PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
METRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS
VILMA MARÇAL DE QUEIROZ
Análise da contaminação bacteriana na superfície de
cimentos biocerâmicos por Enterococcus faecalis
Cuiabá - MT
2020
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VILMA MARÇAL DE QUEIROZ
Análise da contaminação bacteriana na superfície de
cimentos biocerâmicos por Enterococcus faecalis
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas Integradas, da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas. Área de Concentração: Biociência.
Orientadora: Profa. Drª. Cyntia R. A. Estrela.
Cuiabá - MT
2020
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Z947e Vilma Marçal de Queiroz.
Análise da contaminação bacteriana na superfície de cimentos biocerâmicos por Enterococcus faecalis.
Queiroz – Cuiabá, 2020. 52 f.:il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Odontológicas) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas Integradas, Universidade de Cuiabá.
Orientadora: Profa. Drª. Cyntia R. A. Estrela.
1. Enterococcus faecalis. 2. Cimentos Dentários. 3. Microscopia eletônica de varredura.
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
METRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS
VILMA MARÇAL DE QUEIROZ
Análise da contaminação bacteriana na superfície de
cimentos biocerâmicos por Enterococcus faecalis
Dissertação apresentada à UNIC, Doutorado em Ciências Odontológicas
Integradas como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre
conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:
_________________________________________ Prof. Dr. Helder Fernandes de Oliveira
UnivEvangélica
_________________________________________ Prof. Dr. Luiz Evaristo Ricci Volpato
Universidade de Cuiabá - UNIC
_________________________________________ Profª. Drª. Cyntia R. A. Estrela
Universidade de Cuiabá - UNIC Orientadora
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Dedico este trabalho a Deus, pela vida abençoada que me deste, ao meu querido pai (in Memorian) que mesmo na ausência física acredito estar torcendo muito por mim, e minha mãe meu exemplo de garra e persistência, e aos meus queridos irmãos que sempre me apoiam e incentivam na minha caminhada e na realização dos meus sonhos.
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AGRADECIMENTOS
A Deus pela oportunidade da existência e pelo dom da vida.
Ao meu pai Otaviano Marçal de Queiroz (in Memorian) e minha mãe Dazia Fernandes Pereira, meus exemplos de vida.
Aos meus queridos irmãos Daniel, Jonas e Jarbas por serem meu alicerce durante a realização dos meus sonhos, que sempre acreditaram e me incentivaram durante a minha caminhada.
Aos meus colegas e amigos de trabalho pelo apoio nos momentos em que não pude estar presente nas tarefas laborais.
Aos eternos colegas de curso. Vivemos e sobrevivemos a momentos “mágicos” que estão sempre em minha memória.
A minha professora e orientadora Profª. Drª. Cyntia Rodrigues de Araújo Estrela, pela confiança, oportunidade, por me proporcionar direção, paciência, atenção, disposição, e por todos os conhecimentos divididos durante todo o desenvolvimento do trabalho, e por quem devo muito mais que um agradecimento.
A Universidade Federal de Goiás na pessoa da Profª. Drª. Cyntia Rodrigues Estrela e Prof. Dr. Carlos Estrela por permitir a realização da parte experimental deste trabalho na Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás, mostrando na prática o que é fazer pesquisa.
Aos Professores Doutores do Mestrado e Doutorado em Ciências Odontológicas Integrada da Universidade de Cuiabá – UNIC: Prof. Dr. Alexandre Meireles Borba, Profª. Drª. Andreza Maria Fábio Aranha, Profª. Drª. Cyntia Rodrigues Estrela, Prof. Dr. Luiz Evaristo Ricci Volpato, Prof. Dr. Mateus Rodrigues Tonetto. Obrigada pelos ensinamentos, profissionalismo e dedicação.
Ao Coordenador do Mestrado e Doutorado em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Dr. Alexandre Meireles Borba. Muito obrigada pelo apoio, e profissionalismo.
Ao diretor da Faculdade de Odontologia da Universidade de Cuiabá – Unic Prof. Dr. Alessandro Tadeu Correa Marques. Obrigada pelo apoio.
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A Reitora da Universidade de Cuiabá – Unic, a Profª. Drª. Maria Angélica Motta da Silva Esser por nos oportunizar este momento dentro da nossa Universidade.
A Pró-reitora Acadêmica da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Edirles Mattje Backes pelo apoio dado a pós-graduação.
Ao Diretor de Pós-graduação Strito Sensu da Kroton, Prof. Dr. Hélio Suguimoto. Obrigada pela oportunidade.
A secretaria do Programa de Mestrado/Doutorado da Universidade de Cuiabá-UNIC que sempre estiveram e estão solícitos as nossas necessidades e prestativas aos alunos e professores do programa de pós-graduação da Universidade de Cuiabá.
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“Desistir? Eu já pensei seriamente nisso, mas nunca me levei realmente a sério. É que tem mais chão nos meus olhos do que cansaço nas minhas pernas. Mais esperança nos meus passos do que tristeza nos meus ombros. Mais estrada no meu coração do que medo na minha cabeça.” (Cora Coralina)
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RESUMO
QUEIROZ, Vilma Marçal de. Análise da Contaminação Bacteriana na Superfície
de Cimentos Biocerâmicos por Enterococcus faecalis. [Dissertação]. Programa de
Pós-graduação Stricto Sensu em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC. 2020.
O tratamento dos canais radiculares tem como objetivo esvaziar, sanificar, modelar e para finalizar, preencher tridimensionalmente o canal radicular por meio do selamento endodôntico e coronário. O presente estudo avaliou a contaminação bacteriana por Enterococcus faecalis através de análise superficial de diferentes cimentos endodônticos biocerâmicos empregados rotineiramente na Endodontia: MTA Angelus®, Biodentine® e Cimento Portland, por Enterococus faecalis. Vinte dentes
incisivos bovinos de procedência conhecida foram utilizados neste estudo. Os dentes foram seccionados e foram confeccionadas cinco cavidades em cada secção radicular com largura similar e equidistantes 3mm uma da outra. Os materiais foram preparados de acordo com as especificações dos fabricantes e as cavidades preenchidas. Os espécimes foram colocados em tubos de ensaio contendo 5mL de Brain Heart Infusion (BHI; Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) e contaminados por uma cepa padrão de Enterococcus faecalis (ATCC 29212) obtida da American Type Culture Collection nos períodos experimentais de 7 e 30 dias. Nos períodos de 7 e 30 dias de contaminação, os materiais avaliados foram removidos das cavidades e individualmente imersos em 7mL de Letheen Broth seguido pela incubação a 37˚C por 48 horas. Após este período foi realizada a transferência, individualmente, para 5mL de infusão cérebro coração, seguido de novo período de incubação nas mesmas condições anteriormente citadas. A contaminação bacteriana foi avaliada por meio do espectrofotômetro UV. Para avaliação em microscopia eletrônica de varredura foram realizadas a aquisição das imagens com aumento de 50x, 1500x e 5000x para detectar a presença ou ausência de contaminação. A presença de Enterococcus faecalis foi detectada nos materiais tanto pela análise da densidade óptica de culturas de 07 e 30 dias, quanto pela análise das superfícies determinadas pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura.
Palavras-chave: Enterococcus faecalis; Cimentos Dentários; Microscopia eletrônica
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ABSTRACT
QUEIROZ, Vilma Marçal de. Analysis of Bacterial Contamination on the Surface of Bioceramic Cements by Enterococcus faecalis. [Dissertation]. Stricto Sensu Graduate Program in Integrated Dental Sciences at the University of Cuiabá - UNIC 2020.
The treatment of root canals aims to empty, sanitize, shape and, finally, fill the spaces of the pulp cavities by means of endodontic and coronary sealing. The present study analyzed the surface contamination of materials routinely used in Endodontics: MTA Angelus®, Biodentine® and Portland Cement, by Enterococus faecalis. Twenty bovine incisor teeth of known origin were used in this study. The teeth were sectioned and five cavities were made in each root section with similar width and equidistant 3 mm from each other. The materials were prepared according to the manufacturers' specifications and the cavities filled. The specimens were placed in test tubes containing 5mL of Brain Heart Infusion and contaminated with a standard strain of Enterococcus faecalis (ATCC 29212) obtained from the American Type Culture Collection in the experimental periods of 7 and 30 days. In the periods of 7 and 30 days of contamination, the evaluated materials were removed from the wells and individually immersed in 7mL of Letheen Broth followed by incubation at 37˚C for 48 hours. After this period, 01mL was transfered, individually, to 5mL of brain-heart infusion, followed by a new incubation period in the same conditions. Microbial contamination was evaluated using the UV spectrophotometer. For scanning electron microscopy evaluation, images were acquired at 50x, 1500x and 5000x magnification to detect the presence or absence of contamination. The presence of Enterococcus faecalis was detected in the materials both by analyzing the optical density of cultures of 07 and 30 days, and by analyzing the surfaces determined by the scanning electron microscopy images.
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LISTA DE SÍMBULOS E ABREVIATURAS
% Porcento
< Menor
® Marca Registrada
ANOVA Análise de Variância
BA Bioagregado
DP Desvio padrão
et al. e colaboradores
LabMic Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução
mµ Micrômetro
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
min Minutos
mL Mililitro
Mm Milímetro
MTA Mineral Trixide Aggregate
nº Número de amostras
° Graus
ºC Grau Celsius
p Nível de significância RRM Root Repair Material
SP São Paulo
™ Trademark (marca registrada) UFG Universidade de Goiás
UNIC Universidade de Cuiabá
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição das amostras experimentais de acordo com os
materiais estudados, sua composição e número de amostras por grupo... 30
Tabela 2. Distribuição dos grupos experimentais e modelos de estudos... 33 Tabela 3. Distribuição de scores de acordo com a presença de contaminação
sobre a superfície dos materiais avaliados... 35
Tabela 4. Análise estatística da contaminação da superfície de cimentos
biocerâmicos em 7 dias e 30 dias na avaliação por densidade óptica... 36 Tabela 5. Frequência dos scores nos grupos... 37
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Preparo dos espécimes... 29 Figura 2. Inserção do material avaliado nas cavidades... 31 Figura 3. Contaminação bacteriana na superfície dos materiais
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 14
2. REVISÃO DE LITERATURA... 16
2.1. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS, QUÍMICAS E BIOLÓGICAS... 17
2.2. CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS... 23 3. HIPÓTESE... 27 4. OBJETIVO... 28 4.1. OBJETIVO GERAL... 28 4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 28 5. MATERIAL E MÉTODO... 29 5.1. ANÁLISE ESTATÍSTICA... 35 6. RESULTADOS... 36 7. DISCUSSÃO... 38 8. CONCLUSÃO... 41 REFERÊNCIAS... 42
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1. INTRODUÇÃO
O sucesso do tratamento endodôntico é alcançado após a realização cuidadosa de várias etapas que se sucedem umas às outras e que são interdependentes, com o objetivo de reduzir os microrganismos do sistema de canais radiculares, ou reduzi-los a níveis insignificantes. Sanificação dos canais radiculares é alcançar por meio alcançado pelo emprego da ação mecânica do instrumento associada à solução irrigadora e da medicação intracanal, ambas com efeito antimicrobiano (ESTRELA et al., 2014; HOLLAND et al., 2017).
A etapa da obturação visa o preenchimento é a obturação, ou seja, o preenchimento do espaço radicular por meio do emprego do cimento endodôntico associado a guta-percha de maneira a permitir o selamento hermético, e impedir a recolonização bacteriana e estimular o processo de reparo na região apical (MANN et al., 2007). Mesmo quando realizadas todas as etapas corretamente, podem permanecer ainda no sistema de canais radiculares microrganismos residuais, que sobreviveram ao preparo químico-mecânico. Estes microrganismos constituem um potencial para o fracasso do tratamento endodôntico a longo prazo, enfatizando a necessidade de se optar por um material obturador que também apresente efeito antimicrobiano (LUCKMANN et al., 2013).
A escolha de um material para a obturação do sistema de canais radiculares deve levar em consideração algumas características, como fluidez, capacidade de preencher a totalidade do sistema de canais radiculares, biocompatibilidade, efeito antimicrobiano, radiopacidade, estabilidade dimensional, além de prevenir o manchamento dentário (BEATRICE et al., 2009).
Vários materiais obturadores têm sido propostos como o objetivo de promover um selamento adequado do canal radicular. Entre estes destaca-se o MTA, um cimento constituído de partículas hidrófilas a base de silicato tricálcico, silicato dicálcio, aluminato tricálcio e óxido de cálcio (TORABINEJAD et al., 1993; CAMILIERI et al., 2005), possuindo características químicas similares ao Cimento Portland (WUCHERPFINING e GREEN, 1999).
Os biocerâmicos são materiais cerâmicos resultantes da combinação entre silicatos de cálcio e fosfatos de cálcio, acrescidos de partículas de alumina, zircônio e vidros bioativos. Alguns estudos relataram que estes materiais apresentam
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propriedades físico-químicas e biológicas satisfatórias (LOUSHINE et al., 2011; CANDEIRO et al., 2012; WANNES, SEYAM e EL-SAMMAN, 2012; ALMEIDA et al., 2017; DUARTE et al., 2018).
Considerando o objetivo de se reduzir ao máximo, a quantidade de microrganismos presentes no canal radicular, é necessário conhecer as características dos materiais obturadores atualmente empregados dentre os quais se destacam, os cimentos biocerâmicos.
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2. REVISÃO DA LITERATURA
O tratamento de canais radiculares envolve várias etapas que merecem cuidadosa execução para se alcançar o sucesso. O processo de esvaziamento, sanificação e modelagem é essencial dentro deste contexto, contudo, o apropriado selamento do sistema de canais radiculares e coronário é determinante ao reparo tecidual. Um dos papéis da obturação é impedir a invasão microbiana e a colonização do canal radicular, por meio do efeito antimicrobiano alcançado durante o preparo químico-mecânico e a obturação do canal radicular, impedindo a disseminação de microrganismos para os tecidos vizinhos. Todo espaço da cavidade pulpar que foi submetido ao processo de sanificação e modelagem deve ser completamente obturado(ESTRELA et al., 2009).
Um material restaurador endodôntico deve apresentar algumas características físicas como vedação, estabilidade dimensional, estabilidade de cor, radiopacidade, insolubilidade em contato com fluidos, fluidez, fácil inserção, biocompatibilidade e efeito antimicrobiano (DUARTE et al., 2018).
Estrela et al. (2018) descreveram as características de materiais com potencial antibacteriano para o controle de infecções do sistema radicular e capazes de promover a cicatrização por deposição de tecidos mineralizados. Os autores relataram que para se recomendar um material para o tratamento de perfurações do canal radicular, este deve apresentar boas propriedades físico-químicas e biológicas, capacidade adequada de selamento, atividade antimicrobiana e potencial osteogênico. Neste sentido, vários materiais obturadores têm sido atualmente propostos e discutidos na endodontia, como o MTA, Cimento Portland e cimentos biocerâmicos (GROSSMAN,1958; ORSTAVIK, 2005; GOMES-FILHO et al., 2007; ESTRELA et al., 2009; DUARTE et al., 2018; ESTRELA et al.,2018).
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2.1. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS, QUÍMICAS E BIOLÓGICAS
2.1.1. Cimento Portland
O Cimento Portland não foi originalmente destinado a ser utilizado na cavidade bucal. Funteas et al. (2003) avaliaram este material e puderam concluir que não há diferença significativa entre os elementos no MTA e Cimento Portland.
O Cimento Portland possui vários constituintes, sendo os principais o silicato tricálcico (3CaO.SiO2), silicato dicálcico (2CaO.SiO2), aluminato tricálcico (3CaO.Al2O3), aluminoferrito tetracálcico (4CaO.Al2O3.Fe2O3), cálcio hidratado CaO.SO3.2H2O), óxidos alcalinos e outros constituintes. Vários autores relataram que a constituição básica dos Cimentos Portland é a mesma, com algumas poucas diferenças relativas ao fabricante e à localização da fonte de extração mineral (VAN VLACK, 1973; WEIDMANN et al., 1994). Considerando a similaridade ao MTA na composição química, o MTA e o Cimento Portland são compostos de silicato tricálcico e dicálcico, alguns autores relataram que quando hidratados produzem gel hidratado de silicato de cálcio e hidróxido e cálcio (ESTRELA et al; 2000a; CAMILLERI et al, 2005).
Wucherpfening e Green (1999) relataram que o Cimento Portland e MTA apresentaram características idênticas, macroscopicamente e microscopicamente. Ambos os materiais, MTA e Cimento Portland estão disponíveis nas formulações branca e cinza, de acordo com a presença de óxido de ferro (CAMILERI et al., 2005; ASGARY et al., 2005; ISLAM et al., 2006).
Holland et al. (2001a) observaram a reação do tecido subcutâneo de ratos a tubos de dentina preenchidos com MTA, Cimento Portland e hidróxido de cálcio. Os autores verificaram semelhança nos mecanismos de ação dos materiais estudados. Em outro estudo, Holland et al. (2001b) avaliaram o comportamento da polpa dentária de cães após a pulpotomia e a proteção direta da polpa com esses materiais. Após a pulpotomia em dentes de cães, o remanecente pulpar foi protegido com MTA ou Cimento Portland. A análise histomorfológica mostrou uma ponte tubular completa de
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tecido duro em quase todas as amostras. O cimento MTA e Portland apresentaram resultados semelhantes quando usado para proteção direta da polpa após pulpotomia. A semelhança química entre MTA e Cimento Portland foi bastante investigada. Ambos os materiais apresentam componentes semelhantes, exceto pela presença de óxido de bismuto no MTA (CAMILERI et al., 2005; ESTRELA et al., 2012). Além disso, MTA e Cimento Portland mostraram atividade antimicrobiana semelhante (ESTRELA et al., 2000), biocompatibilidade (CAMILLERI et al., 2005), capacidade de vedação (LEE, MONSEF e TORABINEJAD,1993; TORABINEJAD et al., 1995a), adaptação marginal (PEREIRA et al., 2004) e estabilidade dimensional (DUARTE et al., 2003), além de estimularem a cicatrização do tecido perirradicular e a formação da barreira dentinária (BRISO et al., 2006).
Cutajar et al. (2011) avaliaram os resultados na radiopacidade e propriedades físicas do Cimento Portland quando da adição do óxido de zircônio e os resultados demonstraram um material com propriedades comparáveis ao agregado de trióxido mineral.
O Cimento Portland, assim como o MTA, é disponibilizado nas formulações branca e cinza, dependendo da presença de carbonatos, que são adicionados com a função de melhorar a resistência, o Cimento Portland branco pode ainda ser classificado como formulações estruturais e não estruturais (CAMILLERI et al., 2005; ASGARY et al., 2005; ISLAN et al., 2006; BORGES et al., 2017).
2.1.2. Agregado Trióxido Mineral (MTA)
A busca de associar a um mesmo material diferentes propriedades desejáveis (propriedades físico-químicas e biológicas) têm entusiasmado muitos estudos (TORABINEJAD,1995; LOUSHINE et al.,2011; DUARTE et al., 2018; ESTRELA et al., 2018). Depois de várias propostas e estudos em direção ao encontro de um cimento que conquistasse a maioria das propriedades desejáveisfoi proposto o Agregado Trióxido Mineral (MTA) (LEE, MONSEF e TORABINEJAD, 1993; TORABINEJAD, WATSON e PITT-FORD, 1993; TORABINEJAD et al 1995; CAMILLERI et al., 2005; ORSTAVIK, 2005). Este material é constituído de partículas hidrofílicas à base de
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silicato tricálcico, silicato dicálcico, aluminato tricálcico e óxido de cálcio(CAMILLERI et al., 2005).
Holland et al. (1999) observaram resultados biológicos semelhantes entre o Agregado de Trióxido Mineral (MTA) e o hidróxido de cálcio. Os mecanismos de ação destas substâncias mostram-se similares valendo-se de implante destes materiais em subcutâneo de ratos.
O MTA é composto principalmente de Cimento Portland adicionado com óxido de bismuto como agente radiopacificador (TORABINEJAD et al., 1995). Estudos analisaram o efeito do acréscimo do óxido de bismuto e não observaram alteração na resistência à compressão (SALIBA et al., 2009; CAMILLERI, 2010a), porém, outros afirmaram que porcentagens crescentes de óxido de bismuto afetam negativamente a resistência do material (COOMARASWAMY et al., 2007).
Baseado nestes resultados foram realizados estudos para se adicionar outros radiopacificadores que não alterassem as características o MTA, como o óxido de zircônio. O óxido de zircônio foi inicialmente utilizado como um biomaterial para uso em quadril ou outros implantes articulares em cirurgias ortopédicas, alta densidade e boa resistência ao desgaste, mas também é usado como radiopacificante em cimentos de ionômero de vidro (McCABE e WALLS, 2003) e na proporção 1:4 com o Cimento Portland resultou em radiopacidade adequada (DUARTE et al., 2009; CAMILLERI, 2010b).
Na sua primeira formulação do MTA apresentava colocação cinza, fato que limitou sua aplicação em dentes anteriores (BORTOLUZZI et al., 2007). Para resolver esta limitação, foi introduzido no mercado o MTA branco, com o objetivo de eliminar a descoloração dos dentes (PARIROKH e TORABINEJAD, 2010).
O MTA branco apresenta em sua composição o silicato dicálcico e tricálcico e 20% de óxido de bismuto. Entretanto, alguns estudos demonstram que a alteração da cor do material não resolveu a questão da descoloração da estrutura dentária (BELOBROV et al., 2011; FELMAN e PARASHOS, 2013; MARCIANO et al., 2014).
Pode-se verificar a existência de várias formas comerciais de MTA para emprego na endodontia. Entre estas formas comerciais pode-se citar o ProRoot MTA (Dentsply Tulsa Dental, Tulsa, OK, EUA), composto por 50-65% de óxido de cálcio e 15-25% em dióxido de silício (CAMILERI et al., 2005; DAMMASCHKE et al., 2005); o MTA Bio (Angelus Indústria de Produtos Odontológicos Ltda, Londrina, PR, Brasil)
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apresenta em sua composição 80% de Cimento Portland e 20% de óxido de bismuto (DUARTE et al., 2003; SONG et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2007; ESTRELA et al., 2012).
De acordo com Moretti et al. (2008) este material tem a capacidade de manter a vitalidade pulpar e promover a cicatrização quando em contato com polpa dentária ou tecido perirradicular. O efeito do MTA como agente de capeamento também pode ser observado nos canais radiculares, onde ocorre uma deposição ativa do tecido mineralizado e um estreitamento ou obliteração do canal, de forma similar ao hidróxido de cálcio, em que os íons cálcio reagem com o dióxido de carbono presente nos tecidos, produzindo grânulos de calcita e resultando na formação de tecido mineralizado (CASAGRANDE, RODE e MARQUES, 2005).
O MTA apresenta propriedades físicas, químicas e biológicas satisfatórias, tendo como destaque a capacidade de selamento e a tolerância tecidual (TORABINEJAD e PARIROKH, 2010). Dentre as indicações para aplicação clínica encontram-se o tratamento de perfurações, reabsorções radiculares, apicificação, capeamento pulpar, pulpotomia e obturação do canal radicular(CAMILLERI e PITT-FORD, 2006; LIU, WANG e DONG, 2015; BOSSO–MARTELLO et al., 2016). O MTA é um material dinâmico e sua interação com tecidos e fluidos é constante (CAMILLERI et al., 2011). Quando hidratado ele libera íons cálcio (DUARTE, 2003; CAMILLERI et al., 2008).
Prati e GANDOLFI (2015) relataram que o MTA requer umidade para o endurecimento e é capaz de proporcionar uma superfície bioativa adequadas com arquitetura apropriada devido à nucleação de fosfatos de cálcio e a formação de uma apatita.
Apesar das inúmeras vantagens apresentadas pelo MTA, pode-se observar relatos de alguns problemas, tais como o longo tempo de endurecimento, difícil manuseio, dificuldade na remoção após o endurecimento, presença de alguns elementos tóxicos na composição do material e alto custo (KRATCHMAN, 2004; CAMILLERI et al., 2005).
Costa et al. (2018) avaliaram as propriedades físico-químicas, citotoxicidade e bioatividade do MTA Angelus® (MTA), cimento à base de silicato de cálcio (CSC) e CSC com 30% de óxido de itérbio (CSC/Yb2O3). Os autores verificaram que o Yb2O3
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era substância não afetou as propriedades físico-químicas e biológicas, além de preservar o potencial bioativo desse material.
Algumas características do MTA têm induzido novos estudos, como a possibilidade de alteração da coloração da estrutura dentária, mesmo sabendo que este material não é indicado para uso em regiões estéticas, o tempo de trabalho e seu manuseio (TORABINEJAD e PARIROKH, 2010; KOHLI et al., 2015; BOSSO-MARTELO, 2016; MARCIANO et al., 2016; MARCIANO et al., 2017; DUARTE et al, 2012; DUARTE et al, 2018). A partir destes inconvenientes, novos materiais estão sendo desenvolvidos, como novas formulações que tentam aprimorar as características do MTA.
2.1.3. Biocerâmicos
Novos produtos contendo compostos de silicatos de cálcio e fosfatos de cálcio, que têm sido denominados de biocerâmicos foram propostos na endodontia recentemente(DAMAS et al., 2011). Estes materiais cerâmicos são resultantes da combinação entre silicatos de cálcio e fosfatos de cálcio, além de partículas de alumina, zircônio e vidros bioativos(KOCH e BRAVE, 2009; SHINBORI et al., 2015).
O nome biocerâmico tem sido designado devido as propriedades biológicas. A alumina e a zircônio têm sido consideradas cerâmicas bioinertes(AL-HADDAD e CHEAB AZIZ, 2016). Dentre estes estão os vidros bioativos, as vitro-cerâmicas e os fosfatos de cálcio, compõe as cerâmicas bioativas, como por exemplo, a hidroxiapatita representa o componente majoritário da fase mineral dos ossos e dentes humanos (ORÉFICE, PEREIRA e MANSURM, 2006).
O vidro bioativo ou bioactive glass (BAG) é um material nanoparticulado, à base de SiO2, Na2O, CaO2 e P2O5 que apresenta potencial osteoindutor e
propriedades antibacterianas (SHRESTHA e KISHEN, 2016; TELLES e PRADON SIMÃO, 2017). Este material permite a liberação de íons Na+ e Ca2+ do vidro, e a
incorporação de prótons H3O+ no vidro elevam o pH do ambiente tornando-o
inadequado a diferentes microrganismos (ZEHNDER et al., 2004, 2006, 2007; WALTIMO et al., 2007).
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Diferentes propriedades dos biocerâmicos tem sido estudadas, incluindo capacidade de selamento, radiopacidade, tolerância tecidual, alteração dimensional em ambiente tecidual(KOCH e BRAVE, 2009; ZHANG, PAPPEN e HAAPASALO, 2009; LOUSHINE et al, 2011; CANDEIRO et al, 2012; LIU, WANG e DONG, 2015; WANG, 2015; LV et al., 2017).
Vários estudos relataram que os cimentos biocerâmicos apresentam propriedades físico-químicas e biológicas satisfatórias, e seus componentes químicos são responsáveis pelas qualidades de suas propriedades, como as características antibacterianas (LOUSHINE et al., 2011; CANDEIRO et al., 2012; WANNES, SEYAM e EL-SAMMAN, 2012; ALMEIDA et al., 2017; DUARTE et al., 2018).
Alguns estudos têm reportado o Biodentine® como substituto da dentina e com
indicações endodônticas semelhantes às do MTA(ZANINI et al., 2012; CAMILLERI, SORRENTINO e DAMIDOT, 2013). Outros estudos mostraram que o Biodentine® estimula a diferenciação celular e promove a mineralização nas células pulpares humanas (NARAYAN et al., 2006; JI et al., 2010).
Attick et al. (2014) estudaram a biocompatibilidade do Biomedine® e MTA
sobre células humanas de osteoblastos e verificaram que o Biomedine®,
comportou-se de maneira comportou-semelhante ao MTA em termos de rugosidade da superfície, citotoxidade e fixação celular. O conhecimento das composições químicas e das características de superfícies dos cimentos biocerâmicos podem favorecer determinadas propriedadescomo a agregação de células que interferem no processo de reparação tecidual(MILLER et al., 2018) bem como de bactérias que favorecem a formação de biofilme bacteriano.
Araújo et al. (2017) avaliaram o efeito do MTA, hidróxido de cálcio e Biodentine® nas células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos in vitro. Os
autores verificaram que os materiais avaliados são biocompatíveis e mantêm a viabilidade e estimulam a proliferação, migração e diferenciação em uma população chave de células-tronco dentárias.
Almeida et al. (2017) por meio de uma revisão sistemática, compararam as propriedades físico-químicas e biológicas de cimentos endodônticos biocerâmicos com cimentos endodônticos convencionais. Considerando as propriedades analisadas encontraram-se resistência adesiva à dentina, radiopacidade, pH, liberação de íons, solubilidade, tempo de trabalho e de presa, alteração dimensional,
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escoamento, citotoxicidade, biocompatibilidade e atividade antimicrobiana. Os resultados mostraram que os cimentos biocerâmicos apresentaram boas propriedades físico-químicas e biológicas, semelhantes ou melhores que os cimentos convencionais.
Rajasekharam et al. (2018) relataram que o Biodentine® não apresenta, em
sua composição, o silicato dicálcico. Dentre as características deste material pode-se citar: tempo de presa variando entre 6 e 30 min, radiopacidade menor que outros cimentos à base de silicato tricálcico; maior resistência à compressão superior, microdureza, flexão, força, capacidade de vedação, força de ligação push-out e liberação de íons cálcio em comparação com outros à base de silicato tricálcico.
2.2. CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS
As infecções endodônticas são polimicrobianas com mais de 150 espécies de bactérias responsáveis pela infecção primária ou persistente. O Enterococcus faecalis é uma espécie comumente isolada no sistema de canais radiculares e que pode desempenhar um importante papel nas infecções endodônticas persistentes (ZHANG, PAPPEN e HAAPASALO, 2009).
O E. faecalis é um coco anaeróbio facultativo Gram-positivo, presente em canais radiculares tratados e com patologia periapical (SIREN et al.,1997; MOLANDER et al., 1998; SUNDQVIST et al., 1998; LOVE, 2001; PORTENIER, WALTINO e HAAPASALO, 2003). É um microrganismo que apresenta capacidade de sobreviver em condições de elevado pH (NAIR et al., 1990; MOLANDER et al.,1998; SUNDQVIST et al., 1998; LOVE, 2001; SIQUEIRA, 2001; SIQUEIRA e RÔÇAS, 2004), é capaz de aderir às células do hospedeiro e de expressar proteínas que permitem a competição com outras células bacterianas (STUART et al., 2006).
Estudos relatam uma prevalência de E. faecalis até 77% em dentes com falha no tratamento endodôntico (HANCOCK et al., 2001; STUART et al., 2006). Desta forma, o emprego de um material com atividade antimicrobiana é considerado vantajoso no esforço de reduzir os microrganismos remanescentes, prevenir infecções
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recorrentes no canal radicular e auxiliar na cicatrização de tecidos periapicais (ZHANG, PAPPEN e HAAPASALO, 2009).
Estrela et al. (2000) estudaram a ação antimicrobiana e química do MTA, Cimento Portland, pasta de hidróxido de cálcio, Sealapex e Dycal. A atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio foi superior a todas as outras substâncias, sobre todos os microrganismos testados. O Cimento Portland contém os mesmos elementos químicos que o MTA, com a exceção que o MTA também apresenta, na sua constituição. Os autores relataram a necessidade de mais estudo relativos ao MTA, Cimento Portland e hidróxido de cálcio, uma vez que há semelhanças nos mecanismos de ação destas substâncias (HOLLAND et al., 1999).
Al-Nazham e Al-Judai (2003) estudaram, in vitro, a atividade antifúngica do MTA e puderam verificar que, mediante a metodologia empregada, o MTA apresentou efeito antifúngico sobre a C. albicans.
Tanomaru-Filho et al. (2007) avaliaram a atividade antimicrobiana do Sealer 26, Sealapex associado a óxido de zinco, cimento de óxido de zinco e eugenol, Cimento Portland cinza e branco, MTA Angelus® cinza e branco e Pro Root MTA cinza, utilizando o teste de difusão em ágar sobre Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e Enterococcus faecalis. Os autores concluíram que todos os materiais testados apresentaram atividade antimicrobiana sobre todos os microrganismos utilizados no estudo.
A atividade antimicrobiana dos biocerâmicos tem sido bastante relatada. Estudos in vitro onde revelaram a capacidade de controle microbiano da biocerâmica, uma propriedade relacionada à alcalinização do meio devido à liberação de íons hidroxila e sua difusão através da dentina (ZHANG, PAPPEN e HAAPASALO, 2009; LOVATO e Sedgley, 2011).
Zhang, Pappen e Haapasalo (2009) estudaram a eficácia antimicrobiana de bioagregado (BA) e agregado de trióxido mineral (MTA) sobre Enterococcus faecalis e verificaram que houve redução da viabilidade bacteriana.
Lovato e Sedgley (2011) analisaram a atividade antimicrobiana do MTA e Endosequence sobre o E. faecalis e concluíram a atividade antibacteriana foi similar para estes materiais.
Samiei et al. (2013) avaliaram a ação antimicrobiana do MTA branco e da mistura de MTA com nanopartículas de prata. Os resultados mostraram que a adição
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de nanopartículas prata ao material possibilitou melhora na atividade antimicrobiana sobre E. faecalis, C. albicans e P. aeruginosa.
Kim et al. (2015) avaliaram a ação antibacteriana de três MTA (MTA Angelus®, Endocem MTA e ProRoot MTA) sobre bactérias da cavidade bucal empregando testes de difusão em disco. Os autores concluíram que MTA Angelus® e Endocem MTA foram mais eficazes que o E. faecalis foi o microrganismo mais resistente.
Singh et al. (2016) comparam a atividade antibacteriana do EndoSequence BC Sealer, um biocerâmico; do cimento resinoso MM Sealer; do Endoseal, um cimento à base de óxido de zinco e eugenol; do ProRoot White MTA e MM - MTA sobre o E. faecalis. Os autores verificaram que a atividade antibacteriana foi similar para todos os materiais avaliados.
Monajemzadeh et al. (2017) avaliaram a eficácia antimicrobiana de três selantes endodônticos com diferentes composições químicas, como resina AH 26), óxido de zinco eugenol (ZOE) e MTA, sobre Candida albicans, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans e Lactobacillus casei. Fio verificado que o AH 26 apresentou a maior atividade antibacteriana, enquanto o MTA apresentou a menor.
Farrugia et al. (2017) analisaram se as propriedades antimicrobianas dos cimentos à base de Cimento Portland, como o agregado de trióxido mineral são afetadas pelo contato com o sangue presente em situações clínicas. De acordo com os resultados, o MTA, em contato com o sangue, exibiu descoloração e atividade antimicrobiana reduzida causada pela biomineralização do MTA na presença de fosfatos no sangue. Os autores concluíram que são necessários mais estudos em condições próximas da situação clínica de forma a garantir o desempenho clínico a longo prazo do MTA e sua atividade antimicrobiana a longo prazo.
Rajasekharam et al. (2018) verificaram que a atividade antimicrobiana de Biodentine® foi significativamente mais alta sobre cepas como Streptococcus sanguis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli e Candida albicans, enquanto a atividade antibacteriana significativamente menor observados sobre o Streptococcus mutans e Streptococcus salivarius.
Considerando a necessidade de se conhecer o potencial antimicrobiano dos diferentes materiais empregados no tratamento endodôntico, este estudo visa analisar
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a contaminação da superfície do MTA, Biodentine® e Cimento Portland por Enterococcus faecalis.
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3. HIPÓTESE
A hipótese a ser testada é a de que materiais obturadores apresentam ação antimicrobiana e não permitem o crescimento de microrganismos em suas superfícies.
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4. OBJETIVO
3.1. OBJETIVO GERAL
Analisar a contaminação bacteriana na superfície de diferentes cimentos biocerâmicos.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar se houve o crescimento bacteriano na superfície de diferentes cimentos biocerâmicos, MTA Angelus®, Biodentine® e Cimento Portland em
períodos de 7 e 30 dias, através do espectrofotômetro UV;
2. Analisar a presença ou ausência de contaminação por E. faecalis nas superfícies dos cimentos por meio de imagens de microscopia eletrônica de varredura.
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5. MATERIAL E MÉTODO
No presente estudo foram utilizadas duzentas cavidades preparadas em 20 incisivos bovinos com rizogênese completa, de procedência conhecida (Matadouro Mondelli, Bauru, SP, Brasil). Os dentes foram limpos com curetas periodontais, submetidos à profilaxia, e armazenados em timol 0,1%. Os dentes foram radiografados para se verificar o grau de normalidade entre as amostras. Aqueles dentes que apresentavam calcificações, reabsorções internas ou externas, ou outras alterações de desenvolvimento foram excluídos. As coroas dos dentes foram seccionadas. O segmento radicular foi seccionado paralelamente ao longo eixo radicular, com o emprego de disco diamantado de dupla face (4” x 0,12 x 0,12, Extec, Enfield, CT, EUA) montado em micrótomo de tecido duro (Isomet 1000, Buehler Ltda., Bluff, IL, EUA) sob refrigeração com água (Figura 1).
Figura 1. Preparo dos espécimes.
Com o subsídio de uma broca cilíndrica reta no 1094 (KG- Sorensen, São
Paulo, SP, Brasil) montada em alta rotação (Dabi Atlante, Ribeirão Preto, SP, Brasil) com refrigeração de jato de água foram confeccionados em cada secção dos dentes cinco cavidades de largura similar à profundidade de 2,0mm, equidistantes 3mm uma da outra. As medidas dos cilindros de dentina foram determinadas por meio de paquímetro digital (Mitutoyo, Suzano, SP, Brasil). Posterior ao preparo, os orifícios em dentina foram limpos com água destilada, mantidos em EDTA a 17% (pH 7,2) (Fitofarma, Goiânia, GO, Brasil) para remoção da smear layer por 5 minutos. A seguir, todos os blocos de dentina bovina foram autoclavados por 30 minutos a 120˚C.
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Neste experimento foram estudados os seguintes cimentos: 1. MTA Angelus®
(Angelus, Londrina, PR, Brasil; silicato tricálcico, silicato dicálcico, aluminato tricálcico, óxido de cálcio, óxido de bismuto; n=40); 2. Biodentine® (Septodont, Saint-Maur-des
Fosses, França; Silicato tricálcico, silicato dicálcico, carbonato de cálcio, óxido de cálcio, óxido de ferro e óxido de zircônio; n=40); 3. Cimento Portland (Cia. Cimento Portland Itaú, Itaú de Minas, MG, Brasil; óxido de cálcio, dióxido de silício, óxido de alumínio, óxido de magnésio, trióxido de enxofre, óxido de ferro, óxido de potássio e óxido de sódio; n=40). Os grupos 4 e 5, respectivamente, servirão como grupos controle positivo e negativo (Tabela 1).
Tabela 1. Distribuição das amostras experimentais de acordo com os materiais
biocerâmicos empregados, sua composição e número de amostras por grupo.
GRUPOS MATERIAIS ESPECIFICAÇÕES DO FABRICANTE
Grupo 1
MTA Angelus®
(Angelus, Londrina, PR, Brasil; silicato tricálcico, silicato dicálcico, aluminato tricálcico, óxido de cálcio, óxido de bismuto)
Grupo 2
Biodentine®
(Septodont, Saint-Maur-des Fosses, França; silicato tricálcico, silicato dicálcico, carbonato de cálcio, óxido de cálcio, óxido de ferro e óxido de zircônio)
Grupo 3
Cimento Portland
(Cia. Cimento Portland Itaú, Itaú de Minas, MG, Brasil; óxido de cálcio, dióxido de silício, óxido de alumínio, óxido de magnésio, trióxido de enxofre, óxido de ferro, óxido de potássio e óxido de sódio)
Grupo 4 Controle positivo Cavidades preparadas e contaminadas
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Os materiais foram manipulados de acordo com as especificações dos respectivos fabricantes, com exceção do Cimento Portland. A este material foi acrescida água destilada esterilizada até se obter a consistência da pasta de hidróxido de cálcio, ou seja, consistência de pasta de dente. O MTA Angelus® foi proporcionado em uma placa de vidro na medida de 1 dose de pó (pá dosadora) e 1 gota de água destilada, e manipulado por 30 segundos. O pó do cimento Biodentine® é acondicionado em uma cápsula que foi cuidadosamente aberta, sendo aplicadas 5 gotas de água destilada em seu interior. A seguir, a cápsula foi fechada, levada a um amalgamador digital (Astronmix, Dabi Atlante, Ribeirão Preto, SP, Brasil) e agitada por 30 segundos. O Cimento Portland foi manipulado com água destilada na proporção de água-cimento 1:3 (ESTRELA et al., 2012).
Após a manipulação, os materiais avaliados foram inseridos nas cavidades com o auxílio de espátula flexível Hollenback (Duflex - SS White, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e condensador vertical tipo Paiva (Duflex - SS White, Rio de Janeiro, RJ, Brasil), preenchendo completamente todas as cavidades (Figura 2). Os espécimes foram mantidos em estufa (ECB 1.3, OdontoBrás, Ribeirão Preto, SP, Brasil), a temperatura de 37ºC com umidade relativa de 95%, onde permaneceram por 48 horas. Após este período, os espécimes foram mantidos durante 30 minutos em solução de hipoclorito de sódio a 5% (Longevitá, Goiânia, GO, Brasil) durante 30 minutos e, em seguida, lavados em água destilada esterilizada.
Figura 2. Inserção do
material avaliado nas cavidades.
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Os espécimes foram colocados em tubos de ensaio contendo 5mL de Brain Heart Infusion (BHI; Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA). Para assegurar a esterilização, o aparato foi incubado a 37oC por 24 horas e não foi observado crescimento bacteriano. Nos grupos controle negativo e positivo os espécimes foram submetidos ao mesmo protocolo, exceto por não serem inseridos materiais nas cavidades.
Para a contaminação dos espécimes e desenvolvimento de biofilmes, cinco mililitros de infusão cérebro coração (BHI; Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA) esterilizado foram misturados com 5mL de uma cepa padrão de Enterococcus faecalis (ATCC 29212) obtida da American Type Culture Collection. A cepa bacteriana foi incubada a 37˚C por 24 horas. As suspensões experimentais foram preparadas pelo cultivo do marcador biológico na superfície do ágar infusão cérebro coração (BHI; Difco Laboratories), seguindo as mesmas condições de incubação. As células bacterianas foram resuspensas em solução salina em uma concentração final de aproximadamente 3X108 células/mL, ajustada para o padrão turbidade 1 de
McFarland.
Posterior ao preparo das suspensões bacterianas, as 200 cavidades constituintes dos cinco grupos experimentais, foram inoculados com 0,1mL de suspensão de E. faecalis ajustada para o padrão turbidade 1 de McFarland, nos períodos experimentais de 7 e 30 dias. Este procedimento foi repetido a cada 72 horas, sempre utilizando cultura pura com 24 horas de preparo e ajustada ao padrão 1 de McFarland (Tabela 2).
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Tabela 2. Distribuição dos grupos experimentais e modelos de estudos.
GRUPOS/TEMPO/MODELO MEV 7 dias MEV 30 dias Cultura 7 dias Cultura 30 dias MTA Angelus® 10 10 10 10 Biodentine® 10 10 10 10 Cimento Portland 10 10 10 10 Amostras mantidas em meio de cultura com contaminação (controle
positivo)
10 10 10 10
Amostras mantidas em meio de cultura sem contaminação (esterilizado
– controle negativo)
10 10 10 10
No grupo controle negativo (n=40), os espécimes foram mantidos em tubos de ensaio com 5mL de infusão cérebro coração e sem o acréscimo do inóculo bacteriano durante todo o período experimental, incubados a 37˚C por 48 horas. No grupo controle positivo (n=40), os espécimes foram mantidos em tubos de ensaio com 5mL de infusão cérebro coração (BHI; Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA) e com o acréscimo de 0,1mL de inóculo bacteriano durante todo o período experimental, incubados a 37˚C por 48 horas. Toda a técnica foi cuidadosamente desenvolvida seguindo rigorosamente os princípios assépticos.
Nos períodos de 7 e 30 dias de contaminação, o material avaliado foi removido das cavidades com o emprego de espátula flexível Hollenback (Duflex - SS White, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e condensador vertical tipo Paiva (Duflex - SS White, Rio de Janeiro, RJ, Brasil), e individualmente imersos em 7mL de Letheen Broth (LB; Difco Laboratories), seguido pela incubação a 37˚C por 48 horas. Como foi observada alteração da coloração do meio de cultura em função da liberação de bismuto, presente no MTA, após este período foi removida uma amostra de 0,1mL do meios de cultura que continham os materiais avaliados e transferidos individualmente para 5mL de infusão cérebro coração, seguido de novo período de incubação a 37˚C por 48 horas. Após 48 horas foi realizada a avaliação visual e avaliação da densidade ótica
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de cada amostra coletada por meio do espectrofotômetro UV (Spectrophotometer Model Nova 1600 UV, Piracicaba, SP, Brasil) ajustado em comprimento de onda de λ=600 nm (nanômetros), correspondente à absorbância de 0,137 nm.
Para avaliação em microscopia eletrônica de varredura, os espécimes foram fixados em solução tamponada de formalina por uma semana e posteriormente desidratadas em álcool 70%, 96%, e 99%, em imersões de 30 minutos em cada, em ordem crescente de concentração, sendo que a solução foi renovada a cada 10 min. As amostras foram analisadas no Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução (LabMic) da Universidade Federal de Goiás. As amostras foram codificadas e fixadas em fita adesiva de carbono sobre porta amostras de alumínio e recobertas com ouro. As fotomicrografias foram obtidas no microscópio eletrônico de varredura - MEV (JSM-IT300, JEOL Ltda., Fukuoka, Japão) para as análises. A área total do material estudado de cada espécime foi dividida em quatro quadrantes. As áreas A, B, C e D foram analisadas com aumento de 50x, 1500x e 5000x para detectar a presença ou ausência de contaminação usando os seguintes scores: 1 - todas as áreas da superfície do material sem a presença do E. faecalis colonizando a superfície (4 quadrantes); 2 – Apenas 1 quadrante coberto por E. faecalis na superfície do material; 3 – 02 quadrantes coberto por E. faecalis colonizando a superfície do material; 4 – 03 quadrantes coberto por E. faecalis colonizando a superfície do material; 5 – todas as áreas cobertas por E. faecalis (4 quadrantes) (Tabela 3).
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Tabela 3. Distribuição de scores de acordo com a presença de contaminação sobre a
superfície dos materiais biocerâmicos empregados.
CATEGORIAS DESCRIÇÃO
Score 1 Todas as áreas da superfície do material isentas de
contaminação (4 quadrantes)
Score 2 O equivalente a 1 quadrante coberto por E. faecalis colonizando
a superfície do material
Score 3 O equivalente a 2 quadrantes coberto por E. faecalis
colonizando a superfície do material
Score 4 O equivalente a 3 quadrantes coberto por E. faecalis
colonizando a superfície do material
Score 5 Todas as áreas cobertas por E. faecalis (4 quadrantes)
Fonte: (OLIVEIRA et al. 2013; RENOVATO, 2018).
5.1. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores foram tabulados em uma planilha do Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA) para análise estatística. Os dados foram descritos como mediana, valores mínimos e máximos e comparados pela ANOVA e teste Tukey, com nível de significância estabelecido em 5%.
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6. RESULTADOS
Em cada grupo, para a comparação da contaminação da superfície foi empregada a análise de variância e o teste de Tukey.
Os resultados da contaminação da superfície de cimentos biocerâmicos por Enterococcus faecalis são apresentados na Tabela 4.
Tabela 4. Análise estatística da contaminação da superfície de cimentos biocerâmicos
em 7 dias e 30 dias na avaliação por densidade óptica.
GRUPOS
PERÍODO DE AVALIAÇÃO
VALOR DE p
7 dias 30 dias
MTA Angelus® 1,11 ± 0,18C.a 1,12 ± 0,10CD.a >0,05
Biodentine® 1,05 ± 0,05BC.a 1,06 ± 0,10C.a >0,05
Cimento Portland 1,12 ± 0,08C.a 1,16 ± 0,08D.a >0,05
Controle positivo 0,99 ± 0,05B.a 0,67 ± 0,08B.b <0,05
Controle negativo 0,00 ± 0,00A.a 0,00 ± 0,00A.a >0,05
Valor de p <0,05 <0,05
Teste ANOVA com post- hoc de comparações múltiplas com significância de 5%.
Letras maiúsculas diferentes identificam diferenças entre as linhas. Letras minúsculas diferentes identificam diferenças nas colunas.
A Tabela 5 apresenta o resultado da análise das imagens de microscopia eletrônica de varredura sobre a contaminação da superfície de cimentos biocerâmicos por Enterococcus faecalis.
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Tabela 5. Frequência dos scores nos grupos.
GRUPOS PERÍODO DE AVALIAÇÃO SCORE 7 dias (n=10) 30 dias (n=10) MTA Angelus® 10 10 5 Biodentine® 10 10 5 Cimento Portland 10 10 5 Controle positivo 10 10 5 Controle negativo 10 10 1
Após a exposição dos materiais e análise em MEV, observou-se que todas as amostras (100%) de todos os materiais avaliados apresentaram score 5, que evidencia que houve presença de contaminação microbiana em todas as superfícies do material avaliado, com exceção do controle negativo, que não apresentou qualquer contaminação (Figura 3).
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7. DISCUSSÃO
A presença de Enterococcus faecalis foi detecdata nos materiais avaliados (MTA Angelus®, Biodentine® e cimento Portland) tanto pela análise da densidade ópticas de culturas de 07 e 30 dias, quanto pela análise das superfícies determinadas pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura.
A seleção dos materiais empregados neste estudo foi realizada considerando
estudos prévios (CAMILLERI, 2010a; CUTAJAR et al., 2011; CANDEIRO et al, 2012;
LIU, WANG e DONG, 2015; WANG, 2015; DUARTE et al., 2018; ESTRELA et al., 2018; COSTA et al., 2018) que sugeriram estes materiais com características biológicas apropriadas para o selamento de perfurações radiculares, materiais retro-obturadores, pulpotomias, selamentos endodônticos, além de outras.
O modelo de confecção de cavidades em dentina foi empregado previamente para a avaliação de materiais odontológicos (HUFFMAN et al., 2009; NAGAS et al., 2014; SILVA, 2019). Os períodos selecionados para este estudo levam em consideração a possibilidade de estabelecimento de um biofilme bacteriano jovem e maduro sobre os materiais biocerâmicos avaliados. Desta maneira, nestes períodos foi possível verificar que os materiais empregados não conseguiram impedir a colonização bacteriana por meio de um efeito antibacteriano. Porém, foi possível verificar a presença deste indicador microbiano na superfície destes materiais tanto no método por meio de cultura microbiológica, quanto na observação da presença do
E. Faecalis nas superfícies observadas nas imagens de microscopia eletrônica de
varredura. A microscopia eletrônica de varredura tem sido utilizada em estudos prévios para a caracterização da superfície de materiais odontológicos (FORMOSA et al., 2012).
O microrganismo E. Faecalis foi selecionado para este estudo em função de ser um patógeno endodôntico e estar associada a casos resistentes ao tratamento endodôntico (SUNDQVIST et al., 1998; LOVE, 2001; ASGARY et al., 2007). Este microrganismo é mais encontrado em casos de fracasso do tratamento endodôntico (SIREN et al., 1997; SUNDQVIST et al., 1998; MOLANDER et al., 1998; ROÇAS et al., 2004).
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A análise de contaminação bacteriana pode ser verificada por várias metodologias, dentre as quais o teste de difusão em ágar, teste de contato direto, concentração inibitória mínima, formação de biofilme bacteriano (ESTRELA et al., 1999; 2000b; 2009). O teste de difusão em ágar apesar de amplamente utilizado, não estabelece parâmetros confiáveis para a comparação de substâncias com diferentes características químicas, com, por exemplo, a capacidade de dissociação e de difusão (PUMAROLA et al.,1992; WEISS et al., 1996; ESTRELA et al., 1999). Fuss et al. (1997) relataram que a atividade antimicrobiana de um material pode ainda variar, de acordo com o intervalo de tempo entre a mistura e o teste, sugerindo diferentes propriedades físico-químicas. Desta forma, ao se avaliar o efeito antimicrobiano de diferentes substâncias deve-se atentar à metodologia empregada para evitar o viés de resultados.
A atividade antimicrobiana de materiais obturadores do sistema de canais radiculares em diferentes condições clínicas tem sido verificada em vários estudos (TORABINEJAD et al., 1995; LOVE, 2001; MCHUGH et al. 2004). Estas análises têm sido elaboradas por maio de uma grande variedade de testes microbiológicos. Torabinejad et al. (1995) demonstraram efeito antimicrobiano de alguns materiais, dentre os quais o MTA. De acordo com estes autores, esta ação antimicrobiana foi alcançada em função da elevação do pH do meio pelo MTA e, como é conhecido, pH acima de 12 pode exercer efeito sobre diferentes microrganismos, mesmo sobre o E. faecalis, uma bactéria resistente (LOVE, 2001; MCHUGH et al., 2004). Resultados semelhantes foram corroborados através de outros estudos (TANOMARU-FILHO et al., 2007).
Estrela et al. (2000a) avaliaram o efeito antimicrobiano de diferentes materiais endodônticos: MTA, cimento Portland, hidróxido de cálcio, Sealapex e Dycal, sobre diferentes microrganismos encontrados no canal radicular e cavidade bucal. Os resultados mostraram que para todos os microrganismos estudados o hidróxido de cálcio apresentou ação antimicrobiana superior ao MTA, Cimento Portland, Sealapex e Dycal. Estes resultados não condizem com os achados deste estudo em função da diferença do teste microbiano utilizado. Neste estudo foi observado se ocorreria o crescimento bacteriano na superfície do material, isto é, a formação de biofilme.
Sipert et al. (2005) verificaram que o MTA e cimento Portland apresentaram piores efeitos antimicrobianos que o Sealapex e FillCanal. Zhang, Pappen e
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Haapasalo (2009) estudaram a eficácia antimicrobiana de bioagregado (BA) e agregado de trióxido mineral (MTA) sobre Enterococcus faecalis e verificaram que houve redução da viabilidade bacteriana, mas não a completa eliminação dos microrganismos, como verificado neste estudo.
Kim et al. (2015) avaliaram a ação antibacteriana do MTA Angelus®, Endocem
MTA e ProRoot MTA sobre bactérias da cavidade bucal e observaram que o MTA Angelus® e Endocem MTA foram mais eficazes. Singh et al. (2016) compararam a
atividade antibacteriana do EndoSequence BC Sealer, um biocerâmico; do cimento resinoso MM Sealer; do Endoseal, um cimento à base de óxido de zinco e eugenol;
do ProRoot White MTA e MM MTA sobre o E. faecalis.Os autores verificaram que a
atividade antibacteriana foi similar para todos os materiais avaliados. Como anteriormente citado, neste estudo foi observado o crescimento microbiano na superfície do material, ou seja, a formação de biofilme bacteriano. Isto diferencia os resultados deste estudo com outros que empegaram técnicas para avaliação da ação antimicrobiana distintos.
Sampaio (2016) analisou a superfície e avaliar a composição química de materiais obturadores do canal radicular por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de dispersão de raios-X (EDX). Os cimentos apresentaram diferentes regularidades em imagens por MEV, fato pode corroborar para a agregação de microrganismo na superfície dos materiais, conforme os resultados encontrados neste estudo. Por outro lado, Siqueira (2017) estudaram as características de superfície de alguns cimentos biocerâmicos: Biodentine®, Bio-C Fillapex®, Cimento biocerâmico MK Life, MTA Angelus® e Cimento Portland® e concluíram que as superfícies de todos os cimentos avaliados mostraram partículas com padrão de distribuição uniforme.
Considerando todo o exposto anteriormente, cabe ressaltar a necessidade de mais estudos a respeito dos materiais disponíveis como seladores do sistema de canais radiculares com vistas a se obter um cimento endodôntico ideal, com propriedades físicas, químicas, biológicas e microbiológicas que atuem sobre a microbiota do canal radicular favoreçam o reparo tecidual.
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8. CONCLUSÃO
De acordo com a metodologia utilizada, pode-se concluir que:
1. Houve o crescimento bacteriano na superfície de todos os materiais biocerâmicos testados nos diferentes períodos avaliados (7 e 30 dias) utilizando o método de cultura microbiológica;
2. A análise das superfícies de todos os materiais biocerâmicos testados por meio de imagens de microscopia eletrônica de varredura demonstrou a presença de E. faecalis em todos os quadrantes analizados.
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REFERÊNCIAS
ALMEIDA, L. H. S.; et al. Are premixed calcium silicate–based endodontic sealers comparable to conventional materials? A systematic review of in vitro studies. J
Endod; 43:527-35. 2017.
AL-HADDAD, A.; e CHEAB AZIZ, Z. A. Bioceramic-based root canal sealers: A review.
Int J Biomater; 4:1-10. 2016.
AL-NAZHAN, S.; e AL-JUDAI, A. Evaluation of Antifungal Activity of Mineral Trioxide Aggregate. J Endod; 29(12):826-7. 2003.
ARAÚJO, L. B.; COSME-SILVA, L.; FERNANDES, A. P.; OLIVEIRA, T. M.; CAVALCANTI, B. N.; JOÃO, G. F. E. Effects of mineral trioxide aggregate, BiodentineTM and calcium hydroxide on viability, proliferation, migration and differentiation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth. J. Appl. Oral Sci. Fev; 09 (02):122-126. 2017.
ASGARY, S.; et al. Chemical differences between white and gray mineral trioxide aggregate. J Endod; 31 (2):101-3. 2005.
ASGARY, S.; AKBARI KAMRANI, F.; e TAHERI, S. Evaluation of antimicrobial effect of MTA, calcium hydroxide, and CEM cement. Iran J Endod; 2 (3):105-9. 2007. ATTIK, G. N.; et al. In vitro biocompatibility of a dentine substitute cement on human MG63 osteoblasts cells: Biodentine®™ versus MTA®. Int J Endod; 47 (12): 1133-41.
2014.
BEATRICE, L. C. S.; et al. Materiais retroobturadores utilizados na cirurgia paraendodontica. 2009.
BELOBROV, I.; e PARASHOS, P. Treatment of tooth discoloration after the use of white mineral trioxide aggregate. J Endod; Jul; 37 (7): 1017-20. 2011.
BORGES, A. H.; et al. Physicochemical properties of mta and portland cement after addition of Aloe Vera. Iranian Endodontic Journal; 12 (3): 312-317. 2017.
BORTOLUZZI, E. A.; et al. Marginal gingiva discoloration by gray MTA: a case report.
J Endod; Mar; 33 (3): 325-7. 2007.
BOSSO-MARTELO, R. Physicochemical properties of calcium silicate cements associated with microparticulate and nanoparticulate radiopacifiers. Clin Oral Invest; 20: 83–90. 2016.
43
BRISO, A. L. Biological response of pulps submitted to different capping materials.
Braz Oral Res; 20 (3): 219-25. 2006.
CAMILLERI, J.; et al. The constitution of mineral trioxide aggregate. Dent Mat.; 21: 297-303. 2005.
CAMILLERI, J.; e PITT-FORD, T. R. Mineral trioxide aggregate: a review of the constituents and biological properties of the material. Int Endod J; 39: 747-54. 2006. CAMILLERI, J. Characterization of hydration products of mineral trioxide aggregate.
Int Endod J.; May; 41(5): 408-17. 2008.
CAMILLERI, J. Evaluation of the physical properties of an endodontic Portland cement incorporating alternative radiopacifiers used as root-end filling material. Int Endod J; 43: 231–40. 2010a.
CAMILLERI, J. The hydration mechanisms of calcium silicate cements with alternative radiopacifiers used as root-end filling materials. J Endod; 36: 502–8. 2010b.
CAMILLERI, J.; SORRENTINO, F.; e DAMIDOT, D. Investigation of the hydration and bioactivity of radiopacified tricalcium silicate cement, Biodentine® and MTA Angelus.
Dent Mat; 29: 580-93. 2013.
CANDEIRO, G. T.; et al. Evaluation of radiopacity, pH, release of calcium ions, and flow of a bioceramic root canal sealer. J Endod; 38: 842–45. 2012.
CASAGRANDE, B. N.; RODE, S. M.; e MARQUES, M. M. Cytotoxicity of substances leached or dissolved from pulp capping materials. Int Endod J.; 38 (8): 505-9. 2005. COOMARASWAMY, K, S.; LUMLEY, P. J.; e HOFMANN, M. P. Effect of bismuth oxide radioopacifier content on the material properties of an endodontic Portland cement-based (MTA-like) system. J Endod; 33: 295–8. 2007.
COSTA, B. C.; et al. Ytterbium Oxide as Radiopacifier of Calcium Silicate-Based Cements. Physicochemical and Biological Properties. Brazilian Dental Journal; 29 (5): 452-458. 2018.
CUTAJAR, A.; et al. Replacement of radiopacifier in mineral trioxide aggregate; characterization and determination of physical properties. Dent Mater; 27: 879-891. 2011.
DAMAS, B. A.; et al. Cytotoxicity comparison of mineral trioxide aggregates and Endo Sequence bioceramic root repair materials. J Endod; 37: 372-5. 2011.
44
DAMMASCHKE, T.; GERTH, H. U.; ZUCHNER, H.; SCHAFER, E. Chemical and physical surface and bulk material characterization of white ProRoot MTA and two Portland cements. Dent Mater; 21 (8): 731-8. 2005.
DUARTE, M. A. H; et al. pH and calcium ion release of 2 root-end filling materials. Oral
Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.; 95 (3): 345-7. 2003.
DUARTE, M. A. H.; et al. Radiopacity of Portland cement associated with different radiopacifying agents. J Endod; 35: 737–40. 2009.
DUARTE, M. A. H.; et al. Effect of different radiopacifying agents on the physicochemical properties of white Portland cement and white mineral trioxide aggregate. J Endod.; Mar; 38 (3): 394-7. 2012.
DUARTE, M. A. H.; et al. Tricalcium silicate-based cements: properties and modifications. Braz Oral Res; 32 (suppl): e73: 111-118. 2018.
ESTRELA, C.; PÉCORA, J. D.; SOUZA NETO, M. D.; ESTRELA, C. R. A.; e BAMMANN, L. L. Effect of Vehicle on Antimicrobial Properties of Calcium Hydroxide Pastes. Brazilian Dental Journal, v. 10, n.2, p. 63-72, 1999.
ESTRELA, C.; ESTRELA, C. R. A.; MOURA, J. A.; e BAMMANN, L. L. Testing calcium hydroxide antimicrobial potential by different methods. Journal of Dental Research, v. 79, 2000a.
ESTRELA, C.; BAMMANN, L. L.; ESTRELA, C. R.; SILVA, R. S.; PÉCORA, J. D. Antimicrobial and chemical study of MTA, Portland cement, calcium hydroxide paste, Sealapex and Dycal. Braz Dent J; 11: 3-9. 2000b.
ESTRELA, C. R. A.; et al. A model system to study antimicrobial strategies in endodontic biofilms. Journal of Applied Oral Science, v. 17, p. 87-91, 2009.
ESTRELA, C.; FIGUEIREDO, J. A. S.; SOUSA-NETO, M. D.; e FAITARONI, L. A. Root canal filling and coronal seal. In: Estrela C. Endodontic Science. 2.ed. São Paulo: Artes Médicas. p. 823-82. 2009.
ESTRELA, C.; et al. Characterization of Successful Root Canal Treatment. BrazDent J; v. 25, n. 1, p. 3-11, Feb., 2014.
ESTRELA, C.; et al. Root perforations: a review of diagnosis, prognosis and materials.
Braz Oral Res; 32 (suppl): e73: 133-46. 2018.
ESTRELA, C.; et al. Characterization of calcium oxide in root perforation sealer materials. Braz Dent J.; 23 (5): 539-46. 2012.
45
FARRUGIA, C.; BACA, P.; CAMILLERI, J.; e ARIAS MOLIZ, M. T. Antimicrobial activity of ProRoot MTA in contact with blood. Scientific Reports, 2017.
FELMAN, D.; e PARASHOS, P. Coronal tooth discoloration and white mineral trioxide aggregate. J Endod. Apr;39 (4): 484-7. 2013.
FORMOSA, L. M.; MALLIA, B.; BULL, T.; e CAMILLERI, J. The microstructure and surface morphology of radiopaque tricalcium silicate cement exposed to different curing conditions. Dent Mat; 18: 584-595. 2012.
FUSS, Z.; WEISS, E. l.; e SHALHAV, M: Antibacterial activity of calcium hydroxide-containing endodontic sealers on Enterococcus faecalis in vitro. Int Endod J: 397-402, 1997.
GOMES-FILHO, J. E.; GOMES, B. P. F. A.; ZAIA, A. A.; FERRAZ, C. R.; SOUZA-FILHO, F. J. Evaluation of the biocompatibility of root canal sealers using subcutaneous implants. J Appl Oral Sci; 15: 186-94. 2007.
GROSSMAN, L. I. An improved root canal cement. J Am Dent Assoc; 56 (3): 381-85. 1958.
HANCOCK, H. H.; SIGURDSSON, A.; TROPE, M.; e MOISEIWITSCH, J. Bacteria isolated after unsuccessful endodontic treatment in a North Am population. Oral Surg
Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod; 91: 579-86. 2001.
HUFFMAN, B. P.; et al. Dislocation resistance of ProRoot Endo Sealer, a calcium silicate-based root canal sealer, from radicular dentine. Int Endod J; v. 42, n. 1, p. 34– 46, 2009.
HOLLAND, R.; SOUZA, V.; NERY, M. J.; OTOBONI-FILHO, J. A.; BERNABÉ, P. F. E.; e DEZAN-JR, E. Reaction of rat connective tissue to implanted dentin tubes filled with mineral trioxide aggregate or calcium hydroxide. J Endod; 25: 161-6. 1999. HOLLAND, R.; SOUZA, V.; NERY, M. J.; FARACO JÚNIOR, I. M.; BERNABÉ, P. F.; OTOBONI FILHO, J. A.; et al. Reaction of rat connective tissue to implanted dentin tube filled with mineral trioxide aggregate, Portland cement or calcium hydroxide. Braz
Dent J.; 12 (1): 3-8. 2001.
HOLLAND, R.; SOUZA, V.; MURATA, S. S.; NERY, M. J.; BERNABÉ, P. F.; OTOBONI FILHO, J. A.; et al. Healing process of dog dental pulp after pulpotomy and pulp covering with mineral trioxide aggregate or Portland cement. Braz Dent J.; 12 (2): 109-13. 2001.
