Comparação de diferentes estratégias de indução de abstinência
alcóolica em Danio rerio
Suianny Nayara da Silva Chaves Caio Maximino de Oliveira Agência financiadora: FAPESPA
Resumo: O uso crônico do etanol produz adaptações e toxicidade que subjazem a tolerância e a dependência,
incluindo síndrome de abstinência com sintomas de ansiedade, hiperexcitabilidade autonômica, e convulsões. Em modelos animais, a abstinência altera a excitabilidade de neurônios localizados em regiões cerebrais associadas ao comportamento defensivo, ansiedade e medo, e altera a atividade nitrérgica em regiões em áreas límbicas. A produção de modelos animais de abstinência alcoólica pode ajudar a elucidar os mecanismos comportamentais e neuroquímicos dessa condição, bem como propor possíveis tratamentos. O presente plano propõe a utilização do comportamento tipo-ansiedade e de convulsões epileptóides do paulistinha (Danio rerio Hamilton 1822) para analisar o efeito da abstinência alcoólica após administração crônica dessa droga. Em metanálise anterior (Edital 017/2016-PROPIT), demonstramos que há grande variedade, na literatura, de procedimentos para induzir abstinência alcoólica em Danio rerio, e que a variável principal parece ser a concentração de etanol administrada. Além disso, demonstramos que a exposição crônica a uma concentração baixa (0,25%) de etanol por 16 dias, seguida de período de retirada de 60 min, produz efeito significativo mas pequeno sobre o comportamento tipo-ansiedade. Nesse plano, um método diferente será explorado, com exposição intermitente (20 min/dia, por 8 dias) a uma concentração de 1%, com teste após 7 dias de retirada.
Palavras chave: Síndroma de abstinência, alterações comportamentais, zebrafish.
1. INTRODUÇÃO
As síndromes de abstinência representam uma importante fonte de sofrimento psíquico para usuários de drogas, representando um critério diagnóstico central para a classificação de dependência (KRYSTAL; TABAKOFF, 2002). Dentre as drogas mais largamente utilizadas no Brasil e no mundo, o etanol é o mais prevalente (CARLINI et al., 2007, 2010; INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2014; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2014). O uso crônico dessa droga produz adaptações e toxicidade que subjazem a tolerância e a dependência (GATCH; LAL, 2001; KRYSTAL; TABAKOFF, 2002). A síndrome de abstinência do etanol inclui sintomas de ansiedade, insônia, e hiperexcitabilidade autonômica (KRYSTAL; TABAKOFF, 2002). Em níveis mais severos de dependência, com episódios repetidos de abstinência, a síndrome pode incluir hiperexcitabilidade autonômica bastante significativa, agitação, mudanças perceptuais, confusão mental, e convulsões. Esses sintomas podem emergir em um contexto de delirium tremens, uma complicação possivelmente fatal que normalmente desenvolve-se na primeira semana de sobriedade (LONGO; SCHUCKIT, 2014). A motivação para evitar ou cessar os sintomas da abstinência pode ser importante para a recidiva do uso abusivo (KOOB, 2013; KOOB; LE MOAL, 2008).
Algumas alterações neurocomportamentais foram implicadas na síndrome de abstinência do etanol. Em modelos animais, a abstinência altera a excitabilidade de neurônios localizados em regiões cerebrais associadas ao comportamento defensivo, ansiedade e medo (CHAKRAVARTY; FAINGOLD, 1998; LONG et al., 2007; YANG et al., 2002, 2003; YANG; LONG; FAINGOLD, 2001). Além disso, a abstinência também sobre-regula a
atividade do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal, responsável pela organização endócrina das respostas de estresse (RASMUSSEN et al., 2002).
O paulistinha tem emergido como um modelo útil para o estudo de funções genéticas, neurofarmacológicas e comportamentais (KEY; DEVINE, 2003). A sua utilização possibilita uma série de vantagens, tais como o baixo custo de aquisição e manutenção, facilidade de manuseio e acomodação, curto tempo de vida e facilidade de reprodução em laboratório. O paulistinha também é um bom modelo de estudo sobre ansiedade e estresse, além de possuir grande homologia genética, neural e endócrino com roedores e seres humanos (MAXIMINO et al., 2010).
Em trabalho anterior (com bolsa de iniciação científica concedida pelo edital 017/2016-PROPIT), realizamos metanálise dos dados da literatura que analisa efeitos da abstinência alcoólica no comportamento tipo-ansiedade em Danio rerio. Essa análise demonstrou que alguns métodos são incapazes de produzir abstinência, mas que o principal fator parece ser a concentração do etanol a que os animais são expostos, e não o tempo de abstinência ou o tempo de exposição. Utilizamos também o método proposto por TRAN et al. (2014), com exposição constante dos animais à concentração de 0,25% de etanol por 16 dias, e retirada por 60 min, e demonstramos efeito significativo mas pequeno sobre comportamento tipo-ansiedade, bem como ausência de efeito pró-convulsivante. Esses achados nos sugeriram que outros métodos podem ser mais adequados para produzir efeitos disfóricos; de fato, MATHUR & GUO (2011) utilizaram um método intermitente, em que os animais são expostos a concentrações maiores (1% v/v), mas por período de tempo mais curto, e de maneira que modela mais proximamente o padrão de consumo de alcoolistas (i.e., exposição a grandes quantidades por curto período de tempo por dia). Esses autores observaram efeito 7 dias após a exposição, mas os resultados não são inequívocos. Assim, o objetivo desse plano é comparar esse método intermitente ao método contínuo investigado anteriormente.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Descrição da amostra
Foram utilizados zebrafish adultos Danio rerio (n = 15), de origem de um criadouro, mantidos em temperatura média de 28°, com o pH 7,5, mantendo a amônia na forma de NH3 inferior a 0,02 ppm considerado seguro para os peixes, com a dureza total de 5°dGH. Após quarentena nesse sistema previamente descrito, os animais foram transferidos para recipientes com volume de 3 litros de água, em aeração constante por bomba para aquário com pedra porosa. O regime de administração de etanol e retirada (abstinência) foi adaptado de MATHUR & GUO (2011). Os animais foram expostos a dois níveis de administração de etanol (EtOH 0% e 1%) por via hídrica durante 20 minutos por 8 dias. Após o período de tratamento, os animais foram transferidos para água do sistema por 7 dias e realizou-se o teste de distribuição vertical eliciada pela novidade, seguido de dois níveis de tratamento farmacológico (aminoguanidina 0 e 50mg/kg).
Testes Comportamentais
Teste de Distribuição Vertical Eliciada pela Novidade
Após a abstinência alcóolica os animais foram transferidos para o aparato do teste de Distribuição Vertical Eliciada Pela Novidade (DVEN) (CACHAT et al., 2010); 01h após a retirada de etanol os animais foram transferidos individualmente em aquário (15 cm largura X 25 cm comprimento X 20 cm altura). Os animais exploraram livremente o novo aquário durante 6 minutos. O aparato de teste foi iluminado a partir de cima por uma lâmpada fluorescente que produziu uma média de 556,7 lux acima do aquário.
O experimento foi executado sob o ruído branco Gaussiano constante, com uma média de 62 dB acima do tanque. Uma câmera de vídeo filmou o aquário a partir da frente, registrando, assim, a distribuição lateral e vertical do animal. As imagens obtidas a partir da gravação foram divididas em grades de 3 x 5 compostas de quadrados de 10 cm2.
As seguintes variáveis registradas:
• Tempo no topo: O tempo passado no terço superior do aparato;
• Quadrados cruzados: O número de quadrados cruzados pelo animal durante toda a sessão, relacionado à atividade exploratória;
• Nado Errático: frequência de nados erráticos, definidos como um zig-zag de curso rápido e imprevisível de curta duração;
• Congelamento: a duração do tempo total de eventos de congelamento, definida como completa cessação dos movimentos, exceto os movimentos dos olhos e dos opérculos;
• 'Thrashing': a duração total de acontecimentos de 'thrashing', definido como eventos de nado persistente com o uso da nadadeira caudal enquanto o animal está fisicamente em contato com a parede lateral do aquário.
Tratamento Farmacológico
O tratamento farmacológico foi realizado com 50 mg/kg de aminoguanidina, administrado após 7 dias de exposição. Cada animal foi anestesiado com gelo, observando movimentos lentos dos opérculos, parada da atividade natatória, assim como a não reação do animal à manipulação. Em vista disso, foi injetado com a microsseringa 5 μl de AG ou Salina de Cortland (veículo), prosseguindo com a transferência dos animais para aquários realizando o teste de delineamento vertical eliciado pela novidade.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os experimentos nos quais os animais foram submetidos ao teste de DVEN, revelou que o grupo em abstinência (0mg/kg) parece ter apresentado uma diminuição no tempo no fundo quando comparado ao grupo controle. Quanto ao número de quadrantes cruzados, o grupo abstinência (0 mg/kg) parece ter apresentado diminuição de quadrantes cruzados em relação ao grupo controle. As frequências de thrashing parece ter diminuído no grupo de abstinência (0 mg/kg). Não houve diferença na variável congelamento, tempo no topo, nado errático.
4. CONCLUSÃO
Devido ao pequeno número amostral de animais, não é possível avaliar o efeito da aminoguanidina.
5. REFERÊNCIAS
BURGOS, J. S.; ALFARO, J. M.; RIPOLL-GÓMEZ, J. Kainate administered to adult zebrafish causes seizures similar to those in rodent models. European Journal of Neuroscience, v. 33, p. 1252–1255,
2011.
CARLINI, E. L. DE A. et al. II Levantamento Domiciliar sobre o Uso de Drogas Psicotrópicas no Brasil: Estudo envolvendo as 108 maiores cidades do país. São Paulo: [s.n.].
CARLINI, E. L. DE A. et al. VI Levantamento Nacional sobre o Consumo de Drogas Psicotrópicas entre Estudantes do Ensino Fundamental e Médio das Redes Pública e Privada de Ensino nas 27 Capitais Brasileiras. Brasília: [s.n.].
CHAKRAVARTY, D. N.; FAINGOLD, C. L. Comparison of neuronal response patterns in the external and central nuclei of inferior colliculus during ethanol administration and ethanol withdrawal. Brain Research, v. 783, p. 55–57, 1998.
GATCH, M. B.; LAL, H. Animal models of the anxiogenic effects of ethanol withdrawal. Drug Development Research, v. 54, p. 95–115, 2001.
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA. Pesquisa Nacional de Saúde - 2013: Percepção do estado de saude, estilos de vida e doenças crônicas - Brasil, Grandes Regiões e Unidades da Federação. Rio de Janeiro: [s.n.].
KEY, B.; DEVINE, C. A. Zebrafish as an experimental model: Strategies for developmental and molecular neurobiology studies. Methods in Cell Science, v. 25, p. 1–6, jan. 2003.
KOOB, G. F. Negative reinforcement in drug addiction: The darkness within. Current Opinion in Neurobiology, v. 23, p. 559–563, 2013.
KOOB, G. F.; LE MOAL, M. Neurobiological mechanisms for opponent motivational processes in addiction. Philosophical Transactions of the Royal Society Part B, v. 363, p. 3113–3123, 2008.
KRYSTAL, J. J. H.; TABAKOFF, B. Ethanol abuse, dependence, and withdrawal: Neurobiology and clinical implications. In: Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2002. p. 1425–1443.
LOFTIS, J. M.; JANOWSKY, A. Regulation of NMDA receptor subunits and nitric oxide synthase expression during cocaine withdrawal. Journal of Neurochemistry, 2000.
LONG, C. et al. Excitatory amino acid receptor-mediated responses in periaqueductal gray neurons are increased during ethanol withdrawal. Neuropharmacology, v. 52, p. 802–811, 2007.
LONGO, D. L.; SCHUCKIT, M. A. Recognition and management of withdrawal delirium (delirium tremens). New England Journal of Medicine, v. 371, p. 2109–2113, 27 nov. 2014.
MAXIMINO, C. et al. Measuring anxiety in zebrafish: A critical review. Behavioural Brain Research, v. 214, p. 157–171, 2010.
MATHUR, P.; GUO, S. Differences of acute versus chronic ethanol exposure on anxiety-like behavioral responses in zebrafish. Behavioural Brai Research, v. 219, p. 234-239, 2011.
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Global status report on alcohol and health 2014. [s.l: s.n.]. Disponível em: <http://www.who.int/substance_abuse/publications/global_alcohol_report/msbgsruprofiles.pdf>. PINTO, C. B. Caracterização do perfil de crises epilépticas e dos efeitos comportamentais induzidos por pilocarpina em peixe-zebra adulto. [s.l.] Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2015.
RASMUSSEN, D. D. et al. Chronic daily ethanol and withdrawal: 3. Forebrain pro-opiomelanocortin gene expression and implications for dependence, relapse, and deprivation effect. Alcoholism: Clinical and Experimental Research, v. 26, p. 535–546, 2002.
TRAN, S.; CHATTERJEE, D.; GERLAI, R. An integrative analysis of ethanol tolerance and withdrawal in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research, 2014.
YANG, L. et al. Ethanol withdrawal results in aberrant membrane properties and synaptic responses in periaqueductal gray neurons associated with seizure susceptibility. Brain Research, v. 957, p. 99–108,
2002.
YANG, L. et al. Neurons in the periaqueductal gray are critically involved in the neuronal network for audiogenic seizures during ethanol withdrawal. Neuropharmacology, v. 44, p. 275–281, 2003.
YANG, L.; LONG, C.; FAINGOLD, C. L. Neurons in the deep layers of superior colliculus are a requisite component of the neuronal network for seizures during ethanol withdrawal. Brain Research, v. 920, p. 134–141, 2001.
