Como silenciar um gene e
como usar RNAi na biologia tumoral
III Curso de Sinalização Celular no Câncer 29 de Outubro a 01 de Novembro de 2013
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Laboratório de Sinalização e Plasticidade Celular
Mudança de paradigma clássico
Antisense x siRNA no pubmed
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 1986 1990 1994 1998 2002 2006 2010 siRNA antisense
• shRNA x siRNA
Principais estratégias para RNAi
Hek293T Célula AlvoCentrifugar e
Filtrar (0,45 m)
+ polibrene
48h Transcrição VSVG GagPol Rev LTR Trangene siRNA Seleção Puromicina Clonagem shRNA0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 1997 2002 2007 2012 miRNA shRNA siRNA
AUG UAA
5 UTR Traduzido 3 UTR
mRNA
2. siRNA (small ou (short) interfering) 3. shRNA (short hairpin)
1. Onde posicionar?
2. Qual sequencia pode, e qual não pode?
3. Tem como garantir silenciamento?
4. Tem como garantir a ausência de silenciamento de
outros alvos (off-targets)?
AUG UAA
5 UTR Traduzido 3 UTR
mRNA
2. siRNA (small ou (short) interfering) 3. shRNA (short hairpin)
1. Como começar?
Usando um serviço de desenho de siRNAs ou uma
biblioteca de shRNAs
Nature Genetics, 33, 396, 2003.
O que fazer quando não
funciona?
AUG UAA
5 UTR Traduzido 3 UTR
mRNA
2. siRNA (small ou (short) interfering) 3. shRNA (short hairpin)
Onde posicionar?
AUG UAA
5 UTR Traduzido 3 UTR
Não nos últimos 100nt
Não nos primeiros 100nt
miRNA based
Uma base não pareada pode ser o
suficiente para não silenciar
Alta especificidade (será)?
1
Seed Sequence
21
Sense 5 -CAACAAGAT
GAAGAGCACCA
A-3 passanger strand
Anti-sense 3 -GTTGTTCTA
CTTCTCGTGGT
T-5 guide-strand
21 1
Importância do pareamento
(B) Endogenous SOD1 mRNA levels were determined by quantitative RT-PCR for each siRNA transfection. Shown is the mean standard deviation of three replicate determinations for each siRNA. Endogenous wild-type SOD1 mRNA is mismatched to the siRNAs used; taller bars imply greater discrimination against the mismatched target RNA.
• Minha experiência com alvos não conservados
Biblioteca contra genes de humanos e camundongos Mas eu precisava silenciar um gene em ratos
CD73 – 3500nt
CD73 – ecto-5’Nucleotidase Degrada AMP a adenosina
10 - 3
Luis F. Campesato, Patricia L. C. Lopez, Guido Lenz,
Nature Biotech., 21, 635, 2003.
Alvos Reais
Alvos Preditos (Smith-Waterman) 79,84,89% identity cutoff
Mas não dá pra fazer bioinfo para prever os
tais dos off-targets?
• My off-target story
SHC002 Sigma MISSION™ Non-Target shRNA Control Vector
The MISSION Non-Target shRNA Control Vector is a lentivirus plasmid vector. The
vector contains an shRNA insert that does not target human and mouse genes, making it useful as a negative control in experiments using the MISSION shRNA library clones. The short-hairpin sequence contains 4 base pair mismatches to any known human or mouse gene. This allows one to examine the effect of transfection of a short-hairpin on gene expression and interpret the knockdown effect seen with shRNA clones. Ampicillin and puromycin antibiotic resistance genes provide selection in bacterial or mammalian cells respectively. In addition, self-inactivating replication incompetent viral particles can be produced in packaging cells (HEK293T) by co-transfection with compatible packaging plasmids. The Non-Target shRNA Control Vector is provided as 10 μg of plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer at a concentration of 500 ng/μl.
Não afetou a
atividade em
camundongos
e humanos
O “non-target” foi desenhado para
humano e camundongo – e em ratos?
0 20 40 60 80 100 120 140 160 C6 controle C6/Ci C6/C4 C6/C6 nm ol P i/ m in/ m g a a b a
Controle non-target 6 missmatches seq sem missmatch
Atividade da ecto-5’-NT/CD73 após
silenciamento por shRNA em linhagem de glioma C6 de rato.
Alinhamento da sequência toda
Alinhamento só
da dos NTs 2-11
(do anti-sense)
1
Seed Sequence
21
Sense 5 -CAACAAGAT
GAAGAGCACCA
A-3
Anti-sense 3 -GTTGTTCTA
CTTCTCGTGGT
T-5
21 1
Importância do pareamento
O que fazer em relação aos
Off-targets?
• Usar a dose mínima necessária
para silenciar o alvo
• Usar pelo menos duas sequências
• Experimentos de recuperação
O que fazer em relação aos
Off-targets?
• Usar a dose mínima necessária
para silenciar o alvo
• Usar pelo menos duas sequências
• Experimentos de recuperação
AUG UAA
5 UTR Traduzido 3 UTR
Experimentos de recuperação (rescue)
Expressar o gene silenciado recombinante e ver se recupera o fenótipo Mas como fazer para o RNAi não silenciar também o recombinante (de
preferência com um tag (Flag, HA) para ter certeza que o recombinante não está sendo silenciado)
1. Se a região alvo for no UTR - Transfectar a célula com um plasmideo contendo o
gene, sem o 3’UTR
2. Se a região alvo for na região traduzida - Transfectar a célula com um plasmideo contendo o gene um uma (ou mais) mutações silenciosas no alvo
• 36 out of 49 shRNA sequences delivered by
AAV8 produces liver injury, with 23 ultimately
causing death
• Not restricted to a particular shRNA or target
• But dependent on size – 19mers are not toxic
(and silence), 23mers or bigger are toxic (and
don t silence as well)
• Morbidity was associates with the
downreagulation of liver-derived miRNAs
• Probably due to exportin 5 saturation
• Optimization of dose and sequence
• Does not happen with siRNAs, since they enter
the pathway after exportin 5
Tlr3 – Toll-like receptor 3
Long double-stranded viral RNA sensor dsRNAs maiores do que 21nt são agonistas
de Tlr3 e tem efeito anti-angiogênico TLR7 e 8 can also respond to duplex
Transfecção
Transdução viral
Para o que usar
• Curar câncer?
• Se é possível silenciar qualquer gene
• Inclusive oncogenes de forma específica
• Então é só silenciar os oncogenes
daquele tipo tumoral, correto?
• E se silenciar dois ou três ao mesmo
tempo, não terá resistência, correto
também?
Eficiência de transfeção
• Digamos que a eficiência seja aumentada
para 99%
• Ou, sejamos otimistas, 99,9% (só 1 entre
1000 células não receberia o RNAi)
Terapia atual
1 a 30 mil células de 10 bilhões de células no tumor original Ou seja, 0,0000001 a 0,003%
Se a eficiência for de 99,9%, 1 milhão de células não serão afetadas pelo RNAi
