MARCEL APARÍCIO CAMPOS BERNAL

MESTRADO EM ODONTOLOGIA

Área de Concentração em Periodontia

MARCEL APARÍCIO CAMPOS BERNAL

AVALIAÇÃO CLÍNICA PERIODONTAL E

RECOLONIZAÇÃO BACTERIANA SUBGENGIVAL

APÓS RASPAGEM E ALISAMENTO RADICULAR EM

INDIVÍDUOS TABAGISTAS E NÃO-TABAGISTAS

COM DOENÇA PERIODONTAL CRÔNICA

Guarulhos 2008

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

MARCEL APARÍCIO CAMPOS BERNAL

AVALIAÇÃO CLÍNICA PERIODONTAL E

RECOLONIZAÇÃO BACTERIANA SUBGENGIVAL

APÓS RASPAGEM E ALISAMENTO RADICULAR EM

INDIVÍDUOS TABAGISTAS E NÃO-TABAGISTAS

COM DOENÇA PERIODONTAL CRÔNICA

Dissertação apresentada à Universidade Guarulhos para Obtenção do Título de Mestre em Odontologia Área de concentração: Periodontia Orientadora: Profa. Dra. Luciene Figueiredo Co-orientadora: Profa. Dra. Cláudia Ota-Tsuzuki

.

Guarulhos 2008

Ficha catalográfica elaborada pela Coordenação da Biblioteca Fernando Gay da Fonseca

Bernal, Marcel Aparício Campos

B517a _{Avaliação clínica periodontal e recolonização bacteriana subgengival após raspagem e} alisamento radicular em indivíduos tabagistas e não-tabagistas com doença periodontal crônica / Marcel Aparício Campos Bernal. Guarulhos, 2008.

73 f. ; 31 cm

Dissertação (Mestrado em Odontologia, área de concentração em Periodontia) - Centro de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão, Universidade Guarulhos, 2008.

Orientadora: Profª. Drª. Luciene Figueiredo. Co-orientadora: Profª. Drª. Cláudia Ota-Tsuzuki. Bibliografia: f. 63-73

1. Periodontia. 2. Raspagem dentária. 3. Aplanamento radicular. I. Título. II. Universidade Guarulhos.

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho à minha querida mãe Liêda e ao meu querido pai

Aparício, como forma de agradecimento por todo carinho e todo o apoio

dado a mim, principalmente nas horas mais difíceis pelas quais

passamos e superamos. Sem vocês eu não conseguiria realizar meus

AGRADECIMENTOS

A Deus, que se mostrou presente nos momentos difíceis e me ajudou a superá-los com firmeza e sabedoria.

Ao amigo e Prof. Mário Perito pela confiança no meu trabalho desde a época da graduação.

À Profª Drª Magda Feres pela confiança depositada, pela sua presteza e apoio desde o início.

Agradecimentos imensuráveis à minha orientadora Profª Drª Luciene C. de Figueiredo pela dedicação do seu tempo, paciência em esclarecer minhas dúvidas e pela excelente orientação no meu trabalho.

À minha Co-orientadora Profª Drª Claudia Ota-Tsuzuki, por ter esclarecido muitas dúvidas e me emprestar livros que facilitassem o meu aprendizado em microbiologia. À Profª Poliana pela sua paciência em explicar quantas vezes fossem necessárias a matéria e pelo seu apoio na clínica.

Ao Prof. Dr. Jamil, obrigado pelos ensinamentos clínicos e pelo empréstimo da câmera fotográfica.

Aos meus queridos professores do mestrado Acadêmico em Odontologia da UnG, Professores Doutores Magda Feres, Luciene C. de Figueiredo, Jamil Awad Shibli, Poliana Mendes Duarte, Marcelo de Faveri, José Augusto Rodrigues, Cristiane Mariote Amaral, André Figueiredo Reis, Cláudia Ota-Tsuzuki, Marta Ferreira Bastos, pela sabedoria e humildade em passar seus conhecimentos.

Aos meus amigos e colegas de turma, Maike, Adriana, Maria Beatriz, Tatiane, Daniel, Diego e Mônica por terem tornado meus dias mais alegres.

À bióloga Izilvânia Barreto e sua equipe (Priscila e Gisele) pelo trabalho e dedicação em processar os dados no laboratório.

Aos funcionários da Universidade, Cristina Zoucas, Cínthia Lobo, Adriana dos Santos por serem sempre tão prestativos e atenciosos.

Aos pacientes envolvidos na pesquisa e que permitiram a realização deste estudo. Aos amigos e Profs. Nilton de Bortoli, Nilton de Bortoli Jr. e Mário Sérgio de Bortoli, por sempre acreditarem em mim desde o início da minha carreira.

À Shirley Veronezzi por ter me ajudado a revisar os dados digitados dessa pesquisa.

RESUMO

O objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta clínica periodontal e a recolonização bacteriana do ambiente subgengival após a terapia de raspagem e alisamento radicular (RAR) em indivíduos tabagistas e não-tabagistas com doença periodontal crônica. Foram selecionados 30 indivíduos, sendo 15 tabagistas (Grupo T) e 15 não-tabagistas (Grupo NT). Os indivíduos foram submetidos a exame clínico-periodontal e microbiológico. Foram avaliados 6 sítios por dente para os parâmetros de profundidade de sondagem (PS), nível clínico de inserção (NCI) e percentual de sítios apresentando placa visível, sangramento gengival (ISG), sangramento à sondagem (SS) e supuração. Amostras de biofilme subgengival foram coletadas de seis sítios/indivíduo apresentando PS entre 5-7mm e NCI entre 5-10mm, e avaliadas por meio do teste Checkerboard DNA-DNA Hybridization. Os procedimentos de RAR foram iniciados na primeira consulta e não excederam 21 dias. Os indivíduos foram acompanhados clinicamente no exame inicial, aos 90 e 180 dias pós-terapia, e microbiologicamente no exame inicial, aos 42, 63 e 180 dias. A terapia de RAR promoveu melhoras clínicas significativas em todos os parâmetros no grupo NT (p<0,05). Para os indivíduos tabagistas a terapia também foi efetiva, no entanto não foram observadas diferenças nas variáveis ISG e SS (p>0,05, Teste de Wilcoxon). Os sítios com PS inicial entre 4-6mm (intermediários) dos indivíduos não-tabagistas apresentaram resultados mais satisfatórios em relação a redução de PS e NCI em comparação aos indivíduos tabagistas (p<0,05, Teste U de Mann-Whitney). Considerando os dados microbiológicos, nos indivíduos não-tabagistas as espécies benéficas passaram de 20,1% para 50,8% (p<0,05), e as patogênicas passaram de 72,6% para 27,3% (p<0,05). A análise dos resultados encontrados nos indivíduos tabagistas demonstra algumas diferenças. Neste caso as espécies benéficas passaram de 24,1% para 35,3% (p<0,05), porém as espécies patogênicas passaram de 69,0% para 55,3% (p>0,05) aos 180 dias. Ainda que a terapia de RAR tenha reduzido os níveis de várias bactérias no grupo T, os melhores resultados foram observados no grupo NT. A diferença mais marcante em relação ao grupo T foi a redução estatisticamente significante de uma e/ou mais espécies do complexo vermelho em todos os tempos experimentais, sendo que P. gingivalis se manteve em níveis inferiores (p<0,05) até os 180 dias após o término da RAR. E. nodatum e P. micra apresentaram contagens reduzidas logo após a RAR e aos 63 dias, enquanto P. intermedia apenas aos 180 dias, em comparação aos valores iniciais (p<0,05). Em conclusão, a terapia de RAR promoveu melhoras clínicas e microbiológicas nos indivíduos tabagistas e não-tabagistas. Após 180 dias, a recolonização do ambiente subgengival pelos microrganismos patogênicos foi mais evidente nos indivíduos tabagistas.

ABSTRACT

The objective of the present study was to evaluate the periodontal clinical response and the bacterial recolonization of the subgingival environment after the therapy of scaling and root planning (SRP) in smoker and non smoker individuals with chronic periodontitis. 30 individuals were selected, being 15 smokers (S Group) and 15 non-smokers (NS Group). The individuals were submitted to clinical examination - periodontal and microbiologically. 6 sites were evaluated per tooth for the parameters of probing depth (PD), clinical attachment level (CAL) and percentage of sites presenting visible plaque, gingival bleeding (GB), bleeding on probing (BOP) and suppuration. Subgingival biofilm samples were collected of six sites/individuals with PD between 5-7mm and CAL between 5-10mm, and evaluated through the Checkerboard DNA-DNA Hybridization. The proceedings of SRP were initiated into the first visit and they did not exceed 21 days. The individuals were followed clinically in the initial examination, to 90 and 180 days post-therapy, and microbiologically in the initial examination, to 42, 63 and 180 days. The therapy of SRP promoted clinical significant improvements in all the parameters in the group NS (p<0.05). For the smokers individuals the therapy also was effective, however differences were not observed in the variables GB and BOP (p>0.05, Wilcoxon Test). The sites with initial PD between 4-6mm (intermediaries) of the non-smokers individuals presented more satisfactory results regarding reduction of PD and CAL in comparison to the smokers individuals (p<0.05, Mann-Whitney U Test). Considering the microbiological data, in the non smokers individuals the beneficial species passed of 20.1% for 50.8% (p<0.05), and the pathogenic passed of 72.6% for 27.3% (p<0.05). The analysis of the results found in the smokers individuals demonstrates some differences. In this case the beneficial species passed of 24.1% for 35.3% (p<0.05), however the pathogenic species passed of 69.0% for 55.3% (p>0.05) to 180 days. Though the therapy of SRP has reduced the levels of several bacteria in the S group, the best results were observed in the NS group. The most outstanding difference regarding the group S went to statistically significant reduction of one and/or more species of the red complex in all the experimental times, being what P. gingivalis was maintained in inferior levels (p<0.05) up to 180 days after the end of the SRP. E. nodatum and P. micra presented counting reduced soon after the SRP and to 63 days, while P. intermedia you punish to 180 days, in comparison to the initial values (p<0.05). In conclusion, the therapy of SRP promoted clinical and microbiological improvements in the smoker and non-smoker individuals. After 180 days, the recolonization of the subgingival environment for pathogenic microorganisms was more obvious in the smoker individuals.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Delineamento experimental ... 29 Figura 2 Representação gráfica do Minislot (Immunetics, Cambridge,

MA, USA) e resumo da preparação e deposição das amostras de biofilme subgengival (técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization) ... 34

Figura 3 Representação gráfica do Miniblotter (Immunetics,

Cambridge, MA, USA) e resumo das etapas de hibridização e detecção das espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival (técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization) ... 35 Figura 4 Representação gráfica do padrão de hibridização entre as

bactérias presentes nas amostras de biofilme e as sondas de DNA (técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization) ... 36 Figura 5 Representação esquemática do padrão de hibridização entre

as bactérias presentes nas amostras de biofilme e as sondas de DNA (técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization) ...

36

Figura 6 Média dos parâmetros clínicos analisados nos grupos Não-Tabagistas e Não-Tabagistas em todos os tempos de avaliação (consulta inicial, 90 e 180 dias pós-terapia)... 43 Figura 7 Alterações nas médias de profundidade de sondagem e nível

clínico de inserção, de boca toda, ocorridas entre a consulta inicial e, 90 e 180 dias pós-terapia nos dois grupos ... 44 Figura 8 Alterações nas médias de profundidade de sondagem e nível

clínico de inserção, de acordo com as categorias de profundidade de sondagem (PS), ocorridas entre a consulta inicial e, 90 e 180 dias pós-terapia nos dois grupos ... 48 Figura 9 Perfil microbiano das médias de contagem (x105) das 38

espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival nos grupos Não-Tabagistas e Tabagistas, em todos os tempos experimentais ... 52 Figura 10 Perfil microbiano das médias de proporção (%) de sondas de

DNA das 38 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival nos grupos Não-Tabagistas e Tabagistas, em todos os tempos experimentais ...

Figura 11 Proporção dos complexos microbianos presentes nas amostras de biofilme subgengival nos grupos Não-Tabagistas e Tabagistas, em todos os tempos experimentais ... 54 Figura 12 Alteração nas proporções de espécies bacterianas benéficas

e patogênicas entre o tempo inicial e 180 dias após o término da terapia, nos grupos Não-Tabagistas e Tabagistas ... 55 Figura 13 Perfil microbiano das médias de contagem (x105) das 38

espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival, em todos os tempos experimentais. Análise do efeito da terapia de RAR no grupo Tabagistas (figura superior) e no grupo Não-Tabagistas (figura inferior) ... 56

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Relação das cepas empregadas para a confecção das sondas de DNA. As espécies estão agrupadas por complexos bacterianos (Socransky et al., 1998; Socransky & Haffajee, 2002) ... 33 Tabela 2 Índice utilizado para a determinação dos níveis dos

microrganismos nas amostras de biofilme subgengival ... 37

Tabela 3 Média (+DP) dos parâmetros clínicos, nos tempos

experimentais, para os indivíduos nos dois grupos ... 42 Tabela 4 Média (+DP) dos parâmetros clínicos, no exame inicial, para os

indivíduos nos dois grupos nas diferentes categorias de Profundidade de Sondagem ... 45 Tabela 5 Média (+DP) dos parâmetros clínicos, aos 90 dias pós-terapia,

para os indivíduos nos dois grupos nas diferentes categorias de Profundidade de Sondagem ... 46 Tabela 6 Média (+DP) dos parâmetros clínicos, aos 180 dias pós-terapia,

para os indivíduos nos dois grupos nas diferentes categorias de Profundidade de Sondagem ... 47

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 13

1.1 Etiologia da doença periodontal ... 14

1.2 Fumo de tabaco e periodontite crônica ... 16

1.2.1 Tabagismo como fator de risco para a doença periodontal ... 16

1.2.2 Aspectos clínico-periodontais em indivíduos tabagistas ... 19

1.2.3 Aspectos microbiológicos em indivíduos tabagistas ... 21

2 PROPOSIÇÃO ... 26

3 MATERIAL E MÉTODO ... 27

3.1 Seleção de indivíduos ... 27

3.2 Critérios de inclusão e exclusão ... 27

3.3 Delineamento experimental ... 28

3.4 Monitoramento clínico ... 29

3.5 Monitoramento microbiológico ... 30

3.5.1 Seleção dos sítios-teste ... 31

3.5.2 Checkerboard DNA-DNA Hybridization ... 31

3.6 Procedimento terapêutico – Terapia periodontal básica ... 37

3.7 Análise estatística ... 38 3.7.1 Monitoramento clínico ... 38 3.7.2 Monitoramento microbiológico ... 38 4 RESULTADOS ... 40 4.1 Resultados clínicos ... 40 4.2 Resultados microbiológicos ... 49 5 DISCUSSÃO ... 57 5.1 Aspectos clínico-periodontais ... 58 5.2 Aspectos microbiológicos ... 60 6 CONCLUSÃO ... 62 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 63

1 INTRODUÇÃO

A doença periodontal crônica é uma doença infecciosa que acomete as estruturas de proteção e sustentação dos dentes, levando a perda de inserção, de tecido ósseo, e eventualmente do elemento dentário. Observa-se uma progressão geralmente de lenta a moderada, indolor, com destruição tecidual compatível com os fatores locais presentes, e por uma maior prevalência em adultos (ARMITAGE, 1999).

A maior característica desta doença é ser causada por microrganismos específicos que colonizam os tecidos moles e duros da cavidade bucal e formam os biofilmes orais (SOCRANSKY & HAFFAJEE, 1994; SOCRANSKY et al., 1998; SOCRANSKY & HAFFAJEE, 2005). No entanto, o indivíduo pode ser continuamente colonizado por patógenos periodontais e não demonstrar nenhuma evidência de desenvolvimento da doença (SOCRANSKY & HAFFAJEE, 2003).

Uma justificativa para este fato é que o início e a progressão desta infecção são dependentes dos mecanismos de defesa do hospedeiro, e dessa forma, alguns fatores podem cooperar para o aumento do risco e da severidade da doença periodontal. Além de ser apontado como o principal fator de risco e passível de prevenção de inúmeras doenças (BANÓCZY & SQUIER, 2004), o tabagismo tem sido apontado como o fator de risco de maior significância para a infecção periodontal (BERGSTRÖM, 1989; BERGSTRÖM & PREBER, 1994; GENCO, 1996; KINANE & RADVAR, 1997; TONETTI, 1998; RIVERA-HIDALGO, 2003; BERGSTRÖM, 2003; YLÖSTALO et al., 2004; TORRUNGRUANG et al., 2005; GOMES et al., 2006; HAMDAN et al., 2007).

O fumo de tabaco pode promover alterações no ambiente periodontal (HOLMES, 1990; HANIOKA et al., 2000), no sistema imune específico e de defesa inespecífico que podem interferir na progressão da doença periodontal (MACFARLANE et al., 1992; NUMABE et al., 1998; PAULETO et al., 2000; GIANNOPOLOU et al., 2003; RAWLINSON et al., 2003; GRASWINCKEL et al., 2004; PETROPOULOS et al., 2004; CHARALABOPOULOS et al., 2005; GARG et al., 2006; GÜNTSCH et al., 2006). Além disso, a proliferação de fibroblastos pode

estar inibida em tabagistas (JAMES et al., 1999; CHECCI et al., 1999), o que poderia levar a um processo de cicatrização pouco eficiente.

Apesar de todas essas informações indicarem a resposta deficiente à terapia periodontal em indivíduos tabagistas (APATZIDOU et al., 2005; DARBY et al., 2005; PAHKLA et al., 2006), até o momento ainda não é decisivo se existem alterações na microbiota periodontal (UMEDA et al., 1998; CRUZ, 2006; GOMES et al., 2006; MATARAZZO, 2007) e se essa microbiota também pode influenciar esta realidade clínica. Dessa forma, o estudo da recolonização bacteriana do ambiente subgengival após a terapia de raspagem e alisamento radicular em indivíduos tabagistas e não-tabagistas com doença periodontal crônica poderá contribuir para o maior entendimento do papel da microbiota na resposta clínica ao tratamento periodontal.

1.1 Etiologia da doença periodontal

Certos microrganismos presentes nos biofilmes orais têm sido relacionados com o início e progressão da periodontite (para revisão, ver SOCRANSKY & HAFFAJEE, 2005). Porém, a simples presença dessas bactérias na cavidade bucal não determina que o indivíduo desenvolverá a doença. O equilíbrio ecológico entre a microbiota bucal e o hospedeiro na maioria das vezes é benigno e não oferece riscos para as estruturas de suporte dos dentes. Ocasionalmente, um grupo de bactérias pode proliferar ou exibir novas propriedades que levem a destruição do periodonto. Sendo assim, pode-se considerar que a doença periodontal se desenvolve a partir de um desequilíbrio na interação entre hospedeiro e microrganismos patogênicos que possuam o potencial de colonizar os biofilmes da cavidade bucal (SOCRANSKY & HAFFAJEE, 2005). O percentual de sítios colonizados por esses patógenos, os níveis dessas bactérias nos sítios colonizados, e a capacidade do organismo em combater os microrganismos agressores são condições fundamentais para o aparecimento de sinais clínicos de perda de inserção periodontal.

A comprovação da natureza infecciosa da periodontite foi definida com os estudos epidemiológicos, clínicos e microbiológicos na década de 60 (LOVDAL et al., 1958; SCHEI et al. 1959; LÖE et al., 1965; THEILADE et al. 1966; RUSSEL

1967; LÖE et al. 1967). O estudo clássico de Löe et al. (1965) de gengivite experimental promoveu a primeira evidência que o acúmulo de biofilme dental em superfícies limpas dos dentes leva ao desenvolvimento de um processo inflamatório envolvendo o tecido gengival. Seguiu-se um longo período de discussões científicas que questionavam se a destruição dos tecidos de suporte dos dentes era causada pela quantidade ou pela qualidade das bactérias que colonizavam o sulco gengival, teorias que ficaram conhecidas como “hipótese da placa não-específica” e “hipótese da placa específica”, respectivamente (NEWMAN et al., 1976; SLOTS 1976; NEWMAN & SOCRANSKY 1977; LISTGARTEN & HELLDEN 1978; ARMITAGE et al. 1982).

O desenvolvimento, na década de 90, de técnicas imunológicas e de biologia molecular para a detecção dos microrganismos que compõem os biofilmes orais foi importante para uma descrição mais precisa das espécies bacterianas subgengivais relacionadas a diferentes formas de periodontite (CHRISTERSSON et al., 1987; ÁVILA-CAMPOS et al., 1999; SOCRANSKY et al., 1994; GOMES et al., 2006). A grande vantagem dessas técnicas é a possibilidade de detecção de microrganismos fastidiosos como a Tannerella forsythia e as espiroquetas, espécies difíceis de serem detectadas pelos métodos tradicionais de diagnóstico, como a cultura bacteriana.

Socransky et al. (1994) descreveram a técnica de diagnóstico microbiológico do Checkerboard DNA-DNA Hybridization que utiliza sondas de DNA para o diagnóstico microbiológico, e analisaram as associações entre 40 espécies bacterianas presentes na microbiota subgengival de indivíduos com periodontite crônica (SOCRANSKY et al.,1998). Os autores observaram a presença de 5 complexos bacterianos principais neste ambiente subgengival, de acordo com a relação entre as diferentes espécies. Um dos complexos, composto pelas espécies T. forsythia, Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola, chamado de complexo vermelho, foi fortemente relacionado com profundidade de sondagem e sangramento à sondagem. Outro complexo, o laranja, que parece preceder a colonização do complexo vermelho foi dividido em 2 grupos, um central, composto por Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium periodonticum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens e Parvimonas micra; e outro grupo periférico, formado por Eubacterium nodatum, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter gracilis, Streptococcus constellatus. Os outros 3 complexos, o

amarelo, o verde e o roxo, demonstraram grande associação entre si e menor associação com os 2 primeiros, e são compostos por diversas espécies consideradas compatíveis com o hospedeiro. O complexo verde é formado por Capnocytophaga sputigena, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Eikenella corrodens e Aggregatibacter actinomycetemcomitans sorotipo a; o complexo amarelo é composto por um grupo de estreptococos: Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii e Streptococcus intermedius; e o complexo roxo inclui Actinomyces odontolyticus e Veillonella parvula. As espécies de Selenomonas noxia e Aggregatibacter actinomycetencomitans sorotipo b não se correlacionaram com outras espécies. Posteriormente, algumas espécies de actinomicetos (Actinomyces gerencseriae, Actinomyces israelii, Actinomyces naeslundii sorotipos 1 e 2) foram agrupadas no complexo azul (SOCRANSKY & HAFFAJEE, 2002).

1.2 Fumo de tabaco e periodontite crônica

1.2.1 Tabagismo como fator de risco para a doença periodontal

Um importante fator de risco para algumas patologias que acometem o ser humano, inclusive a doença periodontal, é certamente o fumo de tabaco (SUMMERS & OBERMAN, 1968; PREBER et al., 1980; BERGSTRÖM & ELIASSON, 1987a; BERGSTRÖM & PREBER, 1994; NUMABE et al., 1998; PALMER et al., 2005; SUSIN et al., 2005; HAMDAN et al., 2007). Diversos pesquisadores observaram uma associação positiva direta entre a periodontite e a quantidade de cigarros consumidos (BERGSTRÖM & ELIASSON, 1987b; BOLIN et al., 1993; DINI & GUIMARÃES, 1995; MARTINEZ-CANUT et al., 1995; BERGSTRÖM et al., 2000; CHEN et al., 2001; CALSINA et al., 2002; SUSIN et al., 2005; HEITZ-MAYFIELD, 2005; LEOW et al., 2006; THOMSON et al., 2006). Alguns estudos realizados em animais sugeriram que a exposição diária à nicotina pode levar a uma redução do fluxo sanguíneo gengival e aumento da perda óssea na região interradicular (NOCITI et al., 2000; NOCITI et al., 2001; NAKAMURA et al., 2005).

Alguns fatores comportamentais que poderiam influenciar os parâmetros clínicos periodontais em uma população brasileira foram estudados por Susin et al. (2005). Observou-se que indivíduos considerados tabagistas moderados (2735-7300

maços/vida) e pesados (> 7300 maços/vida) possuíam uma maior prevalência (p<0,001) de sítios com profundidade de sondagem > 5 mm (73% e 88%, respectivamente) comparados aos que nunca fumaram (56%). Fatores como idade, gênero, cor da pele, razão sócio-econômica, diabetes e presença de biofilme interdental apresentaram valores de risco relativo (RR) não superiores a 2,4, enquanto que indivíduos tabagistas pesados apresentaram um (RR) de 6,8.

Grande parte dos efeitos prejudiciais dos produtos do fumo resulta da exposição sistêmica da droga, por meio da absorção pulmonar, mas pode ocorrer também pela absorção tópica na cavidade bucal (PALMER et al., 2000). Mavropoulos et al. (2001) relataram um aumento no fluxo sanguíneo da gengiva após a aplicação tópica de fumaça de tabaco no sulco vestibular. A pressão sanguínea e os batimentos cardíacos aumentaram e o fluxo sanguíneo do dedo polegar diminuiu, confirmando os efeitos da nicotina absorvida topicamente.

Apesar da nicotina ser o principal componente psicoativo do fumo, existem diversas outras substâncias presentes no cigarro que têm efeito nocivo direto ao organismo e às suas células. O monóxido de carbono é um destes produtos, e afeta a saturação de oxigênio da hemoglobina (PALMER et al., 2005). Hanioka et al. (2000), examinando a tensão de oxigênio nas bolsas periodontais de indivíduos tabagistas e não-tabagistas encontraram uma tensão de oxigênio menor nas bolsas dos tabagistas.

Os principais mecanismos pelos quais o fumo parece afetar os tecidos periodontais são pela alteração do ecossistema bucal (STOLTENBERG et al,, 1993; HAFFAJEE & SOCRANSKY, 2001a; SHIMAZAKI et al., 2006), do calibre dos vasos sanguíneos (MIRBOD et al., 2001), da resposta inflamatória (REZAVANDI et al., 2002), da resposta imune (SOPORI & KOZAK, 1998; GARG et al., 2006; GÜNTSCH et al., 2006) e da homeostase e do potencial cicatricial dos tecidos periodontais (CHECCI et al., 1999; TYPTON & DABBOUS, 1995).

Não existem fortes evidências de que o fumo causa vasoconstrição direta nos tecidos gengivais (PALMER et al., 2005). Porém, Mirbod et al. (2001) procurando determinar o efeito em longo prazo do fumo na circunferência e na densidade dos vasos sanguíneos gengivais encontraram uma maior quantidade de vasos de pequeno calibre e uma menor quantidade de vasos de grande calibre nos tabagistas. Entretanto, a densidade vascular foi semelhante a dos não-tabagistas.

Rezavandi et al. (2002) avaliaram o efeito do fumo nos níveis de expressão das moléculas de adesão E-selectina e ICAM-1 (molécula de adesão intercelular-1) pelo endotélio dos vasos gengivais com e sem inflamação. O referido estudo demonstrou que a resposta inflamatória local em tabagistas parece não ser acompanhada pelo aumento da vascularização, o que pode explicar o sangramento gengival reduzido e a pequena migração leucocitária nestes indivíduos comparados aos não-tabagistas.

A exposição crônica ao cigarro ou à nicotina parece também prejudicar a resposta do sistema imune. Sopori & Kozak (1998) sugerem que apesar dos efeitos do fumo na resposta imune não serem claros, as propriedades imunossupressivas ou antiinflamatórias dos seus componentes podem funcionar de duas formas. A primeira seria o efeito direto do fumo sobre os linfócitos, alterando o equilíbrio da proporção Th1/Th2 ou tornando-os funcionalmente inertes; e a segunda seria o efeito indireto no sistema neuroendócrino, pela estimulação da secreção de catecolaminas e do hormônio ACTH, que estão associados à depressão imunológica.

Typton & Dabbous (1995) demonstraram uma diminuição significante na proliferação de fibroblastos gengivais em altas concentrações de nicotina, de 10 a 75 µg/mL. Foi observada uma redução na produção do colágeno tipo I e fibronectina e um aumento na atividade de colagenase no meio de cultura. Achados semelhantes foram relatados por Checci et al. (1999) quando compararam os efeitos da nicotina sobre as células de tabagistas e não-tabagistas. No entanto, os autores observaram que os fibroblastos gengivais de indivíduos tabagistas são mais eficientes na adesão e replicação quando comparados aos fibroblastos de não-tabagistas, e sugeriram que os fibroblastos de tabagistas pareciam apresentar resistência à nicotina, provavelmente na tentativa de se adaptar ao meio desfavorável ao qual estavam sujeitos.

O fato de que indivíduos tabagistas possuem respostas clínica e microbiológica ao tratamento periodontal cirúrgico e não-cirúrgico aquém do esperado quando comparados a indivíduos não-tabagistas já foi evidenciado em estudos longitudinais (APATZIDOU et al., 2005; DARBY et al., 2005). Estas respostas às terapias são dependentes da exposição ao tabaco (KALDAHL et al., 1996; GROSSI et al., 1997; LIEDEN et al., 1999), ou seja, números de cigarros consumidos e/ou duração do hábito.

1.2.2 Aspectos clínico-periodontais em indivíduos tabagistas

Preber et al. (1980) observaram em um grupo de jovens soldados (média de idade de 21,9 anos) que os tabagistas possuíam um maior índice de placa e sangramento gengival quando comparados aos jovens que não fumavam. Porém, não houve diferença estatística entre a média de profundidade de sondagem (PS) de indivíduos tabagistas (2,66 mm) e não-tabagistas (2,55 mm).

Bergström & Eliasson (1987b) examinaram 242 indivíduos, 76 tabagistas e 166 não-tabagistas. Nesta amostra, indivíduos tabagistas diferiram na média de PS de indivíduos não-tabagistas, 2,59 mm e 2,36 mm, respectivamente (p<0,05). Também, foi encontrada uma maior freqüência de sítios com PS > 4 mm nos tabagistas.

Preber et al. (1992) avaliaram 32 pacientes (17 tabagistas e 15 não-tabagistas). Foi possível observar diferenças na média de PS entre esses dois grupos, sendo que os não-tabagistas apresentavam média de PS de 3,8 mm e tabagistas de 4,3 mm (p=0,04). Os autores mostraram também que indivíduos tabagistas possuíam maior número de sítios com PS > 4 mm (p=0,05).

No que tange o aspecto clínico periodontal, Stoltenberg et al. (1993) apresentaram dados que demonstram que tabagistas com boa saúde médica possuem um menor número de dentes e maior média de profundidade de sondagem, sendo que 12,7% dos tabagistas possuíam pelo menos um sítio com profundidade de sondagem > 5,5 mm, contrapondo-se a 2,4% dos não-tabagistas.

Bergström et al. (2000), ao examinarem um grupo de 257 indivíduos (20% tabagistas, 23% ex-tabagistas, 52% não-tabagistas e 5% foram excluídos do estudo) em relação à exposição ao fumo (acima ou abaixo de 10 cigarros/dia) e à duração do hábito de fumar (mais ou menos de 15 anos de tabagismo), observaram uma forte associação entre estas variáveis e a doença periodontal. Indivíduos com história de maior exposição ao fumo possuíam uma maior freqüência de sítios afetados pela doença.

Haffajee & Socransky (2001a), em um estudo com indivíduos com periodontite crônica em diversas faixas etárias, demonstraram uma maior perda de inserção em indivíduos tabagistas em relação a indivíduos ex-tabagistas e não-tabagistas. Indivíduos mais jovens (20-41 anos, média de 31,8 anos) tabagistas tiveram perda de inserção semelhante à de indivíduos acima de 49 anos (média de 59,4) que nunca fumaram.

Apatzidou et al. (2005) selecionaram 40 indivíduos não tratados com periodontite crônica, sendo 25 tabagistas e 15 não-tabagistas. Nestes grupos não foram observadas diferenças entre os parâmetros clínicos. Ambos os indivíduos, tabagistas e não-tabagistas apresentaram média de PS de 4,4 mm e a média de NCI foi de 5,3 mm para tabagistas e de 4,9 mm para não-tabagistas (p>0,05).

Em um estudo prospectivo de 10 anos descrito por Baljoon et al., em 2005, foram avaliados 24 indivíduos tabagistas, 24 ex-tabagistas e 43 não-tabagistas portadores de periodontite crônica. Observou-se perda óssea radiográfica estatisticamente significante nos indivíduos tabagistas comparados aos não-tabagistas. Após ajuste para idade, verificaram-se diferenças tanto nos valores de perda óssea vertical, quanto nos valores para profundidade de sondagem entre os dois grupos ao longo do período de 10 anos. Os valores médios de altura óssea foram representados em porcentagem proporcional à medida da raiz, sendo que os valores iniciais foram de 80,3%, 80,7% e 85,1% (tabagistas, ex-tabagistas e não-tabagistas, respectivamente) e após 10 anos: 78%, 80% e 84,2% (p<0,01). Para profundidade de sondagem os valores médios iniciais foram de 2,2 mm, 2,1 mm e 2,0 mm; e os finais de 2,9 mm, 2,2 mm e 2,2 mm (p<0,01). Com relação à exposição ao tabaco, não houve diferenças entre indivíduos ex-tabagistas e não-tabagistas; entretanto para indivíduos tabagistas leves (63,5 a 174,8 cigarros/ano) o risco relativo de perda óssea foi de 2,3 e para tabagistas pesados (350 a 602 cigarros/ano), 5,3 (p<0,05).

Persson et al. (2005) avaliaram 882 indivíduos divididos nas categorias: tabagistas, ex-tabagistas e não-tabagistas. Os autores demonstraram não haver diferenças na freqüência de sítios com PS > 5 mm e nível clínico de inserção (NCI) > 4 mm entre os grupos. A proporção de sítios com NCI > 4 mm foi significativamente maior nos tabagistas.

Ojima et al. (2006) apresentaram um estudo onde os dados foram derivados de um levantamento de doenças dentais realizado em 1999 e conduzido

na população japonesa. A condição periodontal foi analisada pelo Índice Periodontal Comunitário (IPC). A prevalência de doença periodontal variou significativamente em relação ao hábito de fumar: 39,3%, 49,5% e 47,3% (IPC > 3), e 7,9%, 11,7% e 12,4% (IPC = 4), para o grupo que nunca fumou, para os ex-tabagistas e para aqueles considerados tabagistas no momento do estudo, respectivamente.

A fim de testar a hipótese de que indivíduos tabagistas possuem mais doença periodontal do que não-tabagistas, Baharin et al. (2006) analisaram dois grupos: 49 não-tabagistas e 39 tabagistas que fumavam no mínimo 20 cigarros/dia. Os resultados demonstraram que a proporção de sítios com 4,5 mm de perda óssea foi maior nos tabagistas do que nos não-tabagistas, sendo que as principais diferenças foram observadas nos sítios anteriores (73,3% para os tabagistas e 48,3% para os não-tabagistas).

Em 2007, Thomson et al. realizaram um levantamento de dados em 810 indivíduos nascidos em 1972 ou 1973. Os exames periodontais foram realizados nas idades de 26 e 32 anos. 48,9% dos indivíduos já haviam fumado e destes, 31,5% eram tabagistas no momento. Comparados com os indivíduos sem história de hábito de fumar (RR=5,7), aqueles que fumavam apresentaram um risco relativo de 7,1 para possuírem um sítio ou mais com no mínimo 5 mm de perda de inserção.

Millar & Locker (2007) apresentaram os seus resultados após realizarem um levantamento com 33.777 indivíduos maiores de 18 anos. Essa amostragem era representativa de uma população de aproximadamente 24 milhões de pessoas. Desta população avaliada, 24% eram tabagistas, 43% ex-tabagistas e 33% nunca tinham fumado. A prevalência de edentulismo foi 15% para os tabagistas em comparação aos 7% referentes aos indivíduos que nunca fumaram e 9% de ex-tabagistas.

1.2.3 Aspectos microbiológicos em indivíduos tabagistas

Em um estudo que utilizou método de cultura bacteriana, Preber et al. (1992) não encontraram diferenças na contagem e na prevalência de A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e P. intermedia entre indivíduos acima de 32 anos tabagistas (n=83) e não-tabagistas (n=62), em coletas de biofilme subgengival de sítios > 6 mm. Foi considerado tabagista aquele que consumia 15 cigarros ou

mais por dia. Stoltenberg et al. (1993), ao utilizarem técnica de imunofluorescência direta, também, não encontraram diferenças significantes ao testarem a prevalência de P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, E. corrodens e F. nucleatum entre tabagistas (126) e não-tabagistas (63).

Como parte do Erie County Study, foi realizada uma pesquisa sobre a microbiota bucal em uma população de 1426 voluntários, dos quais 60,8 % eram tabagistas (ZAMBON et al., 1996). Nesse trabalho foi avaliada a relação entre o consumo de cigarro e a prevalência de oito espécies bacterianas periodontopatogênicas. Foram coletadas 12 amostras de biofilme subgengival por indivíduo, sendo 6 do arco superior e 6 do arco inferior. As amostras foram coletadas com cones de papel estéreis de sítios mésio-vestibulares e foi feito um pool para cada arco, totalizando 2 amostras por indivíduo. Para a análise microbiológica foi utilizada a técnica de imunofluorescência. Nesse estudo transversal foi observado que os indivíduos tabagistas possuem um risco aumentado para a presença de A. actinomycetemcomitans e T. forsythia (3,11 e 2,32, respectivamente).

Umeda et al. (1998) também avaliaram amostras de um pool de biofilme subgengival das quatro bolsas mais profundas de voluntários tabagistas (21), não-tabagistas (145) e ex-não-tabagistas (33). Nesse estudo foi possível demonstrar que havia um risco maior de indivíduos tabagistas em apresentar T. denticola (4,61), em relação aos não-tabagistas.

Kazor et al. (1999) examinaram 55 indivíduos tabagistas, 38 ex-tabagistas e 79 que nunca fumaram. Foram coletadas de duas a quatro amostras de biofilme interproximal dos primeiros molares de cada indivíduo, totalizando 670 amostras. Estas amostras foram analisadas para a reação de hidrólise de substrato sintético de tripsina, benzoil-DL-arginina naftilamida (BANA), teste diagnóstico que detecta T. forsythia, T. denticola e/ou P. gingivalis. A maioria (81%) do total de resultados negativos para o teste BANA se deu em indivíduos que nunca fumaram. 75% dos sítios sem sangramento em tabagistas apresentaram-se positivos para o teste. Nesse trabalho, os sítios de indivíduos tabagistas possuíam uma chance quatro vezes maior em apresentar-se BANA positivos do que em sítios daqueles que nunca fumaram. Considerando-se apenas os sítios que não sangraram, esta relação foi 11 vezes maior.

Em artigo apresentado em 2001, Boström et al. investigaram a presença de P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, P. intermedia, P. nigrescens, A.

actinomycetemcomitans, F. nucleatum, P. micra, C. rectus, E. corrodens, S. noxia, S. intermedius no biofilme subgengival de 33 indivíduos tabagistas e 31 não-tabagistas. Os pesquisadores utilizaram cones de papel para a coleta, e para a análise microbiológica foi utilizado o método do Checkerboard DNA-DNA Hybridization. Foram coletadas 4 amostras de sítios com profundidade de sondagem > 5 mm em cada indivíduo, totalizando 256 amostras. Foi avaliada a prevalência dessas espécies por indivíduo e a relação entre as espécies bacterianas e a condição de tabagismo (tabagista ou não). Nesse estudo, não foram observadas diferenças na microbiota de tabagistas e não-tabagistas, com exceção na prevalência de indivíduos com bolsas profundas (> 6 mm) no que diz respeito à presença de T. forsythia (88,9% e 37,5%, respectivamente). Entretanto, os autores questionam o achado devido à quantidade pequena de indivíduos comparados e com estas características (18 tabagistas e 8 não-tabagistas).

Haffajee & Socransky (2001b) utilizaram a técnica do Checkerboard DNA-DNA Hybridization para avaliar a microbiota subgengival em indivíduos tabagistas (50), ex-tabagistas (98) e não-tabagistas (124). Os pesquisadores não encontraram diferenças estatisticamente significativas no biofilme subgengival dos 3 grupos de voluntários em bolsas maiores ou iguais a 4 mm no que se refere à contagem, proporção e prevalência das 29 espécies bacterianas avaliadas. Porém, foi observada uma maior prevalência de microrganismos do complexo vermelho (T. forsythia, P. gingivalis e T. denticola) e de algumas espécies do complexo laranja (P. intermedia, P. micra, P. nigrescens, E. nodatum, F. nucleatum ssp. vincentii) nos sítios menores de 4 mm em indivíduos tabagistas.

Em um estudo sobre o impacto do cigarro nos parâmetros clínicos e microbiológicos de indivíduos tabagistas não-tratados, Apatzidou et al. (2005) avaliaram, por meio de PCR, a presença ou ausência de alguns periodontopatógenos no biofilme subgengival do sítio mais profundo de cada quadrante em 40 indivíduos. Os autores observaram diferenças limitadas no que tange a prevalência de indivíduos portadores de P. gingivalis, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia e T. denticola. A exceção de P. gingivalis, os outros microrganismos apareceram com menor freqüência em indivíduos tabagistas. Após analisar, por meio de cultura, a presença de periodontopatógenos nos quatro sítios mais profundos de cada indivíduo (um em cada quadrante), Van der Velden et al. (2003), também, não observaram diferenças na prevalência de A.

actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia, F. nucleatum e P. micra entre 30 tabagistas e 29 não-tabagistas (média de idade 41,5 anos). Os indivíduos não-tabagistas, após se submeterem a tratamento periodontal cirúrgico e não-cirúrgico, tiveram uma redução na prevalência dos periodontopatógenos até dois anos após o tratamento. Os indivíduos tabagistas, todavia, mostraram redução apenas em P. gingivalis no mesmo período de avaliação. Outros autores também observaram uma deficiência na resposta microbiológica de indivíduos tabagistas após diferentes formas de terapia periodontal (GROSSI et al., 1997).

Gomes et al. (2006) utilizando a técnica PCR Real Time compararam os níveis de algumas bactérias (P. gingivalis, P. micra, Dialister pneumosintes, A. actinomycetemcomitans) nos sítios subgengivais de indivíduos tabagistas e não tabagistas. P. gingivalis foi encontrada em níveis similares em ambos os grupos. Números significativamente mais elevados de P. micra e D. pneumosintes foram encontrados no grupo dos indivíduos tabagistas, principalmente em bolsas moderadas e profundas.

Ainda em 2006, Cruz comparou a composição da microbiota de indivíduos brasileiros tabagistas e não-tabagistas com periodontite crônica, por meio da técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization. O grupo de não-tabagistas apresentou valores superiores na média da contagem total de espécies bacterianas (3,2 x 107) comparados aos tabagistas (2,1 x 107_{). Diferenças estatísticas foram observadas}

apenas para a contagem das espécies S. sanguinis, A. actinomycetemcomitans e L. buccalis, as quais se apresentaram diminuídas nos tabagistas. Em conclusão, os resultados deste estudo demonstraram que não houve diferenças marcantes no perfil microbiológico entre indivíduos brasileiros tabagistas e não-tabagistas com periodontite crônica.

Apesar da microbiota de indivíduos tabagistas ter sido investigada por alguns autores, muitos dos resultados desses estudos ainda são controversos (PALMER et al., 2005). Essas diferenças podem ser devido às técnicas de diagnóstico microbiológico empregadas. O método do Checkerboard DNA-DNA Hybridization (SOCRANSKY et al., 1994), utilizado no presente estudo, permite uma avaliação sistemática da microbiota bucal por meio da detecção e quantificação de um grande número de amostras e de espécies bacterianas, viabilizando a realização de estudos ecológicos e terapêuticos de infecções mistas, como a periodontite crônica.

É também importante destacar que estudos recentes sugerem possíveis diferenças na microbiota bucal entre diferentes regiões geográficas (COLOMBO et al., 2002; LOPEZ et al., 2004; HAFFAJEE et al., 2004; NATTO et al., 2005). Utilizando a técnica do Checkerboard DNA-DNA Hybridization, Haffajee et al. (2004) compararam a composição da microbiota subgengival de indivíduos com periodontite crônica de quatro países, Brasil, EUA, Suécia e Chile. Diferenças importantes foram observadas nas proporções de diversas cepas testadas, principalmente dos patógenos do complexo vermelho. Os indivíduos suecos mostraram as menores proporções de P. gingivalis e T. denticola (1,6% e 0,7%, respectivamente); enquanto que os chilenos mostraram as maiores proporções de P. gingivalis (11,7%) e os brasileiros de T. denticola (6,7%). Essas possíveis diferenças microbiológicas entre as regiões geográficas têm efeito clínico direto. Uma vez que o tratamento de uma infecção deve ser direcionado para os agentes etiológicos, o diagnóstico exato de cada condição clínica periodontal, incluindo os diferentes grupos de risco, realizado em cada país, será fundamental para a aplicação de terapias periodontais mais específicas.

2 PROPOSIÇÃO

Avaliar a resposta clínica periodontal e a recolonização bacteriana do ambiente subgengival após a terapia de raspagem e alisamento radicular (RAR) em indivíduos tabagistas e não-tabagistas com doença periodontal crônica.

3 MATERIAL E MÉTODO

Foram selecionados para este estudo 30 indivíduos, sendo 15 tabagistas (Grupo T) e 15 não-tabagistas (Grupo NT) com doença periodontal crônica. A seleção foi realizada na Clínica Odontológica da Universidade Guarulhos - UnG por dois alunos mestrandos em periodontia sob a supervisão dos professores da disciplina. Todos os participantes foram informados dos objetivos do estudo, de seus riscos e benefícios, incluindo os tipos de medições clínicas. A participação na pesquisa foi voluntária e os indivíduos que concordaram em participar assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE, responderam a um questionário de saúde/anamnese e receberam a terapia periodontal gratuitamente, estando de acordo com as diretrizes e normas do Conselho Nacional de Saúde (Resolução nº196/96). O projeto foi submetido à apreciação e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da Universidade Guarulhos.

3.2 Critérios de inclusão e exclusão

Critérios de inclusão

Para a inclusão no estudo, a seleção dos participantes respeitou os seguintes critérios:

- Indivíduos voluntários portadores de doença periodontal crônica; - Idade igual ou superior a 30 anos;

- Possuir no mínimo 15 dentes naturais, exceto terceiros molares;

- Apresentarem no mínimo 06 dentes com pelo menos um sítio interproximal com profundidade de sondagem entre 5 e 7mm e nível clínico de inserção entre 5 e 10mm, não contíguos, preferencialmente distribuídos em sextantes distintos.

Ponto de corte para tabagistas e não-tabagistas: Foram considerados tabagistas aqueles que declararam o uso diário de 10 ou mais cigarros de tabaco industrializados por pelo menos 05 anos (AMMENHEUSER et al., 1997; KERDVONGBUNDIT & WIKESJO, 2000). Foram considerados não tabagistas aqueles que declararam nunca ter tido o hábito de fumar.

Critérios de exclusão

Os critérios de exclusão foram os seguintes:

- História de terapia antibiótica nos últimos 06 meses; - Tratamento periodontal nos últimos 06 meses;

- Uso de antissépticos orais nos últimos 06 meses;

- História de doença sistêmica que comprometa a resposta ao tratamento, ou que exija medicação profilática ao tratamento;

- Gestantes ou lactantes; - Extensas reabilitações

3.3 Delineamento experimental

O protocolo experimental deste estudo está sumarizado na Figura 1. Cada grupo (T ou NT) apresentava 15 indivíduos. Para o cálculo dessa amostragem foi realizado cálculo de potência para os parâmetros clínicos e microbiológico, baseando nos resultados dos estudos de Ximenez-Fyvie et al. (2000) e Feres et al. (1999 e 2001), encontrando uma potência superior a 80% para uma amostragem de 15 indivíduos. Inicialmente todos os indivíduos receberam monitoramento clínico e microbiológico, de acordo com o protocolo especificado nas duas sessões seguintes (ver 3.4 Monitoramento clínico e 3.5 Monitoramento microbiológico), seguido de raspagem supragengival de todos os dentes e instrução de higiene oral. Todos os voluntários foram orientados a utilizar o mesmo dentifrício contendo triclosan/gantrez (Colgate Total®, Anakol Ind. Com. Ltda-Kolynos do Brasil – Colgate Palmolive Co, São Bernardo do Campo, SP, Brasil). A terapia básica de raspagem (RAR) foi realizada de 04 a 06 sessões e finalizada, no máximo, em 21 dias.

No dia 0 (zero), que correspondeu à data final da terapia básica de RAR, e aos 42, 63 e 180 dias após a RAR, os indivíduos foram monitorados microbiologicamente. A avaliação clínica foi repetida aos 90 e 180 dias após o término da RAR. Aos 90 dias pós-terapia os pacientes receberam manutenção periodontal.

Os profissionais envolvidos na execução do estudo não tinham o conhecimento sobre a qual grupo o indivíduo pertencia (Grupo T ou Grupo NT).

Além disto, o profissional que realizou os exames clínicos e as coletas microbiológicas não foi o mesmo que realizou a terapia de RAR.

CL M RSP MT MT IHO CL CL Grupo T/NT M M M M RAR -21 0 42 63 90 180 dias

CL:Monitoramento Clínico RAR:Raspagem e Alisamento Radicular M:Monitoramento Microbiológico MT: Manutenção

RSP: Raspagem Supragengival Grupo T: Tabagistas

IHO: Instrução de Higiene Oral Grupo NT: Não-Tabagistas Figura 1. Delineamento experimental.

3.4 Monitoramento clínico

O monitoramento clínico foi realizado no momento inicial, 90 e 180 dias após o término da RAR, por meio de sondas periodontais milimetradas manuais Carolina do Norte PCPUNC-BR 15 (HuFriedy do Brasil, Rio de Janeiro, RJ, Brasil).

As mensurações clínicas foram realizadas em 06 sítios por dente (mesiovestibular, vestibular, distovestibular, mesiolingual, lingual, distolingual), em todos os dentes, exceto os terceiros molares. Os dados obtidos foram registrados na ficha de exame periodontal. Foram avaliados os seguintes parâmetros clínicos:

Índice de Placa Visível – IPV (AINAMO & BAY, 1975): Observa-se a presença

(escore 1) ou ausência (escore 0) de placa ou biofilme dental supragengival visível, após lavagem e secagem dos dentes.

Índice de Sangramento Gengival – ISG (AINAMO & BAY, 1975): Observa-se a

presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de sangramento na gengiva marginal após percorrer levemente com a sonda periodontal ao longo do sulco gengival.

Profundidade de Sondagem – PS: Distância, em milímetros, entre a margem

Nível Clínico de Inserção – NCI: Distância, em milímetros, entre a junção

esmalte-cemento e a porção mais apical sondável do sulco/bolsa periodontal.

Sangramento à Sondagem – SS: Presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de

sangramento até 20 segundos após a sondagem com sonda periodontal milimetrada.

Supuração – SUP: Presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de supuração até

20 segundos após a sondagem com sonda periodontal milimetrada.

Dois examinadores foram treinados e calibrados com o objetivo de conseguir a máxima reprodutibilidade nas medições realizadas por cada um deles e entre eles. A metodologia utilizada para a calibração foi preconizada por Araujo et al. (2003), que avaliaram o erro padrão da medida (e.p.m.) e o erro médio percentual (e.m.p.) para os parâmetros clínicos periodontais contínuos (profundidade à sondagem e nível clínico de inserção). O e.p.m. e o e.m.p. variaram entre 0,09mm-0,31mm e 2,0%-5,79%, respectivamente. Para as variáveis categóricas, considerando a presença ou ausência do parâmetro clínico, foi realizada a média do nível de concordância para cada examinador e entre eles, obtendo-se concordância superior a 92% (Teste Kappa).

3.5 Monitoramento microbiológico

O monitoramento microbiológico foi realizado no momento inicial, logo após o término da RAR, e aos 42, 63 e 180 dias.

3.5.1 Seleção dos sítios-teste

Amostras de biofilme subgengival foram coletadas de seis sítios/indivíduo apresentando profundidade de sondagem inicial entre 5-7mm e nível clínico de inserção entre 5-10mm. Estes sítios estavam localizados em faces dentais interproximais não-contíguas, e preferencialmente distribuídos em sextantes distintos. Sítios localizados em dentes com próteses mal adaptadas, lesão de cárie extensa e/ou lesão endo-periodontal não foram utilizados.

3.5.2 Checkerboard DNA-DNA Hybridization

Cepas bacterianas e condições de crescimento

A lista das 38 cepas bacterianas utilizadas neste estudo para o preparo das sondas de DNA está apresentada na Tabela 1. Todas as cepas foram adquiridas liofilizadas da ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) ou do Forsyth Institute (Boston, MA, USA). O conteúdo liofilizado foi reidratado em caldo para crescimento de Mycoplasma (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) e cultivado em ágar triptose de soja contendo 5% de sangue de ovelha desfibrinado (BBL, Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD, USA) a 35oC sob condição de anaerobiose (80% N2, 10% CO2, 10%H2). Algumas bactérias foram

cultivadas em meios de cultura enriquecidos de forma a suprir suas necessidades nutricionais. T. forsythia, por exemplo, foi cultivada em ágar triptose de soja com 5% de sangue de ovelha desfibrinado e 10 µg/ml de ácido N-acetil murâmico (NAM) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA); enquanto P. gingivalis cresceu em um meio similar, suplementado com 5% de sangue de ovelha desfibrinado, 0,3µg/ml de menadiona (Sigma) e 5µg/ml de hemina (Sigma). T. denticola e T. socranskii foram cultivados em caldo para crescimento de Mycoplasma (Difco) suplementado com 1mg/ml de glicose, 400µg/ml de niaciamida, 150µg/ml espermina tetraidroclorídrica, 20µg/ml de isobutirato de Na, 1mg/ml de L-cisteína, 5µg/ml de tiamina pirofosfato e 0,5% de soro bovino.

Isolamento do DNA e preparo das sondas

As cepas bacterianas foram anaerobicamente cultivadas na superfície de ágar-sangue contido em placas de Petri, com exceção das 2 espécies de espiroquetas, que foram cultivadas em caldo de cultura, por 3 a 7 dias. As colônias foram raspadas e depositadas em tubos de microcentrífuga de 1,5ml contendo 1ml de solução TE (10 mM Tris-HCl, 0,1mM EDTA, pH 7,6). As células foram lavadas 2 vezes por centrifugação na solução-tampão de TE a 3.500 gp por 10 minutos. Em seguida, as células das cepas Gram-negativas foram novamente suspensas e lisadas com SDS (dodecilsulfato de sódio, C12H25NaO4S) a 10% e proteinase K em

150µl de uma mistura enzimática contendo 15mg/ml de lisozima (Sigma) e 5mg/ml de acromopeptidase (Sigma) em solução tampão de TE (pH 8,0). O DNA foi isolado e purificado como descrito por Smith et al. (1989). As sondas multi-genômicas (whole-genomic) foram preparadas para cada uma das 38 espécies pela marcação de 1µg do DNA bacteriano com digoxigenina, por meio do random primer digoxigenin labeling kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA), de acordo com o método descrito por Feinberg & Vogelstein (1983). As espécies bacterianas avaliadas foram selecionadas segundo sua associação com diferentes tipos de doenças ou saúde periodontal (HAFFAJEE & SOCRANSKY, 1994).

Coleta de amostras de biofilme subgengival

Após a remoção do biofilme supragengival, as amostras de biofilme subgengival foram coletadas utilizando curetas Gracey do tipo mini-five (HuFriedy do Brasil, Rio de Janeiro, RJ, Brasil), posicionadas na porção mais apical dos 6 sítios previamente selecionados para o exame microbiológico. As amostras foram imediatamente depositadas em tubos plásticos individuais contendo 150µl de solução TE (pH 7,6), ao qual foram adicionados 100µl de NaOH a 0,5 M para que o DNA bacteriano permanecesse viável por longos períodos de tempo. Estes tubos foram então identificados e armazenados até serem analisados por meio da técnica do Checkerboard DNA-DNA Hybridization para as 38 cepas bacterianas descritas na Tabela 1, no laboratório de microbiologia da Universidade Guarulhos.

Tabela 1. Relação das cepas empregadas para a confecção das sondas de DNA. As

espécies estão agrupadas por complexos bacterianos (Socransky et al., 1998; Socransky & Haffajee, 2002).

Espécies Cepas Espécies Cepas

A Accttiinnoommyycceesssspp CCoommpplleexxooLLaarraannjjaa((ccoonntt..) ) Actinomyces gerencseriae 23860a Actinomyces israelii 12102a Fusobacterium nucleatum ssp. nucleatum 25586a Actinomyces naeslundii I 12104a C CoommpplleexxooRRooxxoo Fusobacterium nucleatum ssp. polymorphum 10953a Actinomyces odontolyticus 17929a Veillonella parvula 10790a Fusobacterium nucleatum ssp. vincentii 49256a C CoommpplleexxooAAmmaarreelloo Fusobacterium periodonticum 33693a

Streptococcus gordonii 10558a Parvimonas micra 33270a

Streptococcus intermedius 27335a Prevotella intermédia 25611a

Streptococcus mitis 49456a Prevotella nigrescens 33563a

Streptococcus oralis 35037a Streptococcus constellatus 27823a

Streptococcus sanguinis 10556a _{CCoommpplleexxooVVeerrmmeellhhoo}

C

CoommpplleexxooVVeerrddee Tannerella forsythia 43037a

Aggregactibacter 43718a _{Porphyromonas gingivalis 33277}a

actinomycetemcomitans a + b 29523a _{Treponema denticola B1}b

Capnocytophaga gingivalis 33624a OOuuttrraassEEssppéécciieess

Capnocytophaga ochracea 33596a Eubacterium saburreum 33271a

Capnocytophaga sputigena 33612a Gemella morbillorum 27824a

Eikenella corrodens 23834a Leptotrichia buccalis 14201a

C CoommpplleexxooLLaarraannjjaa Prevotella melaninogenica 25845a Campylobacter gracilis 33236a Campylobacter rectus 33238a Propionibacterium acnes I + II 11827a 11828a

Campylobacter showae 51146a Selenomonas noxia 43541a

Eubacterium nodatum 33099a Streptococcus anginosus 33397a

Treponema socranskii S1b

a _{ATCC (American Type Culture Collection)} b_{Forsyth Institute}

Hibridização DNA-DNA

As suspensões contidas nos tubos foram fervidas em banho-maria por 10 minutos e, em seguida, neutralizadas pela adição de 0,8 ml de acetato de amônia a 5 M. Cada suspensão de biofilme bacteriano contendo o DNA livre foi depositada em uma das canaletas do Minislot (Immunetics, Cambridge, MA, USA- Figura 2) ficando, assim, concentrada em uma membrana de nylon (15 x 15cm) com carga positiva (Boehringer Mannheim). As duas últimas canaletas do Minislot (Immunetics) foram ocupadas por controles contendo uma mistura do DNA das espécies de microrganismos investigadas pelas sondas, nas concentrações correspondentes a 105 e 106 células, ou seja, 1ng e 10ng de DNA de cada espécie, respectivamente (Socransky et al., 1994; Haffajee et al., 1997a, b). A membrana foi então removida do Minislot (Immunetics) e o DNA nela concentrado foi fixado por meio de aquecimento em forno a 120º C por 20 minutos.

Figura 2. Representação gráfica do Minislot (Immunetics, Cambridge, MA, USA) e resumo da

preparação e deposição das amostras de biofilme subgengival (técnica Checkerboard DNA-DNA

Hybridization).

A membrana foi pré-hibridizada a 42º C, por 1 hora, em uma solução contendo 50% de formamida, 1% de caseína (Sigma), 5 x standard saline citrate -SSC (1 x -SSC = 150mM NaCl, 15mM de citrato de sódio, pH 7,0), 25 mM de fosfato de sódio (pH 6,5) e 0,5 mg/ml de RNA de levedura (Boehringer Mannheim).

Em seguida, a membrana foi posicionada no Miniblotter (Immunetics, Figura 3) com as linhas de DNA perpendiculares às canaletas do aparato. Em cada canaleta do Miniblotter (Immunetics) foi adicionada uma sonda de DNA (diluída a aproximadamente 20ng/ml) em 130 µl de uma solução de hibridização composta de 45% de formamida, 5 X SSC, 20 mM de fosfato de sódio (pH 6,5), 0,2 mg/ml de RNA de levedura (Boehringer Mannheim), 10% de sulfato de dextrano e 1% de caseína (Sigma). A hibridização ocorreu por um período mínimo de 20 horas, a 42º C.

Figura 3. Representação gráfica do Miniblotter (Immunetics, Cambridge, MA, USA) e resumo das

etapas de hibridização e detecção das espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival (técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization).

Detecção das espécies

Após o período de hibridização, a membrana foi removida do Miniblotter (Immunetics) lavada por 40 minutos, a 65ºC numa solução adstringente composta de 1% de SDS, 1mM de EDTA e 20mM de Na2HPO4, a fim de remover as sondas que

não hibridizaram completamente. Em seguida, a membrana foi imersa por 1 hora em uma solução contendo 1% de ácido maleico (C4H4O4), 3 M de NaCl, 0,2 M de NaOH,

0,3% de Tween 20, 0,5% de caseína, pH 8,0, e, logo após, por 30 minutos, na mesma solução contendo o anticorpo anti-digoxigenina conjugado à fosfatase alcalina em uma concentração de 1:10.000. A membrana foi depois lavada 2 vezes, por 20 minutos, em uma solução de 0,1 M de ácido maleico, 3 M de NaCl, 0,2 M de NaOH, 0,3% de Tween 20, pH 8,0, e 1 vez, por 5 minutos, em uma solução de 0,1 M de Tris HCl, 0,1M de NaCl, 50 mM de MgCl2, pH 9,5.

Os próximos passos foram a incubação da membrana por 45 minutos a 37oC em uma solução detectora à base de fosfatase alcalina, CDP-StarTM Detection Reagent (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, England, UK). A seguir, a membrana foi colocada em um cassete, Chassi Radiográfic 30x40cm (Konex, Ind. Bras., SP, Brasil), sob um filme radiográfico de marca KodakX-Omat K, 18x24cm (Kodak Brasileira Com. e Ind. Ltda, São José dos Campos, SP, BR) por 40 minutos. O filme foi posteriormente revelado (Figuras 4 e 5) manualmente pelo

método convencional temperatura-tempo, de acordo com orientações do fabricante. As soluções utilizadas foram da marca Kodak, sempre mantidas à temperatura de 20ºC.

Figura 4. Representação gráfica do padrão de hibridização entre as bactérias presentes nas

amostras de biofilme e as sondas de DNA (técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization).

Figura 5. Representação esquemática do padrão de hibridização entre as bactérias presentes nas

amostras de biofilme e as sondas de DNA (técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization). Nesta figura estão apresentadas 40 bactérias, e as amostras de biofilme são de todos os dentes de um mesmo indivíduo.

A leitura dos filmes radiográficos foi realizada por um único examinador treinado, da seguinte forma: cada sinal produzido por uma determinada sonda na amostra de placa foi comparado em intensidade ao sinal produzido pela mesma sonda nos dois controles contendo 105 e 106 bactérias. Desta forma, o número 0 foi registrado quando não houve detecção do sinal; 1 equivaleu a um sinal menos intenso que o controle de 105 células; 2 equivaleu a aproximadamente 105 células; 3, entre 105 e 106 células; 4 aproximadamente 106 células e 5, mais de 106 células (Tabela 2). Estes registros foram então utilizados para determinar os níveis das diferentes espécies investigadas nos sítios e indivíduos do estudo.

Tabela 2. Índice utilizado para a determinação dos níveis dos microrganismos nas amostras de

biofilme subgengival.

ÍNDICE NÍVEL DO MICRORGANISMO CONTAGEM

0 Não detectado 0 1 Menos de 105 células 10.000 2 Aproximadamente 105 _{células 100.000} 3 Entre 105 e 106 células 500.000 4 Aproximadamente 106 _{células 1.000.000} 5 Mais de 106 células 10.000.000

3.6 Procedimento terapêutico - Terapia periodontal básica

Após o registro das medidas clínicas e coleta de placa subgengival para a análise microbiológica todos os indivíduos foram submetidos a sessões de adequação do meio bucal que incluíam instrução de higiene oral, raspagem supragengival de todos os dentes, desgaste de restaurações em excesso, selamento provisório das lesões cariosas cavitadas, curativos endodônticos e exodontias. Durante as sessões de instrução de higiene oral, os indivíduos foram orientados a utilizar escovas com cerdas macias, juntamente com creme dental Colgate Total® (Colgate Total®_{, Anakol Ind. Com. Ltda-Kolynos do Brasil – Colgate}