UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA
“Produção de rainhas em colônias órfãs e as mudanças no perfil de hidrocarbonetos cuticulares durante o seu desenvolvimento em Frieseomelitta
languida Moure, 1990 (Hymenoptera, Apidae, Meliponini)”
João Paulo Roma Fadil
Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: Entomologia.
RIBEIRÃO PRETO – SP 2014
João Paulo Roma Fadil
“Produção de rainhas em colônias órfãs e as mudanças no perfil de hidrocarbonetos cuticulares durante o seu desenvolvimento em Frieseomelitta
languida Moure, 1990 (Hymenoptera, Apidae, Meliponini)”
Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: Entomologia.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento
RIBEIRÃO PRETO – SP 2014
i Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Fadil, João Paulo Roma
Produção de rainhas em colônias órfãs e as mudanças no perfil de hidrocarbonetos cuticulares durante o seu desenvolvimento em Frieseomelitta languida Moure, 1990 (Hymenoptera, Apidae, Meliponini)
xx
43 p. : il.
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Entomologia.
Orientador: Nascimento, Fábio Santos do
1. Abelhas sem ferrão. 2. Comportamento animal. 3. Rainha Virgem 4. Rainha fisogástrica 5. Perfil cuticular.
ii Nome: Fadil, João Paulo Roma
Título: Produção de rainhas em colônias órfãs e as mudanças no perfil de hidrocarbonetos cuticulares durante o seu desenvolvimento em Frieseomelitta languida Moure, 1990 (Hymenoptera, Apidae, Meliponini)
Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: Entomologia.
Aprovado em: Banca Examinadora Prof(a).:________________________________________________________________ Dr(a).:_________________________________________________________________ Instituição:_____________________________________________________________ Parecer:________________________________________________________________ Assinatura:_____________________________________________________________ Prof(a).:________________________________________________________________ Dr(a).:_________________________________________________________________ Instituição:_____________________________________________________________ Parecer:________________________________________________________________ Assinatura:_____________________________________________________________ Prof(a).:________________________________________________________________ Dr(a).:_________________________________________________________________ Instituição:_____________________________________________________________ Parecer:________________________________________________________________ Assinatura:_____________________________________________________________ Ribeirão Preto______de________________de 2014.
iii Dedico este trabalho aos meus pais, Paulo e Célia,
e à minha irmã Bárbara, que me ensinaram a viver a vida como eu vivo
iv Agradecimentos
Ao meu orientador Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento pelos ensinamentos e confiança; Ao Ms. Lucas Garcia Von Zuben (Salsas) pela ajuda na preparação do equipamento usado nas análises químicas;
Ao Dr. Túlio Marcos Nunes pelos ensinamentos e dicas ao longo do desenvolvimento do trabalho;
Ao Dr. Sidnei Mateus pela ajuda com a aquisição e manutenção de todas as colônias;
À Dra. Maria Cláudia Guidetti Campos pela ajuda na identificação dos compostos. Sem essa ajuda este trabalho não seria se realizado;
À Sra. Izabel Cristina Casanova Turatti (Cristina Turatti) pela ajuda na identificação de compostos químicos;
À Dra. Maria Juliana Ferreira Caliman pela ajuda na identificação dos compostos;
À minha namorada Letícia Biral de Faria (Xinxa), por todo o suporte e por ter me empurrado pra frente quando eu não via mais saídas;
À mãe da Xinxa, Clarice, por todas as estadias e todos os açaís;
Aos amigos de Ribeirão Preto, pelas noites passadas em claro e boas risadas nas rodas noturnas; À minha mãe, meu pai e minha irmã, pela paciência e conversas;
Aos amigos da Bio 43 pelo carinho e risadas durante todos esses anos; Aos colegas de laboratório por toda a ajuda e conversas diárias;
Ao Programa de Pós-Graduação em Entomologia e à Secretária Renata Cavallari pelo apoio durante o período de estudo;
v Resumo
Compostos químicos presentes nas cutículas dos artrópodes têm se mostrado uma importante ferramenta para entender a base da comunicação nesses animais. Insetos sociais são um modelo muito usado para o estudo de tais compostos. Esses estudos mostram que em alguns insetos sociais existem compostos responsáveis por informar espécie, idade, sexo, parentesco, entre outros aspectos biológicos. Nos insetos sociais estudos mostram que para os grupos que apresentam conspícua divisão do trabalho reprodutivo, que indivíduos férteis possuem compostos que os separam dos indivíduos não férteis. Além disso, para algumas abelhas eussociais, sabe-se que a rainha, o indivíduo fértil da colônia, quando emerge possui compostos bem diferentes daqueles presentes em rainhas após a cópula. Sabendo disso, o objetivo desse trabalho foi investigar sistematicamente as mudanças nos compostos cuticulares de rainhas virgens durante a sua vida até o momento em que elas iniciam suas posturas. Para isso foram utilizadas 15 colônias de Frieseomelitta languida, todas orfanadas. Com a emergência das rainhas em cada colônia seus compostos cuticulares foram extraídos utilizando-se um protocolo de extração não letal, com um intervalo de três dias entre cara extração. Os compostos cuticulares obtidos mostraram que, em concordância com trabalhos anteriores, rainhas fisogástricas e rainhas virgens possuem perfis cuticulares diferentes. As análises também mostraram que as mudanças nesses perfis ocorrem de maneira rápida, dado que extrações realizadas com três dias de intervalo, uma antes e outra depois da cópula, apresentaram compostos completamente diferentes. Os compostos químicos principais que caracterizaram as rainhas virgens foram alcanos lineares, alcanos ramificados, acetatos e ésteres, enquanto que nas rainhas fisogástricas os alcenos foram bastante significativos.
vi Abstract
Chemical compounds that are present in the cuticle of the arthropods have been shown to be an important tool to understand the basis of the communication in these animals. Social insects are a commonly used model to this kind of study. Other studies showed that these insects have some compounds responsible for informing the species, sex, age, relatedness, among other biological aspects. It has also been shown that in social insects that present reproductive division of labor, the reproductive individuals have significantly different cuticular compounds compared to non-reproductive individuals. Studies on social bees showed that virgin queens and physogastric queens also have significant different cuticular compounds. With that in mind, the objective of this work is to study the differences between recent emerged queens, virgin queens, and physogastric queens. To do this, 15 colonies of Frieseomelitta languida were experimentally orphaned. When the queens of those colonies emerged, they had their cuticular compounds extracted by a non-lethal extraction protocol. The queens had their compounds extracted every three days. The extracted compounds showed that virgin and physogastric queens were very different,concerning their cuticular profile, as it was shown before by other studies. Cuticular hydrocarbons also changed along the life of virgin queens to specific profile of physogastric queens. Virgin queens presented higher proportion of alkanes, branched alkanes, acetates and esters in their cuticular profiles, while mated queens presented higher proportion of alkenes.
vii Sumário 1. Introdução ... 1 2. Material e Métodos ... 9 2.1 Área de estudo ... 9 2.2 Espécie estudada ... 9 2. 3 Coleta de dados ... 12 2.3.1 Análises comportamentais ... 12 2.3.2 Análises químicas ... 12 2.4 Análise de dados ... 14 4. Resultados ... 16 5. Discussão ... 26 6. Bibliografia ... 30
1 1. Introdução
Alguns dos comportamentos mais inconspícuos que podem ser observados estão associados à comunicação entre indivíduos. Comunicação, esta, que media a reprodução e a sobrevivência em animais (McGregor, 2005). Comunicação consiste em um comportamento dependente de três componentes básicos: o comunicador, o indivíduo que envia um sinal; o sinal, a informação a ser enviada; e o receptor, o indivíduo que recebe o sinal (McGregor, 2005). A comunicação, então, consiste no ato de um comunicador enviar um sinal para um receptor (McGregor, 2005). Animais se comunicam de diversas maneiras. Dentre elas, pode-se citar: som, vibrações, sinais visuais, posturas corporais e compostos químicos. A forma de comunicação que cada animal utiliza depende do ambiente em que ele está se inserido e das características do animal (Scott, 2005).
Animais que utilizam de pistas químicas para comunicação precisam que os compostos químicos utilizados atinjam o organismo que recebe o sinal. Para isso, os indivíduos que enviam o sinal podem depositar o sinal no substrato ou no próprio indivíduo recebedor do sinal. Os sinais químicos podem ainda ser enviados pelo ar ou difundidos na água (Scott, 2005) e podem estar presentes no corpo do animal comunicador (Blomquist, 2010).
Compostos químicos presentes no corpo do animal são comuns entre os artrópodes. Esses animais possuem compostos sobre sua cutícula que estão associados à comunicação e que, em sua maioria, são hidrocarbonetos de cadeia longa. Cutícula ou epicutícula é uma camada fina e acelular que recobre todo o indivíduo (Triplehorn & Jonnson, 2011). Os hidrocarbonetos teriam como sua função inicial proteger os insetos da perda de água para o ambiente (Lockey, 1988). Porém, secundariamente, esses compostos têm função comunicativa, podendo conter informações como a identidade da
2 espécie, sexo do indivíduo e diversas características importantes para comportamentos associados à corte nesses animais (Lockey, 1988; Howard & Blomquist, 2005; Nunes, 2008).
Dentre os artrópodes, os himenópteros sociais compõem um grupo de táxons que utiliza a comunicação química de maneira extremamente eficiente (Hölldobler & Wilson, 1990). Alguns representantes desse grupo, como as formigas, apresentam desde um pouco complexo até um alto grau de socialidade, sendo os indivíduos divididos por castas e funções. Nas formigas, os hidrocarbonetos cuticulares oferecem informações como relação genética, a que casta cada indivíduo pertence, se o indivíduo pertence ou não à mesma colônia e podem ainda mostrar o status reprodutivo do indivíduo (Blomquist, 2010).
A divisão de trabalho em um ninho, ou o sistema de castas, é exemplificada na presença de, normalmente, um único indivíduo reprodutivamente ativo, a rainha, e os indivíduos inférteis, as operárias. A rainha é o indivíduo responsável pela reprodução dentro da colônia, realizando a função de postura no ninho. São as operárias que realizam todas as funções para a manutenção da colônia, como o forrageamento, a obtenção de alimento, a construção de potes de alimento e de células de cria, a defesa, reparos e manutenção da colônia. Alguns machos podem estar presentes na colônia, porém não exercem nenhuma função não relacionada a reprodução (Michener, 2007).
Os Meliponini (Apidae), junto com os Apini, apresentam o nível mais avançado de socialidade entre os insetos sociais, a eussocialidade avançada. As características que definem esse tipo de eussocialidade são: a sobreposição de gerações, o cuidado cooperativo com a prole e a divisão do trabalho reprodutivo entre os indivíduos de uma mesma colônia (Wilson, 1971; Michener, 2007). Além disso, em Meliponini é possível caracterizar: colônias perenes, diferenciação entre castas, inabilidade da rainha de
3 fundar uma nova colônia, arquitetura elaborada do ninho, complexo sistema de comunicação, armazenamento de grandes quantidades de alimento e eficiente mecanismo de termorregulação (Sakagami, 1982).
Os Meliponini, conhecidos popularmente como abelhas sem ferrão, possuem distribuição majoritariamente Pantropical e na região Neotropical concentra-se o maior número de espécies descritas (Sakagami, 1982). É um grupo antigo entre as abelhas, com cerca de 65 milhões de anos (Grimaldi, 1999; Engel, 2006), grande e diversificado, com algumas centenas de espécies distribuídas em cerca dos 60 gêneros existentes (Roubik, 2006). Os Meliponini são um grupo de abelhas de valor ecológico e econômico no Brasil sendo responsáveis pela polinização de 40 a 90% da flora nativa, dependendo do ecossistema (Kerr et al., 1996), e também de algumas espécies de interesse econômico (Slaa et al., 2006). Além de importantes polinizadores, muitas dessas abelhas produzem mel de alta qualidade e podem ser utilizadas para esse fim (Slaa et al., 2006).
As abelhas sem ferrão constroem seus ninhos, mais comumente, em ocos de árvores, em paredes e alicerces (ninhos internos). Alguns gêneros como Paratrigona,
Geotrigona, Trigona e Melipona constroem ninhos subterrâneos, utilizando cavidades
preexistentes no solo. Outras espécies utilizam ninhos de outros insetos sociais para construir seus ninhos, como é o caso de Scaura latitarsis (Friese, 1900) que faz seus ninhos em termiteiros arbóreos (Kerr et al.., 1967), e Trigona cilipes (Fabricius, 1804) que utiliza ninhos de vespas sociais (Rasmussen, 2004). Os ninhos das abelhas sem ferrão também podem ser expostos e aéreos como é o caso de Trigona hyalinata (Lepeletier, 1836) e Trigona spinipes (Fabricius, 1793) (Rasmussen & Camargo, 2008).
O material utilizado na construção dos ninhos é na maioria das vezes o cerume, mistura de cera produzida pela própria abelha e resinas vegetais. Porém, outros
4 materiais podem ser utilizados, tais como terra, material de origem vegetal e fezes (Sakagami, 1982). Uma característica interessante das abelhas sem ferrão é a diversidade na arquitetura da entrada de seus ninhos. Alguns gêneros têm entradas únicas e elas diferem-se em relação ao material utilizado, ao tamanho e à presença ou não de um tubo (Siqueira et al., 2007). Essas características únicas da entrada de seus ninhos podem ser usadas como caráter taxonômico dentro do grupo (Sakagami, 1982).
Os Meliponini possuem um processo comportamental padronizado ligado a produção de ovos da colônia. O processo de aprovisionamento e postura (Provisioning
and Oviposition Process, POP) das células de cria para a produção de novos indivíduos
nas abelhas sem ferrão é autapomórfico entre os insetos sociais. As interações entre rainha e operárias são complexas, o aprovisionamento da célula é massal e as células de cria são utilizadas uma única vez, sendo então, dezenas de células são construídas diariamente (Sakagami, 1982; Zucchi et al., 1999). As operárias de algumas espécies da tribo Meliponini podem desenvolver os ovaríolos em colônias com rainha, podendo produzir ovos tróficos e reprodutivos simultaneamente. Esses ovos podem fazer parte do processo de oviposição da rainha, que se alimenta do ovo da operária antes de colocar o seu próprio ovo na célula aprovisionada. Operárias de Trigona cilipes desenvolvem os ovaríolos, mas nunca realizam postura (Silva-Matos et al., 2006) e outras espécies como Frieseomelitta varia (Lepeletier, 1836) nunca desenvolvem ovaríolos (Boleli et al., 1999, 2000; Faustino et al., 2002).
Na ausência de uma rainha realizando posturas as abelhas possuem mecanismos variados de produção de uma nova rainha. Sendo esses mecanismos por diferença quantitativa de alimento, diferença qualitativa de alimento e ainda por fatores genéticos combinados à quantidade de alimento oferecida à larva (Faustino et al., 2002).
5 No gênero Apis (Apidae, Apini) as larvas são alimentadas de forma progressiva e, para isso, a célula com a larva é mantida aberta durante todo o período de alimentação. As larvas que darão origem a rainhas e as larvas que darão origem a operárias são alimentadas de forma diferente durante o seu desenvolvimento. A principal diferença nesse caso está na qualidade do alimento dado a cada casta (Michener, 1974). Uma larva que irá se tornar uma rainha é mantida em uma célula de tamanho maior que as células construídas para larvas de operárias. Isso ocorre, pois uma larva alimentada com grandes porções de geleia real se desenvolverá em uma larva de tamanho maior (Michener, 1974). Sabe-se que o tamanho da célula pode ser aumentado depois do início da alimentação diferenciada, como ocorre nos casos de colônias órfãs. A quantidade de alimento também tem seu papel no desenvolvimento de uma nova rainha: uma larva alimentada com geleia real, mas com quantidades pequenas de alimento, poderá originar uma rainha com algumas características de operárias (Michener, 1974).
No gênero Melipona (Apidae, Meliponini) as células de cria que irão produzir rainhas não diferem em tamanho das outras células, resultando em rainhas e operárias emergindo com o mesmo tamanho. O abdômen da rainha só aumentará de tamanho posteriormente, com o desenvolvimento dos seus ovários. A diferenciação das castas ocorre, então, através de uma interação entre dois mecanismos. Um dos mecanismos é o genético, com dois alelos envolvidos, AaBb. Um indivíduo só poderá se tornar uma rainha caso seja heterozigoto em ambos os loci; um indivíduo homozigoto em um ou ambos os loci irá se tornar uma operária. O outro mecanismo envolvido é a quantidade de alimento. O indivíduo heterozigoto para AaBb se desenvolverá em uma rainha caso as condições alimentares sejam ótimas. Caso o indivíduo se desenvolva em condições subótimas de alimento, mesmo possuindo ambos os loci em heterozigose, se
6 desenvolverá em uma operária (Michener, 1974). No gênero Melipona rainhas são produzidas constantemente com pequenas variações anuais. Sendo assim, uma situação de orfandade raramente vai ocasionar a morte da colônia (Nogueira-Neto, 1970).
Outra teoria para a produção de rainhas no gênero Melipona diz que os indivíduos seriam capazes de se desenvolver como rainhas para escapar do destino de serem operárias. De acordo com essa teoria essa seria a única maneira de uma fêmea tentar influenciar o destino reprodutivo da colônia. Isso somente seria possível para o gênero Melipona já que nesse gênero operárias e rainhas emergem de células de mesmo tamanho, com a mesma quantidade e a mesma qualidade dos alimentos (Wenseleers et
al., 2003).
Nos demais gêneros de Meliponini a diferenciação de castas ocorre apenas pela quantidade de alimento oferecido a larva. Assim, larvas que se alimentam de uma quantidade maior de alimento podem se desenvolver em rainhas (Michener, 1974). Essa alimentação diferencial pode ocorrer em dois momentos, antes ou depois do aprovisionamento das células. No primeiro caso, uma célula de tamanho maior que as outras células de cria é construída e a ela dá-se o nome de célula real. Nesta célula a quantidade de alimento aprovisionado é maior e, por isso, essa larva se desenvolve em uma rainha (Michener, 1974).
No segundo caso, a rainha realiza a postura de ovos em células do mesmo tamanho. Quando o ovo dentro da célula eclode e a larva começa a se alimentar, uma nova célula, chamada de célula auxiliar, pode ser construída. A célula auxiliar, que contém apenas alimento larval, é operculada e construída próxima a uma célula com larva, podendo ser conectada a ela. Através dessa conexão a larva poderá ter acesso ao alimento depositado na célula auxiliar. Por ingerir uma quantidade maior de alimento essa larva irá precisar de mais espaço para se desenvolver e, por isso, a célula onde a
7 larva se encontra será manipulada pelas operárias tornando-se, então, uma célula real. O mecanismo de produção de rainhas acima descrito foi observado para Frieseomelitta
varia (Faustino et al., 2002) e para Plebeia lucii Moure, 2004 (Teixeira, 2007).
As rainhas virgens produzidas pelas abelhas em suas colônias têm três principais destinos: substituir a rainha fisogástrica ativa na colônia, formar uma nova colônia ou, ainda, ser morta pelas operárias da colônia. Pouco se sabe sobre como são tomadas as decisões acerca do destino das rainhas em uma colônia. As rainhas sobreviventes precisam, em algum momento, copular com um macho e iniciar suas posturas. A cópula nessas abelhas ocorre, na maior parte das vezes, fora da colônia. Neste caso, a rainha precisa sair da colônia, no chamado voo nupcial. Após a cópula, a rainha volta para a colônia, é reconhecida pelas operárias na entrada da colônia e inicia as posturas. O reconhecimento na entrada da colônia ocorre através dos hidrocarbonetos presentes na cutícula da rainha. Sabe-se que rainhas e operárias possuem perfis de hidrocarbonetos distintos, e que rainhas virgens recém emergidas e rainhas fisogástricas também (Nunes
et al., 2009). As diferenças no perfil de hidrocarbonetos também aparecem entre
diferentes rainhas virgens, mas rainhas fisogástricas diferentes possuem um perfil bem parecido (Nunes et al., 2009).
Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo acompanhar as mudanças no perfil de hidrocarbonetos cuticulares ao longo da vida de uma rainha, evidenciando quais são essas mudanças e quando elas ocorrem. Trabalhou-se com a hipótese de que o perfil de hidrocarbonetos da rainha se altera de um perfil de rainha virgem para o perfil de uma rainha fisogástrica após a cópula. Essa hipótese baseia-se nas premissas que a rainha é afetada por várias modificações fisiológicas no processo pós-cópula, como o desenvolvimento dos ovaríolos e início das oviposições. Além disso, a sinalização da presença da rainha (Endler et al., 2006; Beekmann, 2006) e a série de interações
8 estereotipadas em relação às operárias poderiam ser refletidas por uma variação no perfil químico cuticular.
9 2. Material e Métodos
2.1 Área de estudo
O estudo foi realizado no campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (21º 10’ 30’’ S - 47º48’38’’ W), localizado no nordeste do estado de São Paulo. O
clima da área é marcado por duas estações: seca, de abril a setembro, e úmida, de outubro a março (Figura 1). Todos os experimentos foram realizados no Laboratório de Ecologia Comportamental da FFCLRP. Os experimentos se iniciaram em fevereiro de 2012 e terminaram em junho de 2014.
2.2 Espécie estudada
A espécie estudada pertence ao gênero Frieseomelitta Ihering, 1912. Esse gênero ocorre desde o México até o Estado de São Paulo no Brasil, sendo o Brasil uma área de grande abundância de espécies desse gênero (Camargo & Pedro, 2013) (Figura 2). As abelhas desse gênero organizam as suas células de cria no formato de cacho e
0 5 10 15 20 25 30 35 jan/12 mar /12 mai/12 jul /12 se t/ 12
nov/12 jan/13 mar
/13 mai/13 jul /13 se t/ 13 nov/13 ja n/14 mar /14 mai/14 T emp era tura (ºC ) Máximas Mínimas
Figura 1: Distribuição das temperaturas médias (ºC) ao longo dos dois anos de experimento em Ribeirão Preto (Fonte: Centro Integrado de Informações Agrometeorológicas (http://www.ciiagro.sp.gov.br/ciiagroonline/).
10 constroem potes de alimento com formato alongado e potes de mel arredondados (Figura 3) (Michener, 2007).
A espécie utilizada neste trabalho é a abelha endêmica Frieseomelitta languida Moure, 1990 (Figura 4) que ocorre em regiões de Cerrado da Bahia, Minas Gerais, Goiás e São Paulo. As operárias possuem aproximadamente 4,67 mm de comprimento total, 1,83 mm de largura máxima da cabeça e 1,48 mm de largura máxima do abdômen. Possuem o tegumento predominantemente preto e possuem uma pequena mancha branca no ápice das asas (Moure, 1990). As colônias foram todas removidas de troncos de madeira morta, usados como cercas, coletados no município de Pedregulho, SP.
Figura 2: Distribuição Neotropical do gênero Frieseomelitta (Camargo & Pedro, 2008).
Figura 3: Arquitetura interna de colônia de Frieseomelitta languida. A- Células em cacho B- Potes de alimento alongados.
11
A B
C D
Figura 4: Operária de Frieseomelitta languida. A – Vista Dorsal. B – Detalhe do tórax. C – Detalhe da cabeça. D – Vista lateral (Fotos: Aleixo, K.P.).
12 2. 3 Coleta de dados
2.3.1 Análises comportamentais
Foram usadas 15 colônias da espécie F. languida. As colônias eram mantidas em caixas de madeira de tamanhos variados com uma tampa de vidro, para facilitar as observações. As colônias de F. languida foram mantidas no Laboratório de Ecologia Comportamental da FFCLRP em uma estufa aquecedora a temperatura média de 31ºC. As caixas mantinham uma conexão ao meio externo por um tubo de polietileno.
Os experimentos se iniciaram com a retirada as rainhas de todas as colônias. Depois disso, as colônias foram observadas diariamente atentando-se e contando o tempo para a construção e desconstrução de células auxiliares; a formação de células reais; a emergência de rainhas virgens e os comportamentos envolvidos na aceitação ou rejeição da nova rainha na colônia. Foram iniciados experimentos com cinco colônias de cada vez, para facilitar as observações.
2.3.2 Análises químicas
Para realizar as extrações de hidrocarbonetos cuticulares de F. languida foi utilizado o composto Chromosorb. Esse composto foi escolhido para realizar uma extração não letal dos compostos cuticulares das rainhas. Antes da extração, o Chromosorb era limpo com clorofórmio e hexano para remover impurezas contidas no produto devido a embalagem plástica. Após essa limpeza, uma amostra de 5 mg de Chromosorb era banhado em hexano e injetado no CGMS (Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa) para certificação de que estava completamente livre de impurezas e contaminações. O Chromosorb utilizado foi o Chromosorb 101 60/80 mesh fabricado pela empresa SUPELCO.
13 Os hidrocarbonetos cuticulares das rainhas produzidas nas colônias de F.
languida foram extraídos a cada 3 dias, a partir do dia da emergência das mesmas,
utilizando a técnica descrita por Ferreira-Caliman e colaboradores (2012), sendo 5 mg de Chromosorb utilizados em cada extração. As rainhas eram removidas de suas respectivas colônias utilizando-se um aspirador de vidro. Para evitar contaminações, em cada remoção o aspirador de vidro era limpo utilizando-se hexano. As rainhas eram, então, colocadas em um tubo de ensaio de vidro, previamente limpo com hexano em cada utilização, junto com os 5mg de Chromosorb e a boca do tubo era fechada com papel alumínio. As rainhas eram encobertas com Chromosorb por 10 minutos, girando-se manualmente o tubo de ensaio de vidro durante o processo para manter as rainhas em contato com o Chromosorb na maior parte do tempo. Feito isso, as rainhas eram deixadas por outros 10 minutos isoladas em uma placa de Petri antes de serem reinseridas em suas respectivas colônias, para evitar agressão das operárias.
Após o término do processo de extração, os 5 mg de Chromosorb eram banhados em 10 ml de hexano. Essa mistura era agitada durante 30 segundos em um agitador e o hexano repassado para um vial utilizando-se uma pipeta de vidro. O vial permanecia em uma estufa por 24 horas, para volatilizar o hexano. Os compostos presentes em cada amostra eram ressuspendidos em 5 µl de hexano para a injeção no CGMS. As rainhas que sobreviveram a todo o experimento foram mantidas vivas nas suas colônias.
Cada amostra foi analisada em um sistema de CGMS (Shimadzu, modelo GCMS-QP 2010 Ultra, Tokyo, Japan), equipado com uma coluna capilar DB-5MS usando hélio como o gás de transporte. Foram utilizados 5µl de hexano para ressuspender os compostos a serem analisados e 1 µl foi injetado no CGMS (CG daqui em diante). O protocolo de temperatura foi: 150-300ºC a uma taxa de 3ºC/min (mantido por 20 min). As análises foram realizadas em modo splitless e espectro de massa
14 individual foi comparado com compostos sintéticos e dados da biblioteca Wiley (McLafferty et al., 2000).
2.4 Análise de dados
A análise de componentes principais (PCA) foi utilizada para definir os picos dos principais compostos a serem comparados. Compostos ausentes na maioria dos indivíduos de um grupo analisado, bem como os compostos que contribuem com menos de 5% para os dois primeiros fatores, como indicado pela PCA, foram excluídos da análise estatística. As concentrações relativas dos compostos utilizados na análise discriminante foram reajustadas a 100%. Em seguida, uma análise da função discriminante stepwise foi utilizada para observar se as combinações de variáveis podem ser úteis no grupo de previsão. Neste método, as variáveis são sucessivamente adicionadas ao modelo baseado na maior F para inserir valores, acrescentando não mais variáveis quando a razão F não é mais significativa. Valores do de Wilks foram utilizados para verificar a contribuição individual de cada variável no modelo. A estatística do de Wilks para a discriminação global é calculada como a relação entre o
determinante da variância dentro de grupos / matriz de covariância para o determinante da variância total / matriz de covariância.
Quando estes valores estão perto de 1.0, então o resíduo é alto e a variável não é um bom discriminador. Quando um valor é próximo de 0 significa que o resíduo é baixo e a variável é um bom discriminador (Rao, 1973). Para evitar erros na composição dos dados da amostra, a área abaixo de cada pico foi transformada de acordo com a seguinte fórmula: Z = ln[Ap/g(Ap)], onde Ap é a área abaixo do pico, g(Ap) é a média geométrica para cada grupo de composto e Z é a área transformada do pico (Aitchison, 1986). A distância de Mahalanobis (D) foi usada como parâmetro para avaliar a
15 distância entre os grupos de produtos químicos. A análise de variância One-way ANOVA foi utilizada para testar se as subcastas diferem na proporção relativa dos hidrocarbonetos cuticulares. Análise post-hoc (teste t com uma correção de Bonferroni) foi utilizada para comparar cada composto químico de acordo com o seu grupo específico. As análises foram realizadas utilizando o software Statistica 8.0 (Statsoft, Inc.).
16 4. Resultados
As primeiras cinco colônias de F. languida produziram quatro rainhas virgens. As rainhas de duas colônias morreram logo após a primeira extração. As outras duas rainhas morreram após a 3ª extração e a 7ª extração, sendo que nenhuma delas copulou. Em outras cinco colônias orfanadas, todas produziram novas rainhas. Dessas, três rainhas morreram após a 2ª extração, uma após a 3ª extração e a última rainha copulou e teve seu perfil extraído após a cópula. Das últimas cinco colônias orfanadas apenas 3 produziram rainha. Duas dessas morreram logo após a primeira extração, e a outra rainha copulou e teve seu perfil extraído após a cópula (Figura 5) As rainhas que sobreviveram até após a cópula foram as das colônias numeradas como 2 e 5.
As rainhas que morreram antes da cópula foram todas eliminadas pelas operárias da colônia. As operárias eliminaram as rainhas depositando resina sobre os seus Figura 5: Curva de sobrevivência das rainhas de Frieseomelitta languida utilizadas no estudo, tempo em dias.
17 espiráculos respiratórios inicialmente. Posteriormente, também depositaram resina sobre as asas da rainha. Se o corpo da rainha fosse mantido por muito tempo na colônia, as operárias iram recobri-lo totalmente com resina. Qualquer análise de hidrocarbonetos das rainhas mortas se torna inviável devido a resina depositada em seus corpos.
Em média, as operárias construíram uma célula auxiliar três dias após a orfandade da colônia. Quatro dias após a orfandade foi a média de tempo para que houvesse uma célula real na colônia. Uma nova rainha virgem emergiu nas colônias em média 31 dias após a orfandade. As rainhas que copularam o fizeram em 63 dias (Tabela 1). Célula Auxiliar Célula Real Emergência da rainha Cópula Tempo Médio
(em dias após a orfandade da colônia) 3 4 31 63
As análises dos perfis cuticulares das rainhas indicaram 83 compostos. Entre eles alcanos, alcenos, acetatos, ésteres, hidrocarbonetos ramificados, um colesterol e um geraniol. Dos 83 compostos encontrados (Tabela 2), 29 apresentam diferenças entre rainhas virgens e rainhas fisogástricas. Esses compostos são: não identificados 1 e 2; acetato 1; z-C27 (2) e (3); z-C29 (2), (3), (4) e (5); éster 5, ácido tetradecanoico tetradecil/ acido dodecanoico ester hexadecil; acetatos 6, 7 e 8; z-C31 (1) e (2); colesterol; n-C32; acetatos 9 e 10; z-C33; éster 10; acetatos 11, 12, 13, 14; z-C35 e ácido octadecanoico ester einecosil. Os compostos presentes nas rainhas virgens (R.V.) e fisogástricas (RF) variaram qualitativamente ao longo do tempo (Figuras 6 e 7).
Tabela 1: Tabela com a média de dias necessário para a ocorrência de cada fase da produção de uma nova rainha, a partir do dia da orfandade da colônia.
18 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 R.V. 5 R.V. 4 R.V. 3 R.V. 2 R.V. 1 RF Acetatos Ésteres Ramificados Alcanos Alcenos 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 R.V. 5 R.V. 4 R.V. 3 R.V. 2 R.V. 1 RF Acetatos Ésteres Ramificados Alcanos Alcenos
Figura 6: Proporção dos compostos (%) que ocorrem no perfil cuticular da rainha da colônia 02 ao longo de sua vida. R.V. = rainha virgem; RF = rainha fisogástrica.
Figura 7: Proporção dos compostos (%) que ocorrem no perfil cuticular da rainha da colônia 05 ao longo de sua vida. R.V. = rainha virgem; RF = rainha fisogástrica.
19 Compostos R.V. M ± DP R.F. M ± DP n-C19 0,18 ± 0,17 a 0,09 ± 0,01 a n-C20 0,42 ± 0,32 a 0,19 ± 0,06 a Hexadecilacetato 0,65 ± 1,04 a z-C21 1 ± 1,86 a 0,14 ± 0,10 a n-C21 1,19 ± 1,52 a Não Identificado 1 0,32 ± 0,36 a 4,11 ± 3,95 b
Ester etil ácido Oleico 0,11 ± 0,08 a 0,04 ± 0,02 a
n-C22 0,66 ± 0,57 a 0,24 ± 0,08 a Acetato Octadecanol 0,18 ± 0,19 a z-C23 (1) 0,11 ± 0,1 a 0,12 ± 0,00 a z-C23 2 0,15 ± 0,08 a n-C23 0,56 ± 0,58 a Ester 1 0,1 ± 0,09 a Não Identificado 2 0,49 ± 0,83 a Ester 2 0,12 ± 0,15 a 0,01 ± 0,00 a n-C24 0,38 ± 0,59 a 0,21 ± 0,08 a z-C25 (1) 0,14 ± 0,12 a 0,16 ± 0,05 a z-C25 (2) 0,27 ± 0,15 a 0,31 ± 0,18 a Não Identificado 3 0,13 ± 0,03 a 0,16 ± 0,11 a Acetato 1 0,05 ± 0,03 a 0,21 ± 0,05 b n-C25 6,17 ± 2,71 a 5,78 ± 0,93 a 13-Me C25 0,24 ± 0,42 a 0,04 ± 0,00 a
Ester hexadecil Octadecanol 0,23 ± 0,37 a
Acetato 2 0,25 ± 0,5 a 0,02 ± 0,00 a n-C26 0,3 ± 0,12 a 0,18 ± 0,08 a z-C27 (1) 0,43 ± 0,33 a 1,02 ± 0,20 a z-C27 (2) 0,37 ± 0,5 a 1,47 ± 0,35 b z-C27 (3) 0,16 ± 0,13 a 1,15 ± 0,17 b n-C27 (4) 5,44 ± 1,01 a 2,86 ± 0,33 a 13-Me C27 0,05 ± 0,05 a Ester 3 0,19 ± 0,24 a 0,08 ± 0,04 a Acetato 3 0,21 ± 0,37 a n-C28 0,16 ± 0,06 a 0,12 ± 0,06 a Ester 4 0,07 ± 0,07 a Geranil Geraniol 0,51 ± 0,37 a 0,99 ± 0,72 a Não Identificado 4 0,09 ± 0,03 a z-C29 (1) 0,46 ± 0,8 a z-C29 (2) 1,33 ± 1,21 a 4,77 ± 1,15 b z-C29 (3) 0,42 ± 0,28 a 1,24 ± 1,13 b
Tabela 2: Proporções relativas dos compostos cuticulares das rainhas virgens (R.V.) e rainhas fisogástricas (R.F.). M = média, DP = desvio padrão, a/b indicam diferenças significativas entre os compostos.
20 Compostos R.V. M ± DP R.F. M ± DP z-C29 (4) 1,63 ± ,050 a z-C29 (5) 3,26 ± 1,03 a n-C29 2,29 ± 0,83 a 1,93 ± 0,44 a 15,13-Me C29 0,29 ± 0,53 a Ester 5 0,19 ± 0,18 a 0,02 ± 0,00 b
Acido Tetradecanoico, Ester tetradecil/ Acido Dodecanoico ester
hexadecil 0,05 ± 0,04 a 0,16 ± 0,02 b Não Identificado 5 0,15 ± 0,1 a 0,12 ± 0,03 a n-C30 0,15 ± 0,1 a 0,15 ± 0,18 a Acetate 5 0,05 ± 0,04 a Acetate 6 1,94 ± 0,56 a Acetate 7 2,06 ± 1,65 a Acetate 8 3,35 ± 2,40 a z-C31 (1) 6,57 ± 4,23 a z-C31 (2) 3,82 ± 0,17 a n-C31 0,87 ± 0,32 a 1,57 ± 0,83 a Colesterol 0,09 ± 0,08 a 0,82 ± 0,81 b 15,13-Me C31 0,14 ± 0,09 a Ester 6 0,27 ± 0,04 a 0,21 ± 0,11 a
Acido Hexadecanoico Ester tetradecil / Acido Tetradecanoico ester
hexadecil 0,8 ± 1,83 a 0,19 ± 0,01 a Ester 7 0,25 ± 0,06 a 0,24 ± 0,04 a Ester 8 0,29 ± 0,19 a 0,32 ± 0,27 a n-C32 0,03 ± 0,02 a 4,78 ± 1,32 b Acetato 9 2,80 ± 2,06 a Acetato 10 0,48 ± 0,87 a 6,96 ± 1,85 b z-C33 0,63 ± 0,76 a n-C33 0,19 ± 0,19 a 0,25 ± 0,13 a 15,13-Me C33 0,18 ± 0,08 a 0,24 ± 0,26 a
Acido Oleico, Ester tetradecil 2,91 ± 2,91 a 0,89 ± 0,87 a
Ester 9 0,38 ± 0,32 a
Acido hexadecanoico, Ester hexadecil 0,56 ± 0,36 a 0,25 ± 0,08 a
Ester 10 0,45 ± 0,04 a Acetato 11 0,19 ± 0,09 a Acetato 12 0,20 ± 0,06 a Acetato 13 2,56 ± 0,81 a Acetato 14 1,51 ± 0,80 a z-C35 1,27 ± 0,14 a Ester 11 1,47 ± 1,41 a z-C36 5,89 ± 10,26 a 1,18 ± 1,30 a
21 Compostos R.V. M ± DP R.F. M ± DP
Acido hexadecanoico, ester octadecil 0,41 ± 0,48 a
Ester 12 22,47 ± 16,23 a
Ester 13 14,25 ± 22,39 a
Acido octadecenoico, ester Eneicosil 20,69 ± 19,96 a
Acido Octadecanoico, Ester Octadecil 10,09 ± 6,33 a
9,97 ± 13,56 a
Acido Eicosanoico, Ester Hexadecil 4,32 ± 4,84 a
Acido Octadecanoico,Ester Eneicosil 5,9 ± 3,18 a
Análises discriminantes dividiram significativamente os dois grupos, rainhas virgens e fisogástricas. Os compostos mais importantes para a discriminação podem ser vistos na Tabela 3. A classificação da matriz por grupo de comparação também confirmou a separação dos 2 grupos (Tabela 4). As distâncias químicas obtidas pelos valores de Mahalanobis (Tabela 5) mostram que os dois grupos são significativamente distantes. Compostos F p Ester 10 5195408 0,000000 z-C31 (2) 109775 0,000000 z-C31 (3) 45841 0,000000 Não Identificado 1 72 0,000148 n-C38 12 0,013543 Classes % de acerto R.F. R.V. R.F. 100 2 0 R.V. 100 0 10
Tabela 3: Compostos mais importantes para a discriminação dos grupos. .
Tabela 4: Classificação da matriz por grupo de comparação usando análise discriminante. .
22 R.F. (F) R.F. (p) R.V. (F) R.V. (p)
R.F. 8676894 0,00
R.V. 8676894 0,00
As análises dos fatores de PCA mostraram diferenças significativas entre rainhas virgens e rainha fisogástricas e diferenças significativas entre as duas colônias estudadas (Tabela 6; Figura 8).
Compostos Fator 1 Fator 2
n-C19 -0,167663 0,476946 n-C20 -0,522237 0,376183 Hexadecilacetato 0,864439 0,388180 z-C21 -0,630107 0,246770 n-C21 0,641584 0,651999 Não Identificado 1 -0,610275 -0,630183
Ester etil ácido oleico -0,529789 0,078675
n-C22 -0,598352 0,344616 Acetato Octadecanol 0,715307 0,539056 z-C23 (1) 0,598896 0,098524 z-C23 2 0,506148 0,417960 n-C23 0,287623 0,738440 Ester 1 -0,728652 -0,160129 Não Identificado 2 -0,950330 -0,046247 Ester 2 -0,862416 -0,176598 n-C24 0,424206 0,454655 z-C25 (1) -0,230232 -0,535902 z-C25 (2) 0,526114 0,032948 Não Identificado 3 0,854830 -0,404581 Acetato 1 0,745502 -0,523888 n-C25 0,165552 0,019826 13-Me C25 -0,261834 0,211243
Acido Octadecanol ester Hexadecil -0,172667 0,318751
Acetato 2 0,607968 0,502026
n-C26 0,541710 0,491472
z-C27 (1) 0,242150 -0,656885
z-C27 (2) 0,460153 -0,650798
z-C27 0,383604 -0,786881
Tabela 5: Análise discriminante do perfil cuticular das rainhas. .
Tabela 6: Fatores utilizados nas análises de PCA, para cada composto. .
23
Compostos Fator 1 Fator 2
n-C27 0,382456 0,474436 13-Me C27 0,707011 0,477628 Ester 3 0,673398 -0,109726 Acetato 3 0,154358 0,657853 n-C28 0,154263 0,288530 Ester 4 0,938695 0,161707 GeranilGeraniol -0,610468 -0,500962 Não Identificado 4 0,769735 -0,210673 z-C29 (1) -0,536060 0,218757 z-C29 (2) 0,268686 -0,527323 z-C29 (3) 0,677444 -0,367136 z-C29 (4) 0,766071 -0,601843 z-C29 (5) 0,772207 -0,595389 n-C29 -0,347653 0,300383 15,13-Me C29 0,888469 0,336317 Ester 5 0,149330 0,730523
Acido Tetradecanoico ester Tetradecyl/ Acido Dodecanoico ester
Hexadecil -0,018819 -0,662628 Não Identificado 5 -0,500648 -0,508681 n-C30 -0,631435 0,227449 Acetato 5 0,619573 0,525366 Acetato 6 0,744226 -0,623750 Acetato 7 0,966975 -0,234936 Acetato 8 0,955456 -0,278493 z-C31 (1) 0,957431 -0,215638 z-C31 (2) 0,861247 -0,416036 n-C31 -0,178569 -0,526661 Colesterol -0,252038 -0,695235 15,13-Me C31 0,837839 0,028476 Ester 6 -0,105931 -0,245087
Acido Hexadecanoico Ester Tetradecil/ Acido Tetradecanoico Ester
Hexadecil 0,720534 0,345990 Ester 7 -0,011931 -0,532024 Ester 8 -0,306927 -0,079438 n-C32 -0,719045 -0,519754 Acetato 9 0,958504 -0,267917 Acetato 10 0,006498 -0,830390 z-C33 0,987029 -0,076351 n-C33 0,504877 -0,227482 15,13-Me C33 -0,335674 -0,242299
Acido Oleico ester Tetradecil 0,159106 0,445250
Ester 9 0,449532 0,694469
24
Compostos Fator 1 Fator 2
Ester 10 0,377719 -0,837624 Acetate 11 -0,693749 -0,586918 Acetate 12 0,737543 -0,630139 Acetate 13 0,772096 -0,595506 Acetate 14 0,908823 -0,398303 z-C35 -0,721148 -0,561056 Ester 11 -0,631551 -0,183495 z-C36 -0,781844 0,039564
Acido Octadecanoico ester Hexadecil 0,922675 0,204085
Acido Octadecanoico ester Hexadecil/ácido Hexadecanóico Octadecil
Ester -0,082682 0,260983 Ester 12 -0,872358 0,145725 Ester 13 -0,829674 0,081223 Ester Eneicosil 0,896107 0,195829 Ester Octadecil -0,730836 -0,079613 Acido Eicosanoico -0,236231 0,254236
Acido Octadecanóico ester Eneicosil -0,389026 0,340840
Figura 8: Analise de fatores PCA entre os indivíduos amostrados. R.V.: Rainhas virgens; R.F.: Rainhas Fisogástricas.
25 As mudanças evidenciadas acima entre os perfis de rainhas virgens e rainhas fisogástricas podem ser observados nas figuras abaixo (Figuras 9 e 10) que mostram os perfis cuticulares das rainhas virgens, em preto, e fisogástricas, em rosa. As amostras usadas no exemplo abaixo foram coletadas com três dias de diferença, evidenciando a abrupta mudança que ocorre após a cópula. A rainha da colônia 2 copulou no dia 01/03/2013 e teve sua última extração realizada no dia 03/03/2013. A rainha da colônia 5 copulou no dia 08/03/2014 e teve sua última extração realizada no dia 11/03/2014.
Figura 10: Perfis cuticulares dos dias 08/03/2014 (preto) e dia 11/03/2014 (rosa), rainha colônia 5.
. (ro
26 5. Discussão
Neste trabalho observou-se que rainhas fisogástricas e rainha virgens possuem perfis químicos cuticulares muito diferentes. Os perfis aparentam se modificar abruptamente após a cópula (Figuras 13 e 14). As grandes diferenças e distâncias nos perfis entre rainhas virgens e fisogástricas já eram esperadas e já foram encontradas em outras espécies de abelhas sem-ferrão (Nunes et al., 2009; Nunes, 2010; Ferreira-Caliman et al., 2013) e em outros himenópteros, como formigas (Dietemann et al., 2003). Foram, inclusive, encontradas diferenças nos compostos cuticulares de indivíduos reprodutivos e não reprodutivos de espécies de formiga (Biseau et al., 2004) e vespas (Sledge et al., 2000) que não apresentam divisão morfológica de castas.
Podemos notar a importância dos ésteres para a identificação das rainhas no começo de suas vidas. A proporção de ésteres é alta nas rainhas assim que elas emergem, e continua alta até o momento próximo a cópula. A proporção de ésteres diminui com a proximidade da cópula e diminui ainda mais após a cópula. É interessante ressaltar as grandes mudanças observadas para as quantidades de alcenos nas rainhas fisogástricas. Após a cópula a quantidade desses compostos aumenta significativamente. O aumento na quantidade de alcenos na cutícula da rainha fisogástricas também foi reportado em rainhas de formigas (Biseau et al., 2004; Smith
et al., 2013). Se considerarmos que esses compostos estão altamente associados a
comunicação nos insetos, podemos interpretar isso como um aumento na necessidade de essas rainhas comunicarem o seu status reprodutivo. Diferenças quantitativas e qualitativas entre os perfis químicos de rainhas, como as encontradas neste trabalho são raramente encontradas entre insetos sociais. Normalmente a diferença mais marcante entre os perfis é apenas quantitativa (Biseau et al., 2004).
27 Diferentemente de outros trabalhos que tentam entender as diferenças entre os compostos cuticulares de rainhas virgens e fisogástricas (Dietemann et al., 2003; Nunes
et al., 2009; Nunes, 2010; Ferreira-Caliman et al., 2013), os hidrocarbonetos não foram
os únicos compostos importantes na diferenciação dos dois grupos estudados. Ésteres tiveram um grande impacto nesta diferenciação. Esses compostos parecem ter grande importância para a comunicação em F. languida e podem ter sido negligenciados em trabalhos anteriores. Os resultados mostrados podem ajudar a mostrar a importância de se estudar outros compostos que podem estar envolvidos na comunicação dentro da colônia além dos hidrocarbonetos.
O número de rainhas que sobreviveram nos experimentos de F. languida foi baixo, uma vez que apenas duas das 12 rainhas que emergiram sobreviveram até depois da cópula. Isso pode estar relacionado ao uso do composto Chromosorb para a remoção dos hidrocarbonetos dessas rainhas. A função do Chromosorb é remover compostos importantes para a comunicação entre a rainha e as operárias da colônia. Sendo assim, é possível que a rainha pareça um indivíduo estranho à colônia, um invasor. Isso é plausível pois, como demonstrou Ferreira-Caliman e colaboradores (2012), o composto tem alta taxa de absorção de certos compostos como os hidrocarbonetos cuticulares. Isso ainda não explicaria o porquê de algumas rainhas terem sobrevivido mesmo após a remoção dos compostos de sua cutícula, a não ser que aceitemos que existe uma variação individual na taxa de produção e restabelecimento dos hidrocarbonetos cuticulares entre as rainhas.
O Chromosorb pode também ser relativamente tóxico aos indivíduos e afetar diferentemente as rainhas. Ainda assim, se a toxicidade do Chromosorb fosse alta as rainhas deveriam morrer dentro dos tubos de ensaio, durante a extração. Ambas as hipóteses podem ser testadas no futuro.
28 Para a primeira hipótese, seria possível utilizar uma fibra SPME (Solid Phase Micro Extration) para extrair os compostos cuticulares do indivíduo antes e depois do uso do Chromosorb. Faríamos isso para verificar se os compostos cuticulares são esgotados com o uso do Chromosorb e se esses os indivíduos conseguem recuperar esses compostos em 10 minutos. Pode-se também variar o tempo entre o uso do Chromosorb e a fibra SPME de 10 minutos até 1 hora para ver se o aumento do tempo de descanso ajuda na recuperação do perfil original do indivíduo.
Outro teste que pode ser feito é manter um grupo de 10 operárias em uma placa de Petri, extrair o perfil de hidrocarbonetos de uma operária com o Chromosorb e devolvê-la à placa de Petri. Se houver agressões a esta operária ou morte da mesma pelas outras operárias, isso seria um indício de que o Chromosorb afeta a comunicação e identificação do indivíduo pelo resto da colônia.
Para testar a segunda hipótese, se o composto Chromosorb é toxico para as abelhas, seria possível isolar abelhas em uma placa de Petri, com alimento suficiente para sua sobrevivência. Poderiam ser preparadas 20 placas de Petri, com uma abelha em cada placa, e, em intervalos regulares, submeter metade dos indivíduos à extração de hidrocarbonetos utilizando o Chromosorb. Feito isso, poderia se observar a taxa de mortalidade desses indivíduos comparados aos indivíduos controle (a metade não submetida as extrações).
A curva de sobrevivência em F. languida (Figura 8) se assemelha à curva de sobrevivência encontrada por Wenseleers e colaboradores (2004). Em Melipona beechi (Bennet, 1831) eles mostraram que muitas das rainhas que emergiram nas colônias foram eliminadas pelas operárias nas primeiras 24 horas. Isso também pôde ser observado em F. languida. Apesar de a escala de tempo entre os dois trabalhos ser bem diferente, a taxa de mortalidade é semelhante. A diferença nas escalas de tempo pode
29 ser explicada pela taxa de produção de rainhas. O gênero Melipona produz rainhas constantemente. Já F. languida produz rainhas em uma taxa muito mais baixa: apenas na ausência de uma rainha fisogástrica ou em momentos de enxameio.
O tempo necessário para a ocorrência de cada fase da produção de uma nova rainha foram diferentes dos obtidos em um trabalho anterior (Fadil, 2011). No trabalho anterior, a média para a produção de uma célula auxiliar foi de 17 dias, o que aumentou significantemente as médias para as outras fases da produção da rainha. Porém, se removermos um outlayer, o tempo médio para a construção de células auxiliares diminui e se aproxima da média encontrada no presente trabalho.
Nesse contexto, podemos concluir que existem diferenças qualitativas e quantitativas significativas entre os perfis cuticulares de rainhas virgens e fisogástricas da espécie estudada e que esta mudança se dá rapidamente, a partir do momento da cópula.
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