremamente instáveis. Essa reatividade elevada deve-se ao fato de que o composto representa uma espécie deficiente de elétrons e por esse motivo são em sua maioria observado apenas em reações in situ na forma de intermediários reativos de duração extremamente curta (da ordem de milissegundos).
Os carbenos podem possuir estruturas eletrônicas com duas multiplicidades de spin: tripletos e singletos. Essas duas configurações eletrônicas possuem diferentes geometrias e reatividades39.
39Carey, Francis A., and Richard J. Sundberg. Advanced Organic Chemistry: Part B: Reaction and Synthesis. Springer Science & Business Media, 2007.
Uma imagem aproximada da ligação do estado singlete assume a hibridação sp2 no carbono, com dois elétrons não compartilhados como orbital sp2 (Figura 12). O orbital p está desocupado. Espera-se que o ângulo R-C-R seja ligeiramente menor do
que o esperado de 120o por causa da repulsão eletrônica entre o par de elétrons não
compartilhados e os elétrons nos dois orbitais sigma de ligação. As ligações no estado triplete do carbeno correspondente são formadas a partir de orbitais sp, com os elétrons não pareados em dois orbitais p ortogonais. Uma estrutura linear seria prevista para esse arranjo de ligação.
Figura 12. Carbenos e suas estruturas eletrônicas com duas multiplicidades de spin:
singleto e tripleto
Os estudos teóricos e experimentais forneceram informações mais detalhadas sobre a estrutura dos carbenos. Os cálculos de orbitais moleculares levam à previsão
de ângulos H-C-H para o metileno de 135o para o estado tripleto 105o para o estado
singleto. Calcula-se ainda que o estado tripleto seja cerca de 8 kcal/mol mais estável
que o singlete. As determinações experimentais da geometria do CH2 confirmam os
resultados teóricos e as evidências disponíveis são consistentes com o estado tripleto, sendo essas as espécies do estado fundamental. No entanto, a natureza do substituinte pode tornar o estado singlete mais estável, como exemplificado na figura 13, na qual substituintes que atuam como doadores de elétrons estabilizam o estado singleto pela deslocalização do par eletrônico para o orbital p vazio.
Figura 13. Substituintes doadores de elétrons que estabilizam estado singlete de carbenos
Apesar de possuírem dois elétrons livres, os carbenos são deficientes eletronicamente e procuram completar a sua camada de valência. Como os radicais, os carbenos são espécies bastante reativas e, deste modo, podem participar de uma série de reações como migração-1,2, dimerização, adição a ligações múltiplas e,
ainda, reações de inserção C-H, N-H, O-H ou S-H (Figura 14)40.
Figura 14. Reatividade típica dos carbenos migração-1,2, dimerização, adição a ligações
múltiplas e reações de inserção C-H, N-H, O-H ou S-H14
Uso de Diazirinas no Estudo de Estruturas Quaternárias
Com a vantagem de se controlar o momento exato em que se iniciará a reação de ligação cruzada, o uso de ALCs fotoativáveis permitiu novas possibilidades de experimentos para mapear a estrutura de proteínas. Um exemplo dessas aplicações foi o trabalho de Suchanek e colaboradores,41 envolvendo a utilização de versões modificadas dos aminoácidos leucina, isoleucina e metionina com grupos diazirina fotoativáveis, diretamente em células vivas (Figura 15).A similaridade estrutural entre esses aminoácidos modificados e suas respectivas versões naturais possibilita que eles escapem dos mecanismos de controle de identidade durante a biossíntese
40Pastre, Julio Cezar, and Carlos Roque Duarte Correia. "Catalisadores contendo carbenos N-heterocíclicos como ligantes: propriedades, sínteses, aplicações e comparação com outros ligantes." Química Nova (2008).
41Suchanek, Monika, Anna Radzikowska, and Christoph Thiele. "Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein-protein interactions in living cells." Nature methods 2.4 (2005): 261.
proteica e sejam incorporados às proteínas pelo maquinário de tradução de células de mamíferos. A incidência controlada de radiação UV ativa os grupos diazirina,
procedendo à eliminação de N2, geração de carbenos e formação de ligações
cruzadas entre os três tipos resíduos de aminoácidos modificados e suas vizinhanças. Tais ligações covalentes são capazes de fixar proteínas interagindo entre si, o que permitiu mapear parceiros de interação em complexos proteicos por meio da técnica de Western Blotting.
Figura 15. Mapeamento de interações proteína-proteína em meio intracelular. Esquerda:
aminoácidos modificados com grupos diazirina empregados nos estudos, Leu, photo-Ile e photo-Met. Direita: fotografia de análises por Western Blotting, demonstrando a ocorrência de ligações cruzadas entre proteínas constituintes do complexo proteico estudado após incidência de radiação UV, quando as mesmas foram biossintetizadas incorporando os
aminoácidos modificados do meio intracelular42.
Em 2008, Shigdel42 e colaboradores utilizaram ALCs fotoativáveis baseados em diazirinas na detecção de interações proteína-DNA por SDS-PAGE (Figura 16). Esses métodos de ligação cruzada permitem caracterizar diferentes formas de complexos proteína-DNA que são lábeis na ausência de ligações covalentes. O uso da diazirina nesse exemplo possui várias vantagens: 1) o intermediário de carbeno foto-gerado possui alta eficiência de reticulação podendo se inserir a ligações múltiplas como C-H, N-H, O-H ou S-H ; 2) a diazirina possui excelente estabilidade química antes da fotólise e é ativada rapidamente em comprimentos de onda além daqueles nos quais a maioria das macromoléculas biológicas absorve a luz UV (abaixo de 350 nm); 3) a introdução da pequena unidade de diazirina reduz o potencial
42Shigdel, Uddhav Kumar, Junliang Zhang, and Chuan He. "Diazirine‐Based DNA Photo‐Cross‐Linking Probes for the Study of Protein–DNA Interactions." Angewandte Chemie International Edition 47.1 (2008): 90-93.
impedimento estérico; 4) o método é inespecífico e não requer a presença de resíduos proteicos específicos para reticulação.
Figura 16. A) Incorporação de diazirina à base púrica citosina (através da desproteção do
DNA substituído por O4-triazolil-dUs) ou pirimídica guanina (através da desproteção do DNA substituído com 2-F-dI) utilizando as correspondentes diazirinas-aminas. B) O DNA modificado com diazirina pode ser fotoativado para gerar um intermediário de carbeno para reticulação com as proteínas de ligação ao DNA. (DBU = 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno.)
Das e colaboradores43 utilizaram marcação de fotoafinidade usando aziálcoois
com base em diazirina (Figura 17) para identificar, por espectrometria de massas, locais de ligação do álcool em proteínas, na tentativa de definir alvos moleculares (receptores, enzimas e canais de íons) do etanol no cérebro, para que novos medicamentos possam ser projetados com base nos seus locais de ligação, com o
43Das, Joydip. "Identification of alcohol‐binding site (s) in proteins using diazirine‐based photoaffinity labeling and mass spectrometry." Chemical biology & drug design (2018).
objetivo de auxiliar o tratamento da dependência de álcool em humanos. O etanol possui vários alvos e afeta muitos circuitos neurais no cérebro e para tanto é desejável o desenvolvimento de novas drogas com efeitos colaterais mínimos.
Figura 17 - Esquema simplificado para a detecção da foto incorporação de azilálcool em
proteínas. A proteína foto marcada pode ser analisada por MALDI-TOF ou ESI para identificar a foto incorporação e estequiometria. Os locais de foto incorporação são detectados através da aquisição de dados de espectros de MS/MS após a digestão enzimática e separação por
cromatografia líquida da amostra43.
Horne44 e seus colaboradores também lançaram mão do uso de diazirinas descrevendo novos agentes de ligação cruzada composto por um grupo metanossiossulfonato (MTS) para realizar a marcação de uma cisteína reativa introduzida na proteína isca e um grupo fotoativável à base de diazirina que após irradiação UV intercepta seu parceiro de interação. Conforme o esquema da Figura 18, após a remoção por redução da ligação de sulfeto da proteína isca,o grupo tiol resultante pode ser alquilado e localizado por MS após a digestão tríptica da proteína.
44Horne, Jim E., et al. "Rapid Mapping of Protein Interactions Using Tag‐Transfer Photocrosslinkers." Angewandte Chemie International Edition 57.51 (2018): 16688-16692.
